CN113862338B - 一种检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物及gica-rt-lamp试剂盒 - Google Patents

一种检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物及gica-rt-lamp试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物及GICA‑RT‑LAMP试剂盒，涉及剪秋萝斑驳病毒检测技术领域。本发明提供的检测引物组合物可以进行RT‑LAMP扩增，F3、B3、FIP、BIP、LF和LB共6条特异性引物识别LycMoV CP靶基因的8个序列，特异性强，准确性高。本发明提供的剪秋萝斑驳病毒的检测卡可以实现剪秋萝斑驳病毒的快速筛查。而将二者联合的GICA‑RT‑LAMP试剂盒具有操作简单、检测准确度高、适用性好的优势。

Description

一种检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物及GICA-RT-LAMP试 剂盒
技术领域
本发明涉及剪秋萝斑驳病毒检测技术领域，具体而言，涉及一种检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物及GICA-RT-LAMP试剂盒。
背景技术
当归(Angelica sinensis(Oliv.)Diels)，是一种大宗名贵中药材，随着种植规模和地域的不断扩大，病毒病害频发。2020年，中国科学院西北生态环境资源研究院植物病害研究组对疑似病毒病感染的当归植株进行了RNA测序(Small RNA sequencing，sRNA-seq)，首次鉴定到了剪秋萝斑驳病毒(Lychnis mottle virus，LycMoV)。
LycMoV病毒属于伴生豇豆病毒科(Secoviridae)，可以通过机械传播，能够侵染荔枝，百合，牡丹，苜蓿等植物。LycMoV病毒具有两条RNA链，RNA1和RNA2各包含一个阅读开放框，RNA1编码蛋白酶辅助因子、RNA解旋酶、病毒基因组5’端结合蛋白、蛋白酶和聚合酶，RNA2编码运动蛋白、大外壳蛋白(coat protein,CP)和小外壳蛋白。
LycMoV病毒的检测体系尚不完善，目前的检测方法主要有高通量测序(High-throughput sequencing)或下一代测序(Next-generation sequencing,NGS)技术，以及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，但上述方法程序复杂，检测费用高、对仪器设备和检测条件要求高，需要长期经验积累和具有专业操作技能的人员才能完成，因此使用范围受到很大的局限，无法满足当归种植现场及田间快速检测的需求。对于以种子繁殖的当归作物，种子质量是产业发展的关键，种子病毒含量低，RNA提取难度大，依赖于核酸提取的NGS或RT-PCR及其衍生技术检测的准确性受到影响，急需开发出适用于种子病毒病害快速、灵敏检测的新技术或新方法。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物及GICA-RT-LAMP试剂盒以解决上述技术问题。
本发明将胶体金免疫层析检测GICA与LAMP技术有机结合，先通过胶体金免疫层析GICA技术富集待测样本中的病毒粒子，通过检测线的条带显色快速筛查并判断样本中的病毒感染情况；而利用富集到的病毒粒子作为模板，进行反转录RT和DNA环介导等温LAMP扩增，扩增产物经肉眼观察，即可精确判断样本中的病毒感染情况。由此成功建立了GICA-RT-LAMP技术特异性检测剪秋萝斑驳病毒(LycMoV)的方法。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物，引物组合物包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB；正向外引物F3的序列如SEQ ID NO.1所示，反向外引物B3的序列如SEQ ID NO.2所示，正向内引物FIP的序列如SEQ ID NO.3所示，反向内引物BIP的序列如SEQ ID NO.4所示，正向环引物LF的序列如SEQ ID NO.5所示，反向环引物LB的序列如SEQ ID NO.6所示。
上述引物组合物为发明人经过大量实验筛选出的具有高检测准确度和特异性的引物组合，采用该引物组合物可以进行RT-LAMP扩增，F3、B3、FIP、BIP、LF和LB共6条特异性引物识别LycMoV CP靶基因的8个序列，特异性强，准确性高。
采用检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物进行RT-LAMP扩增的方法，其包括：以待测样本的RNA提取物或待测样本经胶体金免疫层析后的硝酸纤维素膜上的结合物为模板，以引物组合物进行扩增反应；扩增反应的条件包括：
在62-66℃恒温水浴中扩增80-100min，随后80℃变性以终止反应。发明人发现，在上述扩增反应条件下，可以在较短的时间内获得109-1010个拷贝，且无需基因扩增仪等特定的分子生物学设备。在实际应用时，在恒温水浴(或者金属浴)条件下即可快速扩增，更便于检测人员在田间等环境下的快速检测。
在一种实施方式中，将胶体金免疫层析后的硝酸纤维素膜上(检测线)的结合物用刀片刮下，以其为模板进行扩增。
可选地，变性10-15min终止反应。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述扩增反应是以如下引物反应体系进行扩增反应：
引物反应体系中包括如下浓度(扩增反应的终浓度)的引物：
正向外引物F3和反向外引物B3分别为0.2μM-0.4μM；正向内引物FIP和反向内引物BIP分别为1.6μM-2.0μM；正向环引物LF和反向环引物LB分别为0.4μM-0.8μM。
发明人筛选发现，在上述特定的摩尔比条件下，可以更好地实现剪秋萝斑驳病毒的检出，扩增效率更高。
本发明还提供了一种剪秋萝斑驳病毒的检测卡，其包括在衬板上依次设置的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，胶体金结合垫上含有胶体金-剪秋萝斑驳病毒抗体的结合物，硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设置有检测T线和质控C线，检测T线包被有LycMoV的抗体IgG，质控C线包被有抗LycMoV抗体的二抗；检测T线上LycMoV的抗体IgG的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg蛋白；抗LycMoV抗体的二抗的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg蛋白；
胶体金结合垫上的剪秋萝斑驳病毒抗体的包被量为每1mL胶体金中含14-16μg的剪秋萝斑驳病毒抗体。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测卡还包括由下壳体和上壳体组成的卡槽，卡槽具有放置衬板的安装腔，衬板与下壳体的内壁固定连接，上壳体上间隔设置有加样窗和反应观察窗，加样窗空间上位于样品垫的上方，反应观察窗空间上位于硝酸纤维素膜的上方；上壳体与下壳体通过卡扣结构卡接。
本发明还提供了一种检测剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其包括剪秋萝斑驳病毒的检测卡和检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括RT-LAMP扩增反应试剂，RT-LAMP扩增反应试剂包括反转录酶、RNase抑制剂、dNTP混合物、反应缓冲液、MgSO4和DNA聚合酶。
在一种可选的实施方式中，反转录酶选自AMV反转录酶或M-MLV反转录酶，在其他实施方式中，上述反转录酶还可以是SupeSscript IV和/或其突变体、变异体和衍生物。
反应缓冲液选自ThermoPol反应缓冲液。
在一种可选的实施方式中，试剂盒还包括磷酸缓冲液、磷酸洗涤缓冲液、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。
在一种可选的实施方式中，阴性对照品为水，阳性对照品为剪秋萝斑驳病毒外壳蛋白CP基因片段标准品。
剪秋萝斑驳病毒外壳蛋白CP基因片段标准品的序列如SEQ ID NO.7所示：
ACTGAGTGGGGGCGGTTTTATAAGGGTTATCGGTACTTGAGATGCAAACCAACAGTTCGTTTGATTGGTTCAGGGCCCATACAGGCGAAGGGCCTCCTCTGGCTTTGTTATGATCCGTCGGAGACTCTTTCCAAATACCCAAGTAGGGAGAGGGCATTGGCACTGCAGGGAACCTGGTTCATGCCAGGTCGGCACGATTCTACTTCCCTCACTGTTCAGGAACTAGCAACACCTGCGGGTTTCTGTGATATGGATACGGATGTGAATGGCGCTTTCAAGGTGGTCATCATAAAGGATTTGGCCAATTTCGATGTTTCTGATTATGGGATGGAGTTGTCTATGTACCTAGAGGTTGAAAGGATAGGCCTTGGTGATGTCGTTGTTGGTGGTGAGCTCACAACATTCTACCCACTTCGGCAGGTAGTTCTTGATTATGAGCTTTCAACTACAACCTCTAGAGGAAAAGCGTTGGTTCTCCCCTTAAATCCTCTCCTACCTGCTCATGATGAAGCTCAGTTTTATCCAAGCTGCTCTTCTTCCATACTCGAGAATCATAGGTACTGGAAGGGGGTTCTTTCATTGGAGGTTGTTTTTAATCTCCCTGCCATGGCAGGAGGTATTGCCGAGCTCGCCTTTGCTTATGATACTTACGACAATGCAGACGGAGATACCTATCGGCGCTTTGGTTCTTCGGTAGTGGACTTAAGGGCTCATCGTATATTACGAGCTCGTATTCCCTTATCCGGTTATGGTGGTTATCTTGCTGGGGGCTCTGGTTCTCTTTTTGAGGTGAAGCCACAGACGGGCTTTGGAGACGTGCTGAAACTAGTCATACTTTTTACAGCACCGCTGCATATTAGCGATACCTCAAAAAGGGGTTCTGTTCTCGTCCGGTATCTTGGGCTTGAAGACCTGGACTATTTGGAGCCGGCTACTTCTATTGGCAGGTTGAACCCCAAGACAACGCTGGTGCCAAATGTTGCAGCCTCTGGAGGCCCCGTGATAAAGGTTGGTACTATAGAGTGGGAGGAGCCTTTTATTGCGAGAGTGCCACTTGGTTTGCGCCAGAAGACTTTTCGTCTAATGACAATTAATAAGTGGGCGCCTTCTGGTTTCCTCTTCTTCCCAGTTACACCTTCAGTTCATCTGCCACGAACAGCTGGGGGTTTTGAGGCTTCTCTGGAACAACAGTGTCCCCTCATGCATAGGAGCCAGGAGAATTGCCAGTGGAGAGGTACTCTTAAATACCACTTAACAGCACGGTTGGAGGGGGCAACTGAGCAGCTGGTTTTACCGCACCGCTCTTTAACTTTCTCCGCCGTCCTTTTAAGCAAGATTTTACCAGCACCATGTTTTGTGGATAATAGTACTTTCAAGCCCTTGCTCCCCCTGCTCTCTGTGAGGGATACTTTTTCCTTGGGCCAGGATCATCCCTTTGTCGAGTTCACCACGCCTCCAGGTAGGTGGATAAACACGCATTTTGGGGCCACTGAGCAATACACTTGGCGCACTTGTCCTGTGTGGGTTTTATTGCAGTTCCCACCAAAGACGATGGCCCAGCTTCATGTTAGAGATATCTCCCTTTGGGTTGAGCCAGACATTGAGTATAGACATCCCATGGGTGGTTTTCCTCTTACCATCCCAGATCCGTCCC。
在一种可选的实施方式中，DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶。
本发明还提供了一种采用检测剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒检测剪秋萝斑驳病毒的检测方法，其包括如下步骤：
(1)取待测溶液上样至剪秋萝斑驳病毒的检测卡的样品垫上，观察检测T线和质控C线的颜色变化，初次判断待测样品中是否含有剪秋萝斑驳病毒；
(2)若根据步骤(1)无法鉴别待测样品中是否含有剪秋萝斑驳病毒，进行反转录RT-LAMP扩增：将步骤(1)免疫富集反应后检测卡上的检测T线取下，以取下的检测T线作为模板，利用RT-LAMP检测引物组合物进行RT-LAMP扩增；根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品中是否含有剪秋萝斑驳病毒。
本发明提供的GICA-RT-LAMP试剂盒的检测对象是LycMoV病毒粒子，通过胶体金免疫层析GICA技术快速富集病毒粒子，初步判定待测样品的病毒感染情况；再利用病毒基因组序列的特异性引物进行RT-LAMP扩增，通过对扩增产物的分析达到精确检测病原物的目的。GICA-RT-LAMP检测方法将血清学方法和核酸检测方法有机地结合起来，特异性强，其灵敏度达到了85pg/mL，比普通GICA-RT-PCR灵敏10倍，检测过程无需提取核酸RNA，无需专业的仪器设备，简化了操作过程，降低了检测难度，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。
在一种可选的实施方式中，根据检测T线和质控C线的颜色变化初次判断待测样品是否含有剪秋萝斑驳病毒的具体方法为肉眼观察法；肉眼观察法为：
若检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带时，说明待测样品中含有剪秋萝斑驳病毒，无需进行反转录RT-LAMP扩增；
若检测T线没有颜色变化而仅质控C线出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染剪秋萝斑驳病毒，或感染剪秋萝斑驳病毒的含量低，则需进行反转录RT-LAMP扩增；
优选地，根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品是否含有剪秋萝斑驳病毒的具体方法为荧光染料肉眼观察法；荧光染料肉眼观察法为：
取荧光染料反应液在反应前加入RT-LAMP扩增反应管的管盖上，待LAMP扩增反应结束后，使荧光染料检测液与LAMP反应液混合，采用肉眼直接观察混合反应液的颜色。
在一种实施方式中，由于SYBR Green I会抑制LAMP反应，因此不适合反应前加SYBR Green I。待扩增反应完成后，通过甩管盖或离心的方式使管盖上的荧光染料检测液与LAMP反应液混合使得反应液显色。
在一种实施方式中，荧光染料反应液为SYBR Green I，若扩增产物出现绿色荧光，表示待测样品中含有剪秋萝斑驳病毒。
若扩增产物颜色为橙色则表示待测样品中不含剪秋萝斑驳病毒。
本发明还提供了如剪秋萝斑驳病毒的检测卡、检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物或用于检测剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒在检测剪秋萝斑驳病毒中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的检测引物组合物可以进行RT-LAMP扩增，F3、B3、FIP、BIP、LF和LB共6条特异性引物识别LycMoV CP靶基因的8个序列，特异性强，准确性高。此外，本发明提供的剪秋萝斑驳病毒的检测卡可以实现剪秋萝斑驳病毒的快速筛查。而将二者联合的GICA-RT-LAMP试剂盒具有操作简单、检测准确度高、适用性好的优势。
具体地，GICA-RT-LAMP方法克服了现有技术中剪秋萝斑驳病毒的检测方法繁琐，费时费力，必须依赖高通量测序仪、基因扩增仪等昂贵的分子生物学仪器设备，无法快速检测目标病毒等缺陷，将免疫学和LAMP扩增技术有机地结合，充分发挥了两种检测方法的优势，直接以胶体金免疫层析GICA富集到的LycMoV病毒粒子作为检测对象，进行RT-LAMP扩增，避免了RNA提取，降低了检测门槛和难度，反应在同一体系中连续进行，中途不需添加任何试剂，降低了污染风险。
其次，该检测方法直接以检测卡上的检测线为模板，进行RT-LAMP扩增，提高了检测的特异性，减少了假阳性的发生。
再次，该检测方法从根本上降低了检测仪器或设备的依赖程度，非常适合在基层推广应用，前景十分广阔。
此外，本发明既能应用于剪秋萝斑驳病毒LycMoV的快速筛查，也能应用于LycMoV病毒的精准监测，一举两得，为监控LycMoV病毒的发生、扩散、流行提供技术支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的胶体金免疫层析检测卡的平面结构示意图；
图2为图1的内部结构示意图；
图3为本发明实施例GICA-RT-LAMP试剂盒检测LycMoV病毒在不同反应温度下的荧光染料肉眼观察图；
图4为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测LycMoV病毒在不同反应时间下的荧光染料肉眼观察图；
图5为本发明提供的GICA-RT-LAMP试剂盒检测LycMoV病毒的特异性的荧光染料肉眼观察图；图中：1：阴性对照；2-12分别对应：健康当归组织；LSV百合感病组织；CMV-Li百合感病组织；LMoV百合感病组织；PlAMV百合感病组织；JHMV当归感病组织；AMV当归感病组织；LMV生菜感病组织；ALSV当归感病组织；LycMoV当归感病组织；
图6为本发明提供的GICA-RT-LAMP试剂盒检测LycMoV病毒的灵敏性的荧光染料肉眼观察图；图中：1：阴性对照；2-11分别对应LycMoV CP基因标准品浓度：10-1(8.5×103ng/mL)；10-2(8.5×102ng/mL)；10-3(8.5×101ng/mL)；10-4(8.5×100ng/mL)；10-5(8.5×10-1ng/mL)；10-6(8.5×10-2ng/mL)；10-7(8.5×10-3ng/mL)；10-8(8.5×10-4ng/mL)；10-9(8.5×10- 5ng/mL)；10-10(8.5×10-6ng/mL)；
图7为采用GICA-RT-PCR方法检测LycMoV病毒灵敏性的电泳结果图；图中：M：2000bp Marker；1：阴性对照；2-11分别对应LycMoV CP基因标准品浓度：10-1(8.5×103ng/mL)；10-2(8.5×102ng/mL)；10-3(8.5×101ng/mL)；10-4(8.5×100ng/mL)；10-5(8.5×10-1ng/mL)；10-6(8.5×10-2ng/mL)；10-7(8.5×10-3ng/mL)；10-8(8.5×10-4ng/mL)；10-9(8.5×10- 5ng/mL)；10-10(8.5×10-6ng/mL)。
附图标记：1-卡槽；2-加样窗；3-反应观察窗；4-样品垫；5-胶体金结合垫；6-硝酸纤维素膜；7-吸收垫；8-衬板；9-检测T线；10-质控C线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
参照图1和图2所示，本实施例提供了一种剪秋萝斑驳病毒的检测卡，其包括卡槽1。卡槽1由下壳体和上壳体(图中未示出标号)组成，本实施例中设置下壳体和上壳体卡扣相连。上壳体与下壳体留有放置衬板8的安装腔。衬板8与下壳体的一个端面固定连接。
在衬板8上依次设置有样品垫4、胶体金结合垫5、硝酸纤维素膜6和吸收垫7，胶体金结合垫5上含有胶体金-剪秋萝斑驳病毒抗体的结合物，硝酸纤维素膜6上沿层析方向依次设置有检测T线9和质控C线10，检测T线9包被有兔抗LycMoV的抗体IgG，质控C线10包被有抗LycMoV抗体的二抗；检测T线9上兔抗LycMoV的抗体IgG的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg蛋白；抗LycMoV抗体的二抗的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg蛋白，本实施例中的抗LycMoV抗体的二抗为羊抗兔IgG；胶体金结合垫5上的剪秋萝斑驳病毒抗体的包被量为每5mL胶体金中含70μg的剪秋萝斑驳病毒抗体。
上壳体上间隔设置有加样窗2和反应观察窗3，加样窗2空间上位于样品垫4的上方，反应观察窗3空间上位于硝酸纤维素膜6的上方。
本实施例提供了检测卡的制备方法，具体如下：
1、制备剪秋萝斑驳病毒(LycMoV)多克隆抗体IgG。
①LycMoV CP外壳蛋白的表达和纯化：从感染了LycMoV的当归叶片中提取总RNA进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，扩增LycMoV的CP外壳蛋白基因片段；通过酶切克隆至pET-28a载体；重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，37℃培养，IPTG诱导表达，镍柱亲和层析纯化获得大小为69.8kDa的LycMoV CP外壳蛋白；
②多克隆抗体的制备：用1mg/mL上述纯化的LycMoV CP外壳蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔；初次免疫中，将蛋白抗原与弗氏完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射；初次免疫21d后，将1.0mg/ml的纯化蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后，经皮下多点注射作为第一次增强免疫；以后每间隔21d进行一次增强免疫，免疫方式为皮下多点注射。一共进行3次增强免疫，在第4次增强免疫后的5～7d颈动脉采血，静至，离心，收集到的血清加入质量百分比浓度0.02％的叠氮钠，-20℃保存；所得抗血清通过饱和硫酸铵沉淀法，透析至pH7.8的磷酸缓冲液，然后通过Protein A亲和层析的方法对抗血清进行纯化获得兔抗LycMoV多克隆抗体IgG。
2、胶体金标记兔抗LycMoV多克隆抗体的方法。
分别取粒径为25nm的胶体金5mL及兔抗LycMoV多克隆抗体70μg，在pH 7.0的条件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加10％牛血清白蛋白(BSA)和5％PEG 20000作为稳定剂，使得终浓度分别为0.5％和0.2％，采用低温高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及去凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-抗体结合物。
3、胶体金结合垫的制备。
用胶体金溶液(标记前)1/10体积的重悬液悬浮步骤2的胶体金—抗体结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，37℃烘干，制成胶体金结合垫。
4、免疫层析膜(硝酸纤维素膜)的包被。
检测T线包被的是纯化的兔抗LycMoV多克隆抗体IgG，对照C线包被的是羊抗兔IgG抗体，每条线宽2mm，兔抗LycMoV多克隆抗体合适包被量为1.3μg蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为1.5μg蛋白。
5、胶体金免疫层析GICA检测卡的组装。
将作为支撑载体聚氯乙烯衬板体固定于检测卡槽下壳体中，上述的样品垫、胶体金结合垫、包被好的免疫层析膜和吸水滤纸依次排列连接于聚氯乙烯衬板上表面，再通过卡扣将GICA检测卡槽上壳体与下壳体连接。
本实施例还提供了上述检测卡的检测方法：
吸取少量样品的待检测溶液，滴在GICA检测卡槽上壳体加样窗2处，由于毛细效应液体往前移动，若待测液中含有LycMoV，检测样品经过胶体金结合垫时，LycMoV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向检测T线方向层析泳动，当接触到检测T线时，与检测T线上的LycMoV多克隆抗体发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未结合的复合物继续向质控C线方向渗移，当接触到质控C线时与固定在质控C线上的羊抗兔IgG抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带。即当检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了剪秋萝斑驳病毒LycMoV；
若待测液中不含LycMoV或LycMoV含量较低时，检测样品经过胶体金结合垫时，则不能与金标垫上的金标多克隆抗体结合或者结合的复合物量非常少，当接触到检测T线时不发生反应，金标多克隆抗体继续向质控C线方向渗移，当接触到质控C线时与固定在质控C线上的羊抗兔IgG抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带。即当检测线没有颜色变化而仅质控C线出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染剪秋萝斑驳病毒LycMoV，或感染剪秋萝斑驳病毒LycMoV的含量低，需要后续进一步的试验分析。
上述实施例可以看出，本发明提供的检测卡可初步对剪秋萝斑驳病毒进行快速筛查，田间地头及现场就地检测，在3～5分钟可初步判断被检样品的病毒感染情况，达到快速、简便、高效检测LycMoV的目的。
实施例2
本实施例提供了一种检测剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒。其包括实施例1制备的剪秋萝斑驳病毒检测卡；RT-LAMP特异性引物组合物和RT-LAMP扩增反应试剂。
RT-LAMP特异性引物组合物包括如SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3、SEQ IDNO.2所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP、SEQ ID NO.5所示的正向环引物LF和SEQ ID NO.6所示的反向环引物LB。
序列如下：
F3：5’-CGCTGGTGCCAAATGTTG-3’；
B3：5’-AGAAGCCTCAAAACCCCCA -3’；
FIP：
5’-GCGCAAACCAAGTGGCACTCTGAGGCCCCGTGATAAAGGT-3'；
BIP：
5’-ATAAGTGGGCGCCTTCTGGTTGCTGTTCGTGGCAGATGA-3’；
LF：5’-GCTCCTCCCACTCTATAGTACCA-3’；
LB：5’-TCCTCTTCTTCCCAGTTACACC-3’。
RT-LAMP扩增反应试剂由10U/μL AMV反转录酶、40U/μL RNase抑制剂、10mM dNTP混合物、10×ThermoPol反应缓冲液、100mM MgSO4、8U/μLBst DNA polymerase和RNA-freeH2O组成。
此外，GICA-RT-LAMP试剂盒还包括磷酸缓冲液(PBS)、磷酸洗涤缓冲液(PBST)、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。
磷酸缓冲液(PBS)和磷酸洗涤缓冲液(PBST)的浓度为0.02M，pH值为7.4；
荧光染料检测液为1000×SYBR Green I；
阴性对照品为RNA-free H2O；
阳性对照品为当归LycMoVCP基因标准品。
本实施例还提供了LycMoV CP基因标准品的制备方法。具体制备方法如下：
1、总RNA的提取。
将50-100mg感染LycMoV的当归叶片在液氮中研磨，用植物总RNA提取试剂盒提取感病组织的总RNA；
2、引物设计与合成。
根据小RNA测序得到的序列，设计并合成了一对LycMoV CP基因的特异性正向(LycMoV-F)和反向引物(LycMoV-R)；其中上述引物序列如下：
LycMoV-F：5’-ACTGAGTGGGGGCGGTTTTAT-3’
LycMoV-R：5’-GGGACGGATCTGGGATGGTA-3’；
3、阳性对照品的制备。
1)RT反应：
利用上述LycMoV反向引物LycMoV-R和M-MLV反转录酶进行RT反应，合成cDNA第一链；10μL RT反应体系如下:总RNA 2μL，10μM LycMoV特异性反向引物LycMoV-R 1μL，RNA-free H2O 3μL，70℃变性10min，迅速置冰上急冷2min；再加入5×M-MLV buffer2μL，10mMdNTPs 1μL，30U/μL RNase抑制剂0.34μL，200U/μL M-MLV反转录酶0.35μL和RNA-free 0.31μL；混合后42℃水浴1h，70℃保温15min，置冰上待用；
2)PCR反应：
利用上述cDNA第一链为模板，在Ex Taq DNA聚合酶作用下进行LycMoV CP基因的PCR扩增；
PCR反应体系为12.5μL，包括：50ng cDNA 0.5μL，5U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.1μL，10×PCR buffer 1.25μL，2.5mM dNTPs 1μL，10μM正向引物LycMoV-F 0.25μL，10μM反向引物LycMoV-R 0.25μL，ddH2O补足至12.5μL；
PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸105s，循环扩增35次，最后72℃延伸7min；
PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段，利用克隆载体试剂盒将目的片段连接在pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，进行蓝白斑平板筛选；随机挑取3个白斑菌落分别接种在氨苄LB培养基上，37℃摇菌12～16h；使用质粒微量抽提试剂盒提取质粒；分别取1μL质粒，在与上述PCR反应体系相同的条件下进行PCR扩增；将PCR检测得到的阳性重组质粒测序；测序证实序列完全正确的阳性质粒，即为阳性对照品(当归LycMoV CP基因标准品质粒)，当归LycMoV CP基因的片段长度为1654bp；用NanoDrop ND-1000核酸/蛋白分析仪测定标准品的质粒浓度。
3、阳性对照品的序列
经测序，上述阳性对照品与预期完全相符，回收的对照品片段序列如SEQ ID NO.7所示。
实施例3
本实施例提供了采用实施例2中的GICA-RT-LAMP试剂盒检测LycMoV的方法。
1、胶体金免疫层析GICA富集病毒粒子。
1)取100mg感染LycMoV的当归样品(自行采集)或其他待检样品放入3mL装有磷酸缓冲液PBS的自封袋中，用研棒轻轻研磨，研磨后的组织液即为待检样品的检测液；
2)吸取少量上述待测样品的检测液，滴在LycMoV胶体金免疫层析GICA检测卡加样窗2处，3-5分钟内在反应观察窗3内观察显色结果。
2、初次判断反应结果。
当上述LycMoV胶体金免疫层析GICA检测卡反应观察窗3内的检测T线9和质控C线10上均出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了剪秋萝斑驳病毒LycMoV，无需进行后续检测；
当上述LycMoV胶体金免疫层析GICA检测卡反应观察窗3内的检测T线9没有颜色变化，而质控C线10上出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染剪秋萝斑驳病毒LycMoV，或者感染LycMoV的程度轻，则需进行后续的反转录RT-LAMP检测。
3、RT-LAMP反应。
1)将上述反应结束的LycMoV胶体金免疫层析GICA检测卡的检测T线切下，用PBST冲洗三次，用消毒刀片小心地刮下T线区域，放入PCR管中；
2)在上述含有T线的PCR管中加入40U/μL RNase抑制剂0.15μL、10U/μL AMV反转录酶0.3μL、10×ThermoPol缓冲液1.25μL、100mM MgSO4 0.75μL、10mM dNTP混合物1.75μL、LAMP引物组合物1.0μL、8U/μLBst DNA polymerase 1.0μL、RNAse free H2O补足至12.5μL；以RNA-free H2O作为阴性对照，当归LycMoV CP基因标准品作为阳性对照；反应体系配置完成后，在PCR管盖内壁加1μL 100×SYBR Green I荧光染料工作液，盖紧PCR管盖，进行RT-LAMP反应；RT-LAMP的反应条件为:62-66℃扩增80-100min，随后80℃变性10min，终止反应。
LAMP引物组合物分别含2.5μM F3和2.5μM B3、20.0μM FIP和20.0μM BIP、以及10.0μM LF和10.0μM LB。
4、二次判断反应结果：
上述RT-LAMP反应结束后，在不开盖的情况下，离心或轻甩PCR管，使PCR管盖内壁上的SYBR Green I荧光染料与LAMP扩增产物混合，上下颠倒混匀，采用肉眼观察PCR管内混合液的颜色变化。
若混合液颜色变为绿色，说明SYBR Green I染料与双链DNA结合，则为阳性反应，表示被检样品中含有剪秋萝斑驳病毒LycMoV；
若混合液颜色为橙色，则为阴性反应，表示样品中不含剪秋萝斑驳病毒LycMoV。
实验例1
本实验例提供了实施例2中的GICA-RT-LAMP试剂盒检测LycMoV在不同反应温度和反应时间下的荧光染料肉眼观察实验，检测方法参照实施例3所示。
分别测试56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃和70℃的RT-LAMP扩增温度下扩增80min的扩增结果。图3所示，图中：1：阴性对照；2-9分别对应：56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃和70℃。由图可知，本发明实施例提供的扩增引物组合能在56-66℃条件下实现靶基因的高效扩增。
分别测试20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min的RT-LAMP扩增时间下扩增温度为64℃的扩增结果。图4所示，图中：1：阴性对照；2-10分别对应：20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min。由图可知，本发明实施例提供的扩增引物组合能在50-100min条件下实现靶基因的高效扩增。
实验例2
本实验例进行了GICA-RT-LAMP试剂盒检测LycMoV的特异性实验。
以感染百合、生菜、当归的10个常见病毒:百合隐症病毒LSV、百合黄瓜花叶病毒CMV-Li、百合斑驳病毒LMoV、百合车前草花叶病毒PlAMV、当归日本金鱼藻花叶病毒当归分离株JHMV、当归苜蓿花叶病毒AMV、生菜花叶病毒LMV、当归苹果潜隐球状病毒ALSV和当归剪秋萝斑驳病毒LycMoV的感病叶片(田间采集)为样品，分别在装有PBS缓冲液的自封袋中用研棒轻轻研磨，研磨后制成检测液滴加至剪秋萝斑驳病毒的检测卡的加样窗3，3-5分钟后观察显色结果；随后，再用上述实施例3中的GICA-RT-LAMP检测体系和检测方法进行RT-LAMP扩增，反应程序为64℃扩增100min，扩增结束后显色。
以健康当归叶片为阴性对照，每个样本重复检测3次。剪秋萝斑驳病毒的检测卡的显色结果显示，只有感染LycMoV的当归叶片样品的检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带，而其他样品的检测T线没有颜色变化，质控C线上出现棕红色的条带。
SYBR Green I荧光染料肉眼观察法结果显示，只有感染LycMoV的当归叶片的扩增产物出现绿色，其余感病叶片的扩增产物与健康当归叶片的扩增产物均为橙色(图5)；这表明本发明建立的GICA-RT-LAMP方法对LycMoV病毒检测的特异性高，与其他常见病毒均无交叉反应。
实验例3
本实验例进行了胶体金免疫层析GICA-RT-LAMP检测LycMoV的灵敏度实验。
以上述实施例2中当归LycMoV CP基因标准品为样品，经NanoDrop ND-1000核酸/蛋白分析仪测定浓度(8.5×104ng/mL)后，再用RNA-free H2O对上述标准品进行10倍比稀释，-20℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各稀释液1.0μL作为模板，加入上述实施例中的RT-LAMP反应试剂进行RT-LAMP扩增，反应程序为64℃扩增100min。
作为对比检测，将上述10倍比稀释后的各稀释液进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸105s，循环扩增35次，最后72℃延伸7min；
RT-LAMP反应结束后，SYBR Green I荧光染料肉眼观察法观察显色情况，结果显示GICA-RT-LAMP对当归LycMoV CP基因标准品的反应灵敏度为8.5×10-2ng/mL，即85pg/mL(图6)。
PCR反应结束后，取5μL扩增产物上样，琼脂糖凝胶电泳结果显示，GICA-RT-PCR对当归LycMoV CP基因标准品的反应灵敏度为8.5×10-1ng/mL，即850pg/mL(图7)，可见胶体金免疫层析GICA-RT-LAMP检测LycMoV的灵敏性是GICA-RT-PCR的10倍。
实验例4
取田间当归叶片样品，用剪秋萝斑驳病毒的检测卡富集病毒粒子，再用上述实施例中的GICA-RT-LAMP检测体系进行RT-LAMP扩增；
若剪秋萝斑驳病毒的检测卡的检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带，则判定被检样品感染了剪秋萝斑驳病毒LycMoV；
若剪秋萝斑驳病毒的检测卡检测T线没有颜色变化，而质控C线上出现棕红色的条带，同时荧光染料肉眼观察法显示绿色，说明样品中含有剪秋萝斑驳病毒LycMoV；
若剪秋萝斑驳病毒的检测卡检测T线没有颜色变化，而质控C线上出现棕红色的条带，同时荧光染料肉眼观察法显示橙色，说明样品中不含剪秋萝斑驳病毒LycMoV。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院西北生态环境资源研究院
<120> 一种检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物及GICA-RT-LAMP试剂盒
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgctggtgcc aaatgttg 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agaagcctca aaaccccca 19
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcgcaaacca agtggcactc tgaggccccg tgataaaggt 40
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ataagtgggc gccttctggt tgctgttcgt ggcagatga 39
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gctcctccca ctctatagta cca 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tcctcttctt cccagttaca cc 22
<210> 7
<211> 1654
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
actgagtggg ggcggtttta taagggttat cggtacttga gatgcaaacc aacagttcgt 60
ttgattggtt cagggcccat acaggcgaag ggcctcctct ggctttgtta tgatccgtcg 120
gagactcttt ccaaataccc aagtagggag agggcattgg cactgcaggg aacctggttc 180
atgccaggtc ggcacgattc tacttccctc actgttcagg aactagcaac acctgcgggt 240
ttctgtgata tggatacgga tgtgaatggc gctttcaagg tggtcatcat aaaggatttg 300
gccaatttcg atgtttctga ttatgggatg gagttgtcta tgtacctaga ggttgaaagg 360
ataggccttg gtgatgtcgt tgttggtggt gagctcacaa cattctaccc acttcggcag 420
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atactcgaga atcataggta ctggaagggg gttctttcat tggaggttgt ttttaatctc 600
cctgccatgg caggaggtat tgccgagctc gcctttgctt atgatactta cgacaatgca 660
gacggagata cctatcggcg ctttggttct tcggtagtgg acttaagggc tcatcgtata 720
ttacgagctc gtattccctt atccggttat ggtggttatc ttgctggggg ctctggttct 780
ctttttgagg tgaagccaca gacgggcttt ggagacgtgc tgaaactagt catacttttt 840
acagcaccgc tgcatattag cgatacctca aaaaggggtt ctgttctcgt ccggtatctt 900
gggcttgaag acctggacta tttggagccg gctacttcta ttggcaggtt gaaccccaag 960
acaacgctgg tgccaaatgt tgcagcctct ggaggccccg tgataaaggt tggtactata 1020
gagtgggagg agccttttat tgcgagagtg ccacttggtt tgcgccagaa gacttttcgt 1080
ctaatgacaa ttaataagtg ggcgccttct ggtttcctct tcttcccagt tacaccttca 1140
gttcatctgc cacgaacagc tgggggtttt gaggcttctc tggaacaaca gtgtcccctc 1200
atgcatagga gccaggagaa ttgccagtgg agaggtactc ttaaatacca cttaacagca 1260
cggttggagg gggcaactga gcagctggtt ttaccgcacc gctctttaac tttctccgcc 1320
gtccttttaa gcaagatttt accagcacca tgttttgtgg ataatagtac tttcaagccc 1380
ttgctccccc tgctctctgt gagggatact ttttccttgg gccaggatca tccctttgtc 1440
gagttcacca cgcctccagg taggtggata aacacgcatt ttggggccac tgagcaatac 1500
acttggcgca cttgtcctgt gtgggtttta ttgcagttcc caccaaagac gatggcccag 1560
cttcatgtta gagatatctc cctttgggtt gagccagaca ttgagtatag acatcccatg 1620
ggtggttttc ctcttaccat cccagatccg tccc 1654

Claims (15)

1.一种检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，其包括剪秋萝斑驳病毒的检测卡和检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物，所述引物组合物包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB；所述正向外引物F3的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向外引物B3的序列如SEQ ID NO.2所示，所述正向内引物FIP的序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向内引物BIP的序列如SEQ IDNO.4所示，所述正向环引物LF的序列如SEQ ID NO.5所示，所述反向环引物LB的序列如SEQID NO.6所示；所述引物组合物针对的靶标基因如SEQ ID NO.7所示；
所述检测卡包括在衬板上依次设置的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述胶体金结合垫上含有胶体金剪秋萝斑驳病毒抗体的结合物，所述硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设置有检测T线和质控C线，所述检测T线包被有LycMoV的抗体IgG，所述质控C线包被有抗LycMoV抗体的二抗；所述检测T线上LycMoV的抗体IgG的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg蛋白；所述抗LycMoV抗体的二抗的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg蛋白；
所述胶体金结合垫上的剪秋萝斑驳病毒抗体的包被量为每1mL胶体金中含14-16μg的剪秋萝斑驳病毒抗体。
2.根据权利要求1所述的检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述检测卡还包括由下壳体和上壳体组成的卡槽，所述卡槽具有放置所述衬板的安装腔，所述衬板与所述下壳体的内壁固定连接，所述上壳体上间隔设置有加样窗和反应观察窗，所述加样窗空间上位于所述样品垫的上方，所述反应观察窗空间上位于所述硝酸纤维素膜的上方；所述上壳体与所述下壳体通过卡扣结构卡接。
3.根据权利要求1所述的检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT-LAMP扩增反应试剂，所述RT-LAMP扩增反应试剂包括反转录酶、RNase抑制剂、dNTP混合物、反应缓冲液、MgSO4和DNA 聚合酶。
4.根据权利要求3所述的检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述反转录酶选自AMV反转录酶或M-MLV反转录酶，所述反应缓冲液选自ThermoPol反应缓冲液。
5.根据权利要求3所述的检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括磷酸缓冲液、磷酸洗涤缓冲液、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。
6.根据权利要求5所述的检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为水，所述阳性对照品为当归剪秋萝斑驳病毒外壳蛋白CP基因片段标准品。
7.根据权利要求3所述的检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述DNA 聚合酶选自Bst DNA 聚合酶。
8.一种采用如权利要求1-7任一项所述的试剂盒检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒的方法，其特征在于，包括：
（1）取待测溶液上样至剪秋萝斑驳病毒的检测卡的样品垫上，观察检测T线和质控C线的颜色变化，初次判断待测样品中是否含有剪秋萝斑驳病毒；
（2）若根据步骤（1）无法鉴别待测样品中是否含有剪秋萝斑驳病毒，进行反转录RT-LAMP扩增：将步骤（1）免疫富集反应后检测卡上的检测T线取下，以取下的检测T线作为模板，利用RT-LAMP检测引物组合物进行RT-LAMP扩增；根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品中是否含有剪秋萝斑驳病毒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，根据检测T线和质控C线的颜色变化初次判断待测样品是否含有剪秋萝斑驳病毒的具体方法为肉眼观察法；所述肉眼观察法为：
若检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带时，说明待测样品中含有剪秋萝斑驳病毒，无需进行反转录RT-LAMP扩增；
若检测T线没有颜色变化而仅质控C线出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染剪秋萝斑驳病毒，或感染剪秋萝斑驳病毒的含量低，则需进行反转录RT-LAMP扩增。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品是否含有剪秋萝斑驳病毒的具体方法为荧光染料肉眼观察法；所述荧光染料肉眼观察法为：
取荧光染料反应液在反应前加入RT-LAMP扩增反应管的管盖上，待LAMP扩增反应结束后，使荧光染料检测液与LAMP反应液混合，采用肉眼直接观察混合反应液的颜色。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，荧光染料反应液为SYBR Green I，若扩增产物出现绿色荧光，表示待测样品中含有剪秋萝斑驳病毒；
若扩增产物颜色为橙色则表示待测样品中不含剪秋萝斑驳病毒。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述RT-LAMP扩增的方法包括：以待测样本的RNA提取物或待测样本经胶体金免疫层析后的硝酸纤维素膜上的结合物为模板，采用权利要求1所述的检测剪秋萝斑驳病毒的引物组合物进行RT-LAMP扩增反应。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述扩增反应的条件包括：
在62-66℃恒温水浴中扩增80-100 min，随后80℃变性以终止反应。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述扩增反应是以如下引物反应体系进行扩增反应：
所述引物反应体系中包括如下浓度的引物：
正向外引物F3和反向外引物B3分别为0.2μM-0.4μM；正向内引物FIP和反向内引物BIP分别为1.6μM-2.0μM；正向环引物LF和反向环引物LB分别为0.4μM-0.8μM。
15.如权利要求1-7任一项所述的试剂盒在检测侵染当归的剪秋萝斑驳病毒中的应用。
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