JP2010246555A - C型肝炎ウイルスの検出及び定量方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】HCVゲノム核酸を含む疑いのある試験サンプルに、HCV核酸配列を含む既知量の内部対照オリゴヌクレオチドと;内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンに特異的な第1の標識プローブと;HCVゲノム核酸のアンプリコンに特異的な第2の標識プローブを添加し、これを競合的に同時増幅し、プローブとアプリコンにハイブリッドを形成し、ハイブリッドを検出することによりC型肝炎ウイルスを定量する方法。
【選択図】なし
Description
「増幅試薬」とは選択したPCR又はRT−PCR増幅法を実施するために使用される各種緩衝液、酵素、プライマー、デオキシヌクレオシド三リン酸、及びオリゴヌクレオチドの総称である。
一般に、ゲノムRNAからcDNAを作製し、cDNAをポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、同時又は後続段階として配列特異的オリゴヌクレオチドでHCV cDNAアンプリコンの存在をプローブすることにより、(限定しないが)血清又は血漿等の生体サンプル中のHCVゲノムRNAを検出することができる。
検体調製の目的は検体を非感染性にし、検体から潜在的増幅阻害剤を除去し、ターゲットRNA分子を濃縮して増幅できるようにすることである。本発明ではこれらの目的を達成する任意手段を使用することができる。例えば、RT−PCR反応用核酸製造方法はSambrookら(1989)に記載されている。このようなRNA製造方法は当分野で周知であるので、これ以上詳細に記載しない。
上述のように、本方法で使用するプライマーは15〜30ヌクレオチド長が好ましく、試験サンプル中に存在するHCV RNAと内部対照のみの逆転写と増幅を特異的に開始する必要がある。
配列番号44:CGAGACCTCC CGGGGCACTC GC、及び
配列番号45:ATGTGCACGG TCTACGAGAC CTCCである。
内部対照は、好ましくはHCVゲノムの5’非翻訳領域(utr)に由来するHCVゲノム核酸の転写産物である。内部対照は内部対照のアンプリコンに特異的なプローブと配列が相補的なユニークプローブ結合領域を含むように修飾する。他方、他の全点において、内部対照はHCVゲノムの一部と配列が一致する。従って、内部対照はHCVゲノム核酸自体の内側の対応する位置と同一のプライマー結合部位をもつ。
配列番号46:GCC TTG TGG TAC TGC CTGである。
上述のように、本発明で使用する2種のプローブは相互に検出及び区別できるように示差的に標識する。ラベルの検出は直接又は間接手段により実施することができる。ラベルがプローブと夫々のアンプリコンのハイブリダイゼーションを妨げず、アッセイの他の成分に有害でない限り、ラベルの厳密な種類は本発明の総合機能性に重要ではない。本発明で使用するのに最も好適な2種の示差検出可能なラベルはアダマンタン由来ラベル(本明細書では単に「アダマンタン」と総称する)とダンシルである。好適アダマンタンラベルは米国特許第5,424,414号に記載されている。
RT−PCR増幅は好ましくは上記標識プライマーを使用して常法通りに実施される。
cDNA合成:94℃,1分;62℃,30分;94℃,2分;1サイクル。
増幅:94℃,1分;62℃,1分;45サイクル。
プローブハイブリダイゼーション:97℃,5分;15℃,5分;1サイクル。
cDNA合成:94℃,1分;62℃,30分;94℃,2分;1サイクル。
増幅:94℃,15秒;58℃,20秒;サイクル毎に1秒の伸長を挟んで5サイクル;次いで94℃,15秒;62℃,25秒;サイクル毎に1秒の伸長を挟んで40サイクル。
プローブハイブリダイゼーション:97℃,5分;15℃,5分;1サイクル。
増幅反応が完了し、HCV RNAと内部対照プローブのハイブリダイゼーションが完了した後に、サンプルを検出できるようになる。増幅プロトコールの最終段階で、反応体を検出プローブの融点未満に冷却する最終サイクル中にHCVプローブと内部対照プローブは夫々の増幅産物とハイブリダイズする。検出プローブはターゲット鎖の内部配列に相補的であるので、偽増幅産物(例えばプライマーダイマー)を検出から排除することによりアッセイの特異性が増す。2プローブフォーマットデザインによりHCVアンプリコンと内部対照アンプリコンの両者の二重検出が可能になる。
本発明の顕著な利点の1つは、内部対照がRT−PCRからアンプリコンの単離分析に至る全工程に介在するので、1組の校正曲線を使用して方法を先験的に校正できる点にある。従って、末端使用者が実施しなければならない校正操作数が最小限になる。要約すると、使用者はアッセイを実施し、比:{HCV RNAアンプリコンのカウント率(即ちc/s/s)と内部対照アンプリコンのカウント率(c/s/s)の比}の対数を計算し、得られた値を試験サンプル中のHCVの濃度に到達するまで対応する予備作成校正曲線と比較するだけでよい。
本発明は本発明の方法を実施するために必要なプライマー、プローブ、ラベル、試薬等の全部又はサブセットを含むキットにも関する。従って、キットの好適態様はフォワード及びリバースプライマー、内部対照、HCV特異的プローブ、及び内部対照特異的プローブを含む1個以上の容器を含む。これらの成分は適切な緩衝液に溶かす又は凍結乾燥して供給することができる。キットは場合によりHCV検出法を実施するための説明書を添付してもよい。キットは場合により予備作成校正曲線を添付してもよい。
Claims (10)
- 単離オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、
当該オリゴヌクレオチドは、(a)配列番号1〜21、23〜25または27−43のいずれか1つ;又は(b)(a)と長さが同一である(a)の相補配列から成る前記化合物。 - (a)のオリゴヌクレオチドが配列番号1〜8のいずれか1つから成る請求項1に記載の化合物。
- (a)のオリゴヌクレオチドが配列番号9〜21のいずれか1つから成る請求項1に記載の化合物。
- (a)のオリゴヌクレオチドが配列番号23〜25または27〜43のいずれか1つから成る請求項1に記載の化合物。
- オリゴヌクレオチドが標識されている請求項1に記載の化合物。
- オリゴヌクレオチドがハプテンで標識されている請求項1に記載の化合物。
- (a)HCVゲノム核酸を含む疑いのある試験サンプルに、(i)HCV核酸配列を含む既知量の内部対照オリゴヌクレオチドと;(ii)内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンに特異的な第1の標識プローブと;(iii)HCVゲノム核酸のアンプリコンに特異的な第2の標識プローブを添加する段階と;次に
(b)(i)配列番号1〜21、23〜25または27−43のいずれか1つ;又は(i)と長さが同一である(i)の相補配列から成るフォワードプライマーとリバースプライマーを使用して段階(a)からの試験サンプル中に存在する内部対照オリゴヌクレオチドとHCVゲノム核酸が存在する場合にはこれを競合的に同時増幅することにより、試験サンプル中に存在する内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンとHCVゲノム核酸のアンプリコンを生産する段階と;次に
(c)第1の標識プローブを内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンにハイブリダイズさせると共に第2の標識プローブをHCVゲノム核酸のアンプリコンにハイブリダイズさせる条件下で段階(b)からの試験サンプルをインキュベートすることにより、ハイブリッドを形成する段階と;次に
(d)第1の標識プローブと内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンの間で形成されたハイブリッドと、第2の標識プローブとHCVゲノム核酸のアンプリコンの間で形成されたハイブリッドを検出することにより、試験サンプル中に存在するHCVゲノム核酸の量を定量する段階を含む試験サンプル中のC型肝炎ウイルス(HCV)ゲノム核酸の量の定量方法。 - 段階(a)において第1の標識プローブが配列番号46又は配列番号46と長さが同一である配列番号46の相補配列から構成されるオリゴヌクレオチドを含む請求項7に記載の方法。
- 段階(b)(i)の配列が配列番号1〜8のいずれか1つである請求項7に記載の方法。
- HCVゲノム核酸を特異的に増幅することが可能であるプライマー対を収容する第1の容器であって、
一方のプライマーは、(a)配列番号1〜21、23〜25または27〜43のいずれか1つ;又は(b)(a)と長さが同一である(a)の相補配列から成る配列を有する前記第1の容器と;
HCVゲノムの5’非翻訳領域からの核酸転写産物を含む内部対照HCVオリゴヌクレオチドを収容する第2の容器と;
HCVゲノムRNAのアンプリコンに特異的な第1のプローブと内部対照HCVオリゴヌクレオチドのアンプリコンに特異的な第2のプローブを収容する第3の容器を併有する、試験サンプル中のC型肝炎ウイルス(HCV)ゲノム核酸の量の定量用キット。
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