KR102465198B1 - 신속 고효율 fish 수행을 위한 신규한 배추속 또는 무속 식물의 사전 표지 dna 반복서열 올리고 프로브 - Google Patents

신속 고효율 fish 수행을 위한 신규한 배추속 또는 무속 식물의 사전 표지 dna 반복서열 올리고 프로브 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는, 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus)식물 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 핵산 프로브; 상기 핵산 프로브를 포함하는 배추속 또는 무속 식물 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 조성물 및 키트; 상기 핵산 프로브를 배추속 또는 무속 식물 유전체 유래 반복서열을 포함하는 시료와 혼합하여 혼성화시키는 단계 및 상기 핵산 프로브의 혼성화 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 배추속 또는 무속 식물 유전체를 검색하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 핵산 프로브 또는 이를 포함하는 조합체는 FISH 분석에 있어 혼성화 효율이 우수하여 재현성이 높고, 배추속 또는 무속 식물의 특이적인 주요 반복서열에 대해 비용 및 시간적으로 효율적인 FISH 분석을 가능하게 하며, 이를 통해 배추속 또는 무속 식물의 유전체 구조를 밝히고 유사한 종 간의 유전체 비교 분석에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

신속 고효율 FISH 수행을 위한 신규한 배추속 또는 무속 식물의 사전 표지 DNA 반복서열 올리고 프로브 {DNA repeat based pre-labelled oligoprobes for rapid and efficient FISH in Brassica and Raphanus}
본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는, 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus)식물 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 핵산 프로브; 상기 핵산 프로브를 포함하는 배추속 또는 무속 식물 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 조성물 및 키트; 상기 핵산 프로브를 배추속 또는 무속 식물 유전체 유래 반복서열을 포함하는 시료와 혼합하여 혼성화시키는 단계 및 상기 핵산 프로브의 혼성화 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 배추속 또는 무속 식물 유전체를 검색하는 방법에 관한 것이다.
DNA 반복서열은 식물 유전체에 편재되어 있으며, 매우 동적인 방식으로 증폭되거나 제거되기도 한다. 이들은 유전체에서의 물리적 구성에 따라 산재되어 있거나 직렬 반복되어 있다. 이러한 특성으로 인해, 이들은 매우 가까운 근연종 사이에서도 유전체 크기 변이의 주요 원인이 된다(Tenaillon et al., 2010). 또한, 종의 분화 전후에 반복서열의 증폭이나 제거가 일어날 수 있는 바, 반복서열은 유전체의 진화를 연구하는 훌륭한 도구가 될 수 있다(Choi et al., 2014; Mehrotra and Goyal 2014; Wei et al., 2014). 서로 다른 반복서열이 별개의 진화 경로를 따를지라도, 탠덤(tandem) 반복서열은 여러 식물 종에서 45S rDNA 유전자, 전이인자(transposable element) 및 IGSs(intergenic spacer)와 같은 다른 반복적인 DNA와 진화적으로 연관되어있다.
탠덤 반복서열은 반복 단위 및 배열 크기에 따라 microsatellite, minisatellite 또는 satellite로 분류할 수 있다(2-5 bp가 10-100단위, 6-100 bp가 0.5-30kb, 150-400 bp가 최대 100 Mb, 각각). 탠덤 반복서열은 고유한 염색체 영역에 분포되어 염색체를 쉽게 구분할 수 있도록 하는바, 탁월한 세포 유전학적 마커이기도 하다 (Mendes et al., 2011; Choi et al. 2014). 종래의 반복서열을 식별하는 방법은 많은 비용이 들고, 종종 광범위한 분자적 과정 (molecular procedures)을 수반하며 반복서열 식별 및 특성 처리율은 저조한 편이다(Dong et al., 2000). NGS 데이터를 처리하기 위한 TAREAN(Novak et al, 2017)과 같은 생물 정보학 파이프 라인의 발전은 낮은 커버리지 시퀀싱으로도 높은 처리량과 보다 효율적인 유전체 전체 반복서열의 식별을 가능하게 한다.
한편, 배추, 흑겨자, 양배추를 포함하는 배추속 식물 및 무속 식물은 이배체 또는 이질사배체의 다년생 작물로서, 세계적으로 섭취되어 건강 및 경제적 측면에서 그 가치가 매우 높으며, 품종개량을 위하여 교배를 통해 잡종을 만드는 경우가 흔하다. 이러한 배추속 식물과 무속 식물의 잡종은 종종 감수분열 재조합의 불안정성에 의한 유전적 결함을 수반하므로, 핵형 분석 (karyotype analysis) 등에 의한 게놈 안정성 평가가 이루어져왔다. 그러나, 배추속 식물들의 밀접한 유전적 관계로 인해 기존의 세포유전학적 분석 방법으로는 동종 배수체의 서브게놈을 구별하는 것이 어려웠다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 whole genome sequence를 이용하여 텔로미어 반복서열 및 그 분포를 식별하고, 배추속 또는 무속 식물의 세포유전학 및 진화 연구에 유용하게 활용 가능한 새로운 염색체 특이 반복서열을 확인하였다. 또한, 본 발명의 발명자들은 이러한 특이 반복서열과 혼성화 되는 핵산 프로브의 효율적 디자인을 통해 재현성 높은 FISH 결과를 제공함으로써 배추속 또는 무속 식물의 핵형 및 유전체 조성을 확인하고 유사한 종 간의 유전체 유연관계를 밝히는데 유용함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제10-2014-0115118호
본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 예시적 목적은 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는, 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus) 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 핵산 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예시적 목적은 상기 핵산 프로브를 포함하는, 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus) 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 핵산 프로브를 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus) 식물의 유전체 유래 반복서열을 포함하는 시료와 혼합하여 혼성화시키는 단계 및 상기 핵산 프로브의 혼성화 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus) 식물의 유전체를 검색하는 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는, 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus) 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 핵산 프로브를 제공한다.
본 발명의 핵산 프로브 또는 이를 포함하는 조합체는 FISH 분석에 있어 혼성화 효율이 우수하여 재현성이 높고, 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus) 식물의 유전체 유래 주요 반복서열에 대해 비용 및 시간적으로 효율적인 FISH 분석을 가능하게 하며, 이를 통해 배추속(Brassica) 또는 무속(Raphanus) 식물 들의 유전체 구조를 밝히고 배추속 또는 무속 식물 및 이들의 잡종 간의 유전체 비교 분석에 유용하게 활용할 수 있는 장점이 있으며, 이는 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것으로 그 의의가 매우 크다.
본 발명의 용어 "배추속(Brassica)"은 배추과(Brassicaceae)에 속하는 한해살이풀 또는 두해살이풀로서, 배추(Brassica rapa, B. rapa, 브라시카 라파), 흑겨자 (Brassica nigra, B. nigra, 브라시카 니그라) 및 양배추 (Brassica oleraceae, B. oleraceae, 브라시카 올레라케아) 등을 포함하며, 이들 배추속 식물의 유전체는 각각 A 게놈(배추), B 게놈(흑겨자) 및 C 게놈(양배추)으로 표기한다.
본 발명의 용어 "무속(Raphanus)"은 배추과(Brassicaceae)에 속하는 초본식물로서, 대표적으로 무(Raphanus sativus, R. sativus, 라파누스 사티부스)를 포함하며, 무의 유전체는 R 게놈으로 표기한다.
본 발명의 용어 "이배체"는 염색체 조를 2개 가진 개체나 세포를 말하며, 배추속 또는 무속 식물에 있어 B. rapa (AA), B. nigra (BB), B. oleracea (CC), R. sativus (RR)로 나타낸다.
본 발명의 용어 "이질사배체(allotetraploid)"는 식물 잡종에서 유래한 서로 다른 종류의 염색체 짝이 배가되어 형성된 배수체를 말하며, 갓 (Brassica juncea, 브라시카 준시아)의 경우 AABB, 유채 (Brassica napus, 브라시카 나푸스)의 경우 AACC, 에티오피아 겨자 (Brassica carinata, 브라시카 카리나타)의 경우 BBCC, 배무채 (xBrassicoraphanus)의 경우 AARR 및 세가지 게놈 합성 잡종 (three-genome synthetic hybrid species)의 경우 ACRR로 게놈을 나타낸다.
본 발명에서 용어 "프로브"는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는 것으로, 상기 배추속 또는 무속 식물 유전체 유래의 반복서열과 혼성화되어 배추속 또는 무속 식물 간의 유전체 비교 분석시 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus) 식물 특이 반복서열의 존재 유무, 위치, 분포 양 등을 효율적으로 확인할 수 있다. 본 명세서 내에서 상기 프로브는 핵산 프로브와 혼용될 수 있다.
상기 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있으며, 프로브의 형태 및 혼성화 조건은 본 발명의 목적 및 당업계에 공지된 기술에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 또한, 상기 프로브는 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산서열을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는 상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 핵산서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의　상동성　또는 동일성을 갖는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 핵산서열 중 어느 하나의 핵산서열로 이루어진 핵산서열일 수 있다.
본 발명에서 용어 "핵산 프로브 조합체" 또는 "조합체"는 상기 서열번호 1로 표시되는 핵산서열을 포함하는 프로브와 서열번호 2 및 3으로 표시되는 핵산서열을 포함하는 프로브, 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것일 수 있으며, 배추속 또는 무속 식물의 유전체 검색 및/또는 정량, 구체적으로는 FISH를 수행하기 위해 상기 조합체를 활용할 경우 보다 효율적이고 재현성있는 결과를 획득할 수 있다.
상기 프로브는 그 말단이 형광물질 등으로 표지된 것일 수 있으며, 상기 프로브의 말단은 5' 말단일 수 있다. 상기 형광물질의 종류는 본 발명의 목적상 배추속 또는 무속 식물의 유전체 검색 및/또는 정량에 사용될 수 있는 한 제한이 없고, 예컨대 6-carboxyfluorescein(FAM), Cy3, Cy5 또는 Texas Red 등의 물질로 프로브의 말단이 표지될 수 있다.
또한, 상기 핵산 프로브는 배추속 또는 무속 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 것으로, 특히 형광동소혼성화, 즉 FISH(fluorescene in situ hybridization)를 수행하기 위한 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. FISH는 염색체 내 특정 DNA 서열의 존재 유무를 규명하기 위한 방법으로, 염색체에 형광물질이 부착된 프로브를 부착시키는 과정을 혼성화라하며, 염색체에 부착되는 프로브는 자외선에 노출될 경우 형광을 내면서 대응하는 DNA 서열의 유무 및 위치를 보여주게 되는 방법이다. 본 발명의 핵산 프로브, 이를 포함하는 조합체는 FISH 분석에 있어 혼성화 효율이 우수하여 재현성이 높고, 배추속 또는 무속 식물의 유전체 유래의 주요 반복서열에 대해 비용 및 시간적으로 효율적인 FISH 분석을 가능하게 하며, 초보자도 용이하게 사용할 수 있어 이를 통해 배추속 또는 무속 식물 간의 유전체 비교 분석에 유용하게 활용될 수 있다.
상기 핵산 프로브는 배추속 또는 무속 식물 유전체 유래 반복서열과 특이적으로 혼성화되는 것을 특징하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "반복서열"은 개체의 유전체의 상당 부분을 구성하며 특정 패턴으로 반복하여 나열된 핵산 염기서열을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 배추속 또는 무속 식물 유전체로부터 유래된 것을 의미할 수 있다. 이러한 반복서열은 밀접하게 관련된 종들의 염색체 또는 특정 종의 염색체 사이에서도 짧은 진화 기간 내에 크게 변화될 수 있는바, 계통 발생 관계를 규명하는 좋은 도구가 될 수 있으며, 염색체 동정 및 핵형 분석을 위한 세포유전학적 마커로 활용될 수 있다. 또한, FISH 분석을 수행하여 반복서열을 특징짓는 것은 대부분의 서열화된 유전체에서 반복적인 DNA-관련 어셈블리의 어려움을 도울 수 있다(De Bustos 외, 2016).
본 발명에서 반복서열은 배추속 또는 무속 식물 유전체로부터 유래된 서열 (TTCGG)n, (TTTAGGGTTAGGTAGGG)n 또는 (AG)n로 표시될 수 있으며, 여기서 n은 배추속 또는 무속 식물 종에 따라 다양하다. 구체적으로, 본 발명의 반복서열은 표 1에 나타낸 바와 같이 서열번호 4, 5 또는 6으로 표시되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 서열번호 4로 표시되는 MsatA_2, 서열번호 5로 표시되는 MsatBR_1 또는 서열번호 6으로 표시되는 MsatC_6 또는 이들의 조합을 의미할 수 있다.
반복서열 명칭 서열 서열번호
MsatA_2 TTTAGGGTTAGGTAGGGTTTAGGGTTA 4
MsatBR_1 AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG 5
MsatC_6 TTCGGTTCGGTTCGGTTCGGTTCGG 6
본 발명에서 용어 "혼성화"는 서로 다른 기원의 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미하는 것으로, 이는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match; 정합) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하는 경우에도 일어날 수 있다. 본 발명에서 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 핵산 프로브를 포함하는, 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus) 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 조성물 및 키트를 제공한다. 상기 용어 프로브, 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus)은 전술한 바와 같다.
구체적으로, 본 발명의 핵산 프로브 또는 이의 조합체는 하나 이상의 조성물, 경우에 따라 필요한 혼성화 시약과 함께 제공될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus) 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 핵산 프로브 또는 프라이머, 이의 조합체와 선택적으로 혼성화 시약을 함께 포함하는 키트 또는 칩이 제공될 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 키트는 FISH용 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 키트 또는 칩은 본 명세서에 기재되어 있는 핵산 프로브 또는 이의 조합체, 예를 들면 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 조합체를 별도의 조성물에 포함할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 핵산 프로브를 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus) 식물의 유전체 유래 반복서열을 포함하는 시료와 혼합하여 혼성화시키는 단계 및 상기 핵산 프로브의 혼성화 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus) 식물의 유전체를 검색하는 방법을 제공한다. 상기 용어 프로브, 배추속 (Brassica), 무속 (Raphanus), 반복서열 및 혼성화는 전술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브 또는 이의 조합체의 시료 상의 혼성화 여부는 당업계에 알려져 있는 적절한 방법에 의하여 검출될 수 있는데, 예컨대 발광, 특히 형광은 현미경법, 유동 세포검사법 등에 제한됨이 없이 측정될 수 있으며, 현탁액 또는 현탁 배양액에서 보관되어 있는 세포에서 발광, 특히 형광은 유동 세포검사법에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 핵산 프로브 또는 프라이머, 그 조합체의 시료 상의 혼성화 여부는 본 발명의 핵산 프로브 또는 프라이머, 그 조합체를 표지하는 형광물질을 검출함으로써 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 프로브 또는 이의 조합체를 이용한 FISH 수행은 다른 FISH용 프로브 또는 프라이머와 혼합하여 동시에 사용될 수 있으며, 이때 각 핵산 프로브 또는 프라이머, 이의 조합체는 서로 다른 형광물질로 표지하는 것이 바람직하다.
본 발명의 핵산 프로브 또는 이를 포함하는 조합체는 FISH 분석에 있어 혼성화 효율이 우수하여 재현성이 높고, 배추속 또는 무속 식물의 특이적인 주요 반복서열에 대해 비용 및 시간적으로 효율적인 FISH 분석을 가능하게 하며, 이를 통해 배추속 또는 무속 식물의 유전체 구조를 밝히고 유사한 종 간의 유전체 비교 분석에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 B. rapa (AA), B. nigra (BB), B. oleracea (CC), R. sativus (RR), B. juncea (AABB), B. napus (AACC), B. carinata (BBCC), xBrassicoraphanus line BB#1 (AARR) 및 three-genome synthetic species (ACRR)의 염색체 중기의 FISH 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 B. juncea (AABB) 염색체 중기의 FISH 분석 결과를 나타낸 것으로 윗줄은 raw 이미지, 아랫줄은 채색된 FISH 이미지를 나타낸다. (A) DAPI, (B, G) 5S rDNA, (C, H) MsatA, (D, I) MsatBR, (E,J) 아라비돕시스-타입 텔로미어 반복 신호, (F) 5개 프로브의 병합 신호.
도 3은 B. napus (AACC) 염색체 중기의 FISH 분석 결과를 나타낸 것으로 윗줄은 raw 이미지, 아랫줄은 채색된 FISH 이미지를 나타낸다. (A) DAPI, (B, I) 5S rDNA, (C, J) 45S rDNA, (D, K) MsatA, (E, L) MsatBR, (F, M) MsatC, (G, N)아라비돕시스-타입 텔로미어, (H) 6개 프로브의 병합 신호.
도 4는 B. carinata (BBCC) 염색체 중기의 FISH 분석 결과를 나타낸 것으로 윗줄은 raw 이미지, 아랫줄은 채색된 FISH 이미지를 나타낸다. (A) DAPI, (B, H) 5S rDNA, (C, I) 45S rDNA, (D, J) MsatC, (E, K) MsatBR, (F, L) 아라비돕시스-타입 텔로미어 반복 신호, (G) 5개 프로브의 병합 신호.
도 5는 xBrassicoraphanus line BB#1 (AARR) 염색체 중기의 FISH 분석 결과를 나타낸 것으로 윗줄은 raw 이미지, 아랫줄은 채색된 FISH 이미지를 나타낸다. (A) DAPI, (B, H) 5S rDNA, (C, I) 45S rDNA, (D, J) MsatC, (E, K) MsatBR, (F, L) 아라비돕시스-타입 텔로미어, (G) 5개 프로브의 병합 신호.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 식물 재료
종자 출처 정보는 표 2에 나와있는 바와 같다. 종자를 필터 종이에 뿌리고 25 ℃에서 인큐베이션한 후, 수확한 식물의 뿌리 끝을 2mM 8-hydroxyquinoline으로 5시간동안 18 ℃에서 처리하고, 아세토-에탄올 (1:3 v/v)로 고정한 후 사용할 때까지 70% 에탄올로 4 ℃에서 보관하였다.
종 종자 출처 고유번호
(Accession no.) 		염색체 수. (2 n )
Brassica carinata A. Braun U.S. National Plant Germplasm System Ames 2779 34
B. juncea (L.) Czern. U.S. National Plant Germplasm System PI 633077 36
B. napus var. napus L. National Agrobiodiversity Center, RDA 031006 38
B. nigra (L.) W.D.J. Koch U.S. National Plant Germplasm System PI 649154 16
B. oleracea var. capitata L. USDA ARS Plant Genetic Resources Unit N/A 18
B. rapa subsp. pekinesis (Lour.) Hanelt Hoenteun Baechu N/A 20
Raphanus sativus L. Danong.kr N/A 18
xBrassicoraphanus line BB#1 Asia Seed Company N/A 38
16BR-977 (three-genome species) Biobreeding N/A 38
실시예 2. 반복서열 동정 및 프로브 디자인
배추 (B. rapa), 흑겨자 (B. nigra), 양배추 (B. oleraceae) 및 무 (R. sativus)의 전체 유전체 서열은 NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)에서 확보하였다. 분석에 사용한 배추, 흑겨자, 양배추 및 무의 유전 정보는 표 3에 나타낸 바와 같다.
종 배양기 게놈 유형 Acc. number
배추 Chiifu-401-42 AA GCA_000309985.3
흑겨자 inbred line YZ12151 BB GCA_001682895.1
양배추 TO1000 CC GCA_000695525.1
무 XYB36-2 RR GCA_002197605.1
주요 유전체 반복서열의 식별은 주요 TAREAN workflow를 사용하여 수행하였다. 미세위성 (microsatellite) 반복서열 분석을 수행하여 A, B, C 및 R 게놈에서 467개의 microsatellite를 식별하였으며, 이 중 배추, 흑겨자 및 양배추 게놈에서 각각 123개 및 무속에서 98개가 식별되었다. 467개의 microsatellite를 7개의 그룹으로 구별하여 FISH 분석에 적용가능한 종 특이적 올리고프로브로서 MsatA_2, MsatBR_1 및 MsatC_6을 선별하였다.
또한 5S rDNA, 45S rDNA 및 텔로미어 반복 올리고프로브가 FISH 분석에 사용되었다. 사전 표지 올리고프로브 (pre-labeled oligoprobes, PLOP)는 Waminal et al. (2018)에 개시된 방법을 참고하여 디자인하여 준비하였다. NCBI 뉴클레오타이드(https ://www.ncbi.nlm.nih.gov) 및 5S rDNA (http://combi o.pl.rrna) 데이터베이스를 이용하여 5S 및 45S rDNA 서열을 확보하였다. 아라비돕시스-타입 텔로미어 서열 (TTT AGG G)n이 FISH에서 사용되었다. 올리고프로브는 CLC Main Workbench 7.8.1 software (CLC Inc, Rarhus, Denmark)를 이용하여 보존된 영역으로부터 디자인하였다. 텔로미어 반복 프로브로서, 아라비돕시스-타입 텔로미어 서열 (TTT AGG G)n이 사용되었다. 모든 올리고프로브는 바이오니아 (대한민국)에서 수득하였으며 FISH에 사용된 올리고프로브의 정보는 표 4에 나타낸 바와 같다.
반복서열 올리고프로브 서열 형광 서열번호
MsatA_2 MsatA_2_OP TTTAGGGTTAGGTAGGGTTTAGGGTTA 5' Cy3 1
MsatBR_1 MsatBR_1_OP AGNGAGAGAGAGAGAGAGAGAG 5' Cy3 2
MsatC_6 MsatC_6_OP TTCGGTTCGGTTCGGTTCGGTTCGG 5'FAM 3

5S rDNA*		 OP5S_1 GGATGCGATCATACCAGCACTAAAGCACCG
5'Alexa Fluor 488		 7
OP5S_2 CCCATCAGAACTCCGAAGTTAAGCGTGCT 8
OP5S_3 GCGAGAGTAGTACTAGGATGGGTG 9
OP5S_4 CCTGGGAAGTMCTCGTGTTGCAYYCC 10

45S rDNA*		 OP45S_1 CCGGAGAAGGGAGCMTGAGAAACGGCTAC
5' Cy3		 11
OP45S_2 ATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAA 12
OP45S_3 GGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGT 13
OP45S_4 TCGAAGACGATYAGATACCGTCSTAGT 14
Telomeric Repeat OPTel TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTA 5' Texas Red 15
실시예 3. 염색체 표본 제작
Waminal et al,(2012)의 기술에 따라 체세포 염색체 표본을 준비하였다. 구체적으로, 근단 분열조직 (meristematic root tip, ~2mm)을 펙틴 분해 효소 용액 (100mM 시트르산 버퍼에 2% 셀룰라아제 R-10 [C224, Phytotechnology Laboratories] 및 1% 펙토리아제 Y-23 [P8004.0001, Duchefa])으로 37℃에서 90분간 처리하였다. 뿌리를 냉장된 Carnoy 용액과 함께 마이크로 튜브에 옮기고, 실온에서 30초 동안 볼텍싱하였다. 이후 상층액을 버리고 펠렛을 적절한 양의 (9:1 v/v) 아세토-에탄올에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 미리 세척된 슬라이드에 피펫팅하고 습도가 높은 챔버에서 예열하였다. 공기에서 건조 후 슬라이드를 2% 포름알데히드 (Vran et al., 2012)에 5분간 고정하고, 증류수에 신속히 담가서 일련의 에탄올 처리 (70%, 90% 및 100%)로 탈수시켰다.
실시예 4. 형광동소혼성화 (fluorescence in situ hybridization, FISH)
FISH 절차는 Lim et al. (2017) 및 Waminal et al. (2012)의 방법을 변형하여 수행하였다. 혼성화 혼합물은 100% 포름아마이드, 50% 덱스트란 설페이트, 20X SSC, 각 DNA 프로브 50ng/μL 및 시그마 워터 (sigma water)로 제조하였다. 혼합물을 각 슬라이드 상에 피펫팅하였다. 슬라이드를 80℃에서 5분간 배양하고 37℃의 습한 챔버로 옮겨 밤새 인큐베이션하였다. 하룻밤동안 혼성화 후, 배양된 슬라이드를 실온에서 2x SSC로 10분, 42℃에서 0.1x SSC로 25분, 실온에서 2x SSC로 5분 동안 세척 후 일련의 알코올 (70%, 90%, 95%) 처리로 탈수시켰다. 슬라이드를 공기 건조시키고 1:100 DAPI (100 μg/ml 스톡: vectashield (Vector Labs, H-1000, USA)의 비율로 4',6-디아미니디노-2-페닐린돌 (DAPI)로 대조염색하였다. 슬라이드는 오일 렌즈 (x100 배율)를 사용하여 CCD 카메라 (CoolSNAPTM cf)가 내장된 올림푸스 BX53 형광 현미경으로 관찰하였다. 데이터 이미지는 Adobe Photoshop CS6을 사용하여 완성하였다. 동종 염색체는 FISH 신호, 형태학적 특성 및 길이를 기준으로 확인하였다. 염색체 유형은 Levan et al. (1964)에 따라 분류되었다.
실험예 1: 게놈-특이적 microsatellite 프로브를 이용한 FISH 분석
각 프로브의 염색체 내 위치 및 분포는 도 1에 도시된 바와 같다. 신속한 FISH 분석 결과 MsatA는 배추 (B. rapa)의 하위텔로미어 영역에 혼성화되고 MsatC는 양배추 (B. oleracea)의 중간 영역에 혼성화되어 각각 A 및 C 게놈 염색체를 확인하였다. MsatBR은 각각 다른 분포로 B 및 R 게놈에서 검출되었다.
실험예 2: 이질사배체에서 게놈 식별
이질사배체 (B. juncea, B. napus, B.carinata 및 xBrassicoraphanus)종이 MsatA, MsatBR 및 MsatC와의 FISH에 적용되었다. 그 결과, 도 2에서 나타낸 바와 같이, B.juncea (AABB 게놈, 2n = 4x = 36)에서 MsatA_2_OP 및 MsatBR_1_OP을 이용하여 각각 20개의 A 및 16개의 B 게놈 염색체를 명확하게 식별하였다. 또한 도 3에서 나타낸 바와 같이, B.napus (AACC 게놈, 2n = 4x = 38)에서 MsatA_2_OP 및 MsatC_6_OP를 이용하여 각각 20개의 A 및 18개의 C 게놈 염색체를 식별하였다. 또한 도 4에서 나타낸 바와 같이, B. carinata (BBCC 게놈, 2n = 4x = 34)에서 MsatBR_1_OP 및 MsatC_6_OP를 이용하여 각각 16개의 B 및 18개의 C 게놈 염색체가 명확히 식별되었으며, 도 5에서 나타낸 바와 같이, xBrassicoraphanus (AARR 게놈, 2n = 4x = 38)에서 MsatA 신호가 20개의 A 게놈 염색체의 하위텔로미어 영역에서 검출되었고, MsatBR은 18개의 R 게놈 염색체에서 강한 신호를 나타내는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Sahmyook University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> DNA repeat based pre-labelled oligoprobes for rapid and efficient FISH in Brassica and Raphanus <130> KPA01571 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 tttagggtta ggtagggttt agggtta 27 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 agngagagag agagagagag ag 22 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 ttcggttcgg ttcggttcgg ttcgg 25 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 4 tttagggtta ggtagggttt agggtta 27 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Brassica nigra <400> 5 agagagagag agagagagag ag 22 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 6 ttcggttcgg ttcggttcgg ttcgg 25 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 7 ggatgcgatc ataccagcac taaagcaccg 30 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 8 cccatcagaa ctccgaagtt aagcgtgct 29 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 9 gcgagagtag tactaggatg ggtg 24 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 10 cctgggaagt mctcgtgttg cayycc 26 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 11 ccggagaagg gagcmtgaga aacggctac 29 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 12 atccaaggaa ggcagcaggc gcgcaa 26 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 13 gggcaagtct ggtgccagca gccgcggt 28 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 14 tcgaagacga tyagataccg tcstagt 27 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 15 tttagggttt agggtttagg gtttagggtt a 31

Claims (8)

  1. 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 핵산서열들을 포함하는, 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus) 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 핵산 프로브 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 핵산 프로브 조성물은 배추속 또는 무속 식물 유전체 유래 반복서열과 특이적으로 혼성화 되는 것을 특징으로 하는, 핵산 프로브 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 반복서열은 서열번호 4, 5 또는 6으로 표시되는 것인, 핵산 프로브 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 식물은 배추속 또는 무속 잡종식물인 핵산 프로브의 말단이 형광물질로 표지된 것인, 핵산 프로브 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 핵산 프로브 조성물은 FISH (fluorescence in situ hybridization)을 수행하기 위한 것임을 특징으로 하는, 핵산 프로브 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 핵산 프로브 조성물을 포함하는, 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus) 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 조성물.
  7. 제 6항의 조성물을 포함하는, 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus) 식물의 유전체 검색 및/또는 정량을 위한 키트.
  8. (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산 프로브 조성물을 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus) 식물의 유전체 유래 반복서열을 포함하는 시료와 혼합하여 혼성화시키는 단계; 및
    (b) 상기 핵산 프로브 조성물의 혼성화 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 배추속 (Brassica) 또는 무속 (Raphanus) 식물의 유전체를 검색하는 방법.
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