CN108841926B

CN108841926B - 一种rt-rpa-侧流层析双重检测戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒的引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN108841926B
Application number: CN201810769903.4A
Authority: CN
Inventors: 高慎阳; 李丹丹; 查恩辉; 张体银; 周铁忠; 岳喜庆
Original assignee: Jinzhou Medical University
Current assignee: Jinzhou Medical University
Priority date: 2018-07-13
Filing date: 2018-07-13
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2038-07-13
Also published as: CN108841926A

Abstract

本发明公开了一种用于双重检测甲型肝炎病毒与戊型肝炎病毒的RT‑RPA‑侧流层析试剂盒，包括：应用于RT‑RAP扩增技术戊型肝炎病毒ORF2基因序列的上游引物、中间探针与下游引物和/或甲型肝炎病毒VP1基因序列的上游引物、中间探针与下游引物，重组酶聚合酶扩增技术所需常规试剂以及测流层析试纸条，所述测流层析试纸条包括加样垫、对照线、1号检测线和/或2号检测线，通过对照线、检测线与引物及探针标记的配合，使用该试剂盒能够快速、灵敏、特异地、在非实验室环境下也可以现场检测检测样本中戊型肝炎病毒ORF2基因和/或甲型肝炎病毒VP1基因。

Description

一种RT-RPA-侧流层析双重检测戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒的引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明属于生物核酸分子检测技术领域，具体涉及一种应用反转录后重组酶依赖扩增技术检测方法(Reverse Transcript RecombinasePloymerase Amplification,RT-RPA)与测流层析试纸条检测方法相结合的实现戊型肝炎病毒与甲型肝炎病毒双重检测的方法及试剂盒。

背景技术

我国是肝病负担大国，甲肝与戊肝是除乙肝之外发病率最高的两种经消化道路传播的两种重要疾病。根据临床和流行病学观察，甲型肝炎病毒(HAV)多侵犯儿童及青年。发病率随年龄增长而递减。临床表现多从发热、疲乏和食欲不震开始，继而出现肝肿大、压痛、肝功能损害，部份患者可出现黄疸。戊型肝炎病毒(HAV)多侵犯二十岁以上的青壮年人，引起的肝炎在临床症状上与HAV十分相似，但多以急性暴发为主，尤其维产期的感染孕妇病死率高达40％以上。HAV和HEV均能随患者粪便排出体外，通过污染水源、食物、海产品(如毛蚶等)、食具等的传播可造成散发性流行或大流行，也可通过输血或注射方式传播。尤其HEV呈人畜共患性，全球分布。人与猪源HEV核酸同源性最高可达99％以上。因此HAV和HEV被WHO将列为是发展中国家的重要公共卫生问题。

目前关于甲、戊型肝炎检测多采用测ELISA捕捉IgM抗体法检测和胶体金免疫层析技术(GICA)检测，但由于ELISA操作程序较为复杂，时间长，给实验室带来诸多不便，后期提出的ELISA一步法，虽然简化了操作程序，缩短了检测时间，但却带来了个别强阳性标本将阳性问题，胶体金免疫层析技术(GICA)存在胶体金的稳定性不好把控，弱阳性标本所需时间较长等问题，而且上述方法检测成本高且操作不便，不利于现场快速检测应用。因此，亟待开发一种快速、高灵敏度和特异性、可用于临床现场检测的可靠新方法。

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)，是由英国TwistDx Inc公司开发出来的一种不同于PCR的核酸检测技术，它是一种新的核酸分子快速恒温扩增技术，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。该技术主要包括：在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA binding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链。反应产物也是以指数级增长，通常在1小时内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。另外，在RPA扩增体系中加入一个FAM或DIG分子标记的反向引物和5’生物素标记的探针，且探针标记的荧光基团约30个碱基处修饰一个脱碱基位点(dSpacer)或THF，该位点是DNA修复酶作用的底物，可被核酶NFO识别切割，产生新的3’羟基末端，进而在DNA聚合酶的作用下继续进行复制延伸，从而使双标信号与扩增产物的累积同步，检测结果可特异性地被抗生物素金标结合和抗分子标记捕获抗体的胶体金(GICA)或胶体碳(CCICA)的侧流层析试纸条上显示。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用。但是，目前国内外还没有将RPA技术应用于HAV或HEV检测的报道。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和现状，本发明首次将RPA技术应用于HAV和HEV检测领域，并提供了一种RT-RPA-侧流层析同步检测戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒的引物对和探针及试剂盒，该方法可以同时准确、快速、简便检测HAV和/或HEV的RPA，仅需通过对临床样品进行病毒RNA粗提取并进行RT-RPA等温扩增，结果可在侧流层析试纸条上清晰显示，不必在PCR仪中进行扩增，具有灵敏度高、特异性强、操作程序简单、检测时间短等优点，适用于非实验室环境下临床现场检测，具有广泛的应用前景。

为了解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种RT-RPA-侧流层析双重检测戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒的引物对和探针组合，具体为检测戊型肝炎病毒ORF2基因和/或甲型肝炎病毒VP1基因的引物对和探针，其中戊型肝炎病毒ORF2基因的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列包含如SEQIDNo.3所示和SEQIDNo.4所示；甲型肝炎病毒VP1基因的正向引物序列如SEQIDNo.5所示，反向引物序列如SEQIDNo.6所示，探针序列如SEQIDNo.7所示和SEQIDNo.8所示。

所述戊型肝炎病毒ORF2基因的探针，其SEQIDNo.3所示序列5’端连接有第一标记分子，SEQIDNo.4所示序列3’端连接有防止聚合反应的保护标签，SEQIDNo.3所示序列3’端和SEQIDNo.4所示序列5’端由能够被具有DNA损伤修复活性的酶识别并切除的人工碱基类似物连接；

所述甲型肝炎病毒VP1基因的探针，其SEQIDNo.7所示序列5’端连接有第一标记分子，SEQIDNo.8所示序列3’端连接有防止聚合反应的保护标签，SEQIDNo.7所示序列3’端和SEQIDNo.8所示序列5’端由能够被具有DNA损伤修复活性的酶识别并切除的人工碱基类似物连接；

所述戊型肝炎病毒ORF2基因的反向引物5’端连接有第二标记分子；

所述甲型肝炎病毒VP1基因的反向引物5’端连接有第三标记分子。

所述戊型肝炎病毒ORF2基因的探针和正向引物处于同一扩增方向；所述甲型肝炎病毒VP1基因的探针和正向引物处于同一扩增方向。

优选地，上述探针中，防止聚合反应的保护标签为C3-spacer；能够被具有DNA损伤修复活性的酶识别并切除的所述人工碱基类似物为四氢呋喃(THF)。

优选地，所述第一标记分子为生物素(Biotin)，第二标记分子为荧光分子FAM，第三标记分子为地高辛(Dig)。

本发明引物和探针选自以HEV或HAV特征片段，根据HEV或HAV特性设计，应用人工化学法合成并加入了特定大小的DNA指纹序列以及分子标记。

上述引物对和探针组合在检测戊型肝炎病毒和/或甲型肝炎病毒试剂中的应用。

本发明还提供了一种RT-RPA-侧流层析双重检测戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒的试剂盒，包含上述的引物对和探针组合。

优选地，上述试剂盒还包括测流层析试纸条，所述测流层析试纸条包括加样垫、对照线、1号检测线和/或2号检测线。

进一步，优选地，所述加样垫含有胶体碳颗粒标记的所述第一标记分子特异结合物；

进一步，优选地，所述对照线包被有第一标记分子的特异结合物；

进一步，优选地，所述1号检测线包被有第二标记分子特异结合物；

进一步，优选地，所述2号检测线包被有第三标记分子特异结合物；

进一步，优选地，所述第一标记分子特异结合物为链霉亲和素；所述第二标记分子特异结合物为抗FAM抗体；所述第三标记分子特异结合物为地高辛抗体。

本发明还提供了一种RT-RPA-侧流层析双重检测戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒的方法，所述方法包括用RAP技术扩增戊型肝炎病毒ORF2基因序列和/或甲型肝炎病毒VP1基因序列，然后用测流层析试纸条显示所述扩增产物。

具体地，所述方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总RNA；采用病毒RNA磁珠法提取试剂盒提取；

(2)将上述RNA反转录，获得cDNA；利用上述戊型肝炎病毒ORF2基因的引物及探针和/或甲型肝炎病毒VP1基因对所得的cDNA进行RPA扩增；

(3)使用测流层析试纸条检测扩增产物，判定样本中是否含有戊型肝炎病毒和/或甲型肝炎病毒；

判定方法：10分钟内，(1)当对照C线出现证明实验有效，此时1、2检测线同时出现，说明同时存在HEV和HAV，检出判定均为阳性结果；(2)当对照C线出现证明实验有效，此时仅1号检测线出现而2号不出现，说明有HEV检出判定为阳性结果，而HAV检出判定为阴性结果；(3)当对照C线出现证明实验有效，此时仅2号检测线出现而1号不出现，说明有HAV检出判定为阳性结果，而HEV检出判定为阴性结果；(4)当对照C线出现证明实验有效，此时1、2检测线均不出现，说明HEV和HAV均未检出判定为全部阴性结果；(5)当对照C线不出现时，说明实验无效，检测结果无意义。

优选地，所述步骤(2)反转录过程为将反转录反应液FastQant与步骤(1)所得到RNA混匀，42℃的恒温金属浴中处理10～15min。

进一步，优选地，所述反转录体系为20μL；反应液与RNA体积比为3：1。

优选地，步骤(2)中所述RPA扩增体系为：总体积47.5μL，其中ORF2基因和VP1基因的正向引物各2.1μL，反向引物各2.1μL，探针各0.6μL，Rehydration缓冲液29.5μL，模板cDNA 5μL，ddH₂O 3.4μL。

优选地，步骤(2)中RPA扩增为：将所述RPA扩增体系混匀后，再加入2.5μL的醋酸镁，混匀反应。

进一步，优选地，反应条件为：38℃的恒温金属浴中温浴15-30min。

优选地，步骤(3)的具体步骤为：取胶体碳检测卡于室温平衡；取步骤(2)中的扩增产物用缓冲液稀释后滴加于胶体碳检测卡的样品孔中读取结果。

进一步，优选地，所述缓冲液为1％PBS-T。

上述试剂盒和检测方法在检测戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒试剂中的应用。

这里要说明的是，引物和探针的有效设计是决定本发明成功的最关键环节。然而，RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。PCR引物并不适用于RPA。目前实验中需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化，筛选。该技术引物设计要求极其严格，个别碱基的替换或增减都会对实验结果产生重要影响，必须经过实验验证检测后，才能筛选获得可用于临床检测的引物与探针。设计时以下几条成为主要影响因素：(1)引物长度要求为30-35bp(引物过短会严重影响重组酶的活性，长引物并不一定能提高扩增性能，反而还会增加形成二级结构的可能性)，探针长度要求为46-52bp，GC含量在40％-60％(5’端的3-5个核苷酸应当避免聚鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，这样能促引物与扩增靶基因的结合，对于3’末端的3个核苷酸来说，鸟嘌呤和胞嘧啶有助于聚合酶的稳定结合，可以提升引物的扩增性能)，避免引物内部出现二级结构且避免引物出现重复序列，(2)检测扩增片段小于500bp，(3)引物与探针设计时应当尽量避免容易形成二级结构、引物-引物互作、引物-探针互作、发夹结构的序列，减少二聚体的形成。其次，由于本申请涉及到两组基因的引物和探针组合在同一体系中扩增，两组基因中引物和探针之间会出现二级结构和发夹结构等，所以这又再次增加了引物和探针设计的难度，避免二者之间可能出现的问题，同样成为本发明的引物和探针设计需要考虑的另一重要影响因素。

本发明是经过来自于GenBank中的DQ279091、AJ272108、AF060668、AF060669、D11092、M73218、GU206559、GU119961的HEV ORF2和KX088647、KX343015、KX343016、KX343017、KX343018的HAV VP1/VP3同源序列对比分析，确定保守核心区域，并克服上述引物设计问题针对该区域同时设计多组引物对和探针组合，进行RPA扩增筛选，同时以去离子水为模板对设计的引物对和探针扩增作阴性对照，最终选出一对扩增产物能在胶体碳检测卡中显示清晰的检测条带和对照条带(如图3)。

实验原理：NFO-RPA是在RPA扩增体系基础上再加入NFO酶(核酸内切酶IV)和特异性分子标记核酸探针及末端修饰的下游扩增引物，如图2所示，分子标记核酸探针设计原理是在核酸探针5’端标记Biotin(生物素)，中间引入异源核苷酸残基THF(四氢呋喃)，核酸探针3’端添加阻断物C3-spacer以防止诱导Bsu聚合酶扩增非目的DNA。只有当探针与DNA链互补结合后，具有DNA损伤修复活性的NFO酶识别特异位点THF并将其切除，Bsu聚合酶延此位点继续扩增延伸，最终形成同时具有上游5’端标记Biotin(生物素)探针和下游5’端标记FAM或Dig(地高辛)的特异性扩增子产物。测流层析试纸条试纸卡上检测区分别包被有抗FAM抗体对应位置为1号检测线、抗Dig抗体对应2号检测线、Biotin对应位置为对照C线。当NFO-RPA扩增子产物滴加于加样槽后，加样垫上的胶体碳颗粒标记的Strep(链霉素，Biotin-ligand)将随着液体样品流动的同时特异性地结合NFO-RPA扩增子的5’Biotin(生物素)分子，同时该扩增子的另一端将分别被1号线或2号线包被分子特异性捕获形成夹心式的复合物，未特异性结合到扩增子的胶体碳颗粒标记的Strep(链霉素)被对照C线处包被的Biotin(生物素)结合形成对照检测线。

本发明的有益效果为：

1、本发明首次采用RPA技术建立同时快速检测HAV和HEV的方法，并通过特异性、灵敏度和重复性评价，可用于临床现场检测，为HAV和HEV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。RPA技术极大地缩短了检测时间，简化了反应程序，与DNA快速提取技术相结合使野外检测成为可能，具有广泛的应用前景。

2、本发明克服了两套特异性引物和特异性标记探针同一体系扩增扩增时存在的问题，实现可同时鉴别检测HEV和/或HAV的目标。

3、本发明省去了原有的PCR或LAMP扩增产物需要经过凝胶电泳后进行结果的判定的过程，将RPA扩增与测流层析试纸条试纸检测卡相结合使和使检测结果可直接现场判读，从而实现HEV和HAV的分子检测现场化、快速化。

4、实现HEV和HAV的现场快速分子检测，RPA技术为恒温条件下扩增核酸的方法，因此不需要PCR仪，解决了PCR贵重成本高的缺点；将RPA扩增反应时间在二十分钟左右即可完成，与PCR方法相比节约了大量时间；RPA方法与测流层析试纸条试纸检测卡相结合使和使检测结果可直接现场判读，无需要依赖贵重的凝胶成像系统和电脑等设备，从而实现HEV和HAV的分子检测现场化、快速化。

附图说明

图1为RPA扩增原理示意图。

图2为NFO-RPA扩增产物经测流层析试纸条试纸卡读取的原理示意图。

图3为RT-RPA-测流层析试纸条联用后试纸卡读取判定方法。

图4为RT-RPA-测流层析试纸条试纸卡检测灵敏度实验结果。

图5为RT-RPA-测流层析试纸条试纸卡检测特异性实验结果。

图6为HEV和HAV的RT-RPA扩增检测方法的重复性检验结果。

图7为临床样本侧流层析RT-RPA检测结果。

具体实施方式

为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。

本发明材料和试剂如下：

分子生物学试剂、TwistAmp RT-NFO Kits和侧流层析试纸购自TwistDX公司。病毒RNA磁珠法共提取试剂盒购自杭州博日公司。其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯化。引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成。

本发明仪器包括：恒温金属浴、掌上离心机、移液器等。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照Sambrook等主编的《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述条件操作，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。

实施例1引物和探针的设计与筛选

为了实现上述目的，本发明针对HEV ORF2和HAV VP1设计引物和探针。经过对比来自于GenBank中的DQ279091、AJ272108、AF060668、AF060669、D11092、M73218、GU206559、GU119961、的HEV ORF2和KX088647、KX343015、KX343016、KX343017、KX343018的HAV VP1/VP3同源序列对比分析，确定两基因保守核心区域，并分别针对该区域设计多组引物和探针，进行RAP筛选，同时以去离子水为模板对设计的引物对和探针扩增作阴性对照，最终选出一对扩增产物能在胶体碳检测卡中显示清晰的检测条带和对照条带(如图3)，最后确定以下一组引物对和探针组合，作为检测HEV和HAV的通用性基因检测靶点。

注：探针5’-端用生物素标记，距离5’端31个碱基左右的位置处用dSpacer替代一个碱基，3’端用C3-spacer阻断。

Biotin：生物素；FAM：发光基团；dSpacer：脱碱基位点/THF；C3-spacer：聚合酶延伸阻断基团。

实施例2：HEV和HAV的RT-RPA扩增检测方法的建立与检验

1.HEV和HAV的RT-RPA扩增检测方法的建立

1.1 HEV和HAV病毒RNA提取：

取200μL患者血清或唾液，应用病毒RNA磁珠法提取试剂盒提取RNA，洗涤三次后，得到磁珠100mg，最后室温条件下凉干保存，备用。

1.2 RT-RPA扩增反应

本实施例中应用RT-PRA方法扩增HEV和HAV特异序列，具体步骤为：

(1)上述获得的备用磁珠管中加入20μL FastQant反转录反应液混匀，转移至0.2ml的反应管中，放入42℃的恒温金属浴中，处理10min，得到cDNA模板；

(2)向另一0.2ml离心管中加入实施例1设计的ORF2基因和VP1基因正向引物各2.1μL(10μmol/L)，反向引物各2.1μL(10μmol/L)，探针各0.6μL(10μmol/L)，Rehydration缓冲液29.5μL，cDNA模板RNA 5μL，用ddH₂O补足到体积47.5μL，漩涡混匀后短暂离心；

(3)将47.5μL上述混合液转移到含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp NFO反应管中，用移液器反复吹打直到整个颗粒溶解；

(4)向每反应管中加入2.5μL(280mmol/L)的醋酸镁溶液，用力上下颠倒漩涡混匀8-10次，反应立即发生；

(5)瞬时离心后将反应管放入38℃的恒温金属浴中作用20min，得到RT-RPA反应产物。

1.3 CCICD侧流层析试纸条进行扩增产物检测

取一定数量的侧流层析试纸条(PCRD，Abingdon)，针对不同检测样本号进行标记。每一个检测样本取75μL杂交检测缓冲液(PCRD Buffer)，加入反应管中。取5μL反应产物(RT-RPA反应产物)在离心管中混匀。向试纸条的样品反应区加入反应液，室温作用5分钟，立即观察。如果试纸条反应区显示对照线清晰，检测线1、2均显示条带的为HEV与HAV双阳性结果；若仅有检测1或2出现的为HEV或HAV阳性结果；若检测线1和2均未出现的则为为阴性结果。

2.HEV和HAV的RT-RPA扩增检测方法的检验

2.1 HEV和HAV的RT-RPA扩增检测方法的敏感性检验

将已知浓度为9.5×105拷贝/mL的HEV ORF2-HAV VP1 RNA片断的人工重组病毒颗粒液用去离子水进行10倍系列稀释后，应用病毒RNA磁珠法提取试剂盒提取病毒的RNA，以未洗脱的磁珠为RNA携带模板，按“1.2引物扩增”操作方法进行扩增，取5μL杂交反应产物(RT-RPA反应产物)在侧流层析试纸条上显示，结果表明，可以检测到9.5拷贝的靶标分子(图4)，说明用本发明设计的引物检测和HEV和HAV具有较高的灵敏度和准确性，且操作简便。

2.2 HEV和HAV的RT-RPA扩增检测方法的特异性检验

取200μL诺如病毒(NoV)浓度为1.6×10⁸拷贝/mL、轮状病毒(RV)滴度为5.5lgTCID50/mL、丙型肝炎病毒(HCV)浓度为3.5×10⁷拷贝/mL、肠道病毒71(EV71)浓度为7.5×10⁷拷贝/mL、柯萨奇病毒(CAV)浓度为5.4×10⁷拷贝/mL和脊髓灰质炎病毒(PV)滴度为5.95lgTCID50/mL。

将已知浓度为9.5×10⁵拷贝/mL的HEV ORF2-HAV VP1 RNA片断的人工重组病毒颗粒液作为阳性对照模板，利用实施例1筛选的引物和探针对NoV、RV、HCV、EV71、CAV和PV进行实施例2中的RT-RPA等温扩增步骤扩增。扩增产物在测流层析试纸条进行检测。HEV扩增产物在侧流层析试纸条反应区显现出1号和2号检测带和对照带，而以其它病毒检测样本试纸条反应区仅对照线显示清晰，检测线未见条带，均为阴性(图5)。说明本发明的双重HEV-HAVRT-RPA扩增检测方法具有较好的特异性。

2.3 HEV和HAV的RT-RPA扩增检测方法的重复性检验

将已知浓度为9.5×10³拷贝/mL的HEV ORF2-HAV VP1 RNA片断的人工重组病毒颗粒液作为模板，按照实施例1和2筛选所述的引物和探针进行RT-RPA等温扩增，对该模板进行3次重复，扩增产物分别在侧流层析试纸条进行检测。结果证实相同量模板的扩增产物在侧流层析试纸条反应区显现出亮度相同的对照带和检测带，具有较好的重复性(图6)。

对比例1：

本发明根据实施例1确定的保守核心区域同时设计了另外一组的引物对和探针组合，分别为戊型肝炎病毒ORF2基因的正向引物序列如SEQ ID No.9所示，反向引物序列如SEQ ID No.10所示，探针序列包含如SEQIDNo.11所示和SEQIDNo.12所示；甲型肝炎病毒VP1基因的正向引物序列如SEQIDNo.13所示，反向引物序列如SEQIDNo.14所示，探针序列如SEQIDNo.15所示和SEQIDNo.16所示。通过实施例2中的方法同样进行HEV和HAV的RT-RPA扩增检测、敏感性检验、特异性检验以及重复性检验。

结论：基于该套引物及探针RT-RPA扩增结果在敏感性和重复性方面相对稍低、在特异性方面与基于本发明引物、探针组合RT-RPA扩增结果相当。说明本发明引物、探针组合为最优组合。

实施例3：临床样本HEV和HAV检测

1.临床样本侧流层析RT-RPA检测

分别取本实验室已建立的HEV和HAV荧光定量RT-PCR鉴定为HEV和HAV双阳性的临床人血清样品3份，单阳性各7份，双阴性样品4份，共计21份样品，按照实施例2中步骤2.1和2.2中所述的RT-RPA检测方法进行RNA提取与扩增。经RT-RPA扩增产物在侧流层析试纸条显示3份样本试纸条反应区出现对照条带和1号和2号检测条带、7份样本试纸条反应区出现对照条带和1号检测条带、7份样本试纸条反应区出现对照条带和2号检测条带、4份样本试纸条反应区仅出现对照条带。表明RT-RPA方法与荧光定量RT-PCR法检测的符合率为100％，结果如图7所示。

实施例4：用于HEV-HAV检测的试剂盒

1.试剂盒的组成:实施例1筛选的引物和探针组合，HEV-HAV阳性对照模板，RT反转录液，RPA扩增Rehydration缓冲液，冻干酶颗粒，醋酸镁(280mM)、去离子水和侧流层析试纸条；病毒DNA/RNA磁珠法提取试剂。

2.RT反转录体系：为20μL，

3.RPA扩增体系：扩增体系为50μL，向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp NFO反应管中加入HEV和HAV正向引物各2.1μL(10μmol/L)，反向引物各2.1μL(10μmol/L)，探针各0.6μL(10μmol/L)，HEV-HAV阳性对照cDNA模板5μL，29.5μL Rehydration缓冲液，8.2μL去离子水和2.5μL醋酸镁溶液(280mM)。

4.检测步骤：

4.1 RT-RPA扩增

按照实施例2中步骤2.1-2.2中所述的RT-RPA检测方法进行RNA提取与RT反应后，进行RPA扩增。即38℃恒温金属浴内共反应25min。

4.2侧流层析试纸条进行检测

取5μL RT-RPA扩增产物，应用实施例2中“2.3侧流层析试纸条进行扩增产物检测”的方法进行检测，若侧流层析试纸条上显示出现检测带1号和2号以及对照带，则检测结果为HEV和HAV双阳性，若在出现对照线的同时仅出现1号检测线或2号检测则为HEV单阳性或HAV单阳性；若试纸条仅显示对照带，则结果为阴性。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 锦州医科大学

<120> 一种RT-RPA-侧流层析双重检测戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒的引物、探针

及试剂盒

<130> 2010

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgccaccat gcgctctcgg gctcttctgt t 31

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tgagaatcaa cccggtcacc ccagaaacca c 31

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tcgtgcttct gcctatgctg cccgcgccac c 31

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gccggtcagc cgtctg 16

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

aacaggtata caaagtcagc acatcagaaa ggt 33

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ctccaacttg tgtagtaaca tccatagcat gataa 35

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gcttattgtg tattgttata acagattgac c 31

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ctccttctaa cgttgct 17

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

catgcgctct cgggctcttc tgtttctgtt 30

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cgaagggttg agaatcaacc cggtcacccc a 31

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

tctgcctatg ctgcccgcgc caccggccgg tca 33

<210> 12

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ccgtctggcc gtcg 14

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

agtgaacagg tatacaaagt cagcacatca ga 32

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

catagcatga taaagaggag caaaacattc caa 33

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

attgtgtatt gttataacag attgacctct cctt 34

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

taacgttgct tcccat 16

Claims

1.一种RT-RPA-侧流层析双重检测戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒的引物对和探针组合，其特征在于，具体为检测戊型肝炎病毒ORF2 基因和甲型肝炎病毒VP1 基因的引物对和探针，其中戊型肝炎病毒ORF2 基因的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQIDNo.3 所示和SEQIDNo.4所示；甲型肝炎病毒VP1 基因的正向引物序列如SEQIDNo.5 所示，反向引物序列如SEQIDNo.6 所示，探针序列如SEQIDNo.7 所示和SEQIDNo.8 所示；

所述戊型肝炎病毒ORF2 基因的探针，其SEQIDNo.3 所示序列5’端连接有第一标记分子，SEQIDNo.4所示序列3’端连接有防止聚合反应的保护标签，SEQIDNo.3 所示序列3’端和SEQIDNo.4所示序列5’端由能够被具有DNA 损伤修复活性的酶识别并切除的人工碱基类似物连接；

所述甲型肝炎病毒VP1 基因的探针，其SEQIDNo.7所示序列5’端连接有第一标记分子，SEQIDNo.8所示序列3’端连接有防止聚合反应的保护标签，SEQIDNo.7 所示序列3’端和SEQIDNo.8所示序列5’端由能够被具有DNA 损伤修复活性的酶识别并切除的人工碱基类似物连接；

所述戊型肝炎病毒ORF2 基因的反向引物5’端连接有第二标记分子；

所述甲型肝炎病毒VP1 基因的反向引物5’端连接有第三标记分子；

所述戊型肝炎病毒ORF2 基因的探针和正向引物处于同一扩增方向；所述甲型肝炎病毒VP1 基因的探针和正向引物处于同一扩增方向；

所述探针中，防止聚合反应的保护标签为C3-spacer；能够被具有DNA 损伤修复活性的酶识别并切除的所述人工碱基类似物为四氢呋喃（THF）；

所述第一标记分子为生物素（Biotin），第二标记分子为荧光分子FAM，第三标记分子为地高辛（Dig）。

2.一种RT-RPA-侧流层析双重检测戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述检测戊型肝炎病毒ORF2 基因和甲型肝炎病毒VP1 基因的引物对和探针组合。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括测流层析试纸条，所述测流层析试纸条包括加样垫、对照线、1 号检测线和/或2 号检测线。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述加样垫含有胶体碳颗粒标记的所述第一标记分子特异结合物；所述对照线包被有第一标记分子的特异结合物；所述1 号检测线包被有第二标记分子特异结合物；所述2 号检测线包被有第三标记分子特异结合物；

所述第一标记分子特异结合物为链霉亲和素；所述第二标记分子特异结合物为抗FAM

抗体；所述第三标记分子特异结合物为地高辛抗体。

5.一种非诊断治疗目的的RT-RPA-侧流层析双重检测戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）将待测样本中提取的总RNA进行反转录，获得cDNA；利用权利要求1所述的戊型肝炎病毒ORF2 基因的引物及探针和甲型肝炎病毒VP1 基因的引物及探针对所得的cDNA进行RPA 扩增；

（2）使用测流层析试纸条检测扩增产物，判定样本中是否含有戊型肝炎病毒和/或甲型肝炎病毒；

判定方法：10 分钟内，（1）当对照C 线出现证明实验有效，此时1、2检测线同时出现，说明同时存在HEV 和HAV，检出判定均为阳性结果；（2）当对照C 线出现证明实验有效，此时仅1 号检测线出现而2号不出现，说明有HEV 检出判定为阳性结果，而HAV 检出判定为阴性结果；（3）当对照C 线出现证明实验有效，此时仅2 号检测线出现而1 号不出现，说明有HAV检出判定为阳性结果，而HEV 检出判定为阴性结果；（4）当对照C 线出现证明实验有效，此时1、2 检测线均不出现，说明HEV 和HAV 均未检出判定为全部阴性结果；（5）当对照C 线不出现时，说明实验无效，检测结果无意义。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）反转录过程为：将反转录反应液FastQant与RNA混匀，42℃的恒温金属浴中处理10~15min；

所述RPA 扩增体系为：总体积47.5μL，其中ORF2 基因和VP1 基因的正向引物各2.1μL，反向引物各2.1μL，探针各0.6μL，Rehydration 缓冲液29.5μL，模板cDNA 5μL，ddH₂O 3.4μL；

所述步骤（1）RPA扩增为：将上述RPA扩增体系混匀后，再加入2.5μL的醋酸镁，混匀反应；

所述步骤（2）的具体步骤为：取胶体碳检测卡于室温平衡；取步骤（1）中的扩增产物用缓冲液稀释后滴加于胶体碳检测卡的样品孔中读取结果。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述反转录体系为20μL；反应液与RNA体积比为3：1；反应条件为：38℃ 的恒温金属浴中温浴15-30min。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述缓冲液为1% PBS-T。