CN110205400B - 一种检测小麦叶锈菌的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病原菌检测技术领域，尤其涉及一种检测小麦叶锈菌的试剂盒及鉴别方法。该试剂盒中包括5条等温扩增引物，其序列如SEQ ID NO.1～5所示。该5条引物以人为选定的小麦叶锈菌特异性序列(如SEQ ID NO.6)为基础而设计得到，含有小麦叶锈菌DNA片段的待测物能够利用上述引物进行大量扩增，所得的扩增产物可以与荧光染料发生颜色变化，而不含小麦叶锈菌DNA片段的待测物则不会产生任何扩增，不与荧光染料发生颜色变化，从而能够快速鉴别待测物中是否含有小麦叶锈菌DNA，且其他病原菌对该结果无干扰，检测灵敏度高、特异性好、检测率高。
Description
技术领域
本发明涉及病原菌检测技术领域，尤其涉及一种检测小麦叶锈菌的试剂盒及检测方法。
背景技术
小麦叶锈菌是一种严重危害小麦生产的真菌性气传病害，发生范围广、破坏性强、循环式侵染、专性寄生、流行成灾率高，可导致小麦减产甚至绝收。小麦锈菌在成功侵染寄主小麦后，一般具有9～14天甚至更长时间的潜育扩展阶段，在此期间，寄主小麦的发病症状不明显，难以被观测到，当叶锈病症状一旦显现时，大量病原菌孢子已在小麦叶片上大量繁殖产生，并可随气流进行大范围的传播扩散，导致病害的流行爆发。并且，在苗期小麦上条锈病等农作物病症和叶锈病的典型症状差异不明显，易被混淆，难以针对小麦叶锈菌开展及时有效的防治工作。因此，在侵染初期准确检测小麦叶锈菌对于控制病害发生、规避病害流行风险具有重要意义。
在农作物病害诊断和病原菌鉴定方面，DNA/RNA探针技术和聚合酶链式反应(PCR)由于具有强专化性、高灵敏度以及程序化试验操作等优势，已被越来越广泛地推广应用。常规PCR技术检测的操作过程包括样品DNA提取、PCR扩增，以及对扩增产物进行电泳分离、荧光检测，虽然准确性和可靠性均较高，但操作步骤繁琐，耗费时间长、检验仪器昂贵。环介导等温扩增技术(LAMP)通过针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，在15-60分钟内即可实现109-1010倍的扩增，产生的大量扩增产物可通过肉眼观察，灵敏度高，操作简单，对仪器要求低。但环引物间的非特异性配对可导致假阳性结果，使检测结果判断失误。
发明内容
针对现有常规PCR技术检测小麦叶锈菌步骤繁琐、耗费时间长、LAMP技术存在假阳性结果的问题，本发明提供了一种检测小麦叶锈菌的试剂盒。
以及，本发明还提供了检测小麦叶锈菌的方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种检测小麦叶锈菌的试剂盒，包括5条等温扩增引物，所述等温扩增引物的序列(如SEQ ID NO.1～5所示)为：
F3：5′-TCTGTAGATCCGCCTCAG-3′；
B3：5′-GCAATTTTAACCCTAGTTACAACTT-3′；
FIP：5′-CGCCAAACCACATGTACATATGTAA-CAAGGGGGATCCTGACTAC-3′；
BIP：5′-GTAGCGCTGACACGTCACAA-TCCTTGTAACTATACTCCTTCC-3′；
LB：5′-GCCATAACTCAGTAACTCAG-3′。
本试剂盒中的5条等温扩增引物以人为选定的小麦叶锈菌的特异性序列(如SEQID NO.6)为基础而设计得到，包括第一外引物F3、第一内引物B3、第二外引物FIP、第二内引物BIP及一条环引物LB。含有小麦叶锈菌DNA片段的待测物能够利用上述引物进行大量扩增，所得的扩增产物可以与荧光染料发生颜色变化，而不含小麦叶锈菌DNA片段的待测物(包括不含病原菌和含有其他病原菌的待测物)则不会产生任何扩增，因此，利用该试剂盒中的引物进行等温扩增后仅需进行颜色观察即可判断待测物中是否含有小麦叶锈菌DNA，且其他病原菌对该结果无干扰，不会出现假阳性结果，检测灵敏度高、特异性好、检测率高，具有反应时间短、操作简单、准确度高、便于观察结果的优势。
优选地，所述试剂盒还包括10×等温扩增反应缓冲液(10×IsothermalAmplification Buffer)、硫酸镁、脱氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTP Mix)、甜菜碱(Betaine)和DNA聚合酶。
以及，本发明实施例还提供了一种检测小麦叶锈菌的方法，用上述检测小麦叶锈菌的试剂盒对小麦叶锈菌进行检测。
该方法用上述试剂盒对小麦叶锈菌进行检测，快速、简便、准确，可实现小麦叶锈菌的快速检测，并能够与其他病原菌进行区别鉴定。
优选地，具体操作为：提取待测物的基因组DNA，用上述试剂盒进行环介导等温扩增，扩增完成后加入荧光染料。
优选地，所述环介导等温扩增的反应体系为：
反应温度为63～65℃，反应时间≥60min；反应完成后升温至80℃以上灭活DNA聚合酶。该扩增的反应体系简单、反应条件参数少，易于操作和控制，便于在多种场合进行操作，对试验场地要求低。其中等温扩增反应缓冲液中含有2mM硫酸镁，因此最终体系中硫酸镁浓度为8mM。
优选地，反应温度为63℃。
附图说明
图1为本发明实施例2中荧光检测结果；
图2为本发明实施例3中电泳分析结果。
图中：
1阴性对照；2～5小麦叶锈菌侵染程度不同的作物；6小麦条锈菌侵染作物；7玉米柄锈菌侵染作物；8燕麦杆锈菌侵染作物；9鹅观草叶锈菌侵染作物；10小麦根腐菌侵染作物；11小麦白粉菌侵染作物；12小麦叶锈菌阳性对照。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了一种检测小麦叶锈菌的试剂盒，具体包括：
(1)等温扩增引物：序列：
F3：5′-TCTGTAGATCCGCCTCAG-3′；
B3：5′-GCAATTTTAACCCTAGTTACAACTT-3′；
FIP：5′-CGCCAAACCACATGTACATATGTAA-CAAGGGGGATCCTGACTAC-3′；
BIP：5′-GTAGCGCTGACACGTCACAA-TCCTTGTAACTATACTCCTTCC-3′；
LB：5′-GCCATAACTCAGTAACTCAG-3′。
(2)10×等温扩增反应缓冲液(含有2mM硫酸镁)、硫酸镁、脱氧核糖核苷三磷酸混合物(10mM/每种)、甜菜碱。
(3)Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(8000U/mL)。
(4)无酶核水。
实施例2
本发明实施例提供了一种检测小麦叶锈菌的方法，用实施例1的试剂盒进行操作。
各待测物分别为被小麦叶锈菌、小麦条锈菌、玉米柄锈菌、燕麦杆锈菌、鹅观草叶锈菌、小麦根腐菌和小麦白粉菌侵染的农作物样品。步骤具体如下：
(1)环介导等温扩增反应
提取待测物的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，按以下反应体系及反应条件进行环介导等温扩增反应：
反应条件为：63℃水浴锅中保温60min，然后80℃保温10min。
(2)荧光染色
环介导等温扩增反应结束后在扩增产物中加入0.15μL荧光染料(SYBR Green I核酸染料)观察颜色变化。结果如图1所示，含有小麦叶锈菌DNA片段的待测物的反应管呈荧光绿色，含有其他病原菌的待测物的反应管无变化，仍呈染料本身的橙色。
说明含有小麦叶锈菌DNA片段的待测物发生了扩增，其他待测物未发生扩增反应。
以小麦叶锈菌作为阳性对照，将所得扩增产物进行电泳分离和荧光检测，以验证本方法的准确性，结果如图2所示，含有小麦叶锈菌DNA片段的待测物出现与阳性对照相同的条带，其他病原菌未发生扩增反应。
由以上结果可见，本发明所提供的试剂盒在小麦叶锈菌的检测以及其与其他病原菌的鉴别方面具有操作简便快捷、灵敏度好、准确度高、便于观察、不出现假阳性结果的优势。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北农业大学
<120> 一种检测小麦叶锈菌的试剂盒及检测方法
<130> 2019.5.31
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> F3
<400> 1
tctgtagatc cgcctcag 18
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> B3
<400> 2
gcaattttaa ccctagttac aactt 25
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> FIP
<400> 3
cgccaaacca catgtacata tgtaacaagg gggatcctga ctac 44
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> BIP
<400> 4
gtagcgctga cacgtcacaa tccttgtaac tatactcctt cc 42
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> LB
<400> 5
gccataactc agtaactcag 20
<210> 6
<211> 502
<212> DNA
<213> 特异性序列
<400> 6
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tgtgccaaga accgccaccc ta 502
Claims (6)
1.一种检测小麦叶锈菌的试剂盒，其特征在于，包括5条等温扩增引物，所述等温扩增引物的序列为：
F3：5′-TCTGTAGATCCGCCTCAG-3′；
B3：5′-GCAATTTTAACCCTAGTTACAACTT-3′；
FIP：5′-CGCCAAACCACATGTACATATGTAA-CAAGGGGGATCCTGACTAC-3′；
BIP：5′-GTAGCGCTGACACGTCACAA-TCCTTGTAACTATACTCCTTCC-3′；
LB：5′-GCCATAACTCAGTAACTCAG-3′。
2.根据权利要求1所述的检测小麦叶锈菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括10×等温扩增反应缓冲液、硫酸镁、脱氧核糖核苷三磷酸混合物、甜菜碱和DNA聚合酶。
3.一种检测小麦叶锈菌的方法，其特征在于，用权利要求1或2所述的检测小麦叶锈菌的试剂盒对小麦叶锈菌进行检测。
4.根据权利要求3所述的检测小麦叶锈菌的方法，其特征在于，具体操作为：提取待测物的基因组DNA，用上述试剂盒进行环介导等温扩增，扩增完成后加入荧光染料。
5.根据权利要求4所述的检测小麦叶锈菌的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的反应体系为：
反应温度为63～65℃，反应时间≥60min；反应完成后升温至80℃以上灭活DNA聚合酶。
6.根据权利要求5所述的检测小麦叶锈菌的方法，其特征在于，反应温度为63℃。
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2019
- 2019-06-27 CN CN201910567502.5A patent/CN110205400B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101748206A (zh) * | 2008-11-28 | 2010-06-23 | 河南农业大学 | 小麦条锈菌与叶锈菌的复合pcr检测鉴定试剂盒 |
| CN104975073A (zh) * | 2014-04-09 | 2015-10-14 | 河北农业大学 | 鉴定小麦叶锈菌生理小种thts特异引物应用 |
| CN105200122A (zh) * | 2014-11-17 | 2015-12-30 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 小麦条锈菌的定量检测试剂盒及其应用 |
| CN107058602A (zh) * | 2017-06-26 | 2017-08-18 | 河北农业大学 | 小麦叶锈菌est‑ssr分子标记的引物组及其检测方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110205400A (zh) | 2019-09-06 |
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