KR101498704B1 - Ｂ형 간염 바이러스 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 ｂ형 간염 바이러스 진단 방법 - Google Patents

Ｂ형 간염 바이러스 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 ｂ형 간염 바이러스 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스 검출용 프라이머, 탐침 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 B형 간염 바이러스의 표면 항원 S 유전자에 특이적인 프라이머, 프로브 및 상기 프라이머와 프로브를 이용하여 B형 간염 바이러스를 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용하면, 생물학적 시료 내에 존재하는 소량의 B형 간염 바이러스의 DNA를 신속하고 정확하게 검출할 수 있으며, 건조된 키트의 제공을 통해 보관 안전성이 향상되고, 재현성 높은 결과를 얻을 수 있다.

Description

B형 간염 바이러스 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 B형 간염 바이러스 진단 방법{DIAGNOSTIC PRIMER FOR THE HEATITIS B VIRUS, PROBE, KIT INCLUDING SAME, AND METHOD FOR DIAGNOSING THE HEPATITIS B VIRUS USING THE KIT}
본 발명은 B형 간염 바이러스 진단용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 B형 간염 바이러스 진단 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 생물학적 시료 및 환경 시료에 존재하는 B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 프라이머, 프로브 및 이를 이용하여 중합효소연쇄반응을 기반으로 상기 B형 간염 바이러스 감염 유무 및 정량적 진단에 이용할 수 있는 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.
B형 간염바이러스는 외막에 싸인 바이러스(Enveloped Virus)로 3.2 kb의 작은 게놈(genome)을 가지며, 부분적인 이중환상 DNA(partially duplex circular DNA)로 구성되어 있다. 이로부터 4개의 단백질이 발현되는데, 각각 표면항원(Surface Antigen), 코어 단백질(Core), DNA 중합효소(DNA Polymerase), X 단백질이 된다. 바이러스가 숙주 세포내로 침입한 후 게놈은 핵으로 이동되고 숙주세포의 복구기구(Repair system)에 의해 부분적이던 이중가닥이 완전한 이중가닥 DNA(cccDNA, covalently closed circular DNA: 또는 Relaxed circular DNA라고도 함)가 된다. 프리지노믹(Pregenomic) RNA가 전사된 후 코어내로 싸여 들어가서(Encapsidation) 상기 프리지노믹 RNA를 주형으로 B형 간염바이러스 DNA 폴리머레이즈에 의한 복제과정이 일어난다. 이후 성숙된 바이러스 입자가 숙주 세포를 빠져 나오며 새로운 감염주기가 반복된다(Ganem D, Varmus HE., 1987, Ann. Rev. Biochem.. 56, 651-93).
B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus; 이하 'HBV'라 칭하기도 함)는 헤파드나비리대 과(Hepadnaviridae family)에 속하는 바이러스로서, 인간의 간세포에만 특이적으로 감염된다. 전 세계적으로 3억 5천만명 정도의 만성 보균자가 있는 것으로 추정되며, 한국의 경우 인구의 약 7％인 3백만명 정도가 감염되어 있는 것으로 판단된다. 전세계 감염환자의 분포를 보면 아프리카, 동남아, 중국에 많이 분포하고, 오스트레일리아, 서유럽 및 북미에는 상대적으로 적다. 미국에서는 연간 14만명에서 32만명의 인구가 B형 간염 바이러스에 감염되는 것으로 추정되며, 만성 간염 환자는 120만명 정도이다. 유럽 지역에서는 연간 90만명에서 100만명의 인구가 B형 간염 바이러스에 감염된다고 알려져 있다(Andre F, 2000, Vaccine, 18 Suppl S20-2; Tiollais P, Buendia MA, 1991, Sci. Am., 264(4), 116-23; Fallows DA, Goff SP, 1996, AdvVirus Res., 46, 165-94; Maddrey WC, 2000, J. Med. Virol., 61(3), 362-6).
간염의 증상은 가벼운 경우 피로감을 느끼게 되고, 심한 경우 황달이 나타난다. 만성 간염의 말기에는 간경변의 합병증이 발생하고, 복수, 부종, 위식도 정맥류 출혈, 간성 뇌증, 혈액응고 이상, 비장 항진증 등이 나타나게 된다.
주된 감염 경로인 감염된 어머니로부터 출산 전후 및 신생아기에 감염되는 경우 만성화율이 90％에 달하며, 성인이 된 후 감염된 경우 만성화율은 10％ 내외이다. 성관계나 주사침 등에 노출될 때 상처를 통해 감염될 수 있다(Tiollais P, Buendia MA, 1991. Sci. Am., 264(4), 116-23; Maddrey WC., 2000, J. Med. Virol,, 61(3),362-6). 어린 시절 감염된 환자의 경우, 바이러스의 증식은 일어나지만 간염 증상이 나타나지 않는 면역 관용(Immune tolerance) 시기가 10-30년 지속적으로 일어나지만, 이들 보균자(Healthy Carrier)가 일정한 시기(15-30세)가 되면 면역기구의 작용으로 간세포가 손상을 입게 되고 급성 간염으로 발전한다. 혈청전환(Seroconversion)이 빠른 시일 내 일어나는 경우 바이러스 증식이 억제되고 간염의 증상이 더 이상 발전되지 않지만, 바이러스의 증식이 효과적으로 억제되지 않는 경우 간경변증이 생기고 만성 간염으로 발전하며 심한 경우 간암으로 발전한다.
B형 간염 바이러스의 치료제로는 바이러스의 DNA 중합효소를 겨냥해 많은 약물이 개발되었거나 개발되는 과정 중에 있다. 현재 시판되고 있는 약물은 인터페론 알파와 라미부다인(Lamivudine, 이하 '3TC'라 칭함)이 있다. 인터페론 알파는 비용이 많이 들고 치료율이 20％에 불과한 문제점이 있으며(Hoofnagle JH, di Bisceglie AM, 1997. N Engl J Med 0336(5):347-56), 3TC의 경우 경구투여가 가능하고 약효가 뛰어나며 부작용이 적지만 내성 바이러스가 발생하여 치료 효과가 감소하는 단점이 있어 새로운 약물의 개발이 요구되고 있다(De Clercq E, 1999, Int. J. Antimicrob. Agents, 12(2), 81-95).
HBV 감염의 여부는 혈청 내에 있는 HBsAg (HBV 표면항원)의 측정으로 알 수 있으나, 만성 감염과 활성 감염을 구분하기 위해서는 혈액에 순환되는 HBV DNA의 수치와 간 효소 수치를 정량적으로 측정함으로써 판정할 수 있기 때문에 HBV DNA 검사가 요구된다. 또한, B형 간염 바이러스 감염 환자의 신속한 발견과 약물에 의한 내성 또는 치료 효과를 모니터링하기 위해 빠르고 정확한 DNA의 정량적 검사가 요구되고 있다. 그러나, 종래의 방법들은 B형 간염 바이러스 DNA를 정제하는데 많은 시간과 노동이 소요될 뿐만 아니라 실험의 재현성이 높지 않은 문제점이 있었다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 대한민국특허 등록번호 제10-0194003호에서는 세포배양액을 수산화나트륨 및 베타-머캅토에탄올로 처리한 후 중화 및 가열처리하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 'PCR'이라 칭하기도 함)시킴으로써 DNA 정제 과정의 시간, 노동을 단축하고 PCR 반응 중의 오염에 대한 우려를 최소화 하는데 성공하였으나, PCR 반응 산물을 아가로즈 겔에서 전기영동 및 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색한 후 영상분석기로 강도를 분석하여야 하기 때문에 다량의 화합물 분석시 여전히 많은 시간과 노동이 소요되며, 이 과정에서 실험상의 오차가 발생하여 정확한 결과를 얻기 어려운 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 B형 간염 바이러스에 대해 특이적인 신규한 프라이머 및 프로브를 디자인하였으며, 상기 프라이머, 프로브 및 이를 포함하는 키트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 실시함으로써 종래의 방법들에 비해 B형 간염 바이러스 DNA를 신속하고 정확하게 검출할 수 있고, 또한 반응에 필요한 중합효소연쇄반응 혼합액을 건조함으로써, 용액 상태의 혼합액과 성능은 동등하게 유지하면서 보관기간이 향상됨은 물론 혼합과정의 간소화로 오차발생을 최대한 줄여 재현성 높은 결과를 얻을 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 실시간 중합효소연쇄반응에 사용되는 B형 간염 바이러스 DNA 진단용 프라이머와 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다른 간염 바이러스와 교차반응하지 않고 B형 간염 바이러스 DNA를 검출하는 키트로서, 중합효소연쇄반응 반응에 필요한 모든 시약이 1회 테스트 용량에 맞춰 혼합, 분주, 건조되어 있어 사용을 위해 검사자의 숙련도가 요구되지 않는 B형 간염 바이러스 DNA 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신속하고 정확한 B형 간염 바이러스의 감염 유무 및 DNA의 정량적 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응 또는 일반적인 중합효소연쇄반응을 통해 B형 간염 바이러스 DNA를 검출하는데 필요한 프라이머 및 프로브를 제공한다.
본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응은 프라이머와 형광물질이 화학적으로 결합하여 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써 반응 결과를 실시간으로 모니터한다. 이 프로브는 중합효소연쇄반응 과정에서 두 개의 프라이머와 같이 검체의 핵산에 있는 상보서열에 결합하게 되는데, 결합 위치는 프라이머에서 약간 떨어진 부분이다. 본 발명의 프로브는 양끝에 리포터(reporter)와 소광제(quencher)라는 형광물질이 붙어 있는 구조로서, 리포터와 소광제가 근접하여 존재하면 형광을 서로 상쇄하여 리포터의 형광이 감지되지 않으나, 증폭이 진행됨에 따라 리포터가 소광제로부터 떨어지면 리포터의 형광이 감지되는 것이다. 따라서 형광의 강도는 증폭 사이클이 증가함에 따라 점점 증가하게 된다.
본 발명자들은 종래의 실시간 중합효소연쇄반응 제품과 비교하여 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스를 검출하고자 독자적으로 B형 간염 바이러스의 표면 항원 S 유전자의 특정 서열에서 프라이머와 프로브를 디자인하였다. 자체 디자인된 프라이머와 프로브는 다른 간염 바이러스와는 교차반응이 없도록 설계되었다.
본 발명의 프라이머 및 프로브는 B형 간염 바이러스 표면 항원 S 유전자(GeneBank 기탁번호; X04615)의 일부 또는 그 상보적 염기서열의 일부를 포함하는 것으로서, 바람직하게는 상기 염기서열의 155 부터 835 번째 염기 내의 5 내지 40 개의 염기서열을 포함하고, 보다 바람직하게는 서열번호 1 내지 4로 기재되는 염기서열인 정방향 프라이머 및 서열번호 5 내지 8로 기재되는 염기서열인 역방향 프라이머이다. 또한, 프로브는 서열번호 9 내지 12로 기재되는 염기서열이 바람직하며, 모두 정방향 프로브이다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 또는 프로브를 포함하는 B형 간염 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 본 발명의 프라이머 또는 프로브 외에 증폭용 완충용액, dNTP, 대조군, 검출 시약 등을 포함하며, 건조 상태로 제공되는 것이 바람직하고, 반응에 영향이 없는 경우에 한하여 목적에 따라 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 건조 상태로 제공되는 상기 키트는 보관 안정성이 향상되어 오랜 기간 사용이 가능하며, 혼합액의 제조과정이 생략됨으로써 실험자의 숙련도에 상관없이 빠른 시간 내에 재현성 높은 정확한 정량적 결과값을 얻을 수 있다.
상기 키트는 추가로 내부 대조군용 프라이머 및 프로브를 포함할 수 있다. 중합효소연쇄반응시 내부 양성 대조군(internal positive control, 이하 'IPC'라 하기도 함) 주형 및 이에 맞는 프라이머를 제작하여 함께 넣어줌으로써 PCR이 잘 수행되었는지를 여부를 용이하게 확인할 수 있다. 상기 프라이머는 예컨대 Mus musculus dishevelled, dsh homolog 1(Drosophila)(Dvl1) 유전자(GenBank. Accession No. NM010091)의 일부 또는 그 상보적 염기서열의 일부를 포함하는 것으로서, 바람직하게는 상기 염기서열의 942 부터 1708 번째 염기 내의 5 내지 40 개의 염기서열을 포함하고, 보다 바람직하게는 서열번호 13 내지 15로 기재되는 염기서열인 정방향 프라이머 및 서열번호 16 내지 18로 기재되는 염기서열인 역방향 프라이머이다. 또한, 프로브는 서열번호 19 내지 21로 기재되는 염기서열이 바람직하며, 모두 정방향 프로브이다.
내부 대조군용 프라이머 및 프로브는 테스트시 양성 대조군으로서, 본 발명을 이용하여 (실시간) 중합효소연쇄반응을 수행 시 음성 판정이 나왔을 때, 즉 시료에 B형 간염 바이러스가 존재하지 않는 것으로 나왔을 때 그 결과가 실험상의 실수인지 또는 실제 B형 간염 바이러스가 존재하지 않는 것인지 검증하기 위해 필요한 것으로서, 본 발명의 B형 간염 바이러스 유전자 프라이머 세트와 함께 증폭할 때 B형 간염 바이러스 유전자 검출을 방해하지 않아야 한다. 상기 내부 대조군이 양성으로 나타날 경우 중합효소연쇄반응 자체는 문제가 없음을 나타낸다.
상기 프라이머 및 프로브들은 프라이머 2개(정방향 1개, 역방향 1개) 및 프로브 1개의 구성이면 임의의 조합이 가능하나, 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머, 서열번호 5로 기재되는 역방향 프라이머 및 서열번호 9로 기재되는 정방향 프로브를 사용할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 실시간 중합효소연쇄반응 뿐 아니라 일반적인 중합효소연쇄반응에도 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용되기 위한 검체는 임상 시료 또는 환경 시료로부터 습득될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. B형 간염 바이러스 프로브의 리포터는 FAM (6-carboxyfluorescein), 소광제는 BHQ1을 사용하는 것이 바람직하고, 내부 대조군용 프로브의 리포터는 TAMRA(Carboxy-tetramethyl-hod-amine), 소광제는 BHQ1을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 본 발명은
1) 검체를 주형으로 상기 B형 간염 바이러스 검출용 프라이머와 상기 B형 간염 바이러스 검출용 프로브를 사용하여 중합효소연쇄반응 또는 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및
2) 상기 1) 단계의 증폭 유무 또는 증폭 산물에 대한 형광값을 조사하는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 검출 방법에 의하면, 민감도가 높아 매우 적은 양의 B형 간염 바이러스가 시료 내에 존재하더라도 검출할 수 있으며, 특히 실시간 중합효소연쇄반응의 경우 증폭이 진행되는 동안 곧바로 증폭 여부를 관찰할 수 있고 별도의 증폭산물 확인단계가 필요하지 않아 검출 시간을 줄일 수 있다. 본 중합효소연쇄반응 또는 실시간 중합효소연쇄반응에서는 IPC를 추가로 사용하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 중합효소연쇄반응시 상기 IPC 주형 및 이에 맞는 프라이머를 제작하여 함께 넣어줌으로써 PCR이 잘 수행되었는지를 여부를 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 상기 검체는 임상 시료 또는 환경시료로부터 습득될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 프라이머, 프로브 및 검출 방법을 사용하면, B형 간염 바이러스 유전자를 신속하고 간편하게 검출할 수 있으며, 민감도가 높아 시료 내에 존재하는 매우 낮은 농도의 B형 간염 바이러스까지도 정확하게 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 B형 간염 바이러스 DNA 진단용 키트의 개발을 통해 감염 초기의 정확한 진단이 가능할 것으로 기대되며, 약물 치료의 모니터링을 통한 B형 간염 바이러스의 약물 내성 확인 및 치료 효과 확인에도 크게 기여할 것으로 기대된다.
도 1 및 도 2는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST를 이용하여 B형 간염 바이러스 표면 항원 S 서열을 정렬(alignment)하여 상동성이 높은 부분을 확인한 것으로, 100％ 매치되는 부분을 검정색으로 표시하였다. 상기 상동성 있는 서열을 바탕으로 본 발명의 프라이머 및 프로브를 제작하였다.
도 1은 한국에서 많이 발견되는 유전자형 C의 서열을 기준으로 하여 상동성을 확인한 것이고, 도 2는 유전자형 C를 기준으로 제작한 프라이머 및 프로브의 서열을 다양한 유전자형 서열과 매치되는 부분을 비교한 것이다.
도 3 내지 도 8은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 본 발명의 HBV 프라이머 및 프로브의 모든 조합으로 7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems사제, 미국) 기기를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 실시한 결과를 보여주는 그래프이고, 도 9는 서열번호 13 내지 서열번호 21로 기재되는 본 발명의 내부 대조군용 DNA의 프라이머 및 프로브의 조합으로 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems사제, 미국) 기기를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 실시한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3: 세트 1의 프라이머 및 프로브로 증폭한 그래프
도 4: 세트 1의 프라이머 및 프로브로 증폭한 그래프의 표준 커브
도 5: 세트 2의 프라이머 및 프로브로 증폭한 그래프
도 6: 세트 2의 프라이머 및 프로브로 증폭한 그래프의 표준 커브
도 7: 세트 3의 프라이머 및 프로브로 증폭한 그래프
도 8: 세트 3의 프라이머 및 프로브로 증폭한 그래프의 표준 커브
도 9: 내부 대조군용 프라이머 및 프로브의 8개 조합으로 증폭한 그래프. 그래프 우측의 숫자는 테스트 세트 번호 1-8을 나타낸다.
도 10 내지 도 12는 서열번호 1, 5, 9의 서열 중 1 base를 mixbase로 치환한 서열번호 4, 8, 12로 기재되는 본 발명의 프라이머 및 프로브의 조합으로 실시간 중합효소연쇄반응기기 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용한 HBV 표준 주형의 실시간 중합효소연쇄반응의 결과를 보여주는 그래프이다. 또한, 도 13은 서열번호 9로 기재되는 프로브의 소광제인 BHQ를 내부 T 서열에 결합시킨 형태의 Inner dT 프로브를 합성하여 서열번호 1, 5 프라이머와 조합으로 실시간 중합효소연쇄반응기기 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용한 HBV 표준 주형의 실시간 중합효소연쇄반응의 결과를 보여주는 그래프이다.
NTC: 음성 대조군으로서 공시료
도 10: 서열번호 4, 8, 12를 사용한 증폭 그래프
도 11: 서열번호 4, 8, 12를 사용한 증폭 그래프의 표준 커브
도 12: 서열번호 1, 5, 9 세트와 서열번호 4,8,12 세트의 비교증폭 그래프
도 13: 서열번호 1, 5, 9(inner dT)세트로 증폭한 그래프
도 14 내지 도 17은 서열번호 1, 5, 9 및 서열번호 13, 16, 19 로 기재되는 본 발명의 프라이머 및 프로브의 조합으로 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용한 농도별 HBV 표준 주형 실시간 중합효소연쇄반응의 결과를 보여주는 그래프와 표준 곡선을 나타낸다.
도 14: 서열번호 1, 5, 9 세트를 사용한 증폭 그래프
도 15: 서열번호 1, 5, 9 세트를 사용한 증폭 그래프의 표준 커브
도 16: 서열번호 1, 5, 9 세트와 서열번호 13, 16, 19의 혼합사용 증폭 그래프
도 17: 서열번호 1, 5, 9 세트와 서열번호 13, 16, 19의 혼합사용 증폭 그래프의 표준 커브
도 18은 서열번호 1, 5, 9 및 서열번호 13, 16, 19로 기재되는 본 발명의 프라이머 및 프로브를 포함하는 건조 상태의 PCR 조성물을 이용한 HBV 표준 주형의 실시간 중합효소연쇄반응의 결과를 보여주는 그래프로서, 실시간 중합효소연쇄반응기기 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용한 것이다.
검은색 곡선: 10∼107 카피 농도별 HBV 주형 DNA의 증폭 곡선
파란색 곡선: 자체 제작한 내부 대조군용 DNA에 의한 증폭 곡선
NTC: 음성 대조군으로서 공시료
도 19는 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용하여 건조 상태의 PCR 혼합물에 농도별 HBV 표준 주형을 적용한 실시간 중합효소연쇄반응 그래프의 표준 곡선을 나타낸다(기울기: -0.3024, R2: 0.9994).
도 20은 건조 상태의 PCR 혼합물을 이용한 HBV 표준 주형의 실시간 중합효소연쇄반응의 결과를 보여주는 그래프로서, 실시간 중합효소연쇄반응기기 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용한 것이다.
검은색 곡선: 10∼1010 카피 농도별 HBV 표준 주형의 증폭 곡선
NTC: 음성 대조군으로서 공시료
도 21 내지 도 25는 건조 상태의 PCR 혼합물의 보관안정성 시험을 위하여 건조 직후 및 40℃ 정온배치 보관 날짜별(각각 2일, 4일, 6일, 8일) PCR 혼합물을 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 보여주는 그래프이다. 실시간 중합효소연쇄반응기기 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용하였으며, 101∼107 카피 농도의 HBV 표준 주형에 대하여 시험을 진행한 것이다.
검은색 곡선: 농도별 HBV 주형 DNA의 증폭 곡선
파란색 곡선: 자체 제작한 내부 대조군용 DNA의 증폭 곡선
NTC: 음성대조군으로서 공시료
그래프 하단의 수식은 농도별 HBV 표준 주형을 적용한 실시간 중합효소연쇄반응 그래프의 표준 곡선을 나타낸다.
도 26 및 도 27은 HBV 유전자형 패널로부터 DNA를 추출하고, 건조된 PCR 혼합물을 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 보여주는 그래프로서, ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용하여 얻은 결과이다.
도 26: 유전자형 패널 DNA의 증폭 곡선
도 27: 유전자형 패널의 type 정보 및 농도 측정 결과
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 주형 DNA 제조
이후에 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하기 위해, 먼저 주형 DNA를 제조하였다. B형 간염 바이러스의 표면 항원 S 서열을 정렬하여 상동성이 높은 부분을 확인하였다(도 1). 그 후에 상동성이 높은 서열 중 하나인 B형 간염 바이러스 표면 항원 S 유전자(GeneBank 기탁번호; X04615)에서 프라이머 및 프로브 서열을 포함하는 155번째 내지 835번째 서열인 680 bp를 유전자 합성방법(NBiochem . Biophys. Res . Commun . 1998, 248, 200-203)으로 합성하고 이를 pGEM-T-Easy Vector(Cat: A1360, Promega사제, 미국)에 클로닝하였다.
구체적으로 2X rapid ligation buffer(Promega사제, 미국) 5 ㎕, T-Easy Vector(Promega사제, 미국) 1 ㎕, T4 DNA ligase 1 ㎕(Promega사제, 미국), 유전자 합성물질 3 ㎕(8 ng)를 동일한 튜브에 넣어 혼합한 다음 37℃에서 1시간 정온 배치하였다. 그 후, E. coli 만능세포(competent cell) 50 ㎕에 상기의 정온 배치한 반응액 5 ㎕을 넣고 얼음 상에 30분간 놓아둔 뒤 42℃에서 90초 배양하고 다시 얼음 상에 2분 놓아두었다. 앰피실린, IPTG, X-Gal이 포함된 LB 플레이트에 상기 반응액을 접종한 후 37℃에서 16시간 배양하였다.
색이 흰 콜로니를 취하여 LB 액체 배지에서 16시간 정도 배양한 후 원심 분리하여 상층액은 버리고 AccuprepÐplasmid DNA prep kit(Bioneer사제, 한국)를 사용하여 펠렛으로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA는 UV 분광계(Shimazu사제, 일본)로 농도와 순도를 측정한 다음 순도가 1.8∼2.0 사이인 것을 확인하였고, 농도 측정 결과를 바탕으로 DNA 카피 수(copy number)를 아래의 공식에 의하여 계산하였다.
6.02×1023×농도(UV 분광계로 측정된 농도 g/㎖)/(3015+830)×660 [3015 bp: T-easy vector의 크기, 680bp: 말라리아 주형 DNA의 크기]
주형 DNA의 카피 수를 계산한 다음 1X TE buffer(10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA)로 10진 희석하여 사용시까지 -70℃에 보관하였다.
상기 주형 DNA 제조와 같은 방법으로 내부 대조군용 DNA를 제조하였다. 내부 대조군용 DNA는 음성 결과가 나왔을 때, 그 음성 결과가 증폭 오류에 의한 것이 아님을 확인하기 위해 필요하다.
Mus musculus dishevelled, dsh homolog 1(Drosophila)(Dvl1) 유전자(GenBank Accession No. NM010091)에서 프라이머 및 프로브 서열을 포함하는 928번째 내지 1647번째 서열인 767 bp 부위를 유전자 합성하여 내부 대조군용 DNA 제조에 이용하였고, 추출한 플라스미드 DNA의 농도 측정 결과를 바탕으로 DNA 카피 수를 아래의 공식에 의하여 계산하였다.
6.02×1023×농도(UV 분광계로 측정된 농도 g/㎖)/(3015+767)×660[3015 bp: T-easy vector의 크기, 767bp: 내부 대조군용 DNA의 크기]
내부 대조군용 DNA의 카피 수를 계산한 다음 1X TE buffer(10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA)로 10진 희석하여 사용시까지 -70℃에 보관하였다.
실시예 2. 프라이머 및 프로브 디자인
B형 간염 바이러스 표면 항원 S 유전자(GeneBank 기탁번호; X04615)의 염기서열 155 부터 835 사이에서 길이는 19∼27 bp, Tm 값은 55℃ 내지 65℃가 되도록 임의로 염기서열을 선택하여 정방향 및 역방향 프라이머로 하였다. 또한, 염기서열 155 부터 835 사이에서 길이는 20∼30 bp 사이, Tm 값은 67∼77℃ 사이에서 임의로 염기서열을 선택하여 프로브로 하였고, Tm 값은 Primer3Plus 프로그램을 사용하여 체크하였다(표 1).
내부 대조군용 Mus musculus dishevelled, dsh homolog 1(Drosophila) (Dvl1) 유전자(GenBank. Accession No. NM010091)의 염기서열 942 부터 1708 사이에서 길이는 17∼23 bp, Tm 값은 55℃ 내지 62℃가 되도록 임의로 염기서열을 선택하여 정방향 및 역방향 프라이머로 하였다. 또한, 염기서열 942 부터 1708 사이에서 길이는 19∼30 bp 사이, Tm 값은 67∼72℃ 사이에서 임의로 염기서열을 선택하여 프로브로 하였고, Tm 값은 Primer3Plus 프로그램을 사용하여 체크하였다(표 2).
우선, B형 간염 바이러스 유전자의 프라이머 2개와 프로브 1개를 세트로 조합한 후 7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems사제, 미국)을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 진행하였다. 구체적으로 10X Buffer 5㎕, wTfi polymerase 2.5U, dNTP 20mM 5㎕, Thermostable Pyrophosphatase, PPi, 안정화제 등을 한 튜브에 넣고 상기 실시예 1에서 합성한 HBV 주형 DNA, HBV 검출용 프라이머와 프로브 및 증류수를 넣어 총 용량이 50㎕이 되도록 혼합한 후 96-웰 플레이트에 분주하였다. 이 때, 총 용량 50㎕ 혼합액에 포함된 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브의 농도는 각각 15pmole을 사용하였다. 이를 95℃에서 10분간 변성시킨 후, 95℃에서 20초, 55℃에서 30초씩 45 사이클을 반응시켰다. 증폭된 형광값은 각 PCR 사이클이 진행됨에 따라 55℃ 30초 반응 후에 1회씩 지속적으로 측정되었다. 반응 결과, 상기 프라이머 및 프로브 중 PCR 증폭효율이 가장 높은 것은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머, 서열번호 9의 정방향 프로브인 것을 알 수 있었다(표 3, 도 3 내지 도 13).
B형 간염 바이러스의 다양한 유전자형 검출 효율을 증가시키기 위하여, PCR증폭효율이 가장 높은 서열번호 1의 정방향 프라이머의 20번째 base, 서열번호 5의 역방향 프라이머의 18번째 base, 서열번호 9의 정방향 프로브의 7번째 base의 각 1 base를 mixbase로 치환한 서열번호 4의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머, 서열번호 12의 정방향 프로브를 이용하여 상기와 같은 방법으로 실시간 중합효소연쇄반응을 진행하였다(표 5). 상기와 같이 치환된 서열을 사용하는 경우 1base 차이로 100％ 일치하지 못한 서열을 추가적으로 일치시켜 줌으로써 다양한 subtype을 검출할 수 있는 장점이 있다(도 2). 반응 결과, T base를 Y(T+C)로 치환한 서열번호 4의 정방향 프라이머, T base를 K(T+G)로 치환한 서열번호 8의 역방향 프라이머, T base를 Y(T+C)로 치환한 서열번호 12의 정방향 프로브를 사용하여도 유전자 증폭이 잘 진행됨을 확인하였으나, 치환 이전의 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머, 서열번호 9의 정방향 프로브에서 더 높은 증폭효율을 나타내었다(도 10 내지 도 13).
또한, 상기 실시예 1에서 합성한 내부 대조군용 DNA 및 내부 대조군용 모든 프라이머와 프로브를 세트로 조합한 후 상기와 같은 방법으로 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 진행하였다.
반응 조건은 95℃에서 10분간 변성 후, 95℃에서 20초, 55℃에서 30초씩 45 사이클을 반응시켰다. 그 결과, PCR 증폭이 효율적으로 확인되는 내부 대조군용의 프라이머 및 프로브를 선택하였고(표 4), 상기 프라이머 및 프로브 중 PCR 증폭효율이 가장 높은 것은 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 16의 역방향 프라이머, 서열번호 19의 정방향 프로브인 것을 알 수 있었다(도 9).
이 후 실험에서는 HBV 프라이머 및 프로브 중 PCR 증폭효율이 가장 높은 것(서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머, 서열번호 9의 정방향 프로브)과 내부 대조군용 프라이머 및 프로브 중 결과가 가장 좋은 것(서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 16의 역방향 프라이머, 서열번호 19의 정방향 프로브)을 사용하였다.
서열번호 9의 정방향 프로브는 5' 말단에 리포터로서 FAM이, 3' 말단에 소광제로서 BHQ1이 결합되어 있는 구조이다. 이에 대하여, 프로브 서열 중 8번째 염기서열 T에 소광제가 결합되어 있는 inner dT 프로브를 제작하여 상기 동일한 방법으로 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 이 때 프라이머는 증폭효율이 가장 높은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머와 세트를 이루어 ExicyclerTM Quantitative Thermal Block(바이오니아사제, 한국)을 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 진행하였다. 반응조건은 95℃에서 10분간 변성 후, 95℃에서 20초, 55℃에서 30초씩 45 사이클을 반응시켰다. 반응 결과, 소광제(BHQ1)의 위치를 서열내부 8번째 T base에 결합시킨 Inner dT 프로브를 사용하는 경우에도 증폭효율이 거의 동등한 성능을 유지함을 알 수 있다(도 10 내지 도 13).
Figure 112012087733713-pct00001
Figure 112012087733713-pct00002
Figure 112012087733713-pct00003
Figure 112012087733713-pct00004
Figure 112012087733713-pct00005
실시예 3. 표준주형 실시간 중합효소연쇄반응
상기 실시예 1에서 제작한 HBV DNA 및 내부 대조군용 DNA를 주형으로 하고, 상기 실시예 2에서 선택된 서열번호 1, 5, 및 9로 기재되는 HBV 프라이머 및 프로브, 및 서열번호 13, 16 및 19로 기재되는 내부 대조군용 프라이머 및 프로브를 적용하여 ExicyclerTM Quantitative Thermal Block(바이오니아사제, 한국) 실시간 중합효소연쇄반응을 실행하였다. 이는 HBV DNA, HBV 프라이머 및 프로브와 함께 내부 대조군용 DNA, 내부 대조군용 프라이머 및 프로브를 혼합하여 중합효소연쇄반응을 진행하여도 HBV DNA의 증폭효율에 영향을 주지 않고 내부 대조군용 DNA의 증폭이 독립적으로 일어남을 확인하기 위함이다. 반응조건은 실시예 2와 동일한 조성 및 방법으로 45 사이클의 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다.
그 결과, 내부 대조군용 DNA, 내부 대조군용 프라이머 및 프로브를 포함하지 않는 반응에서는 실시예 1의 방법대로 카피 수를 계산하여 HBV 주형 DNA는 최저 10 카피까지 검출이 가능하였고(도 14), 표준 주형 실시간 역전사 중합효소연쇄반응의 표준 그래프를 작성했을 때, 기울기는 -0.3121, R2 값은 0.9992이었다(도 15). 여기서, R2 는 실시간 중합효소연쇄반응의 표준 그래프를 그렸을 때 그래프의 직선성을 나타내는 상관계수로 1에 가까울수록(직선에 가까울수록), PCR이 제대로 진행되었음을 의미한다. 또한, 105 카피의 내부 대조군용 DNA와 내부대조군용 프라이머 및 프로브를 HBV DNA, HBV 프라이머 및 프로브와 함께 반응한 경우에는 실시예 1의 방법대로 카피 수를 계산하여 HBV 주형 DNA는 최저 10 카피까지 검출이 가능하였고(도 16), 표준 주형 실시간 역전사 중합효소연쇄반응의 표준그래프를 작성했을 때, 기울기는 -0.2912, R2 값은 0.9998이었다(도 17). 이로써 HBV DNA 주형의 증폭에 아무런 영향을 주지 않고 내부 대조군 증폭이 독립적으로 이루어짐을 확인하였다.
실시예 4. PCR 프리믹스 건조물을 이용한 표준 주형 실시간 중합효소연쇄반응
PCR 혼합액(프리믹스) 건조물에 대한 열안정성 검토를 위하여 상기 실시예 2와 같은 조성의 PCR 혼합액을 제조, 건조한 후 이를 사용하여 ExicyclerTM Quantitative Thermal Block(바이오니아사제, 한국)로 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 실행하였다.
구체적으로 10X Buffer 5㎕, wTfi polymerase 2.5U, dNTP 20mM 5㎕, Thermostable Pyrophosphatase, PPi, 안정화제 등을 한 튜브에 넣고 증류수를 넣어 총 용량이 25㎕이 되도록 혼합한 후 96-웰 플레이트에 분주하고, SuperCentra2(바이오니아사제, 한국)를 이용하여 50∼60분간 건조하였다. 이 후 상기 실시예 2에서 선택된 서열번호 1, 5 및 9로 기재되는 HBV 프라이머 및 프로브, 또한 서열번호 13, 16 및 19로 기재되는 내부 대조군용 프라이머 및 프로브를 총 용량 5㎕이 되도록 혼합한 후 1차 건조물에 추가 분주하여 25∼30분 건조하였다.
건조한 PCR 혼합물에 상기 실시예 1에서 제작한 HBV DNA 및 내부 대조군용 DNA를 주형으로 첨가하고, 증류수로 총 용량이 50㎕가 되도록 분주하여 건조물이 잘 풀리도록 완전 혼합하였다. ExicyclerTM Quantitative Thermal Block(바이오니아사제, 한국)을 이용하고 실시예 2와 동일한 조건 및 성분으로 45 사이클의 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다.
그 결과, 실시예 1의 방법대로 카피 수를 계산하여 HBV 주형 DNA는 최저 10 카피까지 검출이 가능하였고(도 18), 표준 주형 실시간 역전사 중합효소연쇄반응의 표준 그래프를 작성했을 때, 기울기는 -0.3024, R2 값은 0.9994이었다(도 19). 여기서, R2 는 실시간 중합효소연쇄반응의 표준 그래프를 그렸을 때 그래프의 직선성을 나타내는 상관계수로 1에 가까울수록(직선에 가까울수록), PCR이 제대로 진행되었음을 의미한다.
상기 결과에 의해 용액 상태의 PCR 혼합액을 사용한 것과 건조한 혼합물을 사용하여 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 수행한 두 가지 방법에서 동등한 성능이 유지됨을 알 수 있다.
상기 방법과 동일하게 건조한 PCR 혼합물을 사용하여 최종적으로 다이내믹 레인지(Dynamic Range, 한번의 반응에서 검출할 수 있는HBV DNA의 농도 범위) 확인을 위해 ExicyclerTM Quantitative Thermal Block(바이오니아사제, 한국)을 이용하여 실시예 2와 동일한 조건으로 45 사이클의 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 실시예 1의 방법대로 카피 수를 계산한 HBV 주형 DNA를 최고 1010 카피에서 최저 10 카피 농도 범위에서 10배씩 희석하여 사용하였으며, 10 log 범위에서 HBV DNA 검출이 정상적으로 이루어짐을 확인하였다(도 20).
실시예 6. 건조 타입 PCR 조성물의 보관 기간에 따른 안정성 시험
상기 실시예 4와 동일한 조성과 방법을 이용하여 서열번호 1, 5 및 9로 기재되는 HBV 프라이머 및 프로브와 서열번호 13, 16 및 19로 기재되는 내부 대조군용 프라이머 및 프로브를 포함하는 건조 상태의 PCR 혼합물을 제조한 뒤, 40℃에서 2일 간격으로 8일 동안 정온 배치하고, 각 보관 기간별 건조 타입 PCR 조성물을 ExicyclerTM Quantitative Thermal Block(바이오니아사제, 한국)을 이용하여 상기 실시예 2와 동일한 조건으로 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 이는 실제 보관 권장 온도인 -20℃에서 건조 PCR 조성물의 성능 유지 기간을 가속화 실험을 통해 단기간에 예측할 수 있는 방법으로, 40℃에서 1일 보관한 경우 -20℃에서 약64일 보관한 것으로 간주한다(표 6).
구체적으로, 건조 타입 PCR 조성물은 동일 배치(batch)로 8일 분량을 한번에 제조한 후, 건조 직후의 혼합물 일부를 실시예 2와 동일한 조건으로 45 사이클의 실시간 중합효소연쇄반응에 사용하여 대조군 결과를 얻었다. 그 외의 건조 타입 PCR 조성물은 모두 40℃ 항온기에 동시에 넣어두었으며, 반응에 필요한 수량만큼 2일 간격으로 꺼내어 각각 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 이 때, HBV 주형 DNA는 실시예 1의 방법대로 카피 수를 계산하였고, 최고 107부터 최저 101 카피까지 7가지 농도를 사용하여 반응을 진행하였다. ExicyclerTM Quantitative Thermal Block(바이오니아사제, 한국)을 이용하여 얻은 각 보관 일수별 건조 혼합물의 실시간 역전사 중합효소연쇄반응 결과 중 기울기 값과 R2 값을 대조군 결과와 비교하여, 제조 직후의 건조 혼합물과 40℃ 보관 일수에 따른 건조 혼합물의 성능을 비교하였다.
40℃에서 2일 간격으로 8일 동안 정온배치하여 실험한 결과, 액체 상태의 PCR 혼합물인 대조군에서 기울기는 -0.3161, R2 값은 0.9992이었으며, 40℃에서 보관한 건조 타입 PCR 조성물은 기울기 -0.29∼-0.31, R2 값은 0.9994∼0.9999로 확인되었다(도 21 내지 도 25). 이는 40℃ 정온배치 8일 후에도 건조 직후의 결과와 동등 수준의 결과 값을 얻은 것으로, -20℃ 보관일수로 환산하면 약 512일 동안 건조 직후와 거의 유사한 결과를 안정되게 얻을 수 있음을 의미한다.
Figure 112012087733713-pct00006
N.Temp : Normal temperature 로 정상온도를 의미한다.
실시예 7. 건조 타입 PCR 조성물을 이용한 HBV Genotype 양성 검체의 실시간 중합효소연쇄반응
상기 실시예 4와 동일한 조성과 방법을 이용하여 서열번호 1, 5 및 9로 기재되는 HBV 프라이머 및 프로브와 서열번호 13, 16 및 19로 기재되는 내부 대조군용 프라이머 및 프로브를 포함하는 건조 상태의 PCR 혼합물을 제조한 뒤, ExicyclerTM Quantitative Thermal Block(바이오니아사제, 한국)을 이용하여 상기 실시예 2와 동일한 조건으로 45사이클로 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 이때 HBV 유전자형 패널(PHD201(M), SeraCare Life Sciences, Inc, USA)로부터 추출한 양성 DNA를 사용하여 반응을 진행함으로써 서열번호 1, 5 및 9로 기재되는 HBV 프라이머 및 프로브를 사용하여 서로 다른 HBV 유전자형 검출이 가능한지 여부를 확인하였다.
반응 결과, 음성 시료인 PHD201-01을 제외하고, A∼F 유전자형의 양성 시료인 PHD201-02∼PHD201-09 모두에서 HBV 유전자 검출이 가능하였다(도 26 및 도 27). 이는 서열번호 1, 5 및 9로 기재되는 HBV 프라이머 및 프로브를 포함한 건조 상태의 PCR 혼합물을 사용함으로써 다양한 HBV 유전자형의 검출이 가능하다는 것을 의미한다.

Claims (18)

  1. 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머 및 서열번호 9의 프로브를 포함하는 HBV 유전자 검출용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    하기 세트 2 내지 세트 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세트를 추가로 포함하는 HBV 유전자 검출용 조성물:
    세트 2: 서열번호 2의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 10의 프로브;
    세트 3: 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 7의 역방향 프라이머 및 서열번호 11의 프로브; 및
    세트 4: 서열번호 4의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 12의 프로브.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 프로브는 리포터와 소광제가 붙어 있는 구조인 HBV 유전자 검출용 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 리포터는 FAM인 HBV 유전자 검출용 조성물.
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 소광제는 BHQ1인 HBV 유전자 검출용 조성물.
  8. 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머 및 서열번호 9의 프로브를 포함하는 HBV 유전자 검출용 조성물을 포함하는 HBV 유전자 검출용 키트.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 HBV 유전자 검출용 키트는 내부 대조군용 유전자, 프라이머 및 프로브를 더 포함하는 HBV 유전자 검출용 키트.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 HBV 유전자검출용 키트는 건조 타입인 HBV 유전자 검출용 키트.
  11. 청구항 9에 있어서,
    상기 내부 대조군용 유전자, 프라이머 및 프로브는 Mus musculus dishevelled, dsh homolog 1(Drosophila)(Dvl1) 유전자(GenBank. Accession No. NM010091)의 염기서열로부터 유래된 것인 HBV 유전자 검출용 키트.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 프라이머는 서열번호 13 내지 18로 기재되는 염기서열들로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 프로브는 서열번호 19 내지 21로 기재되는 염기서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 HBV 유전자 검출용 키트.
  13. 1) 검체를 주형으로 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머 및 서열번호 9의 프로브를 포함하는 HBV 유전자 검출용 조성물을 사용하여 중합효소연쇄반응 또는 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및
    2) 상기 1) 단계의 증폭 유무 또는 증폭 산물에 대한 형광값을 조사하는 단계를 포함하는 HBV 유전자 검출방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 연쇄반응을 수행하는 단계는 내부 대조군용 유전자, 프라이머, 프로브를 추가로 사용하여 수행하는 HBV 유전자 검출방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 내부 대조군용 유전자, 프라이머 및 프로브는 Mus musculus dishevelled, dsh homolog 1(Drosophila)(Dvl1) 유전자(GenBank. Accession No. NM010091)의 염기서열로부터 유래된 것인 HBV 유전자 검출방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 프라이머는 서열번호 13 내지 18로 기재되는 염기서열들로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 프로브는 서열번호 19 내지 21로 기재되는 염기서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 HBV 유전자 검출방법.
  17. 청구항 8에 있어서,
    하기 세트 2 내지 세트 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세트를 추가로 포함하는 HBV 유전자 검출용 키트:
    세트 2: 서열번호 2의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 10의 프로브;
    세트 3: 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 7의 역방향 프라이머 및 서열번호 11의 프로브; 및
    세트 4: 서열번호 4의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 12의 프로브.
  18. 청구항 13에 있어서,
    상기 HBV 유전자 검출용 조성물은 하기 세트 2 내지 세트 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세트를 추가로 포함하는 HBV 유전자 검출방법:
    세트 2: 서열번호 2의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 10의 프로브;
    세트 3: 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 7의 역방향 프라이머 및 서열번호 11의 프로브; 및
    세트 4: 서열번호 4의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 12의 프로브.
KR1020127028141A 2010-07-02 2010-07-02 Ｂ형 간염 바이러스 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 ｂ형 간염 바이러스 진단 방법 KR101498704B1 (ko)

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