CN108796127A - 一种特异性检测百合斑驳病毒的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种特异性检测百合斑驳病毒LMoV的IC‑RT‑LAMP试剂盒及其检测方法，试剂盒主要包括特异性LMoV抗体IgG、特异性RT反向引物LMoV‑R、特异性LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂、LAMP扩增反应试剂、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品；特异性LAMP引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB组成；阴性对照品为ddH2O，阳性对照品为兰州百合LMoV CP基因标准品；本发明不用提取RNA，不需要酶标仪、PCR仪或荧光定量PCR仪等分子生物学专业仪器设备，在恒温水浴中即能完成扩增反应，特异性和灵敏度高，操作简便，适用性强，可用于监控百合LMoV病毒的发生、扩散和流行，适合在基层推广应用。

Description

一种特异性检测百合斑驳病毒的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种特异性检测百合斑驳病毒LMoV的IC-RT-LAMP试剂盒及其检测方法。
背景技术
百合是一种集观赏、食用和药用于一体的重要经济作物，长期无性繁殖使病毒不断积累，严重影响了产量和品质，其中百合斑驳病毒(Lily mottle virus, LMoV)是发生最普遍的病毒之一，其在世界范围内广泛分布，特别是在适合其寄主生长的所有温带地区及蚜虫媒介丰富的地区尤为普遍。最新的病毒病田间调查结果显示，LMoV也是兰州食用百合的主要病毒（Zhang et al., 2018）。病毒病造成百合种源严重退化，已成为限制我国百合生产和切花出口的重要原因之一。
LMoV侵染百合科植物常造成叶片有斑驳条纹甚至坏死斑，后期发展为花、叶片卷曲畸形，开碎色花，并常伴随植株矮小、花与球茎的减产等。LMoV属于马铃薯Y病毒科、马铃薯Y病毒属（Potyvirus），病毒粒子为弯曲线状且呈螺旋对称，大小（650～900）nm ×（11～15）nm。病毒基因组为单分子正链RNA，约9.4kb，具有potyvirus属成员的典型基因组结构特征，包括一个Poly（A）尾巴，编码一个由3095个氨基酸组成的分子量为351.0 kDa的多聚蛋白。多聚蛋白通过自我剪切后形成外壳蛋白（CP）等10个不同大小的功能蛋白。LMoV CP亚基由274 aa组成，大小为30kDa左右，组装成外壳包裹病毒RNA。
防治百合病毒病主要依靠准确的病毒检测、无毒种苗繁殖、病株移除以及检验检疫等。这些防治措施的前提是灵敏、准确、快速的病毒检测，因此LMoV的检测对于百合病毒病的防治具有重要的意义。
目前，针对LMoV的常用检测技术主要有酶联免疫吸附法（ELISA）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、免疫捕获(IC)-RT-PCR和实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法等。ELISA方法易污染，且交叉反应比较严重，假阳性多，灵敏性偏低；RT-PCR和Real-time PCR方法检测灵敏度高，但是上述方法操作复杂，对检测人员的技术要求高，还必须提取高质量的RNA，百合以及水仙、郁金香等球茎花卉种球富含多酚和多糖，提取的RNA中残留的多酚和多糖会严重影响检测的灵敏度和特异性；IC-RT-PCR结合了ELISA和RT-PCR两种方法的优点，不用提取RNA，但其灵敏度仍有待提高；除此之外，上述方法都必须依赖酶标仪、PCR仪或荧光定量PCR仪等昂贵的分子生物学专业仪器设备才能完成检测。
DNA环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP)是一种新型的核酸扩增技术。该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异性区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA酶在恒温条件下快速、高特异性地扩增靶基因，扩增产物是一系列反复重复的靶序列构成茎环结构和多环花椰菜样结构DNA片段的混合物，在电泳凝胶中呈阶梯状的特殊条带。在LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过肉眼观察判定结果。
与常规检测的PCR方法相比，LAMP技术在恒温水浴中即能完成扩增反应，具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优势，在食品安全监测、动植物病原物和医学病原物检测中被广泛应用。
由于现有百合病毒检测技术对检测人员的技术水平要求高，且必须依赖分子生物学专业仪器设备，因而在适用性上有很大的局限性，本发明将免疫捕获与LAMP技术有机结合，成功建立了IC-RT-LAMP技术特异检测百合斑驳病毒的方法。
IC-RT-LAMP结合了血清学和LAMP两种方法的优点，特异性好、灵敏度高、操作简便、在恒温水浴中即能完成扩增反应，比如可以是恒温水浴锅、水浴盆、水浴器等等，不需要酶标仪、PCR仪或荧光定量PCR仪等分子生物学专业仪器，更重要的是不用提取RNA，检测成本低，不受多糖多酚的影响，检测结果可用肉眼直接观测，非常适合百合、水仙、郁金香种球以及鳞茎的病毒检测，为LMoV病毒的高效防治提供可靠的技术依据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有LMoV病毒检测方法中技术要求高且依赖专业仪器设备的缺陷与不足，提供一种无需分子生物学专业仪器设备即能特异性高效检测百合斑驳病毒的IC-RT-LAMP方法；具体是将免疫学与LAMP技术巧妙地结合, 首先将LMoV病毒的特异性抗体包被在包被容器壁上用于特异性捕获检测样品中的LMoV粒子，起到浓缩和纯化病毒的作用，再以捕获的LMoV粒子为模板进行反转录RT再进行LAMP反应，即达到检测百合斑驳病毒的目的。该方法可以特异性地检测百合植株、种球、试管苗或组培苗中的LMoV，尤其适用于富含多糖多酚的百合种球以及鳞茎的病毒检测，检测过程不用提取RNA，操作简便，在恒温水浴中即能完成扩增反应，无需酶标仪、PCR仪或荧光定量PCR仪等专业的仪器设备，适用性强，与其他现有技术相比具有明显的优势。
本发明的目的是提供一种特异性检测百合斑驳病毒的IC-RT-LAMP试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种利用该IC-RT-LAMP试剂盒特异性检测百合斑驳病毒的方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种特异性检测LMoV病毒的IC-RT-LAMP试剂盒，包括特异性LMoV抗体IgG、特异性RT反向引物LMoV-R、特异性LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂和LAMP扩增反应试剂，其中特异性LAMP引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB，上述特异性RT反向引物LMoV-R以及LAMP引物组的序列如下：
LMoV-R：5’-GTCGTTGAGACCATACTCGT-3’；
F3：5’- TCCAGTTCCACACAAGCG -3’；
B3：5’- AGGTGCCCAGTGTTCACT -3’；
FIP：5’- CGATCACGCACTCTAGCCTCAGAGTCGATCGACTCGACCTG -3’；
BIP：5’- CGGCACCGTGGGAACATACCCCCTTGACCTTGGGTACGT -3’；
LF：5’- GCGCCACATCAATTGAAGCC -3’；
LB：5’- CCACGACTGAAGGCACTAGCAAC -3’。
本发明的关键在于LAMP扩增引物的设计；本发明设计的LAMP引物组，通过6条特异性引物，即正向外引物（F3）、反向外引物（B3）、正向内引物（FIP）、反向内引物（BIP）、正向环引物（LF）和反向环引物(LB)来识别靶基因（LMoV CP）的8个特异序列，即位于靶标基因5'端的F1、F2和F3区、3' 端的B1c、B2c和B3c区以及LF和LB区的序列；引物的位置均有严格的顺序性，8个不同位点完全匹配才能进行扩增，保证了LAMP扩增的高效性和特异性。
除此之外，所述第一链cDNA合成试剂由10mM dNTPs、 5×M-MLV 反应缓冲液、30U/μL RNase抑制剂、200U /μL M-MLV反转录酶和DEPC-H2O 组成；所述LAMP扩增反应试剂由10mM dNTPs、10×Thermpopol反应缓冲液、100mM MgSO4、8U/μL Bst DNA polymerase和ddH2O组成。
为了达到检测的要求，本发明的试剂盒还包括抗体包被缓冲液（CB）、磷酸缓冲液（PBS）、磷酸洗涤缓冲液（PBST）、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。
其中，所述抗体包被缓冲液CB为碳酸盐缓冲液，其浓度为0.05M，PH为9.6；所述磷酸缓冲液（PBS）和磷酸洗涤缓冲液（PBST）的浓度为0.02M，PH值为7.4；所述荧光染料检测液为1000×SYBR Green I；所述阴性对照品为ddH2O；所述阳性对照品为兰州百合LMoV CP基因标准品；所述阳性对照品序列如下：
兰州百合LMoV CP基因标准品：
GCTTCCAGTTCCACACAAGCGAGCCGATCGACTCGACCTGAGGCTGCAATTGATGTGGCACCGCAACAGAGTTCTGAGGCTAGAGTGCGTGATCGTGATGTTGATGCCGGCACCGTGGGAACATACCAAATCCCACGACTGAAGGCACTAGCAACAAAGATCAACGTACCCAAGGTCAAGGGGCGAATGATAGTGAACACTGGGCACCTTGTGAATTACAACCCAGACCAAACAGATATTTCAAATACAAGGTCAACCCAGAAGCAGTTTGAGGCTTGGTACAACGCAGTGAAAGACGAGTATGGTCTCAACGAC。
在另一方面中，本发明还提供了一种检测LMoV病毒的IC-RT-LAMP方法，其中使用本发明的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
步骤①抗体制备：纯化LMoV天然病毒粒子，用其免疫动物，获得特异性的LMoV抗体IgG；
步骤②免疫捕获IC：将步骤①获得的特异性的LMoV抗体IgG包被在反应容器中，特异捕获待测样品中的LMoV粒子；
步骤③反转录RT：以步骤②捕获的LMoV粒子为模板，利用LMoV的特异性RT反向引物LMoV-R和第一链cDNA合成试剂进行反转录RT反应获得第一链cDNA；
步骤④LAMP扩增：以步骤③得到的第一链cDNA作为模板，用LAMP特异性引物组和LAMP扩增反应试剂进行LAMP扩增；并以ddH2O作为阴性对照，以兰州百合LMoV CP基因标准品作为阳性对照；
步骤⑤分析判断反应产物：以步骤④中所得LAMP扩增结果判断待测样品中是否含有百合斑驳病毒。
其中：步骤①所述LMoV抗体可以为多克隆抗体或单克隆抗体，可以自制或从商业途径获得。
步骤④所述LAMP扩增的反应体系（以反应体系25μL为例）如下：50ng cDNA 1.0μL、10×Thermpopol buffer 2.5μL、100mM MgSO4 1.5μL、10mM dNTPs 3.5μL、10 μM B3 和F3Primer 各0.5μL、 10μM FIP 和BIP Primer 各4.0μL、10 μM LF和LB Primer各1.0μL、8U/μL Bst DNA polymerase 1.0μL、和ddH2O 补至25μL。
步骤④所述LAMP扩增的反应条件为：65-70℃恒温水浴中扩增60-100 min，随后80℃变性10 min，终止反应。
步骤⑤所述根据扩增结果判断病毒粒子是否为百合斑驳病毒的具体方法为荧光染料肉眼观察法或琼脂糖凝胶电泳检测技术。
其中荧光染料肉眼观察法为：取SYBR Green I 荧光染料反应液加入步骤④所述LAMP扩增的反应产物中，采用肉眼直接观察，若扩增产物出现绿色，说明SYBR Green I染料与双链DNA 结合，则为阳性反应，表示样品中含有LMoV；若扩增产物颜色为橙色则为阴性反应，表示样品中不含LMoV。
其中琼脂糖凝胶电泳检测技术为：将步骤④所述LAMP扩增的产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，若凝胶中存在明亮的弥散状核酸泳带，则为阳性反应，表示样品中含有LMoV；若凝胶中无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含LMoV。
本发明IC-RT-LAMP方法的检测对象是完整的病毒粒子，通过固相化的特异抗体捕获特定的病原物抗原，再利用病原物基因组序列特异的引物进行扩增，通过对扩增产物的检测和分析达到对完整病原物的检测。IC-RT-LAMP检测方法将血清学方法的特异性和分子生物学方法的灵敏性有机地结合起来，特异性强，灵敏度高，不需要专业的仪器设备，简化了操作过程，提高了检测效率。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明将血清学和LAMP扩增技术有机地结合，充分发挥两种检测方法的优越性，并根据LMoV CP基因序列设计了6条特异性LAMP扩增引物，采用LAMP技术建立一种简便、灵敏、特异地检测百合组织中LMoV的检测方法，结果可靠、稳定，为LMoV的有效防治提供有力的技术保障。
（2）本发明是用高质量的LMoV抗体IgG捕获待测样品中的LMoV粒子，提高了检测的特异性，减少了假阳性。
（3）本发明直接以捕获的LMoV病毒粒子作为检测对象进行RT-LAMP扩增，避免了RNA抽提，降低了实验难度。
（4）本发明通过颜色反应用肉眼可以直接判断结果，使检测结果更直观。
（5）本发明操作简便，不需酶标仪、PCR仪或荧光定量PCR仪等专业仪器设备，在恒温水浴中即能完成扩增反应，比如可以是恒温水浴锅、水浴盆、水浴器等等，检测成本低，特异性和灵敏度高，适用性强，可用于监控LMoV病毒的发生、扩散和流行，非常适合在基层推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例百合斑驳病毒IC-RT-LAMP扩增反应的荧光染料肉眼观察图；图中：1：阴性对照；2：LMoV感病组织；3：阳性对照；
图2为本发明实施例百合斑驳病毒IC-RT-LAMP扩增反应的电泳检测图；图中： M：500bp Marker；1：阴性对照；2：LMoV感病组织；3：阳性对照；
图3为本发明实施例百合斑驳病毒IC-RT-LAMP反应温度优化试验结果的电泳检测图；图中：M： 600bp Marker；1：阴性对照；2-8分别对应：56℃；58℃；60℃；62℃；65℃；68℃；70℃；
图4为本发明实施例百合斑驳病毒IC-RT-LAMP反应时间优化试验结果的电泳检测图；图中：M： 600bp Marker；1：阴性对照；2-6分别对应：20 min；40 min；60 min；80 min；100min；
图5为本发明实施例电泳分析IC-RT-LAMP检测百合感病样品中LMoV的特异性；图中：M：600bp Marker；1：阴性对照；2-4分别对应：LSV；CMV；LMoV。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1 阳性对照品的获得
1、总RNA的提取
将50-100mg感染LMoV的兰州百合叶片在液氮中研磨，用植物总RNA提取试剂盒提取感病组织的总RNA 。
2、引物设计与合成
根据GenBank上登录的兰州百合LMoV CP基因序列（GenBank登录号：MF781080）设计并合成了1对特异性正向（LMoV-F）和反向引物（LMoV-R）；其中上述引物序列如下：
LMoV-F：5’-GCTTCCAGTTCCACACAAG-3’
LMoV-R：5’-GTCGTTGAGACCATACTCGT-3’。
3、阳性对照品的制备
1）RT反应
利用兰州百合LMoV反向引物LMoV-R和 M-MLV反转录酶进行RT反应，合成cDNA第一链。
10μL RT反应体系如下: 总RNA 2μL，10μM LMoV特异性反向引物LMoV-R 1μL，DEPC-H2O 3μL，70℃变性10 min，迅速置冰上急冷2 min；再加入5×M-MLV buffer 2μL，10mM dNTPs 1μL，30U/μL RNase抑制剂0.34μL，200U /μL M-MLV反转录酶0.35μL和DEPC-H2O 0.31μL；混合后42℃水浴1h，70℃保温15 min，置冰上待用。
2）PCR反应
利用上述cDNA第一链为模板，在Taq DNA聚合酶作用下进行LMoV CP基因的PCR扩增。
PCR反应体系为25μL，包括：50ng cDNA 1μL， 5 U/μL Taq DNA聚合酶0. 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，2.5mM dNTPs 2μL，10μM正向引物LMoV-F 0.5μL，10μM 反向引物LMoV-R0.5μL，和ddH2O 18.3μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1min，循环扩增30次，最后72℃延伸7 min。
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段，利用克隆载体试剂盒将目的片段连接在pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，进行蓝白斑平板筛选；随机挑取3个白斑菌落分别接种在氨苄LB培养基上，37℃摇菌12～16h；使用质粒微量抽提试剂盒提取质粒；分别取2µL质粒，在与上述PCR反应体系相同的条件下进行PCR扩增；将PCR检测得到的阳性重组质粒测序；测序证实序列完全正确的阳性质粒，即为标准品，兰州百合LMoV CP基因对应的片段长度分别为315 bp；用NanoDrop ND-1000 核酸/蛋白分析仪测定标准品的OD260 nm和OD280nm值，根据OD260nm和OD280nm值计算质粒浓度。
4、结果：
经测序，上述设计的标准品与预期完全相符，回收的标准品片段序列如下：
兰州百合LMoV CP基因标准品序列：
GCTTCCAGTTCCACACAAGCGAGCCGATCGACTCGACCTGAGGCTGCAATTGATGTGGCACCGCAACAGAGTTCTGAGGCTAGAGTGCGTGATCGTGATGTTGATGCCGGCACCGTGGGAACATACCAAATCCCACGACTGAAGGCACTAGCAACAAAGATCAACGTACCCAAGGTCAAGGGGCGAATGATAGTGAACACTGGGCACCTTGTGAATTACAACCCAGACCAAACAGATATTTCAAATACAAGGTCAACCCAGAAGCAGTTTGAGGCTTGGTACAACGCAGTGAAAGACGAGTATGGTCTCAACGAC。
实施例2免疫捕获IC-RT-LAMP检测百合LMoV方法的建立
1、本发明中兔抗LMoV多克隆抗体IgG的制备方法：
1）LMoV天然病毒粒子的纯化：取50g冰冻LMoV感病兰州百合叶片，加200mL 0.5M，PH7.0的含0.1% β-巯基乙醇和0.01M EDTA的磷酸钾缓冲液，在冰冻研钵中研磨至匀浆，4层纱布过滤，取滤液；向滤液中加入200mL氯仿，搅拌15 min；5000g离心15 min，保留上清，弃沉淀；向上清液中加入7.5% PEG 6000（W/V）和4% 氯化钠（W/V）搅拌溶解静置30 min；8000g离心20 min；保留沉淀，重悬于0.5M，PH7.0的含0.1%β-巯基乙醇，0.01M EDTA和2%Triton X-100的磷酸钾缓冲液中，4℃过夜；10000g离心20 min，保留上清；加入6%PEG 6000（W/V）和3%氯化钠（W/V）搅拌溶解静置30 min；8000g离心20 min；保留沉淀，重悬于0.5M，PH7.0的含0.1%β-巯基乙醇，0.01M EDTA和2%Triton X-100的磷酸钾缓冲液中搅拌20 min；10000g离心20min，保留上清；25000g 4℃离心，2.5h；保留沉淀，将沉淀重悬于0.5M，PH7.0的含0.1%β-巯基乙醇和0.01 M EDTA的磷酸钾缓冲液中搅拌1h；5000g离心10 min，取上清液经RT-PCR、Western Blotting和胶体金免疫标记鉴定和验证后确定为LMoV病毒粒子用于后续免疫实验。
2）多克隆抗体IgG的制备：用上述纯化的1mg/mL天然LMoV病毒粒子作为免疫原免疫新西兰大白兔。
初次免疫中，将蛋白抗原与弗氏完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射。两周后进行加强免疫，将蛋白抗原与弗氏不完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射。以后每两周加强免疫一次，在第4次加强免疫后的5～7 d颈动脉采血，静至，离心，收集到的血清加入质量百分比浓度0.02%的叠氮钠，-20℃保存。所得抗血清依次通过20%、50%、33%三个饱和度的硫酸铵沉淀粗提后，透析至pH7.8的磷酸缓冲液，然后使用DE52阴离子交换柱进行纯化而获得兔抗LMoV多克隆抗体IgG。
2、免疫捕获IC：
1）取100mg感染LMoV的百合组织，加1mL PBS研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000 rpm离心2min，上清液即感病组织粗提液。
2）用0.05M，PH9.6的碳酸盐缓冲液将LMoV多克隆抗体IgG稀释后混合，使LMoV 抗体IgG的终浓度为1μg/mL；取100μL上述稀释的LMoV多克隆抗体 IgG加入0.2mL PCR管中，37℃孵育2h。
3）弃去包被液，用PBST洗3次，每次3 min; 加入100μL上述感病组织粗提液，37℃孵育2h。
4）弃去感病组织粗提液，用 PBST洗3次，ddH2O洗1次，短暂离心，吸去残液。
3、RT反应：
1) 在上述免疫捕获PCR管中加入浓度为10 μM的LMoV特异性反向引物LMoV-R 2μL,DEPC-H2O 8μL，混合后于70℃保温10 min，之后迅速冰浴2 min。
2）向上述PCR管中加入5×M-MLV buffer 4μL、10mM dNTPs 2μL、30U/μL RNase抑制剂0.68μL、200U /μL M-MLV反转录酶0.70μL、DEPC-H2O 补足至20μL，混合均匀后，42℃水浴1h，70℃保温15 min，得到cDNA第一链用于后续LAMP扩增。
4、LAMP扩增反应：
取一新的PCR管，按以下体系加入各试剂进行LAMP扩增，反应体系为25μL，包括50ngcDNA 1.0μL、10×Thermpopol buffer 2.5μL、100mM MgSO4 1.5μL、10mM dNTPs 3.5μL、 10μM B3 和 F3 Primer 各0.5μL、 10 μM FIP 和 BIP Primer 各4.0μL、 10 μM LF和 LBPrimer各1.0μL、8U/μL Bst DNA polymerase 1.0μL、ddH2O 4.5μL；并以ddH2O作为阴性对照，以兰州百合LMoV CP基因标准品作为阳性对照。
LAMP的反应条件为: 65-70℃扩增60-100 min, 随后80℃变性10 min，终止反应。
5、分析判断反应产物：
LAMP反应结束后，在PCR管内侧加 1μL 1000× SYBR Green I荧光染料工作液，盖紧PCR管，上下颠倒混匀，采用肉眼直接观察PCR管内混合液的颜色变化：
若混合液颜色变为绿色，说明SYBR Green I染料与双链DNA 结合，则为阳性反应，表示样品中含有LMoV；
若混合液颜色为橙色，则为阴性反应，表示样品中不含LMoV。
或者，结果的观察也可以采用琼脂糖凝胶电泳检测技术：取5μL LAMP反应产物进行1.5% 琼脂糖凝胶电泳，在1×TBE缓冲液环境中，100V稳压电泳30min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果：
若凝胶中存在明亮的弥散状核酸泳带，则为阳性反应，表示样品中含有LMoV；
若凝胶中无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含LMoV；
依据上述方法，经检测兰州地区食用百合和切花百合试管苗、植株及种球中的LMoV，荧光染料肉眼观察时，若混合液的颜色为绿色，或者电泳检测结果中若含有弥散状核酸片段，说明样品中含有百合斑驳病毒。
实施例3免疫捕获IC-RT-LAMP检测LMoV的特异性
为了分析免疫捕获IC-RT-LAMP检测LMoV的特异性，以最普遍感染百合的3个主要病毒（百合隐症病毒-LSV、黄瓜花叶病毒-CMV和 LMoV）的感病叶片为样品，分别用LMoV多克隆抗体IgG捕获病毒粒子，用上述实施例中的IC-RT-LAMP检测体系进行反应。以健康百合叶片为阴性对照，实验重复3次。
琼脂糖凝胶电泳结果显示，除了感染LMoV的百合叶片能够扩增出弥散状核酸泳带外，其余样品均没有扩增出核酸泳带。这表明本发明建立的IC-RT-LAMP方法具有很好的特异性。
序列表
<110> 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所
<120> 一种特异性检测百合斑驳病毒的IC-RT-LAMP试剂盒及其检测方法
<130> 2018
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 百合斑驳病毒(Lily mottle virus)
<400> 1
gtcgttgaga ccatactcgt 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 百合斑驳病毒(Lily mottle virus)
<400> 2
tccagttcca cacaagcg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 百合斑驳病毒(Lily mottle virus)
<400> 3
aggtgcccag tgttcact 18
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 百合斑驳病毒(Lily mottle virus)
<400> 4
cgatcacgca ctctagcctc agagtcgatc gactcgacct g 41
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 百合斑驳病毒(Lily mottle virus)
<400> 5
cggcaccgtg ggaacatacc cccttgacct tgggtacgt 39
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 百合斑驳病毒(Lily mottle virus)
<400> 6
gcgccacatc aattgaagcc 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 百合斑驳病毒(Lily mottle virus)
<400> 7
ccacgactga aggcactagc aac 23
<210> 8
<211> 315
<212> DNA
<213> 百合斑驳病毒(Lily mottle virus)
<400> 8
gcttccagtt ccacacaagc gagccgatcg actcgacctg aggctgcaat tgatgtggca 60
ccgcaacaga gttctgaggc tagagtgcgt gatcgtgatg ttgatgccgg caccgtggga 120
acataccaaa tcccacgact gaaggcacta gcaacaaaga tcaacgtacc caaggtcaag 180
gggcgaatga tagtgaacac tgggcacctt gtgaattaca acccagacca aacagatatt 240
tcaaatacaa ggtcaaccca gaagcagttt gaggcttggt acaacgcagt gaaagacgag 300
tatggtctca acgac 315

Claims (5)

1.一种特异性检测百合斑驳病毒LMoV的IC-RT-LAMP试剂盒，包括特异性LMoV抗体IgG、特异性RT反向引物LMoV-R、特异性LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂和LAMP扩增反应试剂，所述特异性LAMP引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB，所述特异性RT反向引物LMoV-R以及LAMP引物组的序列如下：
LMoV-R：5’- GTCGTTGAGACCATACTCGT-3’
F3：5’- TCCAGTTCCACACAAGCG-3’
B3：5’- AGGTGCCCAGTGTTCACT-3’
FIP：5’- CGATCACGCACTCTAGCCTCAGAGTCGATCGACTCGACCTG-3’
BIP：5’- CGGCACCGTGGGAACATACCCCCTTGACCTTGGGTACGT-3’
LF：5’- GCGCCACATCAATTGAAGCC-3’
LB：5’- CCACGACTGAAGGCACTAGCAAC-3’
其特征在于：所述试剂盒还包括LMoV抗体IgG 包被缓冲液（CB）、磷酸缓冲液（PBS）、磷酸洗涤缓冲液（PBST）、SYBR Green I荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品，所述阴性对照品为ddH2O；所述阳性对照品为兰州百合LMoV CP基因标准品；所述阳性对照品序列如下：
兰州百合LMoV CP基因标准品：
GCTTCCAGTTCCACACAAGCGAGCCGATCGACTCGACCTGAGGCTGCAATTGATGTGGCACCGCAACAGAGTTCTGAGGCTAGAGTGCGTGATCGTGATGTTGATGCCGGCACCGTGGGAACATACCAAATCCCACGACTGAAGGCACTAGCAACAAAGATCAACGTACCCAAGGTCAAGGGGCGAATGATAGTGAACACTGGGCACCTTGTGAATTACAACCCAGACCAAACAGATATTTCAAATACAAGGTCAACCCAGAAGCAGTTTGAGGCTTGGTACAACGCAGTGAAAGACGAGTATGGTCTCAACGAC。
2.一种采用如权利要求1所述的特异性检测百合斑驳病毒的IC-RT-LAMP试剂盒特异性检测百合斑驳病毒的检测方法，其特征在于：
①抗体制备：纯化LMoV天然病毒粒子，用其免疫动物，获得特异性的LMoV抗体IgG；
②免疫捕获IC：将步骤①获得的特异性的LMoV抗体IgG包被在反应容器中，特异捕获待测样品中的LMoV粒子；
③反转录RT：以步骤②捕获的LMoV粒子为模板，利用LMoV的特异性RT反向引物LMoV-R和第一链cDNA合成试剂进行反转录RT反应，以此获得第一链cDNA；
④LAMP扩增：以步骤③得到的第一链cDNA作为模板，用LAMP特异性引物组和LAMP扩增反应试剂进行LAMP扩增，并以ddH2O作为阴性对照，以兰州百合LMoV CP基因标准品作为阳性对照；
⑤分析判断反应产物：以步骤④中所得LAMP扩增结果判断待测样品中是否含有LMoV。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤①所述LMoV抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
4. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤⑤中根据扩增结果判断待测样品中是否含有LMoV的具体方法为荧光染料肉眼观察法；所述荧光染料肉眼观察法为：取SYBR Green I 荧光染料反应液加入步骤④所述LAMP扩增的反应产物中，采用肉眼直接观察，若扩增产物出现绿色，说明SYBR Green I染料与双链DNA 结合，则为阳性反应，表示样品中含有LMoV；若扩增产物颜色为橙色则为阴性反应，表示样品中不含LMoV。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤⑤中根据扩增结果判断待测样品中是否含有LMoV的具体方法为琼脂糖凝胶电泳检测技术；所述琼脂糖凝胶电泳检测技术为：将步骤④所述LAMP扩增的反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物呈明亮的弥散状核酸泳带，则为阳性反应，表示样品中含有LMoV；若扩增产物无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含LMoV。
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