JP4465442B2 - Ｓｓｒ法によるイグサ品種識別 - Google Patents

Ｓｓｒ法によるイグサ品種識別 Download PDF

Info

Publication number
JP4465442B2
JP4465442B2 JP2003408328A JP2003408328A JP4465442B2 JP 4465442 B2 JP4465442 B2 JP 4465442B2 JP 2003408328 A JP2003408328 A JP 2003408328A JP 2003408328 A JP2003408328 A JP 2003408328A JP 4465442 B2 JP4465442 B2 JP 4465442B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
primer
sequence
oligonucleotide
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2003408328A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2005168308A (ja
Inventor
彰 齋藤
英司 土門
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Agriculture and Food Research Organization
Original Assignee
National Agriculture and Food Research Organization
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Agriculture and Food Research Organization filed Critical National Agriculture and Food Research Organization
Priority to JP2003408328A priority Critical patent/JP4465442B2/ja
Publication of JP2005168308A publication Critical patent/JP2005168308A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4465442B2 publication Critical patent/JP4465442B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

本発明は、イグサ品種識別に関し、より詳細には、イグサ主要栽培品種のうち、最も優良な品質を持ち産業価値の高い品種「ひのみどり」と他の品種を識別するためのＤＮＡマーカーおよび該マーカーを標的としてイグサ主要栽培品種から品種「ひのみどり」を識別する方法に関する。
イグサは主に栄養繁殖で増殖・栽培されており、これまで育成された品種は、栄養系品種である。
従来、イグサの品種特性は茎長（草丈）、茎の太さ、幹茎色（茎の色）、茎数（一株あたりの茎の数）花序着生率（着花の頻度）、先枯程度（先端部分の枯れの程度）など産業上の品質に関わる特徴で表されてきた。しかし、これらの特性は量的形質であって、生育環境の変化に応じてそれらの形質も変化するため、一定の栽培環境における品種の特徴を説明することはできても、確実に品種を識別するマーカーとしては利用できなかった。このため、いったん入手経路が不確実になるとどの品種であるのか断定することは困難であった。その結果、いくつかの品種が混ざって製品の均一性が失われたり、あるいは優良品種の盗難、不法栽培を防止・規制することができなかった。
品種識別への分子生物学的技術の適用に関して、ＳＳＲマーカーはゲノムＤＮＡ中の遺伝子をコードしていない非コード領域に主に見られる単純反復配列（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）を利用し、ＳＳＲの反復回数が種系統間で異なる性質に基づいて品種系統を識別する方法である。ＳＳＲの検出は、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を電気泳動で分離し、ＤＮＡ断片を蛍光色素で検出する方法で行う。品種の識別は，検出されたＤＮＡ断片長の違いを基準品種と比較することで行う。品種系統の識別には複数のＤＮＡマーカーを併用することが望ましい。ＳＳＲマーカーはＰＣＲによって増幅するＤＮＡ断片長の組み合わせによって、一回のＰＣＲ反応に付き４〜５種類のＳＳＲマーカーで遺伝子型を比較すること（マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）法）が可能であり、アガロースゲル電気泳動と組み合わせれば９６サンプル程度の多検体の検出が３〜４時間で可能であるため、スクリーニング的な用途に適用可能である。特に、イグサ製品の品種識別では、試料１点あたり２０本程度の独立した茎からのＤＮＡ抽出とＰＣＲが必要であるため、ＰＣＲのコストを抑えることが重要である。また、ＤＮＡシーケンサーを利用することで高精度の遺伝子型識別が可能となる。
他方、近年の分子生物学的技術の適用に関しては、九州農業試験場と熊本県農業研究センターい業研究所が平成９〜１０年に「ＲＡＰＤ法によるイグサ品種識別」について共同研究を行った。しかし、開発されたＤＮＡマーカーは熱処理によって断片化した原草のＤＮＡから安定に多型を検出することは困難であり、実用的な品種識別マーカーは全く得られなかった。このため、イグサの品種を識別することは極めて困難であった。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、加工品のイグサの品種識別に利用しうるＤＮＡマーカーを同定し、イグサ産業における品種識別の判断材料を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を行った結果、イグサ主要栽培品種１６品種をＳＳＲ分析法に供することにより、これら品種のゲノムＤＮＡ断片の中から、ＰＣＲによって，優良イグサ品種「ひのみどり」には特異的に増幅されないＤＮＡ断片を同定することに成功した。本発明者らにより同定された、このようなＤＮＡ断片に含まれる特異的な塩基配列は、イグサ品種から品種「ひのみどり」を識別するための重要なＤＮＡマーカーとなる。本発明は、イグサ品種の識別に成功しうる実用的なＤＮＡマーカーを同定したものである。
即ち、本発明は、イグサ主要栽培品種のうち、最も優良な品質を持ち産業価値の高い品種「ひのみどり」と他の品種を識別するための方法に関し、より詳しくは、下記（１）から（１２）に記載の発明を提供するものである。
（１）イグサの品種識別に有用なプライマーであって、該プライマーが、以下：
ＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴ（配列番号１）；
ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）；
ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）；
ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴ（配列番号４）；
ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）；
ＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号６）；
ＧＴＴＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣ（配列番号７）；
ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＡ（配列番号８）；
ＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＣＴ（配列番号９）；および
ＴＣＣＣＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＡＣＴ（配列番号１０）
からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチド、もしくは該オリゴヌクレチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー。
（２）前記プライマーが、以下からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドである、項１に記載のプライマー：
ＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴ（配列番号１）；
ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）；
ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）；
ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴ（配列番号４）；
ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）；
ＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号６）；
ＧＴＴＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣ（配列番号７）；
ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＡ（配列番号８）；
ＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＣＴ（配列番号９）；および
ＴＣＣＣＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＡＣＴ（配列番号１０）。
（３）イグサの品種識別に有用なプライマー対であって、該プライマー対が、項１または２に記載のプライマーの少なくとも２つを含む、プライマー対。
（４）前記プライマー対が、以下の１）から５）の組み合わせの少なくとも１つを含む、項３に記載のプライマー対：
１）ＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴ（配列番号１）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー、ならびに
ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー；
２）ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー、ならびに
ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴ（配列番号４）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー；
３）ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー、ならびに
ＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号６）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー；
４）ＧＴＴＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣ（配列番号７）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー、ならびに
ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＡ（配列番号８）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー；
５）ＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＣＴ（配列番号９）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー、ならびに
ＴＣＣＣＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＡＣＴ（配列番号１０）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー。
（５）前記プライマー対が、以下の１）から５）の組み合わせの少なくとも１つを含む、項４に記載のプライマー対：
１）ＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴ（配列番号１）および
ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）；
２）ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）および
ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴ（配列番号４）；
３）ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）および
ＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号６）；
４）ＧＴＴＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣ（配列番号７）および
ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＡ（配列番号８）；
５）ＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＣＴ（配列番号９）および
ＴＣＣＣＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＡＣＴ（配列番号１０）。
（６）イグサの品種を識別する方法であって、以下の工程を包含する、方法：
（ａ）項３に記載のプライマー対を用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
（７）前記プライマー対が、以下の１）から５）の組み合わせの少なくとも１つを含む、項６に記載の識別方法：
１）ＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴ（配列番号１）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー、ならびに
ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー；
２）ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー、ならびに
ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴ（配列番号４）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー；
３）ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー、ならびに
ＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号６）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー；
４）ＧＴＴＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣ（配列番号７）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー、ならびに
ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＡ（配列番号８）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー；
５）ＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＣＴ（配列番号９）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー、ならびに
ＴＣＣＣＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＡＣＴ（配列番号１０）にて示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー；あるいは
該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマー。
（８）前記プライマー対が、以下の１）から５）の組み合わせの少なくとも１つを含む、項７に記載の識別方法：
１）ＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴ（配列番号１）および
ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）；
２）ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）および
ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴ（配列番号４）；
３）ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）および
ＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号６）；
４）ＧＴＴＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣ（配列番号７）および
ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＡ（配列番号８）；
５）ＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＣＴ（配列番号９）および
ＴＣＣＣＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＡＣＴ（配列番号１０）。
（９）前記プライマー対が少なくとも２つである、項６から８のいずれか一項に記載の識別方法。
（１０）前記プライマー対が少なくとも３つである、項９に記載の識別方法。
（１１）前記プライマー対が少なくとも４つである、項９に記載の識別方法。
（１２）イグサから試料ＤＮＡを抽出する工程をさらに包含する、項６から１１のいずれか一項に記載の方法。
本発明により、イグサの主要品種を識別するための実用的なＤＮＡマーカーが提供された。また、該ＤＮＡマーカーを指標としたイグサ品種の識別方法が提供された。
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。必要に応じて、プライマーは、デオキシイノシン残基で置換された塩基を含む。
用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
本件明細書においてヌクレオチドを１文字表記する場合、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを示す。
本明細書において、「断片」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。断片の長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上（例えば、５００〜１０００もの長さのヌクレオチド長も含まれ得る）のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
本明細書において使用する場合、用語「プライマー」とは、適切な条件下（例えば、４つの異なるヌクレオシド三リン酸およびポリメライゼーション剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素）の存在下）で、適切な緩衝液中で、そして適切な温度において、鋳型指向性のＤＮＡ合成を開始する点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図される使用に依存する。本発明のプライマーは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さであり、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチドである。プライマーは、代表的には、４０ヌクレオチド未満であり得、好ましくは、３０ヌクレオチド未満であり得る。さらに好ましくは、本発明のプライマーは、長さが２０〜２５ヌクレオチドの範囲であり得る。短いプライマー分子は、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、一般により低い温度を必要とする。プライマーは、鋳型の正確な配列に完全にマッチする必要はないが、鋳型とハイブリダイズするのに十分相補的であるべきである。用語「プライマー部位」とは、プライマーがハイブリダイズする標的である鋳型核酸の配列をいう。用語「プライマー対」とは、増幅される核酸配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマーおよび増幅されるその配列の３’末端の相補物とハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含む一組のプライマーをいう。
本明細書において、「プライマー」の３’末端から塩基を数える場合、「プライマーの３’末端から１番目の塩基」とは、３’末端の塩基をいう。従って、例えば、配列番号１の配列（５’−ＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴ−３’）を有するプライマーにおいて、「プライマーの３’末端から１番目の塩基」は「Ｔ」であり、「プライマーの３’末端から３番目の塩基」は「Ａ」である。
本明細書において、「プライマーの３’末端からＸ番目の塩基に対応する塩基」とは、プライマーが鋳型核酸とハイブリダイズした場合に、そのプライマーの３’末端から数えてＸ番目の位置の塩基がハイブリダイズする位置に存在する塩基をいう。また、プライマーの設計において、「（ある）塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列」とは、前者の（ある）塩基配列にアニールする（例えば、相補的な）塩基配列をいい、前者の（ある）塩基配列が、ＧＧである場合、「（ある）塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列」とはＣＣであり得る。
また、本明細書においては、核酸増幅反応として、例示的に用語「ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）」を用いているが、本発明の実施のためにＰＣＲ以外の核酸増幅反応も使用可能である。従って、本発明のプライマーが使用されるのは、ＰＣＲに限定されない。
本発明のプライマーを用いるＰＣＲにおける鋳型ＤＮＡの調製は、周知の種々の方法（例えば、ＣＴＢＡ法、ボイル法など）によって、細胞および組織などからＤＮＡ（好ましくは、ゲノムＤＮＡ）を調製することによって、行われ得る。
鋳型核酸としてＤＮＡ断片を使用する場合、鋳型核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを消化することによって、あるいはＰＣＲの使用によって、調製され得る。プライマーまたはプローブとしての使用のためのオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの化学合成の分野において公知の方法（非限定的例として、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２２：１８５９〜１８６２（１９８１））によって記載されるホスホロアミダイト法、およびＭａｔｔｅｕｃｃｉら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３：３１８５（１９８１））によって提供されるトリエステル法（両方を本明細書において参考として援用する）によって化学的に合成される。これらの合成は、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９〜６１６８（１９８４）において記載されるような自動合成機を使用し得る。オリゴヌクレオチドの精製は、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．およびＲｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍ、２５５：１３７〜１４９（１９８３））に記載されるように、未変性アクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによって行われ得る。次に、所望される場合、二本鎖断片は、適切な相補的な一本鎖の対を適切な条件下でアニールすることによってか、または適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を合成することによって、得られ得る。核酸プローブのための特定の配列が与えられる場合、相補的鎖もまた同定され、そして含まれることが理解される。その相補的鎖は、標的が二本鎖核酸である場合、同等に良く作用する。
合成オリゴヌクレオチドの配列または任意の核酸断片の配列は、ジデオキシチェーンターミネーション法またはマクサム−ギルバート法のいずれかを使用して得られ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８９）、本明細書において参考として援用する）。このマニュアルを、本明細書において、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら」という；「Ｚｙｓｋｉｎｄら（１９８８）」。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ」とは、オルソロガス遺伝子ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。
本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｗｉｌｅｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。
本発明は、イグサの品種を識別するためのプライマーを提供する。上述したように、プライマーの適切な長さは、プライマーの意図される使用に依存するが、本発明のプライマーは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さであり、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチドである。プライマーは、代表的には、４０ヌクレオチド未満であり得、好ましくは、３０ヌクレオチド未満であり得る。さらに好ましくは、本発明のプライマーは、長さが２０〜２５ヌクレオチドの範囲であり得る。
本発明のイグサの品種識別に有用なプライマーは、好ましくは、以下からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドである：ＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴ（配列番号１）；ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）；ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）；ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴ（配列番号４）；ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）；ＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号６）；ＧＴＴＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣ（配列番号７）；ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＡ（配列番号８）；ＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＣＴ（配列番号９）；およびＴＣＣＣＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＡＣＴ（配列番号１０）。
イグサ品種の識別は、イグサから抽出された試料ＤＮＡを、上記に示したようなプライマーを用いて増幅し、この増幅産物を検出することにより行われ得る。例えば、下記に示した実施例では、各配列番号に示される配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーとして用いて増幅反応を行って、他のイグサ品種と品種「ひのみどり」とにおいて明確に異なる結果が得られている。イグサ識別の手法および検出結果は実施例に限定されず、特定の品種（例えば、「ひのみどり」）においてのみ識別可能な結果が得られれば十分である。特定の品種（例えば、「ひのみどり」）においてのみ識別可能な結果が得られるに十分なオリゴヌクレオチドが、本発明の識別方法においてプライマーとして使用され得る。
プライマーは、鋳型とハイブリダイズするのに十分相補的であれば、鋳型の正確な配列に完全にマッチする必要はない。従って、各配列番号に示される配列を有するオリゴヌクレオチドに加えて、これら各配列番号に示される配列を有するオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、各配列番号に示される配列を有するオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド、およびそれらの断片もまた、本発明の識別方法においてプライマーとして使用され得る。各配列番号に示される配列を有するオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位の配列は、各配列番号に示される配列の記載に基づいて当業者に認識され得、このようにして得られたプライマー部位の配列に基づいて、当該プライマー部位にハイブリダイズ可能であるように設計されたプライマーもまた、本発明の範囲内である。本発明のプライマーは、鋳型のプライマー部位にアニールして伸長し得ることが重要であり、そのようなプライマーの設計は、本明細書の記載に基づいて当業者の技術範囲内にて行われ得る。プライマーにより伸長する方向の３’末端領域（例えば、プライマーの３’末端から１番目から６番目以内までの塩基）が、該プライマーがアニールする鋳型と相補的であれば、プライマーを構成する他の塩基は必ずしも、該プライマーがアニールする鋳型とマッチしていなくてもよい。
上述したようなプライマーを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドもまた、本発明のプライマーとして使用され得る。ここで「由来し得る」とは、対応する対応鎖にハイブリダイズ可能であるように設計される塩基配列を有することをいう。ここで、「対応する対応鎖」とは、当該塩基配列とＤＮＡ二本鎖を形成するもう一方の鎖をいう。「対応する対応鎖」の塩基配列は、当該（ある）塩基配列に対して相補的である（例えば、ａに対してｔ、ｔに対してａ、ｇに対してｃ、ｃに対してｇである）ことが当業者には理解され得る。下述するように、当業者は、上述したようなプライマー（例えば、配列番号１から１０のいずれかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー）を用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅し、この増幅断片の塩基配列を決定し、その配列情報に基づいて、さらなるプライマーを設計し得る。このようなプライマーの適切な長さは、プライマーの意図される使用に依存するが、少なくとも１０ヌクレオチドの長さであり、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチドである。プライマーは、代表的には、４０ヌクレオチド未満であり得、好ましくは、３０ヌクレオチド未満であり得る。さらに好ましくは、本発明のプライマーは、長さが２０〜２５ヌクレオチドの範囲であり得る。このさらなるプライマーは、配列番号１から１０のいずれかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがアニールする鋳型のプライマー部位と同じ領域にアニールするか、または異なる領域にアニールして、伸長反応を生じさせるものであり得る。
さらに、上記プライマーは、対として使用し得る。好ましくは、上記プライマーは、以下のようにプライマー対を形成し得る：
ＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴ（配列番号１）および
ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）；
ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）および
ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴ（配列番号４）；
ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）および
ＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号６）；
ＧＴＴＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣ（配列番号７）および
ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＡ（配列番号８）；
ＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＣＴ（配列番号９）および
ＴＣＣＣＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＡＣＴ（配列番号１０）。各対におけるプライマーの対応関係を明確にするために、各配列番号に示した配列のみを記載したが、各配列番号に示される配列を有するオリゴヌクレオチドに加えて、これら各配列番号に示される配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド、およびそれらの断片もまた、プライマー対のプライマーとして使用され得る。上述したようなプライマーを用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドもまた、本発明のプライマー対のプライマーとして使用され得る。プライマーの長さおよび構成は、上述したとおりである。
１つの実施形態において、本発明のプライマーのＴｍは、３４℃〜８０℃であり得る。好ましくは５０℃以上、なお好ましくは、５５℃以上、より好ましくは、６０℃以上であり、そして、６５℃以上、７０℃以上のＴｍを有するプライマーも使用可能である。
本発明は、イグサの品種を識別する方法を提供する。本方法は、上記プライマー対を用いて実施され得る。本方法は、（ａ）上記プライマー対を用いて、イグサのＤＮＡ試料を増幅させる工程；および（ｂ）該増幅産物を検出する工程を包含する。好ましい実施形態では、本発明の方法によって、イグサ品種間で品種「ひのみどり」を識別することができる。
上述したように、本明細書においては、核酸増幅反応として、例示的に用語「ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）」を用いているが、本発明の実施のためにＰＣＲ以外の核酸増幅反応も使用可能である。本発明の識別方法において、好ましくは、増幅工程は、ＰＣＲによって行われ得る。
上記プライマー対を用いてイグサのＤＮＡ試料を増幅させて得られた増幅産物の検出の結果より、イグサ品種間で品種を識別することができる。ＳＳＲマーカーは、ゲノムＤＮＡ中の遺伝子をコードしていない非コード領域に主に見られる単純反復配列（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）を利用し、ＳＳＲの反復回数が種系統間で異なる性質に基づいて品種系統を識別する方法である。本発明のプライマー対は、単純反復配列（例えば、ＣＴまたはＧＡの反復）を含む領域を増幅するものであり得る。
当業者は、上述のプライマー対（例えば、配列番号１および２；３および４；５および６；７および８；９および１０の組み合わせのプライマー対）を用いたイグサの試料ＤＮＡの増幅断片の解析、増幅断片の塩基配列の決定、およびさらなるプライマーの設計を、商業的に入手可能なまたは公に利用可能なプログラムを用いて行い得る。例えば、プライマー設計ソフトウェアＰｒｉｍｅｒ３をデフォルトにて使用することによって行い得る。
例えば、配列番号５および配列番号６のプライマー組み合わせを用いて、プライマー設計ソフトウェアＰｒｉｍｅｒ３（ＭＩＴのＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌから配布されている）をデフォルトにて使用した場合、増幅産物と同等の配列として以下の配列が得られ得る（以下、「２−０７Ｇ」と称する）：ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡＴ（ＣＴ）ｎＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＣＡＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＣＧＡＧＧＡＡＡＡＴＴＡＴＣＧＴ（ここで、下線を付した配列は、配列番号５および配列番号６のプライマーのプライマー部位に相当する；ｎは整数であり、この値は、品種毎に異なり得、「ひのみどり」では、ｎ＝１８であり得る（この場合の配列を、配列番号１１にて示す）。この場合、プライマー対は、各々のプライマーが、（ＣＴ）ｎ（あるいは対応する（ＧＡ）ｎ）でなる領域を挟み込むような部位にアニールするように設計され得る。配列番号５または６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがアニールする鋳型のプライマー部位と同じ領域にアニールするプライマー、および異なる領域にアニールするプライマーの両方が、本発明のプライマーとして用いられ得る。配列番号５または６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがアニールする鋳型のプライマー部位から単純反復配列に隣接するまでの任意の領域にアニールするプライマーもまた、本発明のプライマーの範囲内であり、そのようなプライマーの設計は当業者の範囲内で実施され得る。本発明のプライマーは、配列番号５および６のそれぞれに示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのプライマー対により増幅される単純反復配列を含む領域を増幅し得る限り、配列番号１または２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがアニールする鋳型のプライマー部位からこの単純反復配列に対して遠ざかる側の領域（すなわち、当該プライマー部位から５’末端側のゲノムＤＮＡにおける任意の領域）に由来し得る配列もまた有し得る。ゲノム中に散在する、単純反復配列により示されるマイクロサテライトＤＮＡと、プライマー対との連鎖を考慮して、このようなプライマーの設計も当業者の範囲内であり得る。
プライマー設計上の注意事項は当業者には周知である。プライマーの長さについては上述したとおりであり、プライマーのＧＣ含量は、極端になることを避けるべきである（例えば、このＧＣ含量は４０〜６０％であり得る）。また、プライマー対によるプライマーダイマーの形成、プライマーの分子内高次構造の形成、プライマー対の5'末端配列の相補性などを、プライマー設計の際に考慮に入れるべきであることは、当業者には周知である。
同様に、配列番号３および配列番号４のプライマー組み合わせを用いて、プライマー設計ソフトウェアＰｒｉｍｅｒ３をデフォルトにて使用した場合、増幅産物と同等の配列として以下の配列が得られ得る（以下、「２−０７Ｆ」と称する）：ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＡ（ＧＡ）ｎＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＣＡＣＣＧＴＴＡＧＧＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧ（ここで、下線を付した配列は、配列番号３および配列番号４のプライマーのプライマー部位に相当する；ｎは整数であり、この値は、品種毎に異なり得、「ひのみどり」では、ｎ＝２０であり得る（この場合の配列を、配列番号１２にて示す））。この場合もまた、プライマー対は、各々のプライマーが、（ＧＡ）ｎ（あるいは対応する（ＣＴ）ｎ）でなる領域を挟み込むような部位にアニールするように設計され得、本発明に使用し得るプライマーについての上記の配列番号５および配列番号６の説明が配列番号３および配列番号４の組み合わせの場合にも適用され得る。
配列番号１および配列番号２、配列番号７および配列番号８、ならびに配列番号９および配列番号１０の組み合わせにおいても、同様にして増幅産物と同等の配列を得ることができ、そしてプライマーの設計に関しても同様に、上記の配列番号５および配列番号６の説明が適用され得る。このようにして設計されたプライマーは、下記の実施例２と実質的に同等の条件下で増幅反応を行うとき、各プライマー対における各実施例２の結果と実質的に同等の結果を示しえる。下記の実施例２と実質的に同等の条件下で増幅反応を行うとき、各プライマー対における各実施例２の結果と実質的に同等の結果を示しえるように設計されるプライマーもまた、本発明の範囲内である。
本発明の識別方法は、イグサから試料ＤＮＡを抽出する工程をさらに包含し得る。本発明の識別方法にて品種を識別するための供試材料としては、イグサの植物体（例えば、茎）および加工されたイグサ製品（例えば、畳）のいずれもが用いられ得る。このような材料から当業者に周知の方法（例えば、上述したＣＴＢＡ法、ボイル法など）によってＤＮＡが抽出され得る。例えば、畳表製品からのサンプルの採取は、「裏毛」からとることになり得るが、イグサ植物体の株基と先端部とを見分けて、先端部から抽出することが望ましい。株基は原草を乾燥させる際に熱源に近い位置にあるため、ＤＮＡの分解が進んでいることが多い。しかし、本明細書中のいずれの方法も２００〜３００塩基対程度の短い配列を標的としたＰＣＲ法に基づき得るので、株基のようなＤＮＡの断片化したサンプルにも適用可能である。また、一つの畳表製品が単一の品種である保証は無いため、一つの製品について１６〜３２点程度のサンプリングを行うことが望ましい。
本発明におけるＰＣＲ反応において使用される鋳型としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。本発明において使用される鋳型は、天然から単離された状態であっても、単離された後に酵素などによって処理されたものあってもよい。鋳型を処理する酵素としては、逆転写酵素、制限酵素、ポリメラーゼなどが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明において使用されるプライマーは、例えば、放射性物質、蛍光物質などによって標識されていてもよい。
ＰＣＲ産物を検出する方法としては、電気泳動、リアルタイムＰＣＲ検出装置が挙げられるがこれに限定されない。
ＰＣＲ反応のためには、周知または市販の種々の酵素を使用しうる。また、ＰＣＲ反応の条件は周知である。
本発明の識別方法の１つの実施形態では、本発明のプライマー対を単一で用い得る。本発明の識別方法の別の実施形態では、本発明のプライマー対を少なくとも２つで用い得る。本発明の識別方法では、本発明のプライマー対を、少なくとも３つ、または少なくとも４つでも用い得る。プライマー対の組み合わせは任意であり得る。
本発明のプライマーはまた、イグサの品種の識別のためのキットの構成要素にもなり得る。キットは、上述したようなプライマー対を少なくとも１つ備え得る。このようなキットはさらに、イグサの品種の識別のための手順を記載した説明書もまた備え得る。キットはさらに、上述したようなイグサの品種の識別方法において好適に使用するために用いられ得る他の任意の成分もまた備え得る。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
＜実施例１：ＤＮＡの抽出および定量＞
表１．供試した品種
品種ＩＤ
品種名

１
ひのみどり

２
下増田在来

３
しらぬい

４
岡山３号

５
岡山みどり

６
さざなみ

７
きよなみ

８
ふくなみ

９
岡山Ｆ系

１０
くまがわ

１１
文政在来

１２
筑後みどり

１３
高須在来

１４
千丁在来

１５
あさなぎ

１６
大原四号

品種ＩＤ 品種名
材料は「ひのみどり」を含むイグサ品種１６品種（上記の表１）よりＣＴＡＢ法によって抽出したゲノムＤＮＡである。サンプルを、乾燥茎１本単位で製品当たり２０本程度で採取した。サンプルは、乾燥茎１本当たり長さ３〜４ｃｍの茎の先端部を採取した。
サンプルのＤＮＡの抽出および定量は、以下のようにして行った。
本法は、植物ＤＮＡの抽出に汎用されているＣＴＡＢ法を一部改変したものである。植物体の粉砕を粉砕装置ＦＰ−１２０を使用して密閉したチューブ内で行った。
使用した機器および試薬は以下の通りである：
・フナコシ，ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ−１２０
・ウォーターバスまたはヒートブロック（５５℃，４２℃）
・振とう装置
・ジルコニア・ビーズ（φ５ｍｍ）
・２ｍｌ サンプルチューブ（スクリューキャップ付きのもの）
・１．５ｍｌ サンプルチューブ
・ＣＴＡＢ抽出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ ８．０，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，１．４Ｍ ＮａＣｌ，１％ ＣＴＡＢ）
・β−メルカプトエタノール
・プロテナーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）
・ＰＶＰＰ（ポリビニルポリピロリドン，不溶性）
・ＰｒｏＣｉｐｉｔａｔｅ（ＬｉｇｏＣｈｅｍ社製品，エア・ブラウン社取り扱い）
・イソプロピルアルコール
・８０％ エタノール
・ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ ７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ）
・ＲＮａｓｅＡ（日本ジーン，２０ｍｇ／ｍｌ）。
（サンプルの粉砕）
ジルコニア・ビーズ１個と２０ｍｇのＰＶＰＰをチューブに入れた。畳表の裏毛１本を長さ５−６ｍｍ程度に切断し、サンプルチューブに入れた。このチューブをＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ−１２０にセットし、速度５．５で、３５秒間粉砕した。このチューブを遠心機にセットして１３，０００ｒｐｍ、１５秒間スピンダウンした。
（ＤＮＡの抽出）
使用直前にサンプル１点あたり７００μｌのＣＴＡＢ抽出バッファーに７μｌ β−メルカプトエタノール、３．５μｌプロテナーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）をあらかじめ加えた。サンプル１点あたり、上記のように調製した７００μｌのＣＴＡＢ抽出バッファー／β−メルカプトエタノール／プロテナーゼＫを加えよく混合した。５５℃にセットしたウォーターバスにチューブを入れて、１時間加温した。その間、２０〜３０分に１回程度攪拌した。チューブを室温まで冷まし、７００μｌのＣＩＡＡを加えて３０分間振盪した。このチューブを微量高速遠心器で４℃、１３，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した。
新しいサンプルチューブに上清４００μｌを移した。９６穴クラスターチューブを用いてもよいが、本実施例では、サンプルチューブを用いた。この新しいサンプルチューブに２４０μｌのイソプロピルアルコールを加え、これを攪拌し、完全に混和させた。チューブを室温で３０分から一晩静置した。微量高速遠心器で室温、１４，０００ｒｐｍ、１５分間、遠心分離した。次いで、上清をデカンテーションで捨てた。チューブを数秒間遠心して、上清を集め、ピペットで完全に捨てた。８００μｌの７０〜８０％エタノールを加えチューブの内壁を洗浄した。次いで、このチューブを微量高速遠心器で室温、１４，０００ｒｐｍ、５分間、遠心分離した。次いで、上清をデカンテーションで捨てた。チューブを微量高速遠心器で数秒間遠心して、上清を集め、ピペットで完全に捨てた。
ここで、上記の工程において、９６穴クラスターチューブを用いる場合は、以下のようにして行う。２４０μｌのイソプロピルアルコールを加えて完全に混和し、そしてこれを室温で３０分から一晩静置した後、次のように実施する。クラスターチューブを多本架遠心器で，３，０００ｒｐｍ、５０分間遠心分離し、上清をデカンテーションまたはアスピレーターで吸引する。上清を捨てた後，チューブを反転させて多本架遠心器で８００ｒｐｍ，３０秒間遠心する。８００μｌの７０〜８０％エタノールを加えチューブの内壁を洗う。クラスターチューブを多本架遠心器で、３，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離する。次いで、上清をデカンテーションまたはアスピレーターで吸引する。上清を捨てた後，チューブを反転させて多本架遠心器で８００ｒｐｍ、３０秒間遠心する。
上清を集め、ピペットで完全に捨てた後、チューブの蓋を開けて、室温で１０分間乾燥させた。これは、５分間の減圧乾燥でもよい。
ＲＮａｓｅ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）をＴＥ緩衝液で１０，０００倍に希釈した。このようにＴＥ緩衝液で希釈された５０μｌのＲＮａｓｅ溶液を加え，攪拌，微量高速遠心器でスピンダウンした。４２℃のウォーターバスで１時間加温した。上記のようにして得られたＤＮＡ抽出サンプルを冷蔵庫で保存した。この方法で抽出したＤＮＡの濃度は１００〜４００ｎｇ／μｌの高濃度であった。
（ゲノムＤＮＡの定量）
ＰＣＲの結果を安定させるためには，蛍光光度計またはアガロースゲルを使用してＤＮＡを定量することが好ましい。本実施例では、蛍光光度計を使用してＤＮＡ濃度を測定した。
用いた機器および試薬は以下の通りである：
蛍光光度計（日立 Ｆ−４０１０）
蛍光色素 Ｈ３３２５８（１ｍｇ／ｍｌ）
ＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）
λ−ＤＮＡ（３０ｍｇ／ｍｌ）。
０．１μｇ／ｍｌのＨ３３２５８を含むＴＮＥ緩衝液をサンプル１点あたり２ｍｌ用意した。石英セルに、用意した２ｍｌのＨ３３２５８／ＴＮＥを入れた。まず、ブランクを測定し、標準液としてブランクに２μｌのλ−ＤＮＡを加えて測定した。石英セルに、用意した２ｍｌのＨ３３２５８／ＴＮＥを入れ、２μｌの試料を加え測定した。測定値が表示される。
なお、以下にアガロースゲルを使用した場合の測定法を述べる。
用いられる機器および試薬は以下の通りである：
λ−ＤＮＡ（３０ｍｇ／ｍｌ）
ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）
アガロースゲル（０．８〜１．０％）
臭化エチジウム水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）
トランスイルミネーター
ポラロイドＭＰ−４カメラあるいはデジタルカメラ
ローディングダイ。
０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む０．８−１．０％のアガロースゲルを準備する。次いで、λ−ＤＮＡをＴＥ緩衝液で希釈して１０ｎｇ／μｌの標品を作る。アガロースゲルに１レーンあたり１０、２０、３０、４０、５０ｎｇのλ−ＤＮＡ標品をアプライする。アガロースゲルに５倍希釈したサンプルを２μｌアプライする。１００Ｖで５分間泳動する。トランスイルミネーター上で写真をとる。写真上のサンプルのバンドの濃さを標準品のものと比較して濃度を判定する。
＜実施例２：単一のＳＳＲプライマー対を用いるイグサ品種の識別＞
使用した機器および試薬は以下の通りである：
ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標） ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＡＢＩ）
安定化電源（２００Ｖ定電圧で電気泳動できるもの）
サブマリン電気泳動槽
１．５ｍｌサンプルチューブ
ＰＣＲチューブ
一対のプライマー
Ｅｘ−Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社）
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ
アガロース（ＡＭＲＥＳＣＯ製，ＳＦＲアガロース，エムエステクノシステムズ社取扱）
１×ＴＢＥ緩衝液（１０×ＴＢＥ緩衝液を希釈）
ローディングダイ。
＜実施例２Ａ＞
実施例１において抽出したＤＮＡ溶液５０〜８０ｎｇをＰＣＲ用の作業液として用いた。このＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度を３０ｎｇ／μｌ程度にした。
１．５ｍｌサンプルチューブに、以下に示したＰＣＲ反応液を調製した（２０μｌ×１６本分強、３３０μｌ）：
１０×ＥＸ−Ｔａｑ 緩衝液 ３３μｌ
２．５ｍＭｄＮＴＰ ２６．４μｌ
Ｅｘ−Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ） １．６５μｌ
プライマーＬ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ） ９．９μｌ
プライマーＲ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ） ９．９μｌ
ｄＨ２Ｏ 総容量が３３０μｌとなるように加える。
本実施例では、以下のプライマー対を使用した：
プライマーＬ：ＢＧＡ２９Ｌ（ＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＣＴ（配列番号９）：塩基数２２）；
プライマーＲ：ＢＧＡ２９Ｒ（ＴＣＣＣＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＡＣＴ（配列番号１０）：塩基数２２）。
調製したＰＣＲ反応液をチューブミキサーでよく撹拌し，スピンダウンした。このＰＣＲ反応液を１８μｌずつＰＣＲチューブに分注した。次いで、ＤＮＡ溶液２μｌを各ＰＣＲチューブに加えた。ＰＣＲサイクルは、以下の通りである：（９６℃ ２分；９６℃ ５秒、５８℃ １５秒、および７２℃ ３０秒を３０回繰り返す；７２℃ ２分間；４℃ ∞）。これに３μｌの６×ローディングバッファーを添加し、良く混ぜた。この６μｌを４％アガロースゲルにアプライして１５０Ｖで１００分程度電気泳動を行い、１／１０，０００ Ｇｅｌｓｔａｒ溶液に３０分間浸漬し、紫外線下でＤＮＡ断片の泳動像を撮影した。
電気泳動の結果を図１Ａに示す（ＢＧＡ２９マーカー）。図中のレーンは以下の通りである：Ｍ：１００ｂｐラダー、１：「ひのみどり」、２：下増田在来、３：しらぬい、４：岡山３号、５：岡山みどり、６：さざなみ、７：きよなみ、８：ふくなみ、９：岡山Ｆ系、１０：くまがわ、１１：文政在来、１２：筑後みどり、１３：高須在来、１４：千丁在来、１５：あさなぎ、１６：大原四号。バンドが見られた位置に矢印を示した。図１Ａに見られるように、ひのみどりでは２本のバンドが見られ、他方その他の品種では３本のバンドが見られた。従って、本プライマー対を用いるＰＣＲによって、ひのみどりを識別できることが示された。
＜実施例２Ｂ＞
以下に示すプライマー対を用いたことを除いて、ＰＣＲおよび電気泳動は実施例２Ａと同様に行った。本実施例で使用したプライマーは以下の通りである：
プライマーＬ：１−０５ＡＬ（ＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴ（配列番号１）：塩基数２５）；
プライマーＲ：１−０５ＡＲ（ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）：塩基数２５）。
本実施例における電気泳動の結果を図１中のＢに示す（１−０５Ａマーカー）。図中のレーンは、図１のＡで説明したとおりである。バンドが見られた位置に矢印を示した。図１Ｂに見られるように、ひのみどりでは２本のバンドが見られ、他方その他の品種では３本のバンドが見られた。従って、本プライマー対を用いるＰＣＲによって、ひのみどりを識別できることが示された。
＜実施例２Ｃ＞
以下に示すプライマー対を用いたことを除いて、ＰＣＲおよび電気泳動は実施例２Ａと同様に行った。本実施例で使用したプライマーは以下の通りである：
プライマーＬ：ＢＧＡ２０ＡＬ（ＧＴＴＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣ（配列番号７：塩基数２２）；
プライマーＲ：ＢＧＡ２０ＡＲ（ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＡ（配列番号８）：塩基数２５）。
本実施例における電気泳動の結果を図１中のＣに示す（ＢＧＡ２０Ａマーカー）。図中のレーンは、図１のＡで説明したとおりである。バンドが見られた位置に矢印を示した。図１Ｃに見られるように、ひのみどりでは２本のバンドが見られ、他方その他の品種では３本のバンドが見られた。従って、本プライマー対を用いるＰＣＲによって、ひのみどりを識別できることが示された。
＜実施例２Ｄ＞
以下に示すプライマー対を用いたことを除いて、ＰＣＲおよび電気泳動は実施例２Ａと同様に行った。本実施例で使用したプライマーは以下の通りである：
プライマーＬ：２−０７ＦＬ（ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）：塩基数２５）；
プライマーＲ：２−０７ＦＲ（ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴ（配列番号４）：塩基数２５）。
本実施例における電気泳動の結果を図１中のＤに示す（２−０７Ｆマーカー）。図中のレーンは、図１のＡで説明したとおりである。バンドが見られた位置に矢印を示した。図１Ｄに見られるように、ひのみどりでは２本のバンドが見られ、他方その他の品種では３本のバンドが見られた。従って、本プライマー対を用いるＰＣＲによって、ひのみどりを識別できることが示された。
＜実施例２Ｅ＞
以下に示すプライマー対を用いたことを除いて、ＰＣＲおよび電気泳動は実施例２Ａと同様に行った。本実施例で使用したプライマーは以下の通りである：
プライマーＬ：２−０７ＧＬ（ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）：塩基数２３）；
プライマーＲ：２−０７ＧＲ（ＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号６）：塩基数２５）。
本実施例における電気泳動の結果を図１中のＥに示す（２−０７Ｇマーカー）。図中のレーンは、図１のＡで説明したとおりである。バンドが見られた位置に矢印を示した。図１Ｅに見られるように、ひのみどりでは１本のバンドが見られ、他方その他の品種では２本のバンドが見られた。従って、本プライマー対を用いるＰＣＲによって、ひのみどりを識別できることが示された。
＜実施例３：複数のＳＳＲプライマー対を用いるイグサ品種の識別＞
使用した機器および試薬は上記の実施例２と同様である。
実施例１において抽出したＤＮＡ溶液５０〜８０ｎｇをＰＣＲ用の作業液として用いた。このＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度を３０ｎｇ／μｌ程度にした。
１．５ｍｌサンプルチューブに、以下に示したＰＣＲ反応液を調製した（２０μｌ×１６本分強、３３０μｌ）。
１０×ＥＸ−Ｔａｑ 緩衝液 ３３μｌ
２．５ｍＭｄＮＴＰ ２６．４μｌ
Ｅｘ−Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ） １．６５μｌ
プライマー２−０７ＧＬ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ） ９．９μｌ
プライマー２−０７ＧＲ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ） ９．９μｌ
プライマー２−０７ＦＬ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ） ５．９４μｌ
プライマー２−０７ＦＲ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ） ５．９４μｌ
プライマー１−０５ＡＬ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ） ５．９４μｌ
プライマー１−０５ＡＲ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ） ５．９４μｌ
プライマーＢＧＡ２９Ｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ） ９．９μｌ
プライマーＢＧＡ２９Ｒ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ） ９．９μｌ
ｄＨ２Ｏ １７３．５９μｌ。
本実施例で使用したプライマー２−０７ＧＬ、２−０７ＧＲ、２−０７ＦＬ、２−０７ＦＲ、１−０５ＡＬ、１−０５ＡＲ、ＢＧＡ２９ＬおよびＢＧＡ２９Ｒは、実施例２に示したものと同じである。
調製したＰＣＲ反応液をチューブミキサーでよく撹拌し，スピンダウンした。このＰＣＲ反応液を１８μｌずつＰＣＲチューブに分注した。次いで、ＤＮＡ溶液２μｌを各ＰＣＲチューブに加えた。ＰＣＲサイクルは、以下の通りである：（９６℃ ２分；９６℃ ５秒、５８℃ １５秒、および７２℃ ３０秒を３０回繰り返す；７２℃ ２分間；４℃ ∞）。これに３μｌの６×ローディングバッファーを添加し、良く混ぜた。この６μｌを４％アガロースゲルにアプライして１５０Ｖで１００分程度電気泳動を行い、１／１０，０００ Ｇｅｌｓｔａｒ溶液に３０分間浸漬し、紫外線下でＤＮＡ断片の泳動像を撮影した。電気泳動用の緩衝液には１×ＴＢＥを，アガロースゲルにはＡＭＲＥＳＣＯ社のＳＦＲアガロースを使用した。ここで使用した４％アガロースゲルは，短鎖ＤＮＡの分離用に調製されたＡＭＲＥＳＣＯ社のＳＦＲアガロースであった。
４種のマーカー（２−０７Ｇ、２−０７Ｆ、１−０５Ａ、ＢＧＡ２９）でマルチプレックスＰＣＲを行った場合の電気泳動の結果を図２に示す。図２中のレーンは以下の通りである：レーンＭ：１００ｂｐラダー、レーン１：「ひのみどり」、２：下増田在来、３：しらぬい、４：岡山３号、５：岡山みどり、６：さざなみ、７：きよなみ、８：ふくなみ、９：岡山Ｆ系、１０：くまがわ、１１：文政在来、１２：筑後みどり、１３：高須在来、１４：千丁在来、１５：あさなぎ、１６：大原四号。バンドが見られた位置に矢印を示した。図２に見られるように、マルチプレックスＰＣＲによって、「ひのみどり」では４本程度の明瞭なバンドが現れるが、他の品種では１０本程度のバンドが現れた。従って、マルチプレックスＰＣＲによって、ひのみどりを識別できることが示された。
＜実施例４＞
本実施例は、実施例２にて使用したプライマー対によって増幅され得る増幅断片に基づいて、さらなるプライマーの設計例を示す。
プライマー設計ソフトウェア「Ｐｒｉｍｅｒ３」（ＭＩＴのＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌから配布されている）をデフォルトにて用いて、２−０７ＦＬおよび２−０７ＦＲのプライマー対、ならびに２−０７ＧＬおよび２−０７ＧＲのプライマー対によって増幅され得た増幅断片を増幅し得る、さらなるプライマー対の設計を行ったところ、以下のプライマーの組み合わせが得られた。プライマーの長さは、至適長さ２５ヌクレオチドとした。Ｔｍはいずれも約６０℃〜約６８℃であり、ＧＣ含量は、約４０％〜約５５％であった。
（プライマー対１）
２−０７ＦＬ ：ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）
２−０７ＦＲａ：ＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴＣ（配列番号１３）；
（プライマー対２）
２−０７ＦＬ ：ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）
２−０７ＦＲｂ：ＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴＣ（配列番号１４）；
（プライマー対３）
２−０７ＦＬａ：ＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号１５）
２−０７ＦＲ ：ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴ（配列番号４）；
（プライマー対４）
２−０７ＦＬ ：ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）
２−０７ＦＲｃ：ＧＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧ（配列番号１６）；
（プライマー対５）
２−０７ＧＬ ：ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）
２−０７ＧＲａ：ＧＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧ（配列番号１７）；
（プライマー対６）
２−０７ＧＬ ：ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）
２−０７ＧＲｂ：ＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡＡ（配列番号１８）；
（プライマー対７）
２−０７ＧＬａ：ＧＴＧＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴ（配列番号１９）
２−０７ＧＲ ：ＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号６）；
（プライマー対８）
２−０７ＧＬａ：ＧＴＧＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴ（配列番号１９）
２−０７ＧＲａ：ＧＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧ（配列番号１７）。
プライマー対１〜４においては、「２−０７Ｆ」中の単純反復配列（ＧＡ）でなる領域を挟み込むように設計されている。プライマー対５〜８においては、「２−０７Ｇ」中の単純反復配列（ＣＴ）でなる領域を挟み込むように設計されている。
イグサの鋳型ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、および電気泳動については、実施例２と同様に行い得る。プライマー対１〜４においては、実施例２Ｄと同様の結果が得られ得る。プライマー対５〜８においては、実施例２Ｅと同様の結果が得られ得る。
ＤＮＡマーカーを指標としたイグサ品種の識別方法が提供された。本発明のイグサ品種の識別方法は、ＤＮＡ情報の品種間での違いを反映しているため、従来のような量的形質で識別する方法とは異なり、イグサの生育環境に影響されることはない。また、簡単に再現性の高い結果が得られるので、品種識別の誤認の可能性は低く、正確な品種判定を簡便・高速に実施できる。従って、本発明は、イグサの品種識別に多大な貢献をしうるものである。
単一のＳＳＲプライマー対を用いるイグサ品種の識別における電気泳動の結果を示す写真である。 複数のＳＳＲプライマー対を用いるイグサ品種の識別における電気泳動の結果を示す写真である。

Claims (12)

  1. イグサ「ひのみどり」の品種識別に有用なプライマー対であって、以下の１）〜１３）：
    １）ＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴ（配列番号１）および
    ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）；
    ２）ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）および
    ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴ（配列番号４）；
    ３）ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）および
    ＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号６）；
    ４）ＧＴＴＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣ（配列番号７）および
    ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＡ（配列番号８）；
    ５）ＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＣＴ（配列番号９）および
    ＴＣＣＣＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＡＣＴ（配列番号１０）；
    ６）ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）および
    ＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴＣ（配列番号１３）；
    ７）ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）および
    ＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴＣ（配列番号１４）；
    ８）ＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号１５）および
    ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴ（配列番号４）；
    ９）ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）および
    ＧＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧ（配列番号１６）；
    １０）ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）および
    ＧＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧ（配列番号１７）；
    １１）ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）および
    ＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡＡ（配列番号１８）；
    １２）ＧＴＧＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴ（配列番号１９）および
    ＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号６）；ならびに
    １３）ＧＴＧＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴ（配列番号１９）および
    ＧＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧ（配列番号１７）
    からなる群より選択される、プライマー対。
  2. イグサ「ひのみどり」の品種識別に有用なプライマー対であって、以下のｉ）〜ｘｉｉｉ）：
    ｉ）ＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴ（配列番号１）の全長または断片および
    ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）の全長または断片；
    ｉｉ）ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）の全長または断片および
    ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴ（配列番号４）の全長または断片；
    ｉｉｉ）ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）の全長または断片および
    ＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号６）の全長または断片；
    ｉｖ）ＧＴＴＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣ（配列番号７）の全長または断片および
    ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＡ（配列番号８）の全長または断片；
    ｖ）ＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＣＴ（配列番号９）の全長または断片および
    ＴＣＣＣＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＡＣＴ（配列番号１０）の全長または断片；
    ｖｉ）ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）の全長または断片および
    ＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴＣ（配列番号１３）の全長または断片；
    ｖｉｉ）ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）の全長または断片および
    ＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴＣ（配列番号１）の全長または断片；
    ｖｉｉｉ）ＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号１５）の全長または断片および
    ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴ（配列番号４）の全長または断片；
    ｉｘ）ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）の全長または断片および
    ＧＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧ（配列番号１）の全長または断片；
    ｘ）ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）の全長または断片および
    ＧＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧ（配列番号１７）の全長または断片；
    ｘｉ）ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）の全長または断片および
    ＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡＡ（配列番号１８）の全長または断片；
    ｘｉｉ）ＧＴＧＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴ（配列番号１９）の全長または断片および
    ＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号６）の全長また
    は断片；ならびに
    ｘｉｉｉ）ＧＴＧＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴ（配列番号１９）の全長または断片および
    ＧＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧ（配列番号１７）の全長または断片
    からなる群より選択され、
    該各々の断片が少なくとも１７ヌクレオチドの長さである、プライマー対。
  3. 前記断片が２０〜２５ヌクレオチドの長さである、請求項２に記載のプライマー対。
  4. イグサ「ひのみどり」の品種識別に有用なプライマー対であって、以下のａ）〜ｍ）：
    ａ）ＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴ（配列番号１）およびＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）を用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
    該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるＣＴ反復またはＧＡ反復を、ＰＣＲサイクル（９６℃ ２分；９６℃ ５秒、５８℃ １５秒、および７２℃ ３０秒を３０回繰り返す；７２℃ ２分間）により増幅可能である、プライマー対；
    ｂ）ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）およびＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴ（配列番号４）を用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
    該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるＣＴ反復またはＧＡ反復を、ＰＣＲサイクル（９６℃ ２分；９６℃ ５秒、５８℃ １５秒、および７２℃ ３０秒を３０回繰り返す；７２℃ ２分間）により増幅可能である、プライマー対；
    ｃ）ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）およびＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号６）を用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
    該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるＣＴ反復またはＧＡ反復を、ＰＣＲサイクル（９６℃ ２分；９６℃ ５秒、５８℃ １５秒、および７２℃ ３０秒を３０回繰り返す；７２℃ ２分間）により増幅可能である、プライマー対；
    ｄ）ＧＴＴＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣ（配列番号７）およびＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＡ（配列番号８）を用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
    該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるＣＴ反復またはＧＡ反復を、ＰＣＲサイクル（９６℃ ２分；９６℃ ５秒、５８℃ １５秒、および７２℃ ３０秒を３０回繰り返す；７２℃ ２分間）により増幅可能である、プライマー対；
    ｅ）ＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＣＴ（配列番号９）およびＴＣＣＣＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＡＣＴ（配列番号１０）を用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
    該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるＣＴ反復またはＧＡ反復を、ＰＣＲサイクル（９６℃ ２分；９６℃ ５秒、５８℃ １５秒、および７２℃ ３０秒を３０回繰り
    返す；７２℃ ２分間）により増幅可能である、プライマー対；
    ｆ）ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）およびＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴＣ（配列番号１３）を用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
    該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるＣＴ反復またはＧＡ反復を、ＰＣＲサイクル（９６℃ ２分；９６℃ ５秒、５８℃ １５秒、および７２℃ ３０秒を３０回繰り返す；７２℃ ２分間）により増幅可能である、プライマー対；
    ｇ）ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）およびＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴＣ（配列番号１４）を用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
    該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるＣＴ反復またはＧＡ反復を、ＰＣＲサイクル（９６℃ ２分；９６℃ ５秒、５８℃ １５秒、および７２℃ ３０秒を３０回繰り返す；７２℃ ２分間）により増幅可能である、プライマー対；
    ｈ）ＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号１５）およびＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＴ（配列番号４）を用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
    該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるＣＴ反復またはＧＡ反復を、ＰＣＲサイクル（９６℃ ２分；９６℃ ５秒、５８℃ １５秒、および７２℃ ３０秒を３０回繰り返す；７２℃ ２分間）により増幅可能である、プライマー対；
    ｉ）ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号３）およびＧＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＧ（配列番号１６）を用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
    該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるＣＴ反復またはＧＡ反復を、ＰＣＲサイクル（９６℃ ２分；９６℃ ５秒、５８℃ １５秒、および７２℃ ３０秒を３０回繰り返す；７２℃ ２分間）により増幅可能である、プライマー対；
    ｊ）ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）およびＧＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧ（配列番号１７）を用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
    該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるＣＴ反復またはＧＡ反復を、ＰＣＲサイクル（９６℃ ２分；９６℃ ５秒、５８℃ １５秒、および７２℃ ３０秒を３０回繰り返す；７２℃ ２分間）により増幅可能である、プライマー対；
    ｋ）ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号５）およびＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡＡ（配列番号１８）を用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
    該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるＣＴ反復またはＧＡ反復を、ＰＣＲサイクル（９６℃ ２分；９６℃ ５秒、５８℃ １５秒、および７２℃ ３０秒を３０回繰り返す；７２℃ ２分間）により増幅可能である、プライマー対；
    ｌ）ＧＴＧＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴ（配列番号１９）およびＡＣＧ
    ＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号６）を用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
    該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるＣＴ反復またはＧＡ反復を、ＰＣＲサイクル（９６℃ ２分；９６℃ ５秒、５８℃ １５秒、および７２℃ ３０秒を３０回繰り返す；７２℃ ２分間）により増幅可能である、プライマー対；ならびに
    ｍ）ＧＴＧＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴ（配列番号１９）およびＧＡＣＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧ（配列番号１７）を用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
    該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるＣＴ反復またはＧＡ反復を、ＰＣＲサイクル（９６℃ ２分；９６℃ ５秒、５８℃ １５秒、および７２℃ ３０秒を３０回繰り返す；７２℃ ２分間）により増幅可能である、プライマー対
    からなる群より選択され、各々のプライマーが少なくとも１７ヌクレオチドの長さである、プライマー対。
  5. 前記各々のプライマーが２０〜２５ヌクレオチドの長さである、請求項４に記載のプライマー対。
  6. 請求項１〜５のうちの一項に記載のプライマー対に含まれる、プライマー。
  7. イグサ「ひのみどり」の品種識別に有用なプライマー対の組み合わせであって、
    請求項１の１）〜１３）に記載のプライマー対の各々、請求項２のｉ）〜ｘｉｉｉ）に記載のプライマー対の各々、請求項３に記載のプライマー対、請求項４のａ）〜ｍ）に記載のプライマー対の各々、および請求項５に記載のプライマー対からなる群より選択される２種以上のプライマー対
    を含む、プライマー対の組み合わせ。
  8. イグサの品種を識別する方法であって、以下の工程を包含する、方法：
    （ａ）請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載のプライマー対または請求項７に記載のプライマー対の組み合わせを用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；
    および
    （ｂ）該増幅産物を検出する工程。
  9. 前記プライマー対が少なくとも２つである、請求項８に記載の識別方法。
  10. 前記プライマー対が少なくとも３つである、請求項９に記載の識別方法。
  11. 前記プライマー対が少なくとも４つである、請求項１０に記載の識別方法。
  12. イグサから試料ＤＮＡを抽出する工程をさらに包含する、請求項８から１１のうちのいずれか一項に記載の方法。
JP2003408328A 2003-12-05 2003-12-05 Ｓｓｒ法によるイグサ品種識別 Expired - Fee Related JP4465442B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003408328A JP4465442B2 (ja) 2003-12-05 2003-12-05 Ｓｓｒ法によるイグサ品種識別

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003408328A JP4465442B2 (ja) 2003-12-05 2003-12-05 Ｓｓｒ法によるイグサ品種識別

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2005168308A JP2005168308A (ja) 2005-06-30
JP4465442B2 true JP4465442B2 (ja) 2010-05-19

Family

ID=34730061

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003408328A Expired - Fee Related JP4465442B2 (ja) 2003-12-05 2003-12-05 Ｓｓｒ法によるイグサ品種識別

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP4465442B2 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008237180A (ja) * 2007-03-28 2008-10-09 Japan Grassland Farming Forage Seed Association イタリアンライグラスの品種識別に有用なｓｓｒプライマー対及びその利用
JP7181522B2 (ja) * 2018-09-18 2022-12-01 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 プライマーセット、及びそれを用いた標的ヌクレオチド配列の増幅方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2005168308A (ja) 2005-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5487985A (en) Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes
US5658764A (en) Method and kits for detection of fragile X specific, GC-rich DNA sequences
KR20160001801A (ko) 인삼 품종 판별용 pna 프로브 세트 및 이를 이용한 인삼 품종 판별 방법
JP4465442B2 (ja) Ｓｓｒ法によるイグサ品種識別
KR20230109925A (ko) 대용량 고효율의 밀 품종 식별을 위한 snp 마커, 프라이머 세트, 및 이의 용도
KR100652247B1 (ko) Ｂｃｒ-ａｂｌ 정량키트
JP5115825B2 (ja) イグサ品種「ひのみどり」の識別マーカー
JP2010004878A (ja) タラロマイセス属に属する菌類の検出方法
EP0751227B1 (en) Detection and identification of fungi
JP2002112773A (ja) Ｄｎａマーカーを用いるパパイアの性識別方法
KR101774275B1 (ko) 고추의 여교배 육종을 위한 단일염기다형성 마커 세트 및 이의 용도
KR102338326B1 (ko) 신속 고효율 fish 수행을 위한 신규한 인삼의 사전 표지 dna 반복서열 올리고프로브
EP1254253B1 (fr) Oligonucleotides monocatenaires, sondes, amorces et procede de detection des spirochetes
KR101439452B1 (ko) 고추의 고밀도 유전자 연관지도
KR101439454B1 (ko) 고추의 고밀도 유전자 연관지도
KR101439451B1 (ko) 고추의 고밀도 유전자 연관지도
KR101439457B1 (ko) 고추의 고밀도 유전자 연관지도
KR101439458B1 (ko) 고추의 고밀도 유전자 연관지도
KR101439456B1 (ko) 고추의 고밀도 유전자 연관지도
KR101439459B1 (ko) 고추의 고밀도 유전자 연관지도
KR101439453B1 (ko) 고추의 고밀도 유전자 연관지도
KR101439450B1 (ko) 고추의 고밀도 유전자 연관지도
KR101439449B1 (ko) 고추의 고밀도 유전자 연관지도
KR101439455B1 (ko) 고추의 고밀도 유전자 연관지도
JP4441638B2 (ja) イグサ品種「ひのみどり」の識別マーカー

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20060815

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20061228

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090908

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20091106

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20091106

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20091221

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20091221

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20100120

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20100122

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 4465442

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130305

Year of fee payment: 3

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees