KR102338326B1 - 신속 고효율 fish 수행을 위한 신규한 인삼의 사전 표지 dna 반복서열 올리고프로브 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 7로 표시되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는, 인삼속 식물의 유전체 검출을 위한 핵산 프로브; 상기 핵산 프로브를 포함하는 인삼속 식물의 유전체 검출을 위한 조성물 및 키트; 인삼속 식물의 유전체를 검출하는 방법 등에 관한 것이다.
본 발명의 핵산 프로브 또는 이를 포함하는 조합체는 혼성화 효율이 우수하여 재현성이 높고, 인삼속 식물의 주요 반복서열에 대해 비용 및 시간적으로 효율적인 FISH 분석을 가능하게 하며, 단일 FISH 실험에서 하나의 샘플 슬라이드를 사용하여 동시에 5개의 다른 반복서열-프로브의 염색체 분포를 밝힐 수 있기 때문에 인삼속 식물들의 유전체 구조를 밝히고 종 간의 유전체 비교 분석에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

신속 고효율 FISH 수행을 위한 신규한 인삼의 사전 표지 DNA 반복서열 올리고프로브 {DNA repeat based pre-labelled oligoprobes for rapid and efficient FISH in Panax ginseng}

본 발명은 서열번호 1 내지 7로 표시되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는, 인삼속 식물의 유전체 검출을 위한 핵산 프로브; 상기 핵산 프로브를 포함하는 인삼속 식물의 유전체 검출을 위한 조성물 및 키트; 인삼속 식물의 유전체를 검출하는 방법 등에 관한 것이다.

형광동소혼성화(fluorescence in situ hybridization, FISH) 기술은 표지된 분자 마커 및 타겟 DNA의 위치, 반복서열 또는 단일 복제 유전자를 시각화할 수 있는 강력한 도구이다. 이는 육종 프로그램 및 계통 발생 관계에 대한 유용한 정보를 제공하며, 유전체 변화에 대한 포괄적인 맵핑 및 모니터링을 가능하게 하여 진핵 생물의 유전체 조립을 돕는다. 이러한 FISH 방법은 핵산 프로브가 상보적인 타겟 서열과 혼성화하는 특성, 어떠한 프로브-표지 시스템을 적용했는지 여부, 적절한 형광물질의 선택 및 형광현미경의 세밀도 등에 영향을 받는다. 이때 효율적으로 표지된 프로브의 설계는 성공적인 FISH 수행의 전제조건에 해당한다. 특히, 이러한 FISH 방법을 이용하여 개체 내 반복서열의 염색체를 맵핑(mapping)하는 것은 유전체의 구조와 진화를 이해하는데 매우 중요하다.

한편, 인삼(Panax ginseng, 고려인삼 또는 아시아인삼)은 이질사배체(allotetraploid, 2n = 4x = 48)의 다년생 작물로서, 다양한 치료 효과를 갖는 진세노사이드를 함유하여 그 가치가 높다. 다만 인삼에 대한 약리학적 연구는 비교적 긴 역사를 갖고 있는 것에 반해, 유전체학 및 분자 세포유전학 연구는 최근에야 속도를 올렸을 뿐이며, 현존하는 인삼 게놈의 기원 및 인삼 게놈의 기능 면에서 특정 반복서열의 진화 경로와 같은 질문에는 여전히 답이 필요한 실정이다.

인삼 유전체의 약 80%는 반복서열을 포함하고 있는데, 인삼 포자체의(sporophytic) 중기 염색체를 제조하는 것은 매우 어려우므로 단일 슬라이드로부터 얻은 정보를 최대화하는 것이 실험적인 효율 면에서 유리할 것임은 자명하다. 이에, 본 발명의 발명자들은 인삼의 주요 반복서열, 즉 PgDel1, PgDel2, PgTel 및 Pg167TR에 대해 동시 5색의 FISH 방법의 적합성을 조사하고 혼성화 효율이 우수한 사전 표지 DNA 반복서열 올리고프로브(dPLOP)를 설계하였으며, 상기 올리고프로브를 사용한 5색의 FISH 방법이 인삼의 핵형 및 유전체 조성을 확립하고 유사한 종 간의 유전체 유연관계를 밝히는데 유용함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 내지 7 로 표시되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는, 인삼속 식물의 유전체 검출을 위한 핵산 프로브를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 핵산 프로브를 포함하는, 인삼속 식물의 유전체 검출을 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 핵산 프로브를 포함하는, 인삼속 식물의 유전체 검출을 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 상기 핵산 프로브를 인삼속 식물의 유전체 유래 반복서열을 포함하는 시료와 혼합하여 혼성화시키는 단계; 및 (b) 상기 핵산 프로브의 혼성화 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 인삼속 식물의 유전체를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 내지 7 로 표시되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는, 인삼속 식물의 유전체 검출을 위한 핵산 프로브를 제공한다.

본 발명의 핵산 프로브 또는 이를 포함하는 조합체는 혼성화 효율이 우수하여 재현성이 높고, 단일 FISH 실험에서 하나의 샘플 슬라이드를 사용하여 동시에 5개의 다른 반복서열-프로브의 염색체 분포를 밝힐 수 있기 때문에 인삼속 식물들의 유전체 구조를 밝히고 종 간의 유전체 비교 분석에 유용하게 활용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "인삼"은 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 약용식물로, 그 부위에 특별히 제한되지 않으나 인삼의 뿌리를 의미하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 인삼으로 Panax ginseng C.A. Meyer을 사용하였으나, 본 발명의 목적 상 인삼속 식물에 해당하는 한 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

인삼 포자체의(sporophytic) 중기 염색체를 제조하는 것은 매우 어려운데, 이는 인삼이 다른 식물과 달리 매우 천천히 자라 꽃을 피우는데 약 4년이 걸리고, 그 후 매년 40개의 종자만을 생산하기 때문이다. 또한, 인삼 종자는 발아 유도 전 약 3개월 동안 통제된 온도 및 수분에서 특별한 층적 처리(stratification treatment)가 필요한데, 일반적으로 그 발아율도 낮으며 균류의 공격에도 취약하여 일년 내내 이용할 수 없는 특수성이 있다. 따라서, 잘 펼쳐진 인삼 중기의 염색체를 갖는 슬라이드는 매우 귀중한 것이므로, 단일 슬라이드로부터 얻을 수 있는 정보를 최대화하기 위해서는 본 발명과 같이 효율적인 FISH 방법이 필수적이다.

즉, 본 발명에서 입증된 5색 FISH 방법은 단일 FISH 실험에서 하나의 샘플 슬라이드를 사용하여 동시에 5 개의 다른 반복서열 프로브의 염색체 분포를 밝힐 수 있는 것으로, 상기 인삼 종자의 특성 상 그 핵형 및 유전체 조성을 확립하고 유사한 종 간의 유전체 유연관계를 밝히는데 매우 유용하다.

본 발명에서 용어 "프로브"는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는 것으로, 상기 인삼 유전체 유래의 반복서열과 혼성화되어 인삼속 식물 종 간의 유전체 비교/분석 및 검출 시 인삼 특이 반복서열의 존재 유무, 위치, 분포 양 등을 효율적으로 확인할 수 있다. 본 명세서 내에서 상기 프로브는 핵산 프로브, 올리고프로브와 혼용될 수 있다.

상기 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있으며, 프로브의 형태 및 혼성화 조건은 본 발명의 목적 및 당업계에 공지된 기술에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 또한, 상기 프로브는 서열번호 1 내지 7로 표시되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는 상기 서열번호 1 내지 7로 표시되는 핵산서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의　상동성　또는 동일성을 갖는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 상기 서열번호 1 내지 7로 표시되는 핵산서열 중 어느 하나의 핵산서열로 이루어진 핵산서열일 수 있다.

본 발명에서 용어 "핵산 프로브 조합체" 또는 "조합체"는 상기 서열번호 1 내지 7로 표시되는 핵산서열을 포함하는 프로브 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있으며, 인삼속 식물의 유전체 비교/분석 및 검출, 구체적으로는 FISH를 수행하기 위해 상기 서열번호 1 내지 7로 표시되는 핵산서열을 포함하는 프로브의 조합체를 모두 활용할 경우 보다 효율적이고 재현성있는 결과를 획득할 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 1 내지 2로 표시되는 핵산서열은 반복서열 PgDel1에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브이고, 서열번호 3 내지 4로 표시되는 핵산서열은 반복서열 PgDel2에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브이며, 서열번호 5 내지 6으로 표시되는 핵산서열은 각각 축퇴성, semi-축퇴성 올리고프로브로서 반복서열 Pg167TR에 결합할 수 있는 핵산 프로브이고, 서열번호 7로 표시되는 핵산서열은 반복서열 PgTel에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브이다.

상기 핵산 프로브는 그 말단이 형광물질 등으로 표지된 것일 수 있으며, 상기 프로브의 말단은 5' 말단일 수 있다. 상기 형광물질의 종류는 본 발명의 목적상 인삼속 식물의 유전체 비교/분석 및 검출에 사용될 수 있는 한 제한이 없고, 예컨대 FAM(6-carboxyfluorescein), DEAC(diethylaminocoumarin), Cy3(cyanine-3), Cy5(cyanine-5) 또는 Texas Red 등의 물질로 프로브의 말단이 표지될 수 있다.

또한, 상기 핵산 프로브는 인삼속 식물의 유전체 비교/분석 및 검출을 위한 것으로, 특히 형광동소혼성화, 즉 FISH(fluorescene in situ hybridization)를 수행하기 위한 것을 특징으로 한다. FISH는 염색체 내 특정 DNA 서열의 존재 유무를 규명하기 위한 방법으로, 염색체에 형광물질이 부착된 프로브를 부착시키는 과정을 혼성화라하며, 염색체에 부착되는 프로브는 자외선에 노출될 경우 형광을 내면서 대응하는 DNA 서열의 유무 및 위치를 보여주게 되는 방법이다. 본 발명의 핵산 프로브, 이를 포함하는 조합체는 FISH 분석에 있어 혼성화 효율이 우수하여 재현성이 높고, 인삼속 식물의 유전체 유래 주요 반복서열에 대해 비용 및 시간적으로 효율적인 FISH 분석을 가능하게 한다.

또한, 각각 별도의 필터 세트를 사용하여 5개 이상의 반복서열을 검출하는 것은 제한된 형광 이미징을 위한 스펙트럼 대역폭뿐 아니라 신호 혼선(crosstalk)을 제거할 수 있는 narrow-band 필터의 제한, narrow-bandpass 필터에 대한 신호 강도의 현저한 감소 가능성 등으로 인해 어려움이 있는 반면, 본 발명은 단일 FISH 실험에서 하나의 샘플 슬라이드를 사용하여 동시에 5개의 다른 반복서열-프로브의 염색체 분포를 밝힐 수 있기 때문에, 인삼속 식물들의 유전체 구조를 밝히고 종 간의 유전체 비교 분석에 유용하게 활용할 수 있다.

상기 핵산 프로브는 인삼 유전체 유래 반복서열과 특이적으로 혼성화되는 것을 특징하는 것일 수 있다. 본 발명에서 용어 "반복서열"은 개체의 유전체의 상당 부분을 구성하며 특정 패턴으로 반복하여 나열된 핵산 염기서열을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적 상 인삼속 식물의 유전체로부터 유래된 것을 의미할 수 있다. 이러한 반복서열은 밀접하게 관련된 종들의 염색체 또는 특정 종의 염색체 사이에서도 짧은 진화 기간 내에 크게 변화될 수 있는바, 계통 발생 관계를 규명하는 좋은 도구가 될 수 있으며, 염색체 동정 및 핵형 분석을 위한 세포유전학적 마커로 활용될 수 있다. 또한, FISH 분석을 수행하여 반복서열을 특정하는 것은 대부분의 서열화된 유전체에서 반복적인 DNA-관련 어셈블리의 어려움을 해소할 수 있다(De Bustos 외, 2016). 본 발명에서 반복 서열은 인삼 유전체로부터 유래된 서열 PgDel1, PgDel2, PgTel 및 Pg167TR로 표시될 수 있으며, 각각 구체적으로는 서열번호 8, 9, 10 또는 11로 표시될 수 있으며, 나아가 이들의 조합을 의미할 수 있다.

본 발명에서 용어 "혼성화"는 서로 다른 기원의 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미하는 것으로, 이는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match; 정합) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하는 경우에도 일어날 수 있다. 본 발명에서 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 핵산 프로브를 포함하는, 인삼속 식물의 유전체 검출을 위한 조성물 및 키트를 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 핵산 프로브 및 이의 조합체는 하나 이상의 조성물, 경우에 따라 필요한 혼성화 시약과 함께 제공될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 인삼속 식물의 유전체 비교/분석 및 검출을 위한 핵산 프로브, 이의 조합체, 혼성화 시약을 함께 포함하는 키트 또는 칩이 선택적으로 제공될 수 있으며, 상기 키트는 FISH용 키트일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 키트 또는 칩은 본 명세서에 기재되어 있는 핵산 프로브 또는 이의 조합체, 예를 들면 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 조합체를 별도의 조성물에 포함할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 상기 핵산 프로브를 인삼속 식물의 유전체 유래 반복서열을 포함하는 시료와 혼합하여 혼성화시키는 단계; 및 (b) 상기 핵산 프로브의 혼성화 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 인삼속 식물의 유전체를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브 또는 이의 조합체의 시료 상의 혼성화 여부는 당업계에 알려져 있는 적절한 방법에 의하여 검출될 수 있고, 예컨대 발광, 특히 형광은 현미경법, 유동 세포검사법 등에 제한됨이 없이 측정될 수 있으며, 현탁액 또는 현탁 배양액에서 보관되어 있는 세포에서 형광은 유동 세포검사법에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 핵산 프로브 또는 그 조합체의 시료 상의 혼성화 여부는 본 발명의 핵산 프로브 또는 그 조합체를 표지하는 형광물질을 검출함으로써 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 프로브 또는 이의 조합체를 이용한 FISH 수행은 다른 FISH용 프로브 또는 프라이머와 혼합하여 동시에 사용될 수 있으며, 이때 각 핵산 프로브 또는 이의 조합체는 각각 서로 다른 형광물질로 표지하는 것이 바람직하다.

본 발명의 핵산 프로브 또는 이를 포함하는 조합체는 혼성화 효율이 우수하여 재현성이 높고, 인삼속 식물의 주요 반복서열에 대해 비용 및 시간적으로 효율적인 FISH 분석을 가능하게 하며, 단일 FISH 실험에서 하나의 샘플 슬라이드를 사용하여 동시에 5개의 다른 반복서열-프로브의 염색체 분포를 밝힐 수 있기 때문에 인삼속 식물들의 유전체 구조를 밝히고 종 간의 유전체 비교 분석에 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 344개의 Pg167TR 반복서열 로고로부터 Pg167TR의 축퇴성 PLOP 라이브러리의 설계를 나타낸 것이다. 위치 1-28 및 92-114의 검은 막대는 각각 Pg167TRa 및 Pg167TRb dPLOP 영역을 나타내고, 검은 막대의 축퇴성 서열은 시퀀스 로고로부터 수동으로 생성된 각각의 dPLOP를 나타낸다.
도 2는 별도의 색상으로 표시된 인삼 반복서열의 FISH 분석 결과를 나타낸 것이다. a) raw DAPI 이미지, b-f) 각각 b) PgDel1, c) PgDel2, d) PgTel, e) Pg167TRa 및 f) Pg167TRb를 사용하여 5색 FISH에서 생성된 신호, g-h) 5색 FISH에 사용된 동일한 염색체 스프레드를 re-probing한 후 g) 5S rDNA 및 h) 45S rDNA 프로브의 2색 FISH 신호.
도 3은 병합된 FISH 신호를 사용하여 인삼 상동 염색체 쌍을 식별한 결과를 나타낸 것이다. a) 병합된 Pg167TRa 및 Pg167TRb 신호, b) Pg167TRa, Pg167TRb, PgTel 및 45S 및 5S rDNA의 디지털 5색 FISH 신호, c) 5색 FISH (PgDel1, PgDel2, PgTel, Pg167TRa 및 Pg167TRb)에서 얻은 병합된 신호, d) 단일 염색체 스프레드를 사용한 5색 FISH 및 2색 FISH에서 얻은 7가지 FISH 신호의 디지털 병합.
도 4는 인삼의 FISH 염색체도(karyogram)를 나타낸 것이다. a) raw DAPI 신호; b) PgDel1; c) PgDel2; d) PgTel; e) Pg167TRa; f) Pg167TRb; g) 5S rDNA; h) 45S rDNA; i) PgDel2, PgTel, Pg167TRa, Pg167TRb, 5S 및 45S rDNA의 디지털 6색 FISH 신호; j) 5색 FISH(PgDel1, PgDel2, PgTel, Pg167TRa 및 Pg167TRb)의 병합된 신호.
도 5는 본 발명에 사용된 다른 반복서열의 분포를 보여주는 인삼의 FISH 핵형도를 나타낸 것이다.

1. 재료 및 방법

1-1. 프로브의 PCR 증폭

인삼 BAC 클론 PgH006J17(KF357944) 및 PgH008D23(KF357943)을 기반으로 PCR 프라이머는 Primer3(Rozen and Skaletsky 1998)를 사용하여 PgDel1(2,846 bp) 및 PgDel2(3,186 bp)의 증폭을 위해 고안되었다. PCR 혼합물(총 부피 50 ㎕)은 2.5 U ExTaq DNA 폴리머라제, 5 ㎕의 10X ExTaq 완충액, 2.5 mM의 각 dNTP(TaKaRa, RR001A), 각각의 프라이머 0.3 μM, 주형 인삼 gDNA <500 ng 및 DNase-free water(Sigma-Aldrich, W4502)를 포함하였다. 열 순환(thermocycling) 조건은 다음과 같다: 95 ℃에서 10분 동안 초기 변성(denaturation); 94 ℃에서 30초, 54 ℃에서 30초, 72 ℃에서 4분의 35 사이클; 및 72 ℃에서 10분 동안의 최종 연장(extension). 표적 앰플리콘을 직접 라벨링하기 전에 Wizard SV Gel 및 PCR Clean-Up System(Promega, A9282)을 사용하여 정제하였다.

1-2. 올리고프로브 설계

Pg167TR 유닛은 Tandem Repeats Finder(Benson 1999)를 사용하여 BAC PgH005J07(KF357942) 내 1,603-bp 영역에서 확인되었으며, 이는 인삼 어셈블리 스캐폴드의 유전체 BLAST 검색을 위한 쿼리(query)로 사용되었다. Pg167TR 서열은 multiple sequence alignment에 의해 정렬되었고, 2개의 축퇴성 올리고프로브(dPLOP) 라이브러리는 염색체 위치에서의 변이를 분석하기 위해 최대 및 서브세트를 나타내는 컨센서스 서열(consensus sequence)의 상이한 영역으로부터 설계되었다. multiple sequence alignment은 CLC Main Workbench ver.7.6.4(Qiagen)를 사용하여 수행되었으며, 시퀀스 로고는 WebLogo 도구(Crooks et al. 2004)를 사용하여 생성되었다. 사용된 PgTel 올리고프로브는 이전에 개발된 것을 사용하였다.

1-3. 프로브 라벨링(labeling)

PgDel1 및 PgDel2의 PCR 앰플리콘을 표 1에 나열된 플루오로크롬과의 닉-번역(nick-translation)을 통해 직접 표지하였다. 직접 표지 시약 및 표지 반응 혼합물을 ChromaTide™ 라벨링의 지시(Thermo Fisher Scientific, ChromaTide™ dUTP의 효소 도입 방법) 및 Kato et al(2006)의 방법에 따라 제조하였다. 즉, 정제된 PCR 앰플리콘의> 1 ㎍ aliquots을 플루오로크롬으로 직접 표지하였다. 100bp 내지 700bp를 포함하는 표지된 단편을 Centrisep 스핀 컬럼(Princeton Separators, CS-901)을 사용하여 정제하고, 용리액을 에탄올 침전시킨 후 2X SSC, 1X TE 완충액에서 용리시켰다. Pg167TRa 및 Pg167TRb의 경우, 5'-플루오로크롬-개질된 PLOP는 CLC Main Workbench ver. 7.6.4 (Qiagen)에 의해 설계되고 Bioneer Corp(http://www.bioneer.com/, Korea)에 의해 합성되었다.

색	프로브	형광색소(fluorochromes)			필터 세트
		명칭	Ex**	Em
Blue	PgDel2	DEAC	426	480	ET- Aqua FISH (Chroma, 49302)
Green	Pg167TRb_OP	FAM	494	518	ET - Green#3 Narrow band FISH (Chroma, 49312)
Orange	Pg167TRa_OP	Cy3	550	568	ET - Orange#2 FISH (Chroma, 49309)
Red	PgTel_OP	Texas Red	593	612	ET - Red#3 Narrow band FISH (Chroma, 49311)
Far red	PgDel1	Cy5	648	667	ET - Cy5 (Chroma, 49006)
Blue	Counterstrain	DAPI	350	470	ET - DAPI (Chroma, 49000)

^**Ex: maximum excitation wavelength (nm), Em: maximum emission wavelength (nm)

1-4. FISH (Fluorescence in situ hybridization)

인삼(Panax ginseng)은 금산 인삼도매센터(www.insamdome.com)에서 입수하였다. 뿌리 유사분열 염색체 스프레드는 Waminal et al(2012)에 기술된 방법에 따라 제조하였으며, FISH는 Waminal et al(2012)에 기술된 것에 따라 수행하였다. 즉, 2 %(v/v) 포름 알데히드로 고정한 후, 슬라이드는 사전 펩신 및 RNase 전처리없이 즉시 FISH에 사용되었다. Leica DFC365 FS CCD 카메라가 장착된 Olympus BX53 형광 현미경과 5 개의 형광크롬 및 DAPI에 대한 개별 형광 방출에 적합한 형광 필터 세트를 사용하여 이미지를 캡처하였다. Cytovision version 7.2(Leica Microsystems)를 사용하여 각각의 흑백 raw-이미지를 별도로 저장하였다. 추가적인 이미지 처리와 염색체도(karyogram) 및 핵형도(ideogram) 작성은 Adobe Photoshop CC을 통해 수행되었다.

2. 결과

2-1. 축퇴된(degenerate) Pg167TR pre-labeled 올리고프로브 라이브러리 설계

비록 Pg167TR satellite 반복서열이 167-bp의 컨센서스 서열을 갖지만, 본 실험에서 유전체 BLAST는 반복 길이의 변화를 나타내었다. 139 bp 내지 169 bp 범위의 340개 이상(총 344개)의 Pg167TR 서열이 top BLAST 검색 결과에서 무작위로 선택되어 multiple sequence alignment에 사용되었다.

Pg167TR PLOP 설계의 목표는 인삼의 표준 염색체 식별을 위해 satellite 반복서열 군의 가능한 모든 염색체 위치를 시각화하는 것이다. 즉, 시퀀스 로고는 정렬에 따라 많은 다형성 위치를 나타내므로(도 1), 단일의 PLOP 시퀀스를 설계할 경우 하나의 종에 상보적인 올리고프로브는 다른 종에 상보적이지 않을 수 있어, 원하는 목표를 달성하지 못할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 Pg167TR의 최대로 가능한 염색체 위치들을 검출하기 위해 상이한 서열 변이체를 포함하도록 축퇴성(degenerate) pre-labeled 올리고프로브(dPLOP) 라이브러리를 설계하였다. 이를 위해, 위치 1-28에서 고도로 다형성인 부위(highly polymorphic sites)를 확인하고, 서열 로고에서 다형성 위치를 각 다형성 위치의 염기를 나타내는 IUPAC 뉴클레오티드 Ambiguity code로 대체하였다(도 1). 제조된 Pg167TR dPLOP 라이브러리의 이름을 Pg167TRa로 지정하였으며, 이는 1,152개의 PLOP 조합을 나타낸다.

또한, 일부 다형성 위치에서 축퇴성 뉴클레오티드 대신 정확한 뉴클레오티드를 사용하여 엄격성(stringency)을 추가하는 경우, Pg167TRa와 다른 염색체 분포를 갖는 Pg167TR의 서브세트가 생성되는지 테스트하였다. 이를 위해 위치 92-114의 다형성 영역을 대상으로하는 semi-축퇴성 PLOP 라이브러리 (Pg67TRb)를 설계하였다. 'TCG'영역과 일치하는 3' 말단을 제외하고 서열 길이를 따라 다른 위치에서 축퇴성 뉴클레오티드를 사용하였다(도 1). 이 영역에서는 'AGT'변형보다 'TCG'다형성을 선택하였으며, 상기 Pg167TRb 라이브러리는 32개의 PLOP 조합을 나타낸다(표 2).

명칭	서열	Mer	dPLOPs *	서열번호
PgDel1_F	CAAGATATTTGATGTTTTGGGATG	24	1	1
PgDel1_R	TAAAGTCGGTTCTACTCGTATGTTTG	26	1	2
PgDel2_F	GTTAACTTACTGACTGGAGCAATGAC	26	1	3
PgDel2_R	AAATGTCTTCCTTAATCTCTGTGACTG	27	1	4
Pg167TRa_OP	CCCGCMTCGDHCRTCYGAAYGCCAYRYA	28	1,152	5
Pg167TRb_OP	GAYATACRRARWCCGAGTTATCG	23	32	6
PgTel_OP	TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGT	29	1	7

^* 각 라이브러리에서 가능한 올리고프로브의 조합

표 2의 PLOP 서열을 나타냄에 있어서 IUPAC Ambiguity code를 사용하였다. 즉, A는 아데닌(adenine), G는 구아닌(guanine), C는 시토신(cytosine), T는 티민(thymin)을 나타내고, M은 아데닌 또는 시토신 둘 다 가능한 자리, R은 아데닌 또는 구아닌 둘 다 가능한 자리, Y는 시토신 또는 티민 둘 다 가능한 자리, W는 아데닌 또는 티민 둘 다 가능한 자리, D는 아데닌, 구아닌 또는 티민 모두 가능한 자리, H는 아데닌, 시토신 또는 티민 모두 가능한 자리를 나타낸다.

2-2. 5색 FISH 방법을 이용한 5 가지 인삼 반복서열 동시 검출

개별 형광 방출을 전달하기 위해 5 개의 다른 형광 필터 세트가 있는 5색 FISH를 통해, 단 하나의 염색체 스프레드를 사용하여 단일 FISH 실험에서 5 개의 서로 다른 인삼 반복서열 프로브가 검출되었다(도 2). DAPI 밴드는 여러 염색체에서 확인되었고(도 2a), 확인된 각각의 인삼 반복서열은 24 개의 염색체 쌍에 걸쳐 독특한 분포 패턴을 나타내었다.

염색체 16의 2차 수축 부위(secondary constriction site)를 제외하고는 모든 염색체의 전체 길이에 걸쳐 PgDel1 신호가 관찰되었으며(도 2b), PgDel2 신호는 염색체 13 내지 24로 지정된, 48 개의 인삼 염색체 중 24 개의 동원체 영역(pericentromeric region)에서 더 강렬하게 나타났다(도 2c). 이전의 결과에서와 같이, PgTel PLOP는 염색체의 표준 말단에 더하여 염색체 13의 긴 팔 내에 중간 위치(intercalary locus)를 나타내었다(도 2d). Pg167TRa 및 Pg167TRb dPLOP 라이브러리는 많은 염색체에서 뚜렷한 유전자좌를 나타냈다(도 2e, 2f).

또한, 5색 FISH 프로브를 세척한 후 동일한 염색체 스프레드에서 5S 및 45S rDNA PLOP에 대한 추가적인 FISH 라운드를 통해 총 7 개의 프로브를 탐지할 수 있었다. 5S 및 45S rDNA의 이전 FISH 결과(Waminal et al. 2017)와 마찬가지로, 각 반복 군은 각각 3 개 및 1 개의 신호를 나타 냈으며, 염색체 22의 5S rDNA 신호는 매우 희미하였다(도 2g, 2h).

Pg167TRa 및 Pg167TRb 신호는 24 개의 인삼 염색체 중 22 개에서 라이브러리 특이적 염색체 유전자좌와 함께 관찰되었다(도 3a). 8 개의 상동성 염색체 쌍에서 16 개의 신호는 염색체 당 하나의 유전자좌인 Pg167TRa에 특이적인 반면, 2 개의 염색체에서 6 개의 신호는 Pg167TRb에 대해 관찰되었으며, 염색체 12에는 2 개의 유전자좌가 관찰되었다. 추가 프로브를 분석할 때 동일한 염색체 스프레드를 재-프로빙(re-probing)하는 이점은 동일한 염색체 세트에서 신호 유전자좌를 비교하는 것이 쉽다는 것이다. 두 번째 FISH 라운드에서 얻은 5S 및 45S rDNA 신호를 PgTel, Pg167TRa 및 Pg167TRb와 디지털 방식으로 병합할 경우, 디지털 5색의 FISH가 획득되어 염색체 간 식별이 향상됨을 확이하였다(도 3b). 또한, 5 개의 서로 다른 플루오로크롬으로 라벨링된 5 개의 상이한 프로브를 사용하고 형광 현미경 검사를 위해 5 개의 서로 다른 필터 세트를 사용하여 감지한 5색 FISH는 인삼 핵형 분석에서 이미지 획득 및 분석 처리량을 향상 시킬 수 있음을 확인하였다(도 3c). 즉, 5색 FISH와 디지털 다색-FISH의 조합을 통해 총 7 개의 프로브를 분석하고 염색체의 쌍을 쉽게 만들 수 있었다(도 3d).

2-3. FIHS 염색체도(karyogram)

본 발명에 사용된 7 개의 프로브 외에, DAPI 밴드는 염색체 쌍의 paring을 촉진하였다(도 4a). PgDel1은 전체 염색체에서 신호를 보인 반면 염색체 쌍에 대한 정보는 많지 않았다(도 4b). 그러나, PgDel2는 인삼 염색체를 PgDel2-poor 및 PgDel2-rich(각각 염색체 1-12 및 13-24)로 하위 그룹화 할 수 있었으며, 후자는 일반적으로 전자보다 짧은 것으로 나타났다(도 4c).

염색체 13은 긴 팔의 중간의(intercalary) PgTel 유전자좌로 쉽게 식별할 수 있었다(도 4d). Pg167TRa는 12와 17을 제외한 모든 염색체에 위치하였으며 (도 4e), Pg167TRb는 8과 17을 제외한 모든 염색체에 위치하였으나 매우 희미한 신호는 염색체 6, 10, 15에서 거의 보이지 않았다(도 4f). 한편 염색체 17에는 어떠한 Pg167TR 유전자좌도 없느 것으로 확인되었다. 대부분의 염색체는 Pg167TRa 및 Pg167TRb 유전자좌를 둘 다 가지고 있지만, 몇몇 염색체는 둘 중 하나만 가지고 있는 것으로 나타났다. 염색체 8에는 Pg167TRa만 있고 Pg167TRb 유전자좌는 없었던 한편, 염색체 12에는 Pg167TRb 신호가 우세하였으나 매우 희미한 Pg167TRa 신호가 있었기 때문에 이 염색체는 주로 Pg167TRb에 특이 적인 것으로 나타났다. 염색체 2, 10 및 22는 5S rDNA(도 4g)와 NOR의 염색체 16(도 4h)으로 쉽게 식별 할 수 있었다. 짧은 팔에 주요 5S rDNA 유전자좌를 포함하는 염색체 10은 또한 유일하게 분리된 Pg167TRa 및 Pg167TRb 특이 유전자좌를 포함하였다(도 4i). 염색체도(karyogram)의 요약은 도 5에 핵형도(ideogram)로 나타내었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Sahmyook University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> DNA repeat based pre-labelled oligoprobes for rapid and efficient FISH in Panax ginseng <130> KPA01492 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgDel1_F <400> 1 caagatattt gatgttttgg gatg 24 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgDel1_R <400> 2 taaagtcggt tctactcgta tgtttg 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgDel2_F <400> 3 gttaacttac tgactggagc aatgac 26 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgDel2_R <400> 4 aaatgtcttc cttaatctct gtgactg 27 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pg167TRa_OP <400> 5 cccgcmtcgd hcrtcygaay gccayrya 28 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pg167TRb_OP <400> 6 gayatacrra rwccgagtta tcg 23 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgTel_OP <400> 7 tttagggttt agggtttagg gtttagggt 29 <210> 8 <211> 10039 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 8 tgtaagaccc caactttttg aataaagatt aaattttctc gaaatatttt tttgaatatt 60 atggtgtgga tttgatgtaa tgttatagtt gtgggtaata tttgcaaatt ttgcaaagta 120 cacaagttgt tatataatat tcgattggtc gggaaatatt cattttaaca gggaatatta 180 atacaacgac acaatcattg gtggaccccc acaacgaaat tattgtcgga ttgagaaaac 240 gataaaaata ctttatgaaa ataacggcgg aagttttacc gttaactgtt gaactatccg 300 gtagtaaaag tatagtaata cgtgtggttg catagtagca cacggtattg attattgatg 360 cttacgtgag aagtcactca gttatactca attattgcta cagtaattgt tgcatcatat 420 ctctcatatt attgattcga ttattgtcat agtatcatct gcataatatg ttattttatt 480 aaatcaataa ttgagacgac aaagttattc atattattaa attgcaatat ttacaatgtc 540 tagaagttct gtcaaggaga ggtttggtca caaaattgcg cgccaatagg gagaaatcct 600 tattggaaag ccccctcttt cctgggaacg acctggttga taaatattgt tagttataat 660 attaatgatg aatgttatta aaattgaagt tgtgttcgga gttgaatttg gagacgcgaa 720 cgtgatattt gagtctggaa cgatgaaatt agtaaaaata gtctataaac acaaaaattt 780 ctagaattca 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gacctggttt cttctttatt attctgttgg aacatcctgt ctgtgcgttc 1680 tacgccggac ctggttccgt ctttattatt ctgttggaat atcctgtctg tgcattttac 1740 gccggacctg attccgttat ttattgttct gttggaataa cctgcctgtg cggtctatcg 1800 aaagcctggt gatttctttt gttattccat tccttattat actaagttgg ttaaaatttt 1860 aacttctata ctccatgaaa ttagtggaat atccttgata tttgcacttc atccagtatc 1920 ttttcatgga aatattcttc tgagcattct tgaattttac tttacaaagc agtatcatgt 1980 tgacaatttg gacgttatta gttcctggat aaattaattc ttgaacttgt tttattgaat 2040 tcttatatca ttgtcatcat ccttatgttt atattttgtt gaaattcatc tgtggcatat 2100 agtgcataga tggacttggt ataattatga ccagggatta ttcggtgtaa tcatgaccat 2160 aatgttataa atgatgtgga aaaagtcctc attggcccgt agagcattga tggacagttg 2220 ttggcatgat catgaccatt attgaataca caaatattct tggcccgtag tgcatggata 2280 attgtggtcg tgatactaaa gaatatcatt ggccttagtg caggggtgat tcgatgatgt 2340 ggattattta ttaagccgag tcccagcgat aaaagtgatg aaaaaccttc taaatcataa 2400 aagatagtag attttattct ctacttgact cttttaatgg attatttgtt ccgctgcagt 2460 taaacttgat 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ttttgaccta tttttggctt 120 tttgcccaag tattggcgag ttttacaaac tgggtgataa ctcgaat 167 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 11 tttagggttt agggtttagg gtttaggg 28

Claims (8)

1. 서열번호 1 내지 7로 표시되는 핵산서열들을 포함하는, 인삼속 식물의 유전체 검출을 위한 핵산 프로브 조성물로,
   상기 조성물은 인삼속 식물의 유전체 유래 반복서열인 PgDel1, PgDel2, PgTel 및 Pg167TR을 동시에 검출하기 위한 것인,핵산 프로브 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 핵산 프로브 말단이 각각 형광물질로 표지된 것인, 핵산 프로브 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 FISH(Fluorescene in situ hybridization)를 수행하기 위한 것임을 특징으로 하는, 핵산 프로브 조성물.
   
6. 삭제
7. 제1항, 제4항 또는 제5항의 핵산 프로브 조성물을 포함하는, 인삼속 식물의 유전체 검출을 위한 키트.
   
8. (a) 제1항, 제4항 또는 제5항의 핵산 프로브 조성물을 인삼속 식물의 유전체 유래 반복서열을 포함하는 시료와 혼합하여 혼성화시키는 단계; 및
   (b) 상기 핵산 프로브 조성물의 혼성화 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 인삼속 식물의 유전체를 검출하는 방법.

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