KR102121571B1 - 신속 고효율 fish 수행을 위한 신규한 결명자 속 식물 사전 표지 dna 반복서열 올리고 프로브 및 프라이머 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 14로 표시되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는, 결명자 속 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 핵산 프로브 또는 프라이머; 상기 핵산 프로브 또는 프라이머를 포함하는 결명자 속 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 조성물 및 키트; 상기 핵산 프로브 또는 프라이머를 결명자 속 식물의 유전체 유래 반복서열을 포함하는 시료와 혼합하여 혼성화시키는 단계; 및 상기 핵산 프로브 또는 프라이머의 혼성화 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 결명자 속 식물의 유전체를 검색하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 핵산 프로브 또는 프라이머, 이를 포함하는 조합체는 FISH 분석에 있어 혼성화 효율이 우수하여 재현성이 높고, 결명자 특이적인 주요 반복서열에 대해 비용 및 시간적으로 효율적인 FISH 분석을 가능하게 하며, 이를 통해 결명자 속 각종 식물들의 유전체 구조를 밝히고 종 간의 유전체 비교 분석에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

신속 고효율 FISH 수행을 위한 신규한 결명자 속 식물 사전 표지 DNA 반복서열 올리고 프로브 및 프라이머 {DNA repeat based pre-labelled oligoprobes and primers for rapid and efficient FISH in genus Senna}

본 발명은 서열번호 1 내지 14로 표시되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는, 결명자 속 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 핵산 프로브 또는 프라이머; 상기 핵산 프로브 또는 프라이머를 포함하는 결명자 속 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 조성물 및 키트; 상기 핵산 프로브 또는 프라이머를 결명자 속 식물의 유전체 유래 반복서열을 포함하는 시료와 혼합하여 혼성화시키는 단계; 및 상기 핵산 프로브 또는 프라이머의 혼성화 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 결명자 속 식물의 유전체를 검색하는 방법에 관한 것이다.

반복적인 DNA 염기 서열은 진핵 생물의 주요 부분을 구성하며(Sharma and Raina 2005; Ruban et al 2014), 이는 유전체에서 탠덤 배열(tandem arrangement)로 특정 위치에 분산되어 있는 것 또는 제한되는 것으로 구분된다. 분산된 반복서열에는 전이 가능한 요소가 포함되며, 이는 또한 트랜스포존 및 레트로-트랜스포존으로 구분될 수 있다. 탠덤 반복서열(TRs)은 단위 길이 및 어레이 크기에 따라 분류되는데, 이는 microsatellites(2 내지 5 bp 단위 및 위치 당 10 내지 100 카피), minisatellites(6 내지 100 bp 단위 및 위치 당 0.5 내지 30 kb 카피) 및 위성 DNA(satDNA, 101 내지 500 bp 단위 및 500 Mb 카피 크기)이다. 이중 satDNA는 대부분 AT-풍부한 반복을 갖는 centromeric과 subtelomeric 영역에 위치한다. 또한, satDNA는 협조 진화(concerted evolution)에 의해 진화하고, 분자적 드라이브(molecular drive), 하등 교차(unequal crossing over), 유전자 전환 또는 전위의 메커니즘에 의존한다. 특히, 트랜스포존은 연속적인 사슬 내 결손 및 이동 요소의 전이로부터 탠덤 반복서열을 유발할 수 있다. 반복서열은 밀접한 관련 종 또는 특정 종의 염색체 사이에서도 다른 특정 서열이 보존될 동안 짧은 진화 기간 내에 크게 변화한다. 따라서, 반복서열은 계통 발생 관계를 규명하는 좋은 도구가 될 수 있는 유전체 간 유의한 차이를 만들며(Mehrotra et al. 2013), 이는 염색체 동정 및 핵형 분석을 위한 좋은 세포유전학적 마커로 여겨진다.

형광동소혼성화(fluorescence in situ hybridization, FISH) 기술은 표지된 분자 마커 및 타겟 DNA의 유전체 위치, 반복 요소 또는 단일 복제 유전자를 시각화할 수 있는 강력한 도구이다. 이는 육종 프로그램 및 계통 발생 관계에 대한 유용한 정보를 제공하며, 유전체 변화에 대한 포괄적인 물리적 맵핑 및 모니터링을 가능하게 하여 진핵 생물의 유전체 조립을 돕는다. 이러한 FISH 기법은 핵산 프로브가 상보적인 타겟 서열과 혼성화하는 특성, 어떠한 프로브-표지 시스템을 적용했는지 여부, 형광물질의 선택 및 형광현미경의 세밀도 등에 영향을 받는다. 이때, 효율적으로 표지된 프로브는 성공적인 FISH 수행의 전제조건이다. 프로브를 표지하는 몇몇 효소적 방법들 중 틈-번역(nick-translation)이 가장 자주 사용되는데, 여기서 프로브들은 합텐(hapten) 또는 형광색소와 컨쥬게이트된 뉴클레오티드 유사체로 표지되고, 합텐 결합은 순차적으로 형광색소가 컨쥬게이트된 항체를 필요로 한다. 이러한 간접 표지법(indirect-labelling)을 한 번 수행하는데 대략 2 내지 3일의 시간이 소요되었으며, background의 노이즈가 심하여 단번에 원하는 결과를 얻기가 쉽지 않은 문제가 있었다.

이에 대한 대안으로 형광을 부착한 프로브를 직접 사용하는 직접 표지법(direct-labelling)이 사용되었으나, 실험 시간은 다소 줄어든 반면 시약의 동결-해동의 반복, pipetting 등 요인으로 인해 표지가 일정하게 이루어지지 않고, 만족할 만한 프로브 크기를 얻지 못하는 경우가 있어 결과적으로 매우 비효율적이고 비경제적인 문제점이 있었다. 따라서, 광범위한 유전체 분석 연구를 위한, 질적 수준이 높은 많은 양의 염색체 분석 결과를 얻기 위하여는 시간과 재정적인 면에서 보다 효율적이고 재현성있는 FISH 기법 개발이 절실한 상황이다.

한편, 콩과(Fabaceae)에 속하는 결명자 속(genus Senna)은 전 세계적으로 350종 이상을 포함하는 큰 속으로, 국내에는 명윤결명자(Senna tora (L.) Roxb.)와 석결명자(S.occidentalis (L.) Link)의 두 종이 결명자란 이름으로 알려져 있다. 명윤결명자는 아시아의 몇몇 열대 국가에서 다양한 피부 질환, 장 질환 및 시각 장애에 효과적인 전통적인 약용 식물이다(Chukeatirote et al, 2007; Tripathi et al, 2009; Singh et al, 2013). 또한, 결명자는 종자에서 발견된 안트라퀴논의 원천, 잎에서 검출된 세노사이드, 갈락토만난, 수면 보조용으로 사용되는 멜라토닌 및 항산화 화합물과 같은 의약적 중요 특성을 지닌 유전자의 보고로 알려져 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명의 발명자들은 결명자 속 식물에 대해 종래의 FISH 수행에 비하여 비용 및 시간 면에서 효율적인 결과를 가져오고자 예의 노력한 결과, 결명자(S. tora) 유전체에서 새로운 반복적인 DNA 염기 서열을 발굴하고 반복적으로 사용되는 핵산 프로브 또는 프라이머의 효율적 디자인을 통해 FISH 기술에 의한 유사분열 염색체상의 분포 및 위치를 밝혀내었다. 이러한 결명자 유전체 유래 반복서열 및 그에 대한 핵산 프로브 또는 프라이머는 재현성이 높은 FISH 결과를 제공하며, FISH 전체 실험시간을 2~3일에서 30분 이내로 단축할 뿐 아니라, 실험에 투여되는 시약과 인력의 투여를 현격히 낮추어 시간과 경제적인 면에서 효율성을 부여하고, 전문성과 숙련이 요구되는 FISH 수행을 초보자도 비교적 용이하게 진행할 수 있게 함과 아울러, 노이즈없이 선명한 시그널을 통해 향상된 FISH 수행을 제공함으로써 최초로 정제된 결명자의 핵형 및 유전체 조성을 확립하고 결명자속 종들 간의 유전체 유연관계를 밝히는데 유용함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 내지 14로 표시되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는, 결명자 속 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 핵산 프로브 또는 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 핵산 프로브 또는 프라이머를 포함하는, 결명자 속 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 핵산 프로브 또는 프라이머를 결명자 속 식물의 유전체 유래 반복서열을 포함하는 시료와 혼합하여 혼성화시키는 단계; 및 상기 핵산 프로브 또는 프라이머의 혼성화 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 결명자 속 식물의 유전체를 검색하는 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 내지 14로 표시되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는, 결명자 속 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 핵산 프로브 또는 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 핵산 프로브 또는 프라이머, 이를 포함하는 조합체는 FISH 분석에 있어 혼성화 효율이 우수하여 재현성이 높고, 결명자 속 식물의 유전체 유래 주요 반복서열에 대해 비용 및 시간적으로 효율적인 FISH 분석을 가능하게 하며, 이를 통해 결명자 속 식물 종들의 유전체 구조를 밝히고 결명자속 식물 종 간의 유전체 비교 분석에 유용하게 활용할 수 있는 장점이 있으며, 이는 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것으로 그 의의가 매우 크다.

본 발명에서 용어 "결명자"는 콩과(Fabaceae)에 속하는 결명자 속(Senna)의 한해살이풀 식물로, 이는 눈을 밝게 해주는 씨앗이라는 뜻이다. 한방에서는 야맹증, 변비, 혈압강하 등에 효과가 있음이 보고되어 있으며, 기타 약리효과로는 이뇨, 피부진균억제, 콜레스테롤 강하 효과 등이 알려져 있다. 본 발명에서 결명자는 결명자 속(genus Senna) 식물을 포괄하는 것일 수 있으며, 명윤결명자(Senna tora (L.) Roxb.) 및 석결명자(S.occidentalis (L.) Link)를 포함한 결명자 속의 동속이종 식물을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 결명자는 명윤결명자(Senna tora)를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "프로브"는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는 것으로, 상기 결명자 유전체 유래의 반복서열과 혼성화되어 결명자 속 식물 종 간의 유전체 비교 분석시 결명자 특이 반복서열의 존재 유무, 위치, 분포 양 등을 효율적으로 확인할 수 있다. 본 명세서 내에서 상기 프로브는 핵산 프로브 또는 프라이머와 혼용될 수 있다.

상기 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있으며, 프로브의 형태 및 혼성화 조건은 본 발명의 목적 및 당업계에 공지된 기술에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 또한, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열번호 1 내지 14로 표시되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는 상기 서열번호 1 내지 14로 표시되는 핵산서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의　상동성　또는 동일성을 갖는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 상기 서열번호 1 내지 14로 표시되는 핵산서열 중 어느 하나의 핵산서열로 이루어진 핵산서열일 수 있다.

한편 본 발명에 있어서 "핵산 프로브 또는 프라이머 조합체" 또는 "조합체"는 상기 서열번호 1로 표시되는 핵산서열을 포함하는 프로브 이외에, 추가로 각각 서열번호 2 내지 3; 4 내지 6; 7 내지 10; 11 내지 12 또는 13 내지 14로 표시되는 핵산서열을 포함하는 프로브 또는 프라이머, 이들의 조합을 더 포함하는 것일 수 있으며, 결명자 속 식물의 유전체 검색 및/또는 정량, 구체적으로는 FISH를 수행하기 위해 상기 조합체를 활용할 경우 보다 효율적이고 재현성있는 결과를 획득할 수 있다.

상기 프로브 또는 프라이머는 그 말단이 형광물질 등으로 표지된 것일 수 있으며, 구체적으로 프로브 또는 프라이머의 말단은 5' 말단일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 형광물질의 종류는 본 발명의 목적상 결명자 속 식물의 유전체 검색 및/또는 정량에 사용될 수 있는 한 제한이 없고, 예컨대 아미노메틸쿠마린(Aminomethylcoumarin, AMCA), FAM, Cy5 또는 Texas Red일 수 있으며, 그밖에 digoxigenin-11-Dutp 또는 biotin-16-Dutp 등의 물질로 프로브의 말단이 표지될 수 있다.

또한, 상기 핵산 프로브 또는 프라이머는 결명자 속 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 것으로, 특히 형광동소혼성화, 즉 FISH(Fluorescene in situ hybridization)를 수행하기 위한 것임을 특징으로 하는 것일 수 있다. FISH는 염색체 내 특정 DNA 서열의 존재 유무를 규명하기 위한 방법으로, 염색체에 형광물질이 부착된 프로브를 부착시키는 과정을 혼성화라하며, 염색체에 부착되는 프로브는 자외선에 노출될 경우 형광을 내면서 대응하는 DNA 서열의 유무 및 위치를 보여주게 되는 방법이다. 본 발명의 핵산 프로브 또는 프라이머, 이를 포함하는 조합체는 FISH 분석에 있어 혼성화 효율이 우수하여 재현성이 높고, 결명자 속 식물의 유전체 유래의 주요 반복서열에 대해 비용 및 시간적으로 효율적인 FISH 분석을 가능하게 하며, 초보자도 용이하게 사용할 수 있어 이를 통해 결명자 속 식물 종 간의 유전체 비교 분석에 유용하게 활용될 수 있다.

상기 핵산 프로브 또는 프라이머는 결명자 유전체 유래 반복서열과 특이적으로 혼성화되는 것을 특징하는 것일 수 있다. 본 발명에서 "반복서열"은 개체의 유전체의 상당 부분을 구성하며 특정 패턴으로 반복하여 나열된 핵산 염기서열을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 결명자 유전체로부터 유래된 것을 의미할 수 있다. 이러한 반복서열은 밀접하게 관련된 종들의 염색체 또는 특정 종의 염색체 사이에서도 짧은 진화 기간 내에 크게 변화될 수 있는바, 계통 발생 관계를 규명하는 좋은 도구가 될 수 있으며, 염색체 동정 및 핵형 분석을 위한 세포유전학적 마커로 활용될 수 있다. 한편, 반복서열은 유전자를 담고 있지 않다는 점을 고려하여 쓰레기(junk) 또는 이기적 DNA로 간주되었으나, 이는 염색체 재배열에 관여하고, 관련 종의 핵형 변이에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Terencio et al, 2015). 또한, FISH 분석을 수행하여 반복서열을 특징짓는 것은 대부분의 서열화된 유전체에서 반복적인 DNA-관련 어셈블리 어려움을 도울 수 있다(De Bustos 외 2016). 본 발명에서 반복 서열은 결명자 유전체로부터 유래된 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20으로 표시되는 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 15로 표시되는 StTR55 이외에 각각 서열번호 16 내지 20으로 표시되는 StTR86, StTR178, StTR180, StTR1468, StTR2721 또는 이들의 조합을 의미할 수 있다.

본 발명에서의 용어 "혼성화"란 서로 다른 기원의 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미하는 것으로, 이는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match; 정합) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하는 경우에도 일어날 수 있다. 본 발명에서 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 핵산 프로브 또는 프라이머를 포함하는, 결명자 속 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 조성물 및 키트를 제공한다. 상기 용어 프로브, 결명자는 전술한 바와 같다.

구체적으로, 본 발명의 핵산 프로브 또는 프라이머, 이의 조합체는 하나 이상의 조성물, 경우에 따라 필요한 혼성화 시약과 함께 제공될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 결명자 속 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 핵산 프로브 또는 프라이머, 이의 조합체와 선택적으로 혼성화 시약을 함께 포함하는 키트 또는 칩이 제공될 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 키트는 FISH용 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 키트 또는 칩은 본 명세서에 기재되어 있는 핵산 프로브 또는 프라이머의 하나 이상의 조합체, 예를 들면 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 그 이상의 조합체를 별도의 조성물에 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 핵산 프로브 또는 프라이머를 결명자 속 식물의 유전체 유래 반복서열을 포함하는 시료와 혼합하여 혼성화시키는 단계; 및 상기 핵산 프로브 또는 프라이머의 혼성화 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 결명자속 식물의 유전체를 검색하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 용어 프로브, 결명자, 결명자 유래 반복서열, 혼성화는 전술한 바와 같다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브 또는 프라이머, 그 조합체의 시료 상의 혼성화 여부는 당업계에 알려져 있는 적절한 방법에 의하여 측정될 수 있는데, 예컨대 발광, 특히 형광은 현미경법, 유동 세포검사법 등에 제한됨이 없이 측정될 수 있으며, 현탁액 또는 현탁 배양액에서 보관되어 있는 세포에서 발광, 특히 형광은 유동 세포검사법에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 핵산 프로브 또는 프라이머, 그 조합체의 시료 상의 혼성화 여부는 본 발명의 핵산 프로브 또는 프라이머, 그 조합체를 표지하는 형광물질을 검출함으로써 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 프로브 또는 프라이머, 이의 조합체를 이용한 FISH 수행은 다른 FISH용 프로브와 혼합하여 동시에 사용될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 또 다른 보편적 프로브(5S rDNA, 45S rDNA, telomeric 반복서열 프로브)와 혼합하여 혼성화를 수행함으로써 동시에 FISH 측정이 가능함을 확인하였다. 이때 각 핵산 프로브 또는 프라이머, 이의 조합체는 서로 다른 형광물질로 표지하는 것이 바람직하다.

본 발명의 핵산 프로브 또는 프라이머, 이를 포함하는 조합체는 FISH 분석에 있어 혼성화 효율이 우수하여 재현성이 높고, 결명자 특이적인 주요 반복서열에 대해 비용 및 시간적으로 효율적인 FISH 분석을 가능하게 하며, 이를 통해 결명자 속 각종 식물들의 유전체 구조를 밝히고 종 간의 유전체 비교 분석에 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 결명자 염색체 중기의 3색 FISH 결과를 나타내는 것으로, 각각 염색체 내 5S rDNA, 45S rDNA 및 Arabidopsis-type telomeric 반복서열을 나타낸다.
도 2는 다색 FISH 분석을 통한 결명자의 염색체 내 major 반복서열의 분포를 나타낸 것으로, 각각 Stron55(청색), StTR86(갈색), StTR178(황색), StTR180(분홍색), StTR1468(보라색) 및 StTR2721(녹색)의 반복서열을 나타낸다.
도 3은 결명자 염색체 중기의 FISH 염색체도(karyogram)를 나타낸 것으로, 12번 및 2번 염색체에서 각각 5S rDNA 및 45S rDNA 신호가 검출되었고, Arabidopsis-type telomeric 반복서열 및 6개의 신규 탠덤 반복서열이 13개 염색체 모두에서 검출되었으며, 이는 각기 다른 위치와 분포 패턴을 나타낸다.
도 4는 결명자의 FISH 핵 형도(idiogram)를 나타낸 것으로, 지정된 색은 각각의 반복서열 및 그 colocalization을 나타낸다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 식물 샘플

결명자(Senna tora (L.) Roxb.)는 명윤결명자로 농촌진흥청(RDA) 국립원예특작과학원(NIHHS) 약용작물과로부터 제공받았다. 종자를 온실에 심고 성장하는 뿌리 선단을 2 mM 8-하이드록시퀴놀린(hydroxyquinolin)으로 4시간 동안 처리하고 아세토-에탄올(1:3 v/v)로 고정하였으며, 사용할 때까지 4℃에서 70% 에탄올로 보관하였다.

실시예 2: 염색체 스프레드 제작

Waminal과 Kim(2012)의 방법에서 약간의 변형을 통해 체세포 염색체의 스프레드를 제작하였다. 구체적으로, 분열조직 선단(meristematic tip, ~ 2mm)을 펙틴 분해 효소 용액(100 mM 시트르산 버퍼에 2% 셀룰라아제 R-10 [C224, Phytotechnology Laboratories] 및 1% 펙토리아제 Y-23 [P8004.0001, Duchefa])으로 37℃에서 2시간 동안 처리하고 증류수로 세척하였다. 뿌리를 냉장된 Carnoy 용액과 함께 마이크로 튜브로 옮기고, 실온에서 30초 동안 볼텍싱하였다. 이후 상층액을 버리고 펠렛을(9:1 v/v) 아세토-에탄올에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 미리 세척된 슬라이드에 피펫팅하고 습도가 높은 챔버에서 예열하였다. 공기에서 건조 후 슬라이드를 2% 포름알데히드(Vrana 등, 2012)에 5분간 고정하고, 증류수에 신속히 담가서 일련의 에탄올 처리(70%, 90% 및 100%)로 탈수시켰다.

실시예 3: 반복서열 발굴 및 프로브 디자인

결명자(Senna tora) 유전체의 전체 유전체 서열은 농촌진흥청(RDA), 다부처유전체사업단으로부터 획득하였다. Ilumina 플랫폼을 사용하여 생성된 전체 유전체 서열을 Sequence Read Archive에서 다운로드하였다. 판독 품질 트리밍 및 샘플링은 Tandem Repeat Analyzer-TAREAN(Novak 등, 2017)의 전처리(pre-processing) 도구를 사용하여 수행하였으며, 주요 유전체 반복서열의 식별은 주요 TAREAN workflow를 사용하여 수행하였다.

위성 DNA(satellites DNA) 반복에 대한 신뢰도의 임계점에 도달하는 높고 낮은-풍부한 컨센서스 서열이 선택되었다. 반복서열에 대한 올리고뉴클레오타이드 프로브 StTR55, StTR86, StTR178 및 StTR180은 CLC Workbench를 사용하여 설계되었으며, Bioneer(한국)에서 합성하여 구입하였다. 각 프로브의 5' 말단을 아미노메틸쿠마린(Aminomethylcoumarin) (StTR55), FAM (StTR86), Cy5 (StTR178) 및 Texas Red (StTR180)로 변형시켰다. 한편, StTR1468 및 StTR2721은 Waminal et al(2012)에 기재된 틈-번역(nick-translation)을 통해 digoxigenin-11-Dutp 및 biotin-16-Dutp로 표지하였다. 5S rDNA, 45S rDNA 및 telomeric 반복서열의 사전-표지된 올리고프로브(PLOPs)는 Waminal et al. (2018)의 방법에 따라 설계 및 제작되었다(표 1).

반복서열 명칭	올리고 명칭	PLOP / 프라이머 서열	컨센서스 서열 내 위치	변형	서열번호
StTR55	CL4_55bp_op1	GCGAAAACTGATTAAAAAAAGAAAAATGAATATCAAG	2..38	5' AMCA	1
StTR86	CL1_86bp_op1	TTAATCAGTTTTCGCCGATGAGTGTTTCG	44..72	FAM	2
	CL1_86bp_op2	CATCAGTTTTCGCCAATGAGTGTTTCG	4..30		3
StTR178	CL3_178bp_op1	CCGGAATATGTTAAGACATGATCCACGCT	145..173	Cy5	4
	CL3_178bp_op2	ATCTCAGAAACCTTCACGAATTACGAGGC	14..42		5
	CL3_178bp_op4	CCGGAGTGGTTTTGATGCTCCAATTGGA	98..125		6
StTR180	CL41_180bp_op1	GATTTAATGCTCGAATGGGGCTCGTGATC	62..90	Texas Red	7
	CL41_180bp_op2	GTTGTTGCACAAGTGAGTCAAACCGATC	5..32		8
	CL41_180bp_op3	TGTTTAGACATGACTTGACACACCTTCCA	94..122		9
	CL41_180bp_op4	TGAGTTCTTTTGAGATTCAATCGCGATTT	136..164		10
StTR1468	Forward	GTGTGGAGTGAGTGGGTGAG	74..93	Dig (Nick- Translation)	11
	Reverse	CCCTGAAGTCTGGGCATCTC	1270..1289		12
StTR2721	Forward	ACCTGTGAAGATGCGAGTGG	373..392	Biotin (Nick-Translation)	13
	Reverse	GCGAGAGAGAGAGAAGCGAC	2604..2623		14

실시예 4: 형광동소혼성화(fluorescence in situ hybridization, FISH)

FISH 절차는 Lim et al. (2007)과 Waminal 및 Kim (2012)의 방법을 변형하여 수행하였다. 혼성화 혼합물은 100% 포름아마이드, 50% 덱스트란 설페이트, 20×SSC, 각 DNA 프로브 50ng/L 및 시그마 워터(sigma water)로 제조하였다. 혼합물을 90℃에서 10분간 변성시키고 얼음 위에서 5분간 방치한 다음, 각 슬라이드 상에 피펫팅하였다. 슬라이드를 80℃에서 5분간 배양하고 37℃의 습한 챔버로 옮겨 밤새 인큐베이션하였다. 하룻밤 인큐베이션 후, 슬라이드를 실온에서 2× SSC로 10분, 42 ℃에서 0.1× SSC로 25분, 실온에서 2× SSC로 5분 동안 세척하고 일련의 알코올(70 %, 90 %, 95 %) 처리로 탈수시켰다. 슬라이드를 공기 건조시키고 1:100 DAPI(100 μg/ml 스톡: vectashield(Vector Labs, H-1000, USA))의 비율로 4', 6-디아미노-2- 페닐인돌(DAPI)로 대조 염색하였다. 슬라이드는 오일 렌즈(× 100 배율)를 사용하여 CCD 카메라(CoolSNAP^TM cf)가 내장된 Olympus BX53 형광 현미경으로 관찰하였으며, 데이터 이미지는 Adobe Photoshop CS6을 사용하여 완성하였다. 동종 염색체는 FISH 신호, 형태학적 특성 및 길이를 기준으로 확인하였다. 염색체 유형은 Levan et al. (1964)에 따라 분류된 염색체 유형에 따라 확인하였다.

실험예 1: 반복서열의 식별

결명자(S. tora)의 낮은-커버리지 유전체 DNA 데이터베이스로부터 얻은 총 6개의 주요 반복서열을 추정 위성 DNA 서열로서 TAREAN에 의해 분석하였다. Repeat Explorer 기반의 추정에 기초하여, 모든 새로운 반복서열은 단량체 길이 및 유전체 비율에 따라 달라지게 되는데, 유전체 비율에 있어서 StTR86은 유전체의 4.30%로 가장 풍부한 탠덤 반복서열이자 86bp의 컨센서스 길이를 가지고 있었다. 이어서 2.20%의 유전체 비율을 갖는 StTR178이 뒤따랐으며, 이는 178bp의 단량체로 구성되었다. StTR55는 유전체의 1.60%를 차지하며 55bp의 컨센서스 길이를 갖는 한편, StTR180은 0.39%의 유전체 구성 및 단량체 길이 180bp를 나타냄을 확인하였다. StTR1468과 StTR2721은 모두 1468 및 2721bp에 이르는 가장 긴 컨센서스 길이를 가지고 있으나, 각각 0.087%와 0.340%의 가장 적은 유전체 비율을 나타내었다(표 2).

실험예 2: FISH 분석을 통한 반복서열의 염색체 분포

본 실시예에서 상동 염색체의 동정은 StTR55, StTR86, StTR178, StTR180, StTR1468 및 StTR2721의 통합과 함께 초기 분석으로부터 확인되었으며, 각 염색체의 특징은 도 3에 나타내었다.

StTR55 반복서열은 2번, 3번, 5번, 6번, 7번, 8번, 12번 및 13번 염색체의 para-centromeric 영역; 4번 및 9번 염색체의 peri-centromeric 위치; 및 1번 및 9번 염색체의 centromeric 영역에서 가장 많이 검출되었다. 내재성(interstitial) 부위의 추가 신호가 1번 염색체에서 발견되었다.

StTR86. 대부분의 반복서열은 1 내지 8번, 9번(매우 약함), 10번 및 13번 염색체의 para-centromeric 영역에서 검출되었다. 또한 12번 염색체와 11번 염색체의 centromeric 및 peri-centromeric 영역에서 각각 신호가 검출되었다. 매우 약한 신호가 NOR 영역을 colocalizing하는 것으로 관찰되었다.

StTR178. 이 반복서열의 FISH 신호는 염색체 1번, 3 번, 5 번, 6 번, 7 번, 8 번, 9 번 및 10번을 포함하는 centromeric 영역에서 가장 많이 관찰되었다. 7 번 염색체의 내재성 위치에서도 추가적인 약한 신호가 검출되었다. Para-centromeric 영역에서 관찰된 신호는 2 번 및 4번 염색체에서 발견되었고 상기 반복서열의 peri-centromeric 위치는 12번 염색체에서 발견되었다.

StTR180. 이 반복서열의 신호 대부분은 1 내지 10번, 11번 및 13번 염색체의 centromeric 영역에서 다시 발견되었으며, 신호의 내재성 위치는 5, 6, 7, 8번 및 13번 염색체에서도 관찰되었다. 이 반복서열은 또한 NOR 영역 및 12번 염색체에서 발견되었다.

StTR1468. FISH 결과는 이 반복이 염색체 1 내지 10번 및 13번을 포함하는 centromeric 영역에서 주로 나타남을 보여주었다. 내재성 부위의 약한 minor 신호 또한 염색체 1번 및 7번에 나타났다. 약한 minor 신호는 또한 염색체 3번 및 8번의 para-centromeric 영역에서 관찰되었다. 한편 염색체 12번에서는 peri-centromeric 영역에서 신호가 발견되었다.

StTR2721. major 반복서열의 대다수와 달리 이는 주로 1 내지 11번 염색체와 13번 염색체를 포함하는 para-centromeric 영역에 국한되었다. Centromeric 및 peri-centromeric 영역에서 발견된 신호는 각각 염색체 9번 및 12번에서 검출되었다. 1번 염색체와 NOR 영역의 내재성 부위에서도 두 가지 major 신호가 관찰되었다.

결명자 유전체에서 모든 major 반복서열은 모든 염색체에서 검출되었고, 신호의 중첩을 나타내는 염색체의 centromere, para- 및 peri-centromeric 영역에서 가장 혼성화되었다. telomeric 반복서열, StTR55, StTR178, StTR180, StTR1468 및 StTR2721의 colocalization은 특히 염색체 1 내지 6번, 8 내지 10번 및 12 내지 13번에서 관찰되었다. 염색체 1 내지 5번, 8번, 10번 및 13번에서 발견되는 telomeric 반복서열 및 StTR55의 내재성 영역에서 또 다른 colocalization이 검출되었다. 또한, 모든 DAPI 밴드는 StTR86으로 colocalization 되었다. Ideogram은 모든 신호와 동시 표의 패턴을 요약하기 위해 제공되었다(도 4). 한편, 주요 결명자 내 주요 반복서열의 염색체 상의 분포를 아래 표 3에 나타내었다.

반복서열 명칭	반복서열이 포함된 염색체쌍 수	염색체 내 위치
5S rDNA	1	Interstitial region
45S rDNA	1	Nucleolus Organizer Region
St_Tel	13	Centromeric, Interstitial, para- and peri-centromeric, and termini region
StTR55	13	Centromere, Interstital, para- and peri-centromeric region
StTR86	13	Centromere, para- and peri centromeric, and NOR (very weak signal)
StTR178	13	Centromere, interstitial (minor signal), and para-centromeric region
StTR180	13	Centromere, interstitial, and NOR
StTR1468	13	Centromere, interstitial, para- and peri-centromere region
StTR2721	13	Centromere, interstitial, para- and peri-centromeric, and NOR

이로부터 9개의 세포 유전학적 마커가 결명자의 체세포 염색체에 적용되어 유전체 구성에 대한 이해를 도울 수 있으며, 이러한 반복서열은 대부분의 진핵 생물의 유전체에서 급속하게 진화하여 반복서열, 카피 수 및 염색체 위치의 변화를 유발할 수 있는바, 본 발명의 결과는 결명자 속 식물 각 종의 유전체 구조를 밝히고, 종 간 비교 유전체 분석에 유용할 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Sahmyook University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> DNA repeat based pre-labelled oligoprobes and primers for rapid and efficient FISH in genus Senna <130> KPA01349 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL4_55bp_op1 <400> 1 gcgaaaactg attaaaaaaa gaaaaatgaa tatcaag 37 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL1_86bp_op1 <400> 2 ttaatcagtt ttcgccgatg agtgtttcg 29 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL1_86bp_op2 <400> 3 catcagtttt cgccaatgag tgtttcg 27 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL3_178bp_op1 <400> 4 ccggaatatg ttaagacatg atccacgct 29 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL3_178bp_op2 <400> 5 atctcagaaa ccttcacgaa ttacgaggc 29 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL3_178bp_op4 <400> 6 ccggagtggt tttgatgctc caattgga 28 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL41_180bp_op1 <400> 7 gatttaatgc tcgaatgggg ctcgtgatc 29 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL41_180bp_op2 <400> 8 gttgttgcac aagtgagtca aaccgatc 28 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL41_180bp_op3 <400> 9 tgtttagaca tgacttgaca caccttcca 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL41_180bp_op4 <400> 10 tgagttcttt tgagattcaa tcgcgattt 29 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> StTR1468_F <400> 11 gtgtggagtg agtgggtgag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> StTR1468_R <400> 12 ccctgaagtc tgggcatctc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> StTR2721_F <400> 13 acctgtgaag atgcgagtgg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> StTR2721_R <400> 14 gcgagagaga gagaagcgac 20 <210> 15 <211> 55 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Senna tora (L.) Roxb.StTR55 <400> 15 ggcgaaaact gattaaaaaa agaaaaatga atatcaagtt ttcgaaacac tcatc 55 <210> 16 <211> 86 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Senna tora (L.) Roxb.StTR86 <400> 16 tttcgaaaca ctcattggcg aaaactgatg aatatcaagt tttcgaaaca ctcatcggcg 60 aaaactgatt aacaagaaaa tcaagt 86 <210> 17 <211> 178 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Senna tora (L.) Roxb.StTR178 <400> 17 aaatcgcggt cggatctcag aaaccttcac gaattacgag gcaaaagact tgttgcgcaa 60 gtgagtcaaa cacgtcggtt cgcgttgtat tcgcgaacgg gagtggtttt gatgctccga 120 ttggagtcgt cttggcatgg gaggagcgtg gatcatgtct taacatattc cggacgac 178 <210> 18 <211> 180 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Senna tora (L.) Roxb.StTR180 <400> 18 acgtgttgtt gcacaagtga gtcaaaccga tcgcttcgcg ttgtatttgg gaatccgagt 60 ggatttaatg ctcgaatggg gctcgtgatc gcatggaagg tgtgtcaagt catgtctaaa 120 cacattttga attgaaaatc gcgattgaat ctcaaaagaa ctcaagaagt acaagtttaa 180 180 <210> 19 <211> 1468 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Senna tora (L.) Roxb.StTR1468 <400> 19 agaaataatg taggactttg gattaaggga ggatttgttg tgtgtgtaat tcaaagtccc 60 acattggtgg ggtgtgtgga gtgagtgggt gaggagctta tataaatagg tgtgagttat 120 ataggttcca acacacataa gaatactagc ctataaccat tgggtgtatt gggttttggg 180 tatttttatg tattgaggag ggtttgtaat ttttccgttc aaaaattaca agtagtaaag 240 tttgtcccag tgggggtcgt ggtagtaggt cttgaggcac cgaaccacgt taaaattttt 300 gtgtgttctt ctttctcttt tctttatatt tttgtgcggg gcccaacaag tggtatcaga 360 gctttggttc cggcctaggg aggaagaagg gagaaagagc aagaggaagg agtcgtcatc 420 atccagtcag caatttggag agaggttggt tctggcttat tttctcattt ttttcaagtc 480 agattttctt ttgaatttgg gttgtttgtg gtgctggttg gttggctgtg tgagtggaag 540 tatttagcca agagttgggt taaatacaat gaacaccctg aagtttgaag ttccgttgtt 600 tgatgggaga acggatttta cactgtggca atgcacgatt caagattatt tggttcagca 660 gggtcttgac ttagcattgc aggatgagaa accgagtgaa ataaaagagt cagattggag 720 tacaattcag aaaaaggctg ttagtacaat tcgattggca ctagccccac agataaaagt 780 gactgtgctg aaggagacat caccgaagaa gttgtgggac acgttggaga gcaagtttgc 840 gtcgaagaca ttgaccaatc gattgatgat gaagatggat ttgtactcat tgaagatgga 900 agagggaggt aatgtgactg atcacattaa caaatttaat gagatggtat ctagactgtt 960 gaatgcaggg gagactatta aggatgaaga gcaagcgctg cttctcttgg cttcactacc 1020 aaaatccttc aagcctctag tccagtcaat gctagcagga aagagcacac tgaaactaga 1080 tgaagtgatg agtaccttga aggagagtca gaggatgatg ggtggtgaag agtctttcag 1140 ggacagtcat atactagcag tggatagtga caggaagaag aagggtgatc aacttggaag 1200 aaattctcga tcgagagaca tgagcactgt tgagtgccat tactgtggac agttgggtca 1260 catacagatg agatgcccag acttcaggga ggacttgcag agcatgaagg agaagagagg 1320 aagatcaaag ggagcttctt ctactaatgt ggtttcttat gaagatgagt taatctgagg 1380 atgttagagg attctgcagc aagggaggat cgttgcagaa gcagaagaag tcagaaaatt 1440 aataggagag tttagttttt ttatagag 1468 <210> 20 <211> 2721 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Senna tora (L.) Roxb.StTR2721 <400> 20 agcagatctt gccggagaaa acgcagaagt gcttcgggag agtgaaggag aagaagcctc 60 cgccgccgcg gaagaggaag tgtttggttt ggaggtaagt gagggaaatc tcttgctcta 120 ctctgtttag gattttccac aggttcttgt cttgcgctgc tagtgtagat gttgtggatg 180 aaaaggatta ttgacttctt ctgaagaaaa atttatattt caaggtttga gctcgatcgt 240 aatttgcttt ctatttatta tggagagagg aattgaggaa ggagatgatg ttggtattaa 300 tttctttttg tttaatttgg ctttatctta attacatgat tttatatata tgatttatga 360 cacactagct aaacctgtga agatgcgagt ggattggtag attggagata tgttggagga 420 atttatggtt gcaatcacag aactttgaga ttgaaatcgt actgtggaat gttgagaatc 480 agcaataaaa gttcgacctg caaaagtgat gttttgggaa gaaccacaag caatcaagta 540 gttatcaatt ggtgtaaagg tagtagtagt agcagcacat gaataataat tgacaaagag 600 aataataata ataataatag cgagaaacag aggagaaggg aaacacttat ctggattcat 660 tttttataaa tcctaacact cacaaggaat tttttccaga gaagtggttt cttttcttca 720 atttttcctt ttagtttcag taatgatgat tttgtgaaga ctacggtcgt agagtgggag 780 agaataggaa tttcaaagga tggtattaac attgtggtgt tttgcaatta catgattttc 840 ttaagcaccc atttactctt tcttctctct gttttatgct ttgttcaatt gtgataactt 900 ttcaagtagc atcatgcctc acatttgggg atttaatttg acatataatg tgatgtatat 960 cttgttcttg aaatattatg ttgttataac gttttggttg ttggaaatag tagagggaaa 1020 agatattttt actgaccagc agcagtgatg atttcaaatc tgtcatgatt tttgaatccc 1080 aataaattat ttgcagcatg aatcactttt caattaggat aaattttttt tgcatttgga 1140 ttaaaaagat gagatgtcat tacttgatta caagtcattg gcgtttatga tctactgtgt 1200 actgttttct acctttagtt ccttgataca tatttgacaa ttatggtaag tattttgaga 1260 aatttgtttg ttcttcactt ttaacacagt gattaagctt ttctcgatca tcatattgga 1320 gtatctagtt ttatatctgc ctctttgatc tttgtgatgc atgcatactt tttctcacct 1380 gaacccttac acttactaga tttggaacta cttgaacgat tgataatgat tttgatattt 1440 tacgcctttc atttgttctg cctttaatgt taaggtatgg attctgttac tcatgaattt 1500 tatttttgtg tagtgtaaca tgtatccttt gatgggccac ttacaatccc agagtcactt 1560 gcccgcagtg caaacatcca tttgactttc tcaatgtcca tcgatcccaa aacccttttt 1620 gctgcccact atattaagaa attttaatgt tgcctatttt ttccctttag atatgtggct 1680 taaaacatgc tcatgaaggc tgtcaatgtc catctgtggc ttgtcctctg gattttagcc 1740 ccataattat ggtttgatgg tttgctagca gtagttcttg acactgaatt gtcttagtaa 1800 aagtaatttt tcattcatgt acaaagattg gttaaataat gttctgtttc gtatggaatc 1860 ttcttggata tgcacttaaa acttgcatat ttatagtggc catttagata tatccatata 1920 tatatatata tatatgcttg tgtatttatt ctgtttgata ttggaaagaa tatttatatt 1980 gagatgtaat attgtcacat gtaccaagag aagcagttat tatagttgtt aaaatacata 2040 gcatatagca gcagtttttt attgccagta taaaatgtgt ctatagcagc agttttttta 2100 tttatagcag caatgttctt gcttgttact atagaaaaag cttataccaa cagtttgcat 2160 tctgctagta gaactttcta gtgacaggga aatagcagca gattggacct taatagcagc 2220 agttaggaca acagctggta taacatttag tagcagcttt agtcattttt agcagcagtt 2280 taaactgctg gtaaaaacct tttttgtagt agtgtacact actacaaaaa taagatttag 2340 tagctgattt tgaaatagct agtaaaactc aaatattgta acaatttatt tatttgctac 2400 tataaacatg atttttagta acattttatt taggagtgcc actaaacagt tttgctatac 2460 tagcagttag acatgttact ataataaaaa tatttattaa attataatat aatttcatat 2520 tttattattt atataaaata ttatattcta aatactaaat tactaattca gtttaaccct 2580 aatttaccct aataagttta ttggtcgctt ctctctctct cgctcaacct ctcaaacact 2640 ctcatcggcg gcaaaaactc tcaccatcga aggaggatcc atggccaccg gacagatctc 2700 tcggcgccgt cgtctcgttg c 2721

Claims (8)

1. 서열번호 1 내지 14로 표시되는 핵산서열들을 포함하며,
   서열번호 1로 표시되는 핵산서열은 반복서열 StTR55에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브이고,
   서열번호 2 내지 3으로 표시되는 핵산서열은 반복서열 StTR86에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브이고,
   서열번호 4 내지 6으로 표시되는 핵산서열은 반복서열 StTR178에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브이고,
   서열번호 7 내지 10으로 표시되는 핵산서열은 반복서열 StTR180에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브이고,
   서열번호 11 내지 12로 표시되는 핵산서열은 반복서열 StTR1468에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브이고,
   서열번호 13 내지 14로 표시되는 핵산서열은 반복서열 StTR2721에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브인,
   명윤결명자의 유전체 검출을 위한 핵산 프로브 조합체.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 명윤결명자의 유전체 유래 반복서열과 특이적으로 혼성화되는 것을 특징으로 하는, 핵산 프로브 조합체.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 반복서열은 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20으로 표시되는 것인, 핵산 프로브 조합체.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 핵산 프로브의 말단이 형광물질로 표지된 것인, 핵산 프로브 조합체.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 FISH(Fluorescene in situ hybridization)를 수행하기 위한 것임을 특징으로 하는, 핵산 프로브 조합체.
   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산 프로브 조합체를 포함하는, 명윤결명자의 유전체 검출을 위한 조성물.
   
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산 프로브 조합체를 포함하는, 명윤결명자의 유전체 검출을 위한 키트.
   
8. (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산 프로브 조합체를 결명자 속 식물의 유전체 유래 반복서열을 포함하는 시료와 혼합하여 혼성화시키는 단계; 및
   (b) 상기 핵산 프로브의 혼성화 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 명윤결명자의 유전체를 검출하는 방법.
   

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