CN114019159B - 一种日本山药花叶病毒的检测引物组合物、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种日本山药花叶病毒的检测引物组合物、试剂盒及其应用，涉及植物病毒病原体的检测领域。本发明提供的GICA‑RT‑LAMP检测方法将血清学方法和核酸检测方法有机地结合起来，特异性强，灵敏度达到了1.3pg/mL，检测过程中免核酸RNA提取，无需要专业的仪器设备，简化了操作过程，降低了检测难度，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。

Description

一种日本山药花叶病毒的检测引物组合物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及植物病毒病原体的检测领域，具体而言，涉及一种日本山药花叶病毒的检测引物组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

黄精病毒病发病主要表现为花叶、褪绿、坏死等病毒病症状，中国科学院西北生态环境资源研究院植物病害研究小组在一些样品中利用小RNA测序技术(small RNAsequencing，sRNA-seq)鉴定到了日本山药花叶病毒(Japanese yam mosaic virus，JYMV)，这也是黄精中首次发现有JYMV感染。

JYMV属于马铃薯Y病毒科(potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，最早于19世纪70年代报道于日本山药。受感染的植物表现出叶子的花叶和绿色条带，并且块茎产量显著降低。JYMV病毒粒子为680-780nm弯曲的丝状颗粒，并在受感染细胞的细胞质中诱导形成典型的圆柱形包裹体。JYMV在营养繁殖过程中通过种子块茎垂直传播，也由蚜虫水平传播。

目前，针对JYMV病毒的检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、高通量测序(High-throughput sequencing)或下一代测序(Next-generation sequencing,NGS)技术等，但这些方法表现在程序复杂，检测费用高、对仪器设备和检测条件要求高，需要长期经验积累和具有专业操作技能的人员才能完成，因此使用范围受到很大的局限，无法满足黄精种植现场及田间快速检测的需求。而对于以无性繁殖为主的黄精作物，种源质量是产业发展的关键，根茎病毒含量低，RNA提取难度大，依赖于核酸提取的RT-PCR及其衍生技术检测的准确性受到影响，急需开发出适用于根茎病毒病害快速、灵敏检测的新技术和新方法。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种日本山药花叶病毒的检测引物组合物、试剂盒及其应用以解决上述技术问题。

本发明提供了一种快速检测JYMV的胶体金免疫层析检测卡，该检测卡可以借助胶体金结合垫上的特异性抗体偶联物以及硝酸纤维素膜上包被的JYMV的抗体IgG，实现待测样本中的病毒粒子富集，可通过肉眼观察检测卡的T线颜色初步快速判断样本是否为JYMV阳性。

为了弥补检测卡的灵敏度和准确度，本发明还提供了一种检测引物组合物，该引物组合为LAMP扩增引物组合物。采用本发明提供的核酸组合物进行LAMP扩增，无需RNA提取，具有操作简便、特异性强、灵敏度高、检测速度快、成本低的优势，且无需基因扩增仪、高通量测序仪等特殊的仪器设备，在恒温水浴中完成扩增反应，检测结果可用肉眼直接判断。

而将二者有机结合后的试剂盒，同时具有检测速度快、灵敏度高、特异性好、适用性好、操作简单的技术优势。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种检测日本山药花叶病毒的引物组合物，具体包括如SEQ IDNO.1所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP和SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP。

上述引物组合物可以用于RT-LAMP反应，RT-LAMP反应通过F3、B3、FIP和BIP共4条特异性引物识别JYMV CP靶基因的6个序列，具有特异性强和准确性高的优势。需要说明的是，上述引物组合物是发明人经过长期大量的扩增筛选，获得的一组同时具有高特异性、较好重复率和高灵敏度的检测引物组合。

此外，本发明还提供了一种检测日本山药花叶病毒的检测卡，其包括：在衬板上依次设置的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，胶体金结合垫上含有胶体金-日本山药花叶病毒抗体的结合物，硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设置有检测T线和质控C线，检测T线包被有JYMV的抗体IgG，质控C线包被有抗JYMV抗体的二抗；检测T线上JYMV的抗体IgG的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg蛋白；抗JYMV抗体的二抗的包被量为每2mm线宽上包被1.5～2.0μg蛋白；

胶体金结合垫上的日本山药花叶病毒抗体的包被量为每1mL胶体金中含17-18μg的日本山药花叶病毒抗体。

本发明还提供了一种用于检测日本山药花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其包括上述的检测日本山药花叶病毒的检测卡和用于日本山药花叶病毒检测的引物组合物。

在一种实施方式中，上述试剂盒还包括RT-LAMP扩增反应试剂，RT-LAMP扩增反应试剂包括反转录酶、RNase抑制剂、dNTP混合物、反应缓冲液、MgSO₄、DNA聚合酶和水。

在一种实施方式中，上述反转录酶选自AMV反转录酶或M-MLV反转录酶，在其他实施方式中，上述反转录酶包括不限于M-MLV酶的工程酶，所用的转录酶只要能实现cDNA 3’端加尾功能即可。

反应缓冲液包括不限于ThermoPol反应缓冲液。

在一种实施方式中，上述试剂盒还包括磷酸缓冲液、磷酸洗涤缓冲液、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。

在一种可选的实施方式中，上述阴性对照品为水，阳性对照品为日本山药花叶病毒的CP基因片段标准品。

JYMV CP基因片段的标准品的序列如下：

ATCTTGAATGGTCTAATGGTCTGACGGATGTCTTCTCGACTAATGGGATGTGGGTGATGATGGATGGAGACGAGCAAGTGGAATTCCCAATAAAACCATTAATTGATCACGCAAAACCAACATTTCGACAAATAATGGCTCATTTCAGCAACGTCGCTGAGGCGTATATTGAAAAGAGAAATTATGAAAAACCGTATATGCCACGATACGGACTTCAGCGCAACCTGAATGATATGAGTCTTGCTCGGTATGCTTTTGATTTTTAAAAG。

本发明还提供了一种采用试剂盒检测日本山药花叶病毒的检测方法，其包括：

(1)取待测溶液上样至日本山药花叶病毒的检测卡的样品垫上，观察检测T线和质控C线的颜色变化，初次判断待测样品中是否含有日本山药花叶病毒JYMV；

(2)若根据步骤(1)无法鉴别待测样品中是否含有日本山药花叶病毒JYMV，进行反转录RT-LAMP扩增：将步骤(1)免疫富集反应后检测卡上的检测T线取下，以取下的检测T线作为模板，利用日本山药花叶病毒检测的引物组合物进行RT-LAMP扩增；根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品中是否含有日本山药花叶病毒。

RT-LAMP扩增的反应条件为56-66℃下反应50-100min，然后在80±2℃下变性，从而终止反应，可选的，变性5-20min。在实际应用场景中，可以通过恒温水浴即可实现RT-LAMP扩增，无需特定的荧光定量扩增仪等设备，也无需单独的RNA提取，操作简单易行。

在一种实施方式中，根据检测T线和质控C线的颜色变化初次判断待测样品是否含有JYMV的具体方法为肉眼观察法；肉眼观察法为：

若检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带时，说明待测样品中含有日本山药花叶病毒；

若检测T线没有颜色变化而仅质控C线出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染日本山药花叶病毒，或感染日本山药花叶病毒的含量低，则需进行反转录RT-LAMP扩增。

在一种实施方式中，根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品是否含有日本山药花叶病毒的具体方法为荧光染料肉眼观察法；荧光染料肉眼观察法为：

取荧光染料反应液在反应前加入RT-LAMP扩增反应管的管盖上，待LAMP扩增反应结束后，使荧光染料检测液与LAMP反应液混合，采用肉眼直接观察混合反应液的颜色：

优选地，荧光染料反应液为SYBR Green I，若扩增产物出现绿色荧光，表示待测样品中含有日本山药花叶病毒；

若扩增产物颜色为橙色则表示待测样品中不含日本山药花叶病毒。

本发明提供的GICA-RT-LAMP检测试剂盒的检测对象是JYMV病毒粒子，通过胶体金免疫层析GICA技术快速富集病毒粒子，初步判定待测样品的病毒感染情况；再利用病毒基因组序列的特异性引物进行RT-LAMP扩增，通过对扩增产物的分析达到精确检测病原物的目的。GICA-RT-LAMP检测方法将血清学方法和核酸检测方法有机地结合起来，具有特异性强、灵敏度高的优势，其检测灵敏度达到了1.3pg/mL。这个检测方法中免核酸RNA提取，无需要专业的仪器设备，简化了操作过程，降低了检测难度，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。

本发明还提供了一种日本山药花叶病毒的检测卡、用于日本山药花叶病毒检测的引物组合物或试剂盒在检测日本山药花叶病毒中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的检测卡可以借助胶体金结合垫上的特异性抗体偶联物以及硝酸纤维素膜上包被的JYMV的抗体IgG，实现待测样本中的病毒粒子富集，可通过肉眼观察检测卡的T线颜色初步快速判断样本是否为JYMV阳性。还提供了提高检测准确度的特异性检测引物组合物，该引物组合为LAMP扩增引物组合物。采用本发明提供的核酸组合物进行LAMP扩增，无需RNA提取，具有操作简便、特异性强、灵敏度高、检测速度快、成本低的优势，且无需基因扩增仪、高通量测序仪等特殊的仪器设备，在恒温水浴中完成扩增反应，检测结果可用肉眼直接判断。

本发明还提供了一种GICA-RT-LAMP检测试剂盒，该试剂盒首先利用检测卡免疫富集待测样品中的JYMV粒子，用其作为模板进行反转录和DNA环介导等温LAMP扩增。提高了检测的特异性，减少了假阳性的发生。RT-LAMP反应通过F3、B3、FIP和BIP共4条特异性引物识别JYMV CP靶基因的6个序列，具有特异性强和准确性高的优势。

本发明为黄精及植物病害检测提供了新的技术平台，既能应用于日本山药花叶病毒的快速筛查，也能应用于日本山药花叶病毒的精准监测，为监控JYMV病毒的发生、扩散、流行以及防治提供了强有力的技术支撑。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测JYMV病毒的胶体金免疫层析检测卡平面结构示意图；

图2为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测JYMV病毒的胶体金免疫层析检测卡内部结构示意图；

图3为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测JYMV病毒反应温度的荧光染料肉眼观察图；图中：1：阴性对照；2-9分别对应：56℃；58℃；60℃；62℃；64℃；66℃；68℃，70℃；

图4为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测JYMV病毒反应时间的荧光染料肉眼观察图；图中：1：阴性对照；2-10分别对应：20min；30min；40min；50min；60min；70min；80min；90min；100min；

图5为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测JYMV病毒特异性的荧光染料肉眼观察图；图中：1：阴性对照；2-12分别对应：健康黄精组织；LSV百合感病组织；CMV-Li百合感病组织；LMoV百合感病组织；ArMV百合感病组织；BrYV黄芩感病组织；AMV当归感病组织；PlAMV百合感病组织；LMV生菜感病组织；ALSV当归感病组织；JYMV黄精感病组织；

图6为本发明实施例GICA-RT-LAMP检测JYMV病毒灵敏性的荧光染料肉眼观察图；图中：1：阴性对照；2-11分别对应JYMV CP基因标准品浓度：10^-1(1.3×10⁴ng/mL)；10^-2(1.3×10³ng/mL)；10^-3(1.3×10²ng/mL)；10^-4(1.3×10¹ng/mL)；10^-5(1.3×10 ⁰ng/mL)；10^-6(1.3×10^-1ng/mL)；10^-7(1.3×10^-2ng/mL)；10^-8(1.3×10^-3ng/mL)；10^-9(1.3×10^-4ng/mL)；10^-10(1.3×10^-5ng/mL)；

图7为本发明实施例GICA-RT-PCR检测JYMV病毒灵敏性的电泳分析图；图中：M：600bp Marker；1：阴性对照；2-11分别对应JYMV CP基因标准品浓度：10^-1(1.3×10⁴ng/mL)；10^-2(1.3×10³ng/mL)；10^-3(1.3×10²ng/mL)；10^-4(1.3×10¹ng/mL)；10^-5(1.3×10⁰ng/mL)；10^-6(1.3×10^-1ng/mL)；10^-7(1.3×10^-2ng/mL)；10^-8(1.3×10^-3ng/mL)；10^-9(1.3×10^-4ng/mL)；10^-10(1.3×10^-5ng/mL)。

附图标记：1-卡槽；2-加样窗；3-反应观察窗；4-样品垫；5-胶体金结合垫；6-硝酸纤维素膜；7-吸收垫；8-衬板；9-检测T线；10-质控C线。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

参照图1和图2所示，本实施例提供了一种日本山药花叶病毒的检测卡，其包括卡槽1。卡槽1由下壳体和上壳体(图中未示出标号)组成，本实施例中设置下壳体和上壳体卡扣相连。上壳体与下壳体留有放置衬板8的安装腔。衬板8与下壳体的一个端面固定连接。

在衬板8上依次设置有样品垫4、胶体金结合垫5、硝酸纤维素膜6和吸收垫7，胶体金结合垫5上含有胶体金-日本山药花叶病毒抗体的结合物，硝酸纤维素膜6上沿层析方向依次设置有检测T线9和质控C线10，检测T线9包被有JYMV的抗体IgG，质控C线10包被有抗JYMV抗体的二抗；检测T线9上JYMV的抗体IgG的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg蛋白；抗JYMV抗体的二抗的包被量为每2mm线宽上包被1.5～2.0μg蛋白，本实施例中的抗JYMV抗体的二抗为羊抗兔IgG；胶体金结合垫5上的日本山药花叶病毒抗体的包被量为每1mL胶体金中含16μg的日本山药花叶病毒抗体。本实施例中，胶体金结合垫5上的日本山药花叶病毒抗体为兔抗JYMV多克隆抗体。

上壳体上间隔设置有加样窗2和反应观察窗3，加样窗2空间上位于样品垫4的上方，反应观察窗3空间上位于硝酸纤维素膜6的上方。

上述检测卡的制备方法如下：

1.先制备日本山药花叶病毒(JYMV)多克隆抗体IgG。

①JYMV CP外壳蛋白的表达和纯化：从感染了JYMV的黄精叶片中提取总RNA进行逆转录聚合酶链式反应(RT－PCR)，扩增JYMV的CP外壳蛋白基因片段；通过酶切克隆至pET-28a载体；重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，37℃培养，IPTG诱导表达，镍柱亲和层析纯化获得大小为37.1kDa的JYMV CP外壳蛋白；

②多克隆抗体的制备：用1mg/mL上述纯化的JYMV CP外壳蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔；初次免疫中，将蛋白抗原与弗氏完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射；初次免疫21d后，将1.0mg/ml的纯化蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后，经皮下多点注射作为第一次增强免疫；以后每间隔21d进行一次增强免疫，免疫方式为皮下多点注射。一共进行3次增强免疫，在第4次加强免疫后的5～7d颈动脉采血，静至，离心，收集到的血清加入质量百分比浓度0.02％的叠氮钠，-20℃保存；所得抗血清通过饱和硫酸铵沉淀法，透析至pH7.8的磷酸缓冲液，然后通过Protein A亲和层析的方法对抗血清进行纯化获得兔抗JYMV多克隆抗体IgG。

2.用胶体金标记兔抗JYMV多克隆抗体。

分别取粒径为30nm的胶体金5mL及兔抗JYMV多克隆抗体90μg，在pH 7.2的条件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加10％牛血清白蛋白(BSA)和5％PEG 20000作为稳定剂，使得终浓度分别为0.5％和0.2％，采用低温高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及去凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金—抗体结合物。

3、制备胶体金结合垫。

用1/10标记前胶体金溶液体积的重悬液悬浮胶体金—抗体结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，37℃下烘干，制成胶体金结合垫。

4、包被免疫层析膜。

检测T线包被的是纯化的兔抗JYMV多克隆抗体IgG，对照C线包被的是羊抗兔IgG抗体，每条线宽2mm，兔抗JYMV多克隆抗体合适包被量为1.0～1.5μg蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为1.5～2.0μg蛋白。

5、组装。

作为支撑载体聚氯乙烯衬板体被固定于检测卡槽下壳体中，样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸(即为吸收垫7)依次排列连接于聚氯乙烯衬板上表面，再通过卡扣将GICA检测卡槽上壳体与下壳体连接。

本实施例还提供了上述检测卡的检测方法：

参照图1所示，吸取少量样品的待检测溶液，滴检测卡槽上壳体加样窗2处，由于毛细效应液体往前移动，若待测液中含有JYMV，检测样品经过胶体金结合垫时，JYMV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述检测T线方向层析泳动，当接触到检测T线时，与检测T线上的JYMV多克隆抗体发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未结合的复合物继续向质控C线方向渗移，当接触到质控C线时与固定在质控C线上的羊抗兔IgG抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带。即当检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了日本山药花叶病毒JYMV。

若待测液中不含JYMV或JYMV含量较低时，检测样品经过胶体金结合垫时，则不能与金标垫上的金标多克隆抗体结合或者结合的复合物量非常少，当接触到所述检测T线时不发生反应，金标多克隆抗体继续向质控C线方向渗移，当接触到质控C线时与固定在质控C线上的羊抗兔IgG抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带。即当检测线没有颜色变化而仅质控C线出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染日本山药花叶病毒JYMV或感染日本山药花叶病毒JYMV的含量低，需要后续进一步的试验分析。

因此，本发明提供的检测卡可初步对日本山药花叶病毒进行快速筛查，田间地头及现场就地检测，在3～5分钟内即可初步判断被检样品的病毒感染情况，达到快速、简便、高效检测JYMV的目的。

实施例2

本实施例提供了一种检测日本山药花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒。其包括实施例1制备的检测卡；RT-LAMP特异性引物组合物和RT-LAMP扩增反应试剂。

RT-LAMP特异性引物组合物包括如SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3、SEQ IDNO.2所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP。

序列如下：

F3：5’-TCTCGACTAATGGGATGTG-3’；

B3：5’-CCTCTGAAGTCCATAGCG-3’；

FIP：

5’-GTTTGGCGTGATCAATTAATGGTTTGGTGATGATGGATGGAGAA-3'；

BIP：

5’-ACATTTCGCCAAATAATGGCCCATGTACGCTTTTTCCTGGTT-3’。

RT-LAMP扩增反应试剂由10U/μL AMV反转录酶、40U/μLRNase抑制剂、10mM dNTP混合物、10×ThermoPol反应缓冲液、100mM MgSO₄、8U/μLBst DNA polymerase和RNA-free H₂O组成。

此外，GICA-RT-LAMP试剂盒还包括磷酸缓冲液(PBS)、磷酸洗涤缓冲液(PBST)、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。

磷酸缓冲液(PBS)和磷酸洗涤缓冲液(PBST)的浓度为0.02M，pH值为7.4；

荧光染料检测液为1000×SYBR Green I；

阴性对照品为RNA-free H₂O；

阳性对照品为黄精JYMVCP基因标准品。

本实施例还提供了JYMV CP基因标准品的制备方法。具体制备方法如下：

1、提取黄精叶片中的总RNA。

将50-100mg感染JYMV的黄精叶片在液氮中研磨，用植物总RNA提取试剂盒提取感病组织的总RNA。

2、设计引物。

根据小RNA测序得到的序列，设计并合成了JYMV CP基因的1对特异性正向(JYMV-F)和反向引物(JYMV-R)；其中上述引物序列如下：

JYMV-F：5’-ATCTTGAATGGTCTAATGGTCTG-3’

JYMV-R：5’-TAAAAATCAAATGCATACCGAGC-3’；

3、制备阳性对照品。

1)RT反应

利用上述JYMV反向引物JYMV-R和M-MLV反转录酶进行RT反应，合成cDNA第一链；10μL RT反应体系如下:总RNA 2μL，10μM JYMV特异性反向引物JYMV-R 1μL，RNA-free H₂O 3μL，70℃变性10min，迅速置冰上急冷2min；再加入5×M-MLV buffer 2μL，10mM dNTPs 1μL，30U/μL RNase抑制剂0.34μL，200U/μL M-MLV反转录酶0.35μL和RNA-free 0.31μL；混合后42℃水浴1h，70℃保温15min，置冰上待用；

2)PCR反应

利用上述cDNA第一链为模板，在Ex Taq DNA聚合酶作用下进行JYMV CP基因的PCR扩增；

PCR反应体系为12.5μL，包括：50ng cDNA 0.5μL，5U/μLEx Taq DNA聚合酶0.1μL，10×PCR buffer 1.25μL，2.5mM dNTPs 1μL，10μM正向引物JYMV-F 0.25μL，10μM反向引物JYMV-R 0.25μL，ddH₂O补足至12.5μL；

PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，51℃退火45s，72℃延伸45s，循环扩增35次，最后72℃延伸7min；

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段，利用克隆载体试剂盒将目的片段连接在pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，进行蓝白斑平板筛选；随机挑取3个白斑菌落分别接种在氨苄LB培养基上，37℃摇菌12～16h；使用质粒微量抽提试剂盒提取质粒；分别取1μL质粒，在与上述PCR反应体系相同的条件下进行PCR扩增；将PCR检测得到的阳性重组质粒测序；测序证实序列完全正确的阳性质粒，即为阳性对照品，黄精JYMV CP基因对应的片段长度分别为269bp；用NanoDrop ND-1000核酸/蛋白分析仪测定标准品的质粒浓度。

3、阳性对照品的序列。

经测序，上述阳性对照品与预期完全相符，回收的对照品片段序列如下：

黄精JYMV CP基因片段标准品序列(SEQ ID NO.5所示)：

ATCTTGAATGGTCTAATGGTCTGACGGATGTCTTCTCGACTAATGGGATGTGGGTGATGATGGATGGAGACGAGCAAGTGGAATTCCCAATAAAACCATTAATTGATCACGCAAAACCAACATTTCGACAAATAATGGCTCATTTCAGCAACGTCGCTGAGGCGTATATTGAAAAGAGAAATTATGAAAAACCGTATATGCCACGATACGGACTTCAGCGCAACCTGAATGATATGAGTCTTGCTCGGTATGCTTTTGATTTTTAAAAG。

实施例3

本实施例提供了采用实施例2中的试剂盒检测JYMV的方法。

1、检测卡富集病毒粒子。

1)取100mg感染JYMV的黄精样品或其他待检样品放入3mL装有磷酸缓冲液PBS的自封袋中，用研棒轻轻研磨，研磨后的组织液即为待检样品的检测液；

2)吸取少量上述待测样品的检测液，滴在JYMV胶体金免疫层析GICA检测卡加样窗2处，3-5分钟内在反应观察窗3内观察显色结果。

2、初次判断反应结果。

当上述JYMV胶体金免疫层析GICA检测卡反应观察窗3内的检测T线9和质控C线10上均出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了日本山药花叶病毒JYMV，无需进行后续检测；

当上述JYMV胶体金免疫层析GICA检测卡反应观察窗3内的检测T线9没有颜色变化，而质控C线10上出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染日本山药花叶病毒JYMV，或者感染JYMV的程度轻，则需进行后续的反转录RT-LAMP检测。

3、RT-LAMP反应。

1)将上述反应结束的JYMV胶体金免疫层析GICA检测卡的检测T线切下，用PBST冲洗三次，用消毒刀片小心地刮下T线区域，放入PCR管中；

2)在上述含有T线的PCR管中加入40U/μL RNAse抑制剂0.15μL、10U/μL AMV反转录酶0.3μL、10×ThermoPol缓冲液1.25μL、100mM MgSO₄ 0.75μL、10mM dNTP混合物1.75μL、分别含2.5μM B3和F3，20.0μM FIP和BIP的LAMP引物组1.0μL、8U/μL Bst DNA polymerase1.0μL、RNAse free H₂O补足至12.5μL；以RNA-free H₂O作为阴性对照，黄精JYMV CP基因标准品作为阳性对照；反应体系配置完成后，在PCR管盖内壁加1μL 100×SYBR Green I荧光染料工作液，盖紧PCR管盖，进行RT-LAMP反应；RT-LAMP的反应条件为:56-66℃扩增50-100min，随后80℃变性10min，终止反应。

4、二次判断反应结果。

上述RT-LAMP反应结束后，在不开盖的情况下，离心或轻甩PCR管，使PCR管盖内壁上的SYBR Green I荧光染料与LAMP扩增产物混合，上下颠倒混匀，采用肉眼观察PCR管内混合液的颜色变化：

若混合液颜色变为绿色，说明SYBR Green I染料与双链DNA结合，则为阳性反应，表示被检样品中含有日本山药花叶病毒；

若混合液颜色为橙色，则为阴性反应，表示样品中不含日本山药花叶病毒。

实验例1

本实验例提供了实施例2中的试剂盒检测JYMV在不同反应温度和反应时间下的荧光染料肉眼观察实验，检测方法参照实施例3所示。

分别测试56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃和70℃的RT-LAMP扩增温度下扩增80min的扩增结果。图3所示，图中：1：阴性对照；2-9分别对应：56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃和70℃。由图可知，本发明实施例提供的扩增引物组合能在56-66℃条件下实现靶基因的高效扩增。

分别测试20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min的RT-LAMP扩增时间下扩增温度为62℃的扩增结果。图4所示，图中：1：阴性对照；2-10分别对应：20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min。由图可知，本发明实施例提供的扩增引物组合能在50-100min条件下实现靶基因的高效扩增。

实验例2

本实验例进行了GICA-RT-LAMP检测JYMV的特异性实验。

以感染百合、黄芩、当归、生菜、黄精的10个常见病毒:百合隐症病毒LSV、百合黄瓜花叶病毒CMV-Li、百合斑驳病毒LMoV、百合南芥菜花叶病毒ArMV、百合车前草花叶病毒PlAMV、黄芩芸薹黄化病毒BrYV、当归苜蓿花叶病毒AMV、当归苹果潜隐球状病毒ALSV、生菜花叶病毒LMV和黄精日本山药花叶病毒JYMV的感病叶片(田间采集)为样品，分别在装有PBS缓冲液的自封袋中用研棒轻轻研磨，研磨后制成检测液滴加至检测卡的加样窗2，3-5分钟后观察显色结果；随后，再用上述实施例3中的GICA-RT-LAMP检测体系和检测方法进行RT-LAMP扩增，反应程序为62℃扩增80min，扩增结束后显色。以健康黄精叶片为阴性对照，每个实验重复3次。

检测卡的显色结果显示，只有感染JYMV的黄精叶片样品的检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带，而其他样品的检测T线没有颜色变化，质控C线上出现棕红色的条带。

SYBR Green I荧光染料肉眼观察法结果显示，只有感染JYMV的黄精叶片的扩增产物出现绿色，其余感病叶片的扩增产物与健康黄精叶片的扩增产物均为橙色(图5)；这表明本发明建立的GICA-RT-LAMP方法对JYMV病毒有很高的特异性，与其他常见病毒无交叉反应。

实验例3

本实验例进行了GICA-RT-LAMP检测JYMV的灵敏度实验。

以实施例2中黄精JYMV CP基因标准品为样品，经NanoDrop ND-1000核酸/蛋白分析仪测定浓度(1.9×10⁵ng/mL)后，再用RNA-free H₂O对上述标准品进行10倍比稀释，-20℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各稀释液1.0μL作为模板，加入上述实施例中的RT-LAMP反应试剂进行RT-LAMP扩增，反应程序为62℃扩增80min；

作为对比检测，将上述10倍比稀释后的各稀释液进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸40s，循环扩增35次，最后72℃延伸7min；

RT-LAMP反应结束后，SYBR Green I荧光染料肉眼观察法观察显色情况，结果显示GICA-RT-LAMP对黄精JYMV CP基因标准品的反应灵敏度为1.3×10^-3ng/mL，即1.3pg/mL(图6)；PCR反应结束后，取5μL扩增产物上样，琼脂糖凝胶电泳结果显示，GICA-RT-PCR对黄精JYMV CP基因标准品的反应灵敏度也为1.3×10^-3ng/mL，即1.3pg/mL(图7)，可见GICA-RT-LAMP检测JYMV的灵敏性与GICA-RT-PCR的相同。

实验例4

GICA-RT-LAMP试剂盒检测田间样品。

取田间黄精叶片样品，用检测卡富集病毒粒子，再用上述实施例3中的GICA-RT-LAMP检测体系进行RT-LAMP扩增；

若检测卡的检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带，则判定被检样品感染了日本山药花叶病毒JYMV；

若检测卡检测T线没有颜色变化，而质控C线上出现棕红色的条带，同时荧光染料肉眼观察法显示绿色，说明样品中含有日本山药花叶病毒JYMV；

若检测卡检测T线没有颜色变化，而质控C线上出现棕红色的条带，同时荧光染料肉眼观察法显示橙色，说明样品中不含日本山药花叶病毒JYMV。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院西北生态环境资源研究院

<120> 一种日本山药花叶病毒的检测引物组合物、试剂盒及其应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tctcgactaa tgggatgtg 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctctgaagt ccatagcg 18

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtttggcgtg atcaattaat ggtttggtga tgatggatgg agaa 44

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acatttcgcc aaataatggc ccatgtacgc tttttcctgg tt 42

<210> 5

<211> 269

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atcttgaatg gtctaatggt ctgacggatg tcttctcgac taatgggatg tgggtgatga 60

tggatggaga cgagcaagtg gaattcccaa taaaaccatt aattgatcac gcaaaaccaa 120

catttcgaca aataatggct catttcagca acgtcgctga ggcgtatatt gaaaagagaa 180

attatgaaaa accgtatatg ccacgatacg gacttcagcg caacctgaat gatatgagtc 240

ttgctcggta tgcttttgat ttttaaaag 269

Claims (11)

1.一种检测侵染黄精的日本山药花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，其包括检测日本山药花叶病毒的检测卡和用于日本山药花叶病毒检测的引物组合物，所述引物组合物包括如SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3、SEQID NO.3所示的正向内引物FIP和SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP；

所述检测卡包括：在衬板上依次设置的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述胶体金结合垫上含有胶体金-日本山药花叶病毒抗体的结合物，所述硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设置有检测T线和质控C线，所述检测T线包被有JYMV的抗体IgG，所述质控C线包被有抗JYMV抗体的二抗；所述检测T线上JYMV的抗体IgG的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg蛋白；所述抗JYMV抗体的二抗的包被量为每2mm线宽上包被1.5～2.0μg蛋白；

所述胶体金结合垫上的日本山药花叶病毒抗体的包被量为每1mL胶体金中含17-18μg的日本山药花叶病毒抗体。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT-LAMP扩增反应试剂，所述RT-LAMP扩增反应试剂包括反转录酶、RNase抑制剂、dNTP混合物、反应缓冲液、MgSO₄、DNA聚合酶和水。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录酶选自AMV反转录酶或M-MLV反转录酶，所述反应缓冲液选自ThermoPol反应缓冲液。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括磷酸缓冲液、磷酸洗涤缓冲液、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为水，所述阳性对照品为日本山药花叶病毒的CP基因片段标准品。

6.一种采用如权利要求1-5任一项所述的试剂盒检测侵染黄精的日本山药花叶病毒的检测方法，其特征在于，其包括：

(1)取待测溶液上样至日本山药花叶病毒的检测卡的样品垫上，观察检测T线和质控C线的颜色变化，初次判断待测样品中是否含有日本山药花叶病毒JYMV；

(2)若根据步骤(1)无法鉴别待测样品中是否含有日本山药花叶病毒JYMV，进行反转录RT-LAMP扩增：将步骤(1)免疫富集反应后检测卡上的检测T线取下，以取下的检测T线作为模板，利用日本山药花叶病毒检测的引物组合物进行RT-LAMP扩增；根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品中是否含有日本山药花叶病毒。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，RT-LAMP扩增的反应条件为56-66℃下反应50-100min，然后在80±2℃下变性。

8.根据权利要求6所述的检测日本山药花叶病毒的检测方法，其特征在于，根据检测T线和质控C线的颜色变化初次判断待测样品是否含有JYMV的具体方法为肉眼观察法；所述肉眼观察法为：

若检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带时，说明待测样品中含有日本山药花叶病毒；

若检测T线没有颜色变化而仅质控C线出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染日本山药花叶病毒，或感染日本山药花叶病毒的含量低，则需进行反转录RT-LAMP扩增。

9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品是否含有日本山药花叶病毒的具体方法为荧光染料肉眼观察法；所述荧光染料肉眼观察法为：

取荧光染料反应液在反应前加入RT-LAMP扩增反应管的管盖上，待LAMP扩增反应结束后，使荧光染料检测液与LAMP反应液混合，采用肉眼直接观察混合反应液的颜色。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，荧光染料反应液为SYBR Green I，若扩增产物出现绿色荧光，表示待测样品中含有日本山药花叶病毒；

若扩增产物颜色为橙色则表示待测样品中不含日本山药花叶病毒。

11.一种如权利要求1-5任一项所述的试剂盒在检测日本山药花叶病毒中的应用。

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