CN111621597A - 一种病毒重组酶-聚合酶扩增检测方法 - Google Patents

一种病毒重组酶-聚合酶扩增检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速、高灵敏度的病毒重组酶‑聚合酶扩增检测方法、引物组以及试剂盒。本发明涉及的检测方法可快速且高灵敏度地对COVID‑19等突发性病毒的核酸进行检测，检测过程无需纯化提取核酸，直接裂解后就能够实现检测，极大减化了核酸检测操作步骤，降低了操作复杂性，适用于新型冠状病毒等突发性卫生事件的快速即时检测。

Description

一种病毒重组酶-聚合酶扩增检测方法
技术领域
本发明属于病毒检测领域，具体涉及到一种快速、高灵敏度的病毒重组酶-聚合酶扩增检测方法、引物组以及试剂盒，尤其可用于新型冠状病毒的检测中。
背景技术
COVID-19鉴定试剂盒以荧光定量PCR方法为主，实践显示其检测特异性高，成本低，操作方便。但是，该类试剂盒是根据已知病毒序列设计特异性引物和探针，因此只能鉴别已知病毒类型，不能鉴定未知新型病毒；此外，由于病毒基因序列变异，会导致引物和探针扩增失败，检测敏感性降低，因此需要定期更换引物和探针，并重新进行实际评估，而且根据目前临床实际使用情况表明现有的核酸检测存在较多的假阴性，给防控带来很大的隐患，其假阴性的原因可能由于实时荧光检测时检测灵敏度不够，从而导致其检测下限较高，检测结果存在部分误差。其次使用的较多的是胶体金检测方法，其是根据IgM、 IgG类抗体是人体感染新冠病毒后产生的免疫防御蛋白，IgG是感染14天后出现的抗体，产生后持续存在，可以作为既往感染的指标，此法检测的IgG在感染后持续存在导致不能很准确的对预后患者的感染情况进行有效评估和精确健康阶段检测。而酶联免疫法、恒温扩增-实时荧光法、杂交捕获免疫荧光法等方法均需要多个连续步骤进行，操作复杂程度高，耗时长，无法适应紧急检测的需要。
本发明采用的重组酶-聚合酶扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。最初由ASM scientific,Inc.于2003年申请专利 (EP1499738B1)。此类扩增反应又被称为recombinase-aidamplification(RAA)， Multienzyme Isothermal Rapid Amplification(MIRA)和体温扩增技术(STAMP)。
RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，其基本原理为：重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA 复合物(filament)，入侵到底物核酸template strand进行，能在双链DNA中寻找同源序列，一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，在DNA聚合酶作用下，在引物3‘端开始合成互补链，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被置换的DNA 链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。
RPA检测技术的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物并不能直接用于RPA检测，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。可见RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，需要大量的摸索和测试才能获得理想的引物和探针。
在COVID-19等的检测中，使用RPA技术能够实现快速高灵敏度的检测，然而临床实践中，样品来源复杂，数量巨大，经常面临急需拿到准确的检测结果的情形，如何获得更加明显的检测信号是急需解决的问题。
发明内容
本发明目的是为了克服现有技术的不足，提供一种快速、高灵敏度的病毒重组酶-聚合酶扩增检测方法、引物组以及试剂盒，尤其可用于新型冠状病毒的扩增检测。
具体的，本发明涉及一种病毒核酸扩增方法，所述方法包括第一步RPA或RT-RPA反应和第二步RPA反应，所述第二步RPA反应的引物对位于所述第一步RPA或RT-RPA反应引物对扩增获得的模板内，且与第一步RPA反应引物对不重叠或小于10bp的重叠。所述扩增方法属于检测过程的前一阶段，未对检测结果进行判断，属于非疾病的诊断方法。
所述第一步RPA或RT-RPA反应分别可用于DNA或RNA的扩增。
所述第二步RPA是带有探针的RPA，且里面可添加可以识别/thf/或者/idSp/的核酸内切酶。
更进一步地，所述方法还包括，在第一步RPA或RT-RPA反应体系中加入RNA模板进行反应，取1％-100％第一步RPA或RT-RPA反应产物加入第二步RPA反应体系进行第二步RPA反应。第一步反应完成后，反应液可不经过纯化，直接作为第二步反应的核酸模板溶液进入第二步反应。
更优的，所述第一步RPA反应体系中RNA模板为4个copy到1E6个copy，优选的加入的体积从2ul-100ul，优选的所述浓度为可以是40copies/ul、25copies/ul、15copies/ul、8copies/ul、4copies/ul、1copies/ul、0.6copies/ul、0.4copies/ul、0.2copies/ul。
更进一步地，所述方法的所述第一步RPA或RT-RPA反应或第二步RPA反应的反应时间分别为5-30min。优选的，所述第一步RPA或RT-RPA反应和第二步RPA反应时间均不超过10分钟，更优地均不超过5分钟；两步RPA反应总时间均不超过15分钟。
更进一步地，所述第一步RPA或RT-RPA反应或第二步RPA反应的反应温度为35℃到45℃，优选的是37℃-42℃，更优选的是37℃。
本发明还涉及一种用于病毒检测的引物对，所述引物对包括第一对RPA或RT-RPA引物对，和/或第二对RPA引物对，分别依次用于第一步RPA或RT-RPA反应和第二步RPA反应，所述第二步RPA反应的引物对位于所述第一步RPA或RT-RPA反应引物对扩增获得的模板内，且与第一步RPA反应引物对不重叠或小于10bp的重叠。
更进一步地，所述引物对为新型冠状病毒检测的RPA引物对，所述引物对包括：
1)1st RPA-F:ATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGG(SEQ ID No.1)和1st RPA-R:AGACCAGAAGATCAGGAACTCTAGAAGAA(SEQ ID No.2)，和/或
2)2nd RPA-F:TTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGC(SEQ ID No.3)和2nd RPA-R:5’biotin-AAGAAGGTTTTACAAGACTCACGTTAACAAT(SEQ ID No.4)。
本发明还涉及一种前述的引物对配套使用的用于病毒检测的探针，所述探针在第二步 RPA反应时使用，所述探针添加可以识别/thf/或者/idSp/的核酸内切酶。
更进一步地，所述探针为新型冠状病毒检测的RPA探针，所述探针分别为胶体金探针和荧光探针，优选的，所述探针分别为 Probe:
5’FAM-TTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGAT[thf]GTGTGCGTACTGCTG[C3 spacer](SEQ ID No.5)，或者
Probe:
5’GCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGA/i6FAMdT//idSp/G/iBHQ1dT/GTGCGTACTGCTG-C3spacer(SEQ ID No.6)。
本发明还涉及一种用于病毒检测的序列组合包括前述的引物对和探针。
具体的，所述序列组合为一种新型冠状病毒检测的序列组合，包括两组RPA反应引物对和探针，
所述引物对包括：
1)1st RPA-F:ATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGG(SEQ ID No.1)和1st RPA-R:AGACCAGAAGATCAGGAACTCTAGAAGAA(SEQ ID No.2)，和/或
2)2nd RPA-F:TTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGC(SEQ ID No.3)和2nd RPA-R:5’biotin-AAGAAGGTTTTACAAGACTCACGTTAACAAT(SEQ ID No.4)；
所述探针包括Probe:
5’FAM-TTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGAT[thf]GTGTGCGTACTGCTG[C3s pacer](SEQ ID No.5)，或者
Probe:
5’GCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGA/i6FAMdT//idSp/G/iBHQ1dT/GTGCGTACTGCTG-C3spacer(SEQ ID No.6)。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含前述任选的病毒检测的引物对、探针和/或序列组合。
另一方面，本发明还涉及前述的前述任选的病病毒检测的引物对、探针和/或序列组合在制备检测新型冠状病毒试剂盒中的用途。
另一方面，本发明还涉及一种用于病毒检测的重组酶-聚合酶扩增方法，具体步骤包括：
(1)将病毒样本与核酸释放剂混合，裂解病毒衣壳并释放病毒核酸；
(2)两步RPA反应：包括第一步RPA或RT-RPA反应和第二步RPA反应，所述第二步RPA反应的引物对位于所述第一步RPA或RT-RPA反应引物对扩增获得的模板内，且与第一步RPA反应引物对不重叠或小于10bp的重叠。
更进一步地，所述方法还包括，在第一步RPA或RT-RPA反应体系中加入RNA模板进行反应，取第一步RPA或RT-RPA反应产物加入第二步RPA反应体系进行第二步RPA反应。
其中所述步骤(1)的病毒RNA原液样本来源于鼻咽拭子、深咳痰液、肺泡灌洗液、唾液样品或肺组织活检标本。
其中所述步骤(2)第一步RPA反应体系中RNA模板为4个copy到1E6个copy，优选的加入的体积从2ul-100ul，优选的所述浓度为可以是40copies/ul、25copies/ul、15copies/ul、 8copies/ul、4copies/ul，1copies/ul、0.6copies/ul、0.4copies/ul、0.2copies/ul。
所述方法的所述第一步RPA或RT-RPA反应或第二步RPA反应的反应时间分别为 5-30min。优选的，所述第一步RPA或RT-RPA反应和第二步RPA反应时间均不超过10分钟，更优地均不超过5分钟；两步RPA反应总时间均不超过15分钟。
更进一步地，所述第一步RPA或RT-RPA反应或第二步RPA反应的反应温度为35℃到45℃，优选的是37℃-42℃，更优选的是37℃。
其中所述步骤(2)，取1％-100％的第一步RPA反应产物加入第二步RPA反应体系进行第二步RPA反应。
所述方法还包括胶体金显色步骤，该步骤为获得检测结果的步骤，具体为：取第二步RPA反应产物加入到DEPC水中混合均匀进行稀释，吸取稀释产物置于胶体金点样孔中显色拍照。所述方法还包括荧光探针检测步骤。
优选的，第二步扩增反应中，探针被切割后的带有FAM的产物与第二步中的带有biotin 的引物组成引物对，参与扩增并形成一端带有FAM，一端带有biotin的双链DNA，此在胶体金层析中通过夹心法被显色。此时胶体层析试纸可设置为：胶体金表面为链霉亲和素 (或者FAM抗体)，第一条线T线为FAM抗体(或者链霉亲和素)，第二条线C线为链霉亲和素抗体(FAM)。
本发明涉及的方法、试剂盒具有高灵敏度。快速准确、方便便携的优点。对于痕量的核酸检测，无法通过一步RPA来得到足够的扩增倍数，从而获得明显的信号，本发明提出可以通过两步RPA反应，在第一步RPA反应的基础上，设计新的引物序列位于第一步引物对扩增出来的模板内部，与原有引物不重叠(或10bp以内的重叠)，可以进一步对原有的模板进行扩增，提高扩增倍数，有效的检验极低浓度的核酸信号，实现了对含有 COVID-19病毒核酸检测～3个拷贝的检测。
其次，常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。本发明RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要温控设备，本发明的RPA 技术可以真正实现便携式的快速核酸检测。此外传统的qPCR、一步法RPA、基于RPA扩增的sherlock技术对临床样本的核酸进行检测，通常需要裂解病毒样本后进行核酸纯化，然后对纯化后的核酸进行检测。本发明的方法对COVID-19病毒核酸进行检测，可以在不纯化核酸的前提下，只对样本进行简单的裂解，无需核酸提取纯化的过程，即可输入到扩增反应中进行检测，因此可以大大降低核酸检测的复杂程度。
同时，本发明设计胶体金检测用的特异性探针对于COVID-19检测，实现了通过胶体金试纸读取的方式进行结果读取，无需仪器。同时，与高灵敏度的RPA-Cas12a技术相比，在相同反应体系下，本发明的两步RPA荧光强度明显强于RPA-Cas12a技术，在荧光信号放大方面具有明显的优势，尤其是在低拷贝数的反应体系，本发明的两步RPA的反应速度仍然保持高拷贝体的水平和效果，而RPA-Cas12a反应速度大大降低。对于极低拷贝反应体系(甚至低于2copies)，两步RPA仍然可以检测到荧光信号，而RPA-Cas没有荧光信号。因此，两步法RPA对于检测痕量核酸样品相对于RPA-Cas具有更高的灵敏度，更适用于病毒的紧急检测、无症状感染者或恢复期病毒感染患者等场景的检测。
附图说明
图1：本发明快速、高灵敏度的病毒重组酶-聚合酶扩增方法示例性流程图。
图2：两步RPA检测COVID-19病毒RNA有效性实验结果。
图3：两步RPA检测游离病毒RNA灵敏度测试实验结果。
图4：两步RPA极限反应时间测试实验结果。
图5：两步RPA对病毒采集液以及裂解溶液耐受实验结果。
图6：两步RPA在咽拭子环境下检测新冠假病毒测试实验结果。
图7 ：1st RPA反应30min下，两步RPA和RPA-Cas荧光曲线对比图。
图8 ：1st RPA反应30min下，取30min时荧光值作图。
图9 ：1st RPA反应10min下，两步RPA和RPA-Cas荧光曲线对比图。
图10 ：1st RPA反应10min下，取2nd RPA反应30min时荧光值作图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1两步RPA检测COVID-19病毒RNA有效性验证
1.试剂准备
COVID-19病毒RNA样品购自国家标准物质(标准物质编号：GBW(E)091099)
1st RPA反应试剂盒购自英国TwistDX公司，产品型号为
Figure BDA0002484625880000081
Basic RT kit
2nd RPA反应试剂盒购自英国TwistDX公司，产品型号为
Figure BDA0002484625880000082
nfo kit
胶体金试纸购自北京库尔科技有限公司
2.实验步骤
1)将新冠病毒RNA原液(E基因RNA浓度：1.06±0.11×103copies/ul)稀释至10copies/ul。
2)将正向引物，反向引物和探针用DEPC水稀释至10uM。引物序列如下：
1st RPA-F:ATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGG(SEQ ID No.1)
1st RPA-R:AGACCAGAAGATCAGGAACTCTAGAAGAA(SEQ ID No.2)
2nd RPA-F:TTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGC(SEQ ID No.3)
2nd RPA-R:5’biotin-AAGAAGGTTTTACAAGACTCACGTTAACAAT(SEQ ID No.4)
Probe:5’FAM-TTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGAT[thf]GTGTG CGTACTGCTG[C3spacer](SEQ ID No.5)
3)两步RPA反应流程
①1st RPA反应体系配置
Figure BDA0002484625880000091
②2nd RPA反应体系配置
Figure BDA0002484625880000092
3、实验分组：
实验组：
在1st RPA反应体系中加入2.5ul RNA模板(共25copies RNA)，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10分钟。取10ul 1st RPA反应产物加入2nd RPA反应体系中，37℃反应10 分钟。做两个实验重复。
对照组一：
在1st RPA反应体系中加入0ul RNA模板，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10分钟。取10ul 1st RPA反应产物加入2nd RPA反应体系中，37℃反应十分钟。做两个实验重复。
对照组二：
直接在2nd RPA反应体系中加入2.5ul RNA模板(共25copies RNA)，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10分钟。
对照组三：
直接在两步RPA反应体系中加入0ul RNA模板，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10分钟。
4、胶体金显色
取20ul2nd RPA反应产物加入到80ul DEPC水中，混合均匀。吸取100ul稀释产物置于胶体金点样孔中。2分钟后显色拍照。
5、实验结论
实验组和对照组一对比说明两步RPA可以在50ul反应体系中检测到25个copies病毒RNA。而且反应产物并非由引物非特异性扩增得到。
实验组同对照组二对比，说明单纯的一步RPA反应不能够获得足够的产物使得胶体金显色。结果如图2所示。
实施例2两步RPA检测游离病毒RNA灵敏度测试
该实施例的试剂准备、实验步骤、两步RPA反应体系与实施例1相同。
1、实验分组如下：
实验组一：1st RPA反应体系中使用的RNA浓度为15copies/ul。配制好1st RPA反应体系后，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10分钟。取10ul1st RPA反应产物加入到2nd RPA 反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10分钟。
实验组二：1st RPA反应体系中使用的RNA浓度为8copies/ul。配制好1st RPA反应体系后，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10分钟。取10ul1st RPA反应产物加入到2nd RPA 反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10分钟。
实验组三：1st RPA反应体系中使用的RNA浓度为4copies/ul。配制好1st RPA反应体系后，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10分钟。取10ul 1st RPA反应产物加入到2nd RPA 反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10分钟。
对照组：1st RPA反应体系中使用的RNA浓度为0copies/ul。配制好1st RPA反应体系后，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10分钟。取10ul 1st RPA反应产物加入到2nd RPA 反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10分钟。
2、胶体金显色
取20ul 2nd RPA反应产物加入到80ul DEPC水中，混合均匀。吸取100ul稀释产物置于胶体金点样孔中。2分钟后显色拍照。
3、实验结论
如图3所示，两步RPA可以在50ul反应体系中检测到4copies目标RNA的存在。
实施例3两步RPA极限反应时间测试
该实施例的试剂准备、实验步骤、两步RPA反应体系与实施例1相同。
1、实验分组如下：
实验组一：按照上表配好1st RPA反应体系，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。取10ul反应产物加入到2nd RPA反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。
实验组二：按照上表配好1st RPA反应体系，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。取10ul反应产物加入到2nd RPA反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应5min。
实验组三：按照上表配好1st RPA反应体系，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应5min。取10ul反应产物加入到2nd RPA反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。
实验组四：按照上表配好1st RPA反应体系，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应5min。取10ul反应产物加入到2nd RPA反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应5min。
对照组：1st RPA反应体系中用1ul水替代RNA溶液，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。取10ul反应产物加入到2nd RPA反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。
2、胶体金显色
取20ul 2nd RPA反应产物加入到80ul DEPC水中，混合均匀。吸取100ul稀释产物置于胶体金点样孔中。2分钟后显色拍照。
3、实验结论
如图4所示，两步RPA可以实现在15min内检测出50ul反应体系中的10copies新冠病毒RNA。
实施例4两步RPA对病毒采集液以及裂解溶液耐受测试
1.试剂准备
新冠病毒COVID-19假病毒购买自复百澳生物科技有限公司(货号： FNV-2019-ncov-abEN)
1st RPA反应试剂盒购自英国TwistDX公司，产品型号为
Figure BDA0002484625880000121
BASIC RTKIT
2nd RPA反应试剂盒购自英国TwistDX公司，产品型号为
Figure BDA0002484625880000122
NFO KIT
胶体金试纸购自北京库尔科技有限公司
病毒保存液：友康保存液MT0301，基于Hanks液基础上添加庆大霉素，真菌抗生素，BSA，冷冻保护剂，生物缓冲剂和氨基酸等成分。
病毒裂解液品牌：圣湘裂解液：Tris-His 400mM，氯化钠150mM，吐温-20 0.8％，曲拉通X-100 1.2％，乙基苯基聚乙二醇1.5％，氯化钾6mg/mL，氢氧化钠15mg/mL。
2.实验步骤
1)将假病毒原液(病毒浓度：6.5×105copies/ul)用病毒保存液稀释至0.3copies/ul。
2)将正向引物，反向引物和探针用DEPC水稀释至10uM，引物序列与实施例1相同。
3)两步RPA反应流程，与实施例1相同。
3、实验分组
实验组一：取7.05ul假病毒稀释液(0.3copy/ul)，加入7.05ul圣湘病毒裂解液，吹打混匀，作为病毒溶液加入1st RPA反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。取10ul1st RPA产物加入到2nd RPA反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。
实验组二：取14.1ul假病毒稀释溶液(0.3copy/ul)，65℃加热30min，冷却后作为病毒溶液加入1st RPA反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。取10ul1st RPA 产物加入到2nd RPA反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。
实验组三：取14.1ul假病毒稀释液(0.3copy/ul)，作为病毒溶液加入1st RPA反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。取10ul1st RPA产物加入到2nd RPA反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。
对照组：取14.1ul DEPC水代替假病毒溶液加入1st RPA反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。取10ul1st RPA产物加入到两步反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。
4、胶体金显色
取20ul 2nd RPA反应产物加入到80ul DEPC水中，混合均匀。吸取100ul稀释产物置于胶体金点样孔中。2分钟后显色拍照。
5、实验结论
裂解液可以很好的裂解释放溶于保存液中的假病毒，而且两步RPA可以耐受裂解液和保存液的混和溶液。可以实现核酸免提取，直接反应。
实施例5两步RPA在咽拭子环境下检测新冠假病毒测试
该实施例的试剂准备、实验步骤、两步RPA反应体系与实施例4相同。
1、实验分组如下：
实验组一：取含有咽拭子含有病毒的友康保存液7.05ul同7.05ul圣湘裂解液混合均匀，作为病毒溶液加入到1st RPA反应体系中。颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。取10ul1st RPA产物加入到2nd RPA反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。
实验组二：取含有病毒的友康保存液7.05ul同7.05ul圣湘裂解液混合均匀，作为病毒溶液加入到1st RPA反应体系中。颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。取10ul1st RPA产物加入到2nd RPA反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。
对照组一：取含有咽拭子的友康保存液7.05ul同7.05ul圣湘裂解液混合均匀，代替病毒溶液加入到1st RPA反应体系中。颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。取10ul1stRPA产物加入到2nd RPA反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。
对照组二：取不含有咽拭子的友康保存液7.05ul同7.05ul圣湘裂解液混合均匀，代替病毒溶液加入到1st RPA反应体系中。颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。取10ul1stRPA产物加入到2nd RPA反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应10min。
2、胶体金显色如实施例4所示。
3、实验结论
如图6所示，两步RPA可以在咽拭子环境下检测50ul反应体系中的25copies病毒RNA。
实施例6两步RPA和RPA-Cas12a检测方法对比
1.试剂准备
RNA样品购自国家标准物质(标准物质编号：GBW(E)091099)
1st RPA反应试剂盒购自英国TwistDX公司，产品型号为
Figure BDA0002484625880000141
BASIC RT KIT
2nd RPA反应试剂盒(荧光型)购自英国TwistDX公司，产品型号为
Figure BDA0002484625880000142
EXOKIT
胶体金试纸购自北京库尔科技有限公司
LbCas12a购自NEB公司,货号为M0653T
NEB2.1 10x buffer购自NEB公司，货号为B7202S
Ultrapure Water购自Thermo公司，货号为10977023
2.实验步骤
1)将新冠病毒RNA原液(E基因RNA浓度：1.06±0.11×103copies/ul)稀释至合适浓度。
2)将正向引物，反向引物和探针用DEPC水稀释至10uM，1st RPA和2nd RPA引物对序列如实施例1；
两步RPA探针如下：
Probe:5’
GCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGA/i6FAMdT//idSp/G/iBHQ1dT/GTGCGTACTGCTG-C3spacer(SEQ ID No.6)；
E-cr1crRNA:UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAAGACUCACGUUAACAAUA
Cas12areporter:/5’6-FAM/AAAAAAAAAAAAAAA/3’BHQ1/
3、两步RPA反应流程
①1st RPA反应体系配置
Figure BDA0002484625880000151
②2nd RPA反应体系配置(1：6)
Figure BDA0002484625880000152
Figure BDA0002484625880000161
2nd RPA反应体系配置(1：10)
Figure BDA0002484625880000162
两步RPA实验分组
实验组一:将病毒RNA分别稀释至100copies/ul，50copies/ul，20copies/ul，10copies/ul, 5copies/ul,2copies/ul,0copies/ul浓度。按照1st RPA反应体系配制，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应30min。取3.33ul反应产物配制2nd RPA(1：6)反应体系，颠倒混匀，短暂离心，置于qPCR仪(伯乐CFX96)上，37℃反应1h，每1min记录荧光值。每组做三个实验重复。
实验组二:将病毒RNA分别稀释至100copies/ul，50copies/ul，20copies/ul，10copies/ul, 5copies/ul,2copies/ul,0copies/ul浓度。按照1st RPA反应体系配制，颠倒混匀，短暂离心， 37℃反应30min。取2ul反应产物配制2nd RPA(1：10)反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，置于qPCR仪(伯乐CFX96)上，37℃反应1h，每1min记录荧光值。每组做三个实验重复。
实验组三：
将病毒RNA分别稀释至100copies/ul，50copies/ul，20copies/ul，10copies/ul,5copies/ul, 2copies/ul,0copies/ul浓度。按照1st RPA反应体系配制，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应 10min。取3.33ul反应产物配制2nd RPA(1：6)反应体系，颠倒混匀，短暂离心，置于qPCR 仪(伯乐CFX96)上，37℃反应1h，每1min记录荧光值。每组做三个实验重复。
实验组四：
将病毒RNA分别稀释至100copies/ul，50copies/ul，20copies/ul，10copies/ul,5copies/ul, 2copies/ul,0copies/ul浓度。按照1st RPA反应体系配制，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应 10min。取2ul反应产物配制2nd RPA(1：10)反应体系中，颠倒混匀，短暂离心，置于 qPCR仪(伯乐CFX96)上，37℃反应1h，每1min记录荧光值。每组做三个实验重复。
4、RPA-Cas反应流程
RPA-Cas12a检测原理是Cas12a结合guide RNA后形成核蛋白复合物，该复合物识别结合在目标dsDNA上后会被激活。激活态的Cas12a会切割reporter DNA。Reporter DNA的两端分别带有荧光基团和淬灭基团，被切割后，荧光基团的荧光被检测到。
①准备Cas12a+crRNA复合体。冰上解冻crRNA并充分混匀，首先对crRNA进行预退火，配置反应体系如下(多个反应配置预混液后分装)：
Figure BDA0002484625880000171
Figure BDA0002484625880000181
混匀后65℃3分钟，随后马上插到冰上，保持1分钟。每个反应添加0.2ul 10uMCas12a，混匀后37℃孵育30分钟。
②Cas12荧光检测，配置反应体系如下：
Cas12荧光反应体系(1：6)
Figure BDA0002484625880000182
Cas12荧光反应体系(1：10)
Figure BDA0002484625880000183
Cas12荧光检测实验分组
实验组一:将病毒RNA分别稀释至100copies/ul，50copies/ul，20copies/ul，10copies/ul, 5copies/ul,2copies/ul,0copies/ul浓度。按照1st RPA反应体系配制，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应30min。取3.33ul反应产物配制Cas12荧光反应体系(1：6)，涡旋3s混匀，短暂离心，置于qPCR仪(伯乐CFX96)上，37℃反应1h，每1min记录荧光值。每组做三个实验重复。
实验组二:将病毒RNA分别稀释至100copies/ul，50copies/ul，20copies/ul，10copies/ul, 5copies/ul,2copies/ul,0copies/ul浓度。按照1st RPA反应体系配制，颠倒混匀，短暂离心， 37℃反应30min。取2ul反应产物配制Cas12荧光反应体系(1：10)，涡旋3s混匀，短暂离心，置于qPCR仪(伯乐CFX96)上，37℃反应1h，每1min记录荧光值。每组做三个实验重复。
实验组三：
将病毒RNA分别稀释至100copies/ul，50copies/ul，20copies/ul，10copies/ul,5copies/ul, 2copies/ul,0copies/ul浓度。按照1st RPA反应体系配制，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应 10min。取3.33ul反应产物配制Cas12荧光反应体系(1：6)，涡旋3s混匀，短暂离心，置于qPCR仪(伯乐CFX96)上，37℃反应1h，每1min记录荧光值。每组做三个实验重复。
实验组四：
将病毒RNA分别稀释至100copies/ul，50copies/ul，20copies/ul，10copies/ul,5copies/ul, 2copies/ul,0copies/ul浓度。按照1st RPA反应体系配制，颠倒混匀，短暂离心，37℃反应 10min。取2ul反应产物配制Cas12荧光反应体系(1：10)，涡旋3s混匀，短暂离心，置于qPCR仪(伯乐CFX96)上，37℃反应1h，每1min记录荧光值。每组做三个实验重复。
5、实验结果
将1st RPA反应30min后的产物加入第二步反应体系中(2nd RPA或者Cas12a)，检测30min内荧光强度变化(图7-8)；将1st RPA反应10min后的产物加入第二步反应体系中(2ndRPA或者Cas12a)，检测10min内荧光强度变化(图9-10)。
结果显示，对于高拷贝数的反应体系(≥50copies)，两步RPA和RPA-Cas均能在短时间内达到最大荧光强度。对于低拷贝数的反应体系(5～20copies)，两步RPA的反应速度和高拷贝体系一致，而RPA-Cas反应速度大大降低。对于极低拷贝反应体系(2copies)，两步RPA可以检测到荧光信号，而RPA-Cas没有荧光信号。因此，两步法RPA对于检测痕量核酸样品具有较高的灵敏度。
因此相对于高灵敏度的RPA-Cas技术，本发明的两步RPA在荧光信号放大方面具有更明显的技术优势。
本发明虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 清华大学
<120> 一种病毒重组酶-聚合酶扩增检测方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
atgtactcat tcgtttcgga agagacagg 29
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
agaccagaag atcaggaact ctagaagaa 29
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
ttctttttct tgctttcgtg gtattcttgc 30
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
aagaaggttt tacaagactc acgttaacaa t 31
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
ttacactagc catccttact gcgcttcgat tgtgtgcgta ctgctg 46
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt gcgtactgctg 51

Claims (19)

1.一种病毒核酸扩增方法，其特征在于，所述方法包括第一步RPA或RT-RPA反应和第二步RPA反应，所述第二步RPA反应的引物对位于所述第一步RPA或RT-RPA反应引物对扩增获得的模板内，且与第一步RPA或RT-RPA反应引物对不重叠或小于10bp的重叠。
2.根据权利要求1的扩增方法，其特征在于，所述方法还包括，在第一步RPA或RT-RPA反应体系中加入RNA模板进行反应，取1％-100％第一步RPA或RT-RPA反应产物加入第二步RPA反应体系进行第二步RPA反应。
3.根据权利要求1或2的扩增方法，其特征在于，所述第一步RPA或RT-RPA反应体系中RNA模板为4个copy到1E6个copy。
4.根据权利要求1或2的扩增方法，其特征在于，所述第一步RPA或RT-RPA反应或第二步RPA反应的反应时间分别为5-30min。
5.根据权利要求1或2的扩增方法，其特征在于，所述第一步RPA或RT-RPA反应或第二步RPA反应的反应温度为35℃到45℃，优选的是37℃-42℃，更优选的是37℃。
6.一种用于病毒检测的引物对，其特征在于，所述引物对包括第一对RPA或RT-RPA引物对，和/或第二对RPA引物对，分别依次用于第一步RPA或RT-RPA反应和第二步RPA反应，所述第二步RPA反应的引物对位于所述第一步RPA或RT-RPA反应引物对扩增获得的模板内，且与第一步RPA或RT-RPA反应引物对不重叠或小于10bp的重叠。
7.一种与权利要求6所述的引物对配套使用的病毒检测的探针，其特征在于，所述探针在第二步RPA反应时使用，所述探针添加可以识别/thf/或者/idSp/的核酸内切酶。
8.一种用于病毒检测的序列组合，其特征在于，包括权利要求6所述的引物对和权利要求7所述的探针。
9.一种试剂盒，其特征在于，其包含权利要求6的引物对、权利要求7的探针和/或权利要求8的序列组合。
10.权利要求6的引物对、权利要求7的探针和/或权利要求8的序列组合在制备检测病毒试剂盒中的用途。
11.一种用于病毒检测的重组酶-聚合酶扩增方法，其特征在于，具体步骤包括：
(1)将病毒样本与核酸释放剂混合，裂解病毒衣壳并释放病毒核酸；
(2)两步RPA反应：包括第一步RPA或RT-RPA反应和第二步RPA反应，所述第二步RPA反应的引物对位于所述第一步RPA或RT-RPA反应引物对扩增获得的模板内，且与第一步RPA反应引物对不重叠或小于10bp的重叠。
12.根据权利要求11的扩增方法，其特征在于，所述方法还包括，在第一步RPA或RT-RPA反应体系中加入RNA模板进行反应，取第一步RPA或RT-RPA反应产物加入第二步RPA反应体系进行第二步RPA反应。
13.根据权利要求11或12的所述扩增方法，其特征在于，其中所述步骤(1)的病毒RNA原液样本来源于鼻咽拭子、深咳痰液、肺泡灌洗液、唾液样品或肺组织活检标本。
14.根据权利要求11或12的所述扩增方法，其特征在于，所述第一步RPA或RT-RPA反应体系中RNA模板为4个copy到1E6个copy。
15.根据权利要求11或12的扩增方法，其特征在于，所述第一步RPA或RT-RPA反应或第二步RPA反应的反应时间分别为5-30min。
16.根据权利要求11或12的扩增方法，其特征在于，所述第一步RPA或RT-RPA反应或第二步RPA反应的反应温度为35℃到45℃，优选的是37℃-42℃，更优选的是37℃。
17.根据权利要求11或12的扩增方法，其特征在于，所述在第一步RPA或RT-RPA反应体系中加入RNA模板进行反应，取1％-100％第一步RPA或RT-RPA反应产物加入第二步RPA反应体系进行第二步RPA反应。
18.根据权利要求11或12的扩增方法，其特征在于，所述方法还包括胶体金层析显色步骤，取第二步RPA反应产物加入到DEPC水中混合均匀进行稀释，吸取稀释产物用于胶体金层析显色。
19.根据权利要求11或12的扩增方法，其特征在于，所述方法还包括荧光探针检测步骤。
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