CN107058602B - 小麦叶锈菌est-ssr分子标记的引物组及其检测方法和应用 - Google Patents
小麦叶锈菌est-ssr分子标记的引物组及其检测方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及植物保护领域，具体公开了小麦叶锈菌EST‑SSR分子标记的引物组及其检测方法和应用。所述小麦叶锈菌EST‑SSR分子标记的引物组包括核苷酸序列SEQ ID No：1～74所示引物；利用所述引物组对叶锈菌遗传多样性的检测方法，对小麦叶锈菌多样性和群体遗传结构进行分析，具有操作简单，检测方便，PCR扩增结果稳定，电泳条带清晰，多态性丰富的特点，对小麦叶锈菌毒性监测和遗传多样性分析发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明属于植物保护领域，具体涉及一种小麦叶锈菌EST-SSR分子标记的引物组及其检测方法和应用。
背景技术
小麦叶锈病是小麦生产上危害严重的病害之一，利用抗病品种是最安全、经济、有效的防治手段。然而，由于小麦叶锈菌不断变异，毒性频率每年都会发生变化，导致小麦的抗性基因不断“丧失”，造成抗病品种的使用寿命速度缩短，因此，了解小麦叶锈菌的遗传多样性及群体动态变化具有重要意义。
小麦叶锈病菌遗传变异快，有效监测其遗传变化趋势，可以有效控制该病害的发生。目前用于小麦叶锈菌监测的分子标记以RAPD和AFLP分子标记为主，RAPD检测往往随机性强，条件不易控制；AFLP虽然揭示的多态性强，但检测步骤较为繁琐。而SSR、EST-SSR具有检测方便，可定位于特定染色体等优势。但是在小麦叶锈菌中SSR及EST-SSR标记、利用的研究非常有限，目前只有Szabo等报道了25对小麦叶锈菌SSR标记用于小麦叶锈菌多态性检测；Wang等2010年开发出了21对小麦叶锈菌EST-SSR标记；Sipahi通过搜索NCBI中EST数据库并筛选验证获得了10对新的小麦叶锈菌EST-SSR引物，这些引物的开发虽然为小麦叶锈菌的遗传多样性分析提供了有力的工具，但对于揭示小麦叶锈菌的遗传多态性远远不够，在一定程度上限制了小麦叶锈菌毒性的监测和遗传多态性的研究。因此非常必要继续开发新的分子标记。
发明内容
针对小麦叶锈菌监测的随机性强，条件不易控制，步骤较为繁琐的问题，本发明提供小麦叶锈菌EST-SSR分子标记的引物组及其检测方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
小麦叶锈菌EST-SSR分子标记的引物组，所述引物组包括核苷酸序列SEQ ID No：1～74所示引物。引物列表如表1所示。
表1 37对引物序列信息
本发明所提供的小麦叶锈菌EST-SSR分子标记的引物组，具有PCR扩增结果稳定，多态性丰富的特点。
本发明所述对叶锈菌遗传多样性的检测方法，至少包括如下步骤：
(1)小麦叶锈菌全基因组DNA提取；
(2)PCR扩增：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55-59℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，72℃延伸2min，10℃保存；
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：取扩增产物，加入变性载样指示剂，在浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，300V恒压电泳约1h，然后银染显色；
(4)小麦叶锈菌遗传多样性检测：构建ESR-SSR标记0、1矩阵，用NTSYS–pc 2.10e软件进行非加权平均(UPGMA)聚类分析。
本发明所提供的对叶锈菌遗传多样性的检测方法，利用小麦叶锈菌EST-SSR分子标记的引物组对叶锈菌遗传多样性进行检测，操作简单，检测方便；
本发明所述引物组应用于小麦叶锈菌多样性和群体遗传结构分析，对小麦叶锈菌毒性监测和遗传多样性分析发挥重要作用。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
(1)本发明所提供的小麦叶锈菌EST-SSR分子标记的引物组，具有PCR扩增结果稳定，多态性丰富的特点；
(2)利用本发明小麦叶锈菌EST-SSR分子标记的引物组的检测方法，操作简单，检测方便；
(3)本发明小麦叶锈菌EST-SSR分子标记的引物组，可用于小麦叶锈菌多样性和群体遗传结构分析，对小麦叶锈菌毒性监测和遗传多样性分析发挥重要作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
本发明提供小麦叶锈菌EST-SSR分子标记的引物组，所述引物组包括核苷酸序列SEQ ID No：1～74所示引物；所述引物由上海生工生物工程公司合成。小麦叶锈菌菌株由河北农业大学小麦锈病研究中心提供，如表2所示。
表2 37对引物的分子遗传特征
所选用的Illumina Hiseq 2000测序系统是一种高通量测序技术，这种测序技术通过将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的表面，这些DNA片段通过延长和桥梁扩增，形成了具有数以亿计cluster的Flowcell，每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板，然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序，这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序，排除了序列方面的特殊错误，能够测序同聚物和重复序列，这种技术避免了像传统测序技术那样耗费大量人力、物力进行片段克隆、转化、质粒抽提等繁琐的操作；
所用MISA软件工具提供批量识别和定位简单重复序列(SSR)，EST序列或是基因组序列都可以；另外，还提供一个与批量设计引物Primer3的接口工具，通过这个工具，可以把MISA识别出来的SSR，转为Primer3需要的格式，从而方便批量设计引物；
所用Primer 3是一个设计引物的软件，与MISA软件配合使用，设计本发明所需的37对引物，并由上海生工生物工程公司合成。
本发明还提供一种对叶锈菌遗传多样性的检测方法，至少包括如下步骤：
(1)小麦叶锈菌全基因组DNA提取；
(2)PCR扩增：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55-59℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，72℃延伸2min，10℃保存；
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：取扩增产物，加入变性载样指示剂，在浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，300V恒压电泳约1h，然后银染显色；
(4)小麦叶锈菌遗传多样性检测：构建ESR-SSR标记0、1矩阵，用NTSYS–pc 2.10e软件进行非加权平均(UPGMA)聚类分析。
进一步地，所述PCR扩增体系为：模板DNA 2μL，Taq DNA聚合酶1U，dNTPs 1.0mmol/L，上下游引物各1.5μL，1×PCR缓冲液，用无菌蒸馏水补充反应体系至25.0μL。
进一步地，所述电泳所用的缓冲液为0.5×TBE，TBE(Tris硼酸)，是一种PCR技术中用到的缓冲液，用于电泳时，稀释并配成0.5×TBE使用。
进一步地，所述标记0表示相同迁移位置处无带，所述标记1表示相同迁移位置处有带，对有多态性的引物进行统计记录，易于区分且稳定存在的条带，忽略弱带和杂带，构建ESR-SSR标记0、1矩阵，利用NTSYS–pc 2.10e软件进行非加权平均(UPGMA)聚类分析。
本发明还提供一种所述的小麦叶锈菌EST-SSR分子标记的引物组在检测小麦叶锈菌群体遗传多样性中的应用。
为了更好的理解本发明的小麦叶锈菌EST-SSR分子标记的引物组及其检测方法和应用，下面通过进一步的实施例做更加详细的解释说明。
实施例1
小麦叶锈菌RNA-seq数据的获得及EST-SSR引物合成
提取小麦叶锈菌RNA，样品交由华大(深圳)公司进行RNA-Seq测序。
通过Illumina Hiseq2000平台测序组装，从小麦叶锈菌中获得了46008个Unigenes，N50达到1064nt；利用MISA软件从46008个Unigenes序列中进行SSR位点搜寻，共获得3729个SSR位点，分布在3085个Unigenes中；利用Primer3软件设计引物，随机选取37对引物序列，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如表3所示。
表3 37对引物序列信息
实施例2
小麦叶锈菌全基因组DNA的提取
1)称取200μg左右的小麦叶锈菌夏孢子，分别装在2mL离心管中，放入液氮壶中预冷后，利用组织研磨仪充分研磨；
2)在离心管中迅速加入800μL 65℃预热的CTAB溶液(用前加入2％的巯基乙醇)，将离心管放入65℃水浴1h，期间每5min颠倒混匀一次样品；
3)待冷却至室温，加入800μL的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，混匀10min后，12000rpm离心15min；
4)吸上清，装入一新的离心管中，加入800μL氯仿：异戊醇(24:1)，混匀10min，然后12000rpm离心10min；
5)上清液转移至一新管中，加入1mL的-20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃条件下3～4h；
6)12000rpm离心10min，弃上清液；
7)向离心管中加入75％的乙醇洗涤2次，置于吸水纸上倒置晾干；
8)加入ddH2O(30～50μL)溶解。
实施例3
扩增体系为：25μL总体系中含模板DNA 2μL，Taq DNA聚合酶1U，dNTPs1.0mmol/L，上下游引物各1.5μL，1×PCR Buffer，其余用无菌蒸馏水补充反应体系至25.0μL。
反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55-59℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸2min，10℃保存。
检测方法为：取5μL扩增产物，加入0.5μL变性载样指示剂，在浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，300V恒压电泳约1h，然后银染显色。
实施例4
小麦叶锈菌遗传多样性检测
对来自河北和新疆的48个小麦叶锈菌DNA进行多态性筛选，对有多态性的引物进行统计记录。相同迁移位置处无带记为0，有带记为1。统计易于区分且稳定存在的条带，忽略弱带和杂带，构建ESR-SSR标记0、1矩阵，利用NTSYS–pc 2.10e软件进行非加权平均(UPGMA)聚类分析。
利用本发明的一组引物对48个小麦叶锈菌基因组进行扩增，遗传多样性分析结果表明，每个EST-SSR引物的等位基因数目1-4个不等，平均等位基因数1.97个。供试的48株菌株间分子标记多态性相似系数为0.83-1.00，在相似系数0.88处，供试菌株被聚类为5组，其中S1组中有15株，全部来自河北；S2组中有6株，也全部来自河北；S3组共有6株，全部来自新疆；S4组中共有18株，除了12号菌株来自河北外，其他17株全部来自新疆；S5组中共有3株，其中两株来自河北，1株来自新疆。从地区间的菌株聚类情况分析，来自河北的菌株，主要聚类在S1和S2组中，来自新疆的菌株主要聚类在S3、S4组中，S5组与其他4组遗传距离较远，并且河北和新疆的菌株都有分布。综合结果来看，两个地区的小麦叶锈菌大部分分别被聚类到不同的组中，表明小麦叶锈菌的EST-SSR多态性和地理分布来源有较为密切的相关性。而不同地区的菌株有一部分被聚类在一起，说明地区间可能有基因交流或相同起源的菌株，使不同地区间的小麦叶锈菌具有相同或相近的EST-SSR基因型。同一地区的菌株聚类在不同的组或亚组，说明一定范围内的小麦叶锈菌可能发生广泛的遗传变异，使群体趋于多样化。由此说明，本发明的一组EST-SSR引物可用于小麦叶锈菌多样性和群体遗传结构分析。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 河北农业大学
<120> 小麦叶锈菌EST-SSR分子标记的引物组及其检测方法和应用
<130> 2017
<160> 74
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
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<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 59
ggtcctggta ggacagcatc t 21
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 60
gtcctgctcg agaagccat 19
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 61
atttgttttc agagtcgccg 20
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 62
agttgatgga cggggtgtt 19
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 63
agcacgacca ccgactacat 20
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 64
ctggtgttct ctgggttgag at 22
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 65
atcttatcga ctagttcggc ctc 23
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 66
accagatcag tcctgtgaac aat 23
<210> 67
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 67
gaaattcatc caactgctca ctc 23
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 68
tcaagagttc tttctgttga ggg 23
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 69
gcatgtatga gagggacaaa gtc 23
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 70
tcttgatact ttgagtgaag ccc 23
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 71
ctctcatgaa tcccatgaac act 23
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 72
ggtgtgtatg ttgtgtagag cga 23
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 73
tattgacgag tgaagaccag ctt 23
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 74
aaaccagcct acgacttatc tcc 23
Claims (6)
1.一种小麦叶锈菌EST-SSR分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列SEQ ID No：1～74所示引物。
2.利用权利要求1所述的小麦叶锈菌EST-SSR分子标记的引物组对叶锈菌遗传多样性的检测方法，其特征在于，至少包括如下步骤：
(1)小麦叶锈菌全基因组DNA提取；
(2)PCR扩增：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55-59℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，72℃延伸2min，10℃保存；
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：取扩增产物，加入变性载样指示剂，在浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，300V恒压电泳0.8-1.2h，然后银染显色；
(4)小麦叶锈菌遗传多样性检测：构建ESR-SSR标记0、1矩阵，用NTSYS–pc 2.10e软件进行非加权平均聚类分析。
3.如权利要求2所述的对叶锈菌遗传多样性的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为：模板DNA 2μL，Taq DNA聚合酶1U，dNTPs 1.0mmol/L，上下游引物各1.5μL，1×PCR缓冲液，用无菌蒸馏水补充反应体系至25.0μL。
4.如权利要求2所述的对叶锈菌遗传多样性的检测方法，其特征在于，所述电泳所用的缓冲液为0.5×TBE。
5.如权利要求2所述的对叶锈菌遗传多样性的检测方法，其特征在于，所述标记0表示相同迁移位置处无带，所述标记1表示相同迁移位置处有带。
6.如权利要求1所述的小麦叶锈菌EST-SSR分子标记的引物组在检测小麦叶锈菌群体遗传多样性中的应用。
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