CN111041129A - 检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用 - Google Patents

检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111041129A
CN111041129A CN202010173666.2A CN202010173666A CN111041129A CN 111041129 A CN111041129 A CN 111041129A CN 202010173666 A CN202010173666 A CN 202010173666A CN 111041129 A CN111041129 A CN 111041129A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
nucleotide sequence
influenza
seq
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010173666.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111041129B (zh
Inventor
刘莹莹
葛少林
马银平
牟海青
韩春燕
徐婷婷
冯丽
邢婉丽
李为民
程京
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tsinghua University
CapitalBio Corp
Original Assignee
CapitalBio Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CapitalBio Corp filed Critical CapitalBio Corp
Priority to CN202010173666.2A priority Critical patent/CN111041129B/zh
Publication of CN111041129A publication Critical patent/CN111041129A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111041129B publication Critical patent/CN111041129B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及医学检测领域，特别涉及检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用。本发明提供的试剂盒采用恒温扩增与微流控芯片相结合的方法，能同时精准检测新型冠状病毒（2019‑nCoV）S和N靶基因，以及甲型流感病毒、新型甲型H1N1流感病毒（2009）、甲型H3N2流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，达到区分新型冠状病毒和普通流感病毒的目的。本发明试剂盒具有检测指标多、操作简便、检测时间短等优点，一次加样可同时检测6种病毒指标，从样品处理到出报告在1.5 h内，比qPCR方法更省时省力。

Description

检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及医学检测领域，特别涉及检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用。
背景技术
新型冠状病毒患者初始症状多为发热、乏力和干咳，并逐渐出现呼吸困难等严重表现。多数患者预后良好，部分严重病例可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克，甚至死亡。目前，该病没有特效治疗方法。该病潜伏期一般为3~7天，最短的潜伏期为一天发病，最长的潜伏期是14天。潜伏期具有传染性。主要通过飞沫传播和接触传播，密闭、不通风场所可能存在气溶胶传播风险，需加强预防和隔离处理。人群普遍易感、老年人及有基础疾病者感染后病情较重，儿童及婴幼儿也有发病。
冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）正冠状病毒亚科（Orthocoronavirinae）。冠状病毒有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，经常为多形性，直径50～200nm。S蛋白位于病毒表面形成棒状结构，作为病毒的主要抗原蛋白之一，是用于分型的主要基因。N蛋白包裹病毒基因组，可用作诊断抗原。
病毒性肺炎多见于冬春季，可散发或暴发流行，临床主要表现为发热、浑身酸痛、少部分有呼吸困难，肺部浸润影。据统计，90%以上的急性呼吸道感染是由病毒引起。主要包括流感病毒、鼻病毒、肠道病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒等，可侵犯上呼吸道的不同部位，引起炎症。
流行性感冒（简称流感）是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病。典型的临床症状是：急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。据世界卫生组织（WHO）的数据显示：在全球范围内，每年流感（季节性甲型流感病毒H1N1、H3N2亚型及乙型流感病毒）流行导致数亿人感染，造成约300万至500万严重病例，约29万至65万例与呼吸道疾病相关的死亡。
呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）在世界各地均有流行，是引起世界范围内婴幼儿下呼吸道感染的最常见病毒。呼吸道合胞病毒主要通过飞沫传播或直接接触手、污染物而感染，人群普遍易感。呼吸道合胞病毒己成为上呼吸道感染的主要致病微生物之一。
新型冠状病毒（2019-nCoV）传播速度快，由于其潜伏期也具有传染性，传播范围广，给防疫工作带来了巨大的困难。加之，冬春季节，各种呼吸道疾病高发，仅靠发热区别患者，或单指标检测是否为新型冠状病毒（2019‑nCoV），并不足以满足各级医院对患者的分流，需要更强有力的手段，辅助临床，为临床提供更多信息支持。
目前已获证的用于检测新型冠状病毒的方法主要为荧光PCR法，并且为单指标检测，甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的检测方法主要有荧光PCR法、PCR毛细电泳片段分析法、免疫层析试纸条法。实时荧光PCR技术虽有高灵敏度、高特异性等特点，但该实验对检测人员要求较高且实验操作步骤需要频繁的进行升温和降温过程，需要昂贵的仪器，光检测耗时至少需要1.5h以上，且多数为单指标检测，通量低；PCR毛细电泳片段分析法同样对检测人员要求较高且实验操作步骤频繁耗时；免疫层析试纸条法虽灵敏度较高，但检测结果可能包括假阳性和假阴性。
发明内容
有鉴于此，本发明选择了新型冠状病毒（2019-nCoV）S和N靶基因，以及甲型流感病毒、新型甲型H1N1流感病毒（2009）、甲型H3N2流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，开发检测产品。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了引物探针组合，包括如下组合中的一种或两者以上：
组合一（2019-nCov-S）：
（1）、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
（2）、下游引物具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；和
（3）、荧光探针具有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列；或
（4）、如（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（5）、与（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；
和/或
组合二（2019-nCov-N）：
（6）、上游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；和
（7）、下游引物具有如SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列；和
（8）、荧光探针具有如SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列；或
（9）、如（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（10）、与（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；
和/或
组合三（InfA）：
（11）、上游引物具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；和
（12）、下游引物具有如SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列；和
（13）、荧光探针具有如SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列；或
（14）、如（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（15）、与（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；
和/或
组合四（InfA_2009H1）：
（16）、上游引物具有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；和
（17）、下游引物具有如SEQ ID No. 11所示的核苷酸序列；和
（18）、荧光探针具有如SEQ ID No. 12所示的核苷酸序列；或
（19）、如（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（20）、与（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；
和/或
组合五（InfA_H3）：
（21）、上游引物具有如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；和
（22）、下游引物具有如SEQ ID No. 14所示的核苷酸序列；和
（23）、荧光探针具有如SEQ ID No. 15所示的核苷酸序列；或
（24）、如（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（25）、与（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；
和/或
组合六（InfB）：
（26）、上游引物具有如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列；和
（27）、下游引物具有如SEQ ID No. 17所示的核苷酸序列；和
（28）、荧光探针具有如SEQ ID No. 18所示的核苷酸序列；或
（29）、如（26）、（27）或（28）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（26）、（27）或（28）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（30）、与（26）、（27）或（28）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；
和/或
组合七（RSV）：
（31）、上游引物具有如SEQ ID No.19所示的核苷酸序列；和
（32）、下游引物具有如SEQ ID No. 20所示的核苷酸序列；和
（33）、荧光探针具有如SEQ ID No. 21所示的核苷酸序列；或
（34）、如（31）、（32）或（33）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（31）、（32）或（33）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（35）、与（31）、（32）或（33）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；
在本发明的一些具体实施方案中，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个或3个。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的引物探针组合在制备病毒检测的试剂盒中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒为呼吸道病毒。在本发明的一些具体实施方案中，所述呼吸道病毒为流感病毒、鼻病毒、肠道病毒、呼吸道合胞病毒或冠状病毒中的一种或多种。在本发明的一些具体实施方案中，所述流感病毒甲型流感病毒H1N1、H3N2亚型或乙型流感病毒；所述冠状病毒为新型冠状病毒（2019-nCoV）。
在上述研究的基础上，本发明还提供了病毒检测的试剂盒，包括所述的引物探针组合以及常用的助剂。在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒为呼吸道病毒。在本发明的一些具体实施方案中，所述呼吸道病毒为流感病毒、鼻病毒、肠道病毒、呼吸道合胞病毒或冠状病毒中的一种或多种。在本发明的一些具体实施方案中，所述流感病毒甲型流感病毒H1N1、H3N2亚型或乙型流感病毒；所述冠状病毒为新型冠状病毒（2019-nCoV）。
在上述研究的基础上，本发明还提供了呼吸道病毒的检测方法，取待测样本与所述的引物探针组合或所述的试剂盒中的引物探针组合混合后扩增，检测。
本发明提供的试剂盒采用NASBA（Nuclear acid sequence-basedamplification）恒温扩增技术，基于反转录酶和体外转录酶的协同作用在恒温（41℃）条件下进行反应，使用特异性荧光探针进行实时荧光检测。扩增阳性的结果会产生类似实时荧光的“S”形扩增曲线，一步完成对靶基因的扩增和检测。
本发明提供的六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒（恒温扩增芯片法）采用完全自主知识产权的、国际先进的微流控基因芯片系统。达到了国际先进水平，具有重要的临床应用价值，与其它检测方法相比本产品具有以下优势：
检测速度快、病毒种类多。除新型冠状病毒2019-nCoV外，本产品还可在1.5小时内同时检测其它5种呼吸道常见病毒亚型和甲型流感病毒感染情况，达到快速（比已获批产品快一倍）确认新型冠状病毒、同时排查其它引起相似症状的病毒的目的，实现快速鉴别诊断、及时针对性治疗，大幅度降低目前居高不下的疑似病例数量，大大减轻医院无法确诊病例的负担，使紧缺的大医院救治资源合理的用于新型肺炎病人的救治上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示碟式芯片结构图；
图2示引物筛选结果图；其中，图2（A）示2019-nCoV-S引物组1结果图；图2（B）示2019-nCoV-S引物组2结果图；图2（C）示2019-nCoV-S引物组3结果图；图2（D）示2019-nCoV-S引物组4结果图；图2（E）示2019-nCoV-S引物组5结果图；图2（F）示2019-nCoV-N引物组1结果图；图2（G）示2019-nCoV-N引物组2结果图；图2（H）示2019-nCoV-N引物组3结果图；图2（I）示2019-nCoV-N引物组4结果图；图2（J）示2019-nCoV-N引物组5结果图。
具体实施方式
本发明公开了检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的第一个目的是提供一种用于检测六项呼吸道病毒的引物与探针组合。
在NCBI 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索并下载待检测的6个指标的基因序列。在引物和探针筛选方面，分析6种病毒的序列，比对后，压缩序列，设计覆盖度高的引物和探针，以便能适应RNA病毒的高突变率，通过比对多种型别甲型流感病毒，也设计了甲型流感通用检测引物和探针。为了保证新型冠状病毒（2019-nCoV）的检出，专门设计了2套引物探针用于检测其S基因和N基因。经过反复的引物筛选和验证，最终得到7套适合的引物和探针组合，用于检测7种指标。
表1 本发明所提供的引物与探针
Figure 378185DEST_PATH_IMAGE002
续表
Figure 29747DEST_PATH_IMAGE004
续表
Figure 727926DEST_PATH_IMAGE006
所述探针中所有碱基使用2'-O-methyl修饰碱基，探针中T被修饰后变成U；探针的5’端标记有荧光报告集团可以为FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、ROX、Texas、Red等，探针的3’端标记有荧光猝灭集团TAMARA、BHQ1、BHQ2、CY5等。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测六项呼吸道病毒的检测方法。其特征是使用上述的NASBA引物组与探针组进行恒温扩增。
所述NASBA引物组与探针的比例为：1 μM上游引物、1 μM下游引物、0.1 μM探针混合后固定在微流控碟式芯片反应池中。
所述检测方法中还可含有恒温扩增缓冲液、恒温扩增酶溶液和核苷酸混合液。恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：40mM的Tris-HCL（pH8.0）、12mM的MgCl2、70mM的KCl、15% 的DMSO(V/V)、315mM的 Sorbitol
所述恒温扩增酶溶液的溶剂为50%甘油，溶质及浓度如下：AMV逆转录酶0.32U/μL，T7RNA聚合酶1.6U/μL，核糖核酸酶H 0.008U/μL，RNA酶抑制剂0.5U/μL，BSA 0.2µg/μL。
所述核苷酸混合液的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.15% 的PEG8000、5mM 的DTT、1mM 的dNTP Mix、2mM 的rNTP Mix。
上述NASBA扩增反应条件为41℃，40 min。
上述的NASBA检测方法中，可以在恒温扩增微流控芯片核酸分析仪（RTisochip-A/RTisochip-W）上通过出峰时间以及扩增曲线判定检测结果。
本发明的第三个目的是提供一种用于检测六项呼吸道病毒的检测试剂盒。
本发明所述的检测试剂盒包含预包埋引物和探针的微流控碟式芯片、恒温扩增缓冲液、恒温扩增酶溶液、核苷酸混合液和阳性对照品。
所述预包埋引物和探针的微流控碟式芯片如图1所示，每张芯片上设有24个反应池，逆时针依次编号，其中进出样口1对应的为1号反应池。每张芯片在特定反应池包埋固定1套引物，用于1种核酸靶序列的扩增与检测。微流控碟式芯片反应池中预包埋的NASBA引物组与探针的比例为：1 μM上游引物、1 μM下游引物、0.1 μM探针。
所述恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：40mM的Tris-HCL（pH8.0）、12mM的MgCl2、70mM的KCl、15% 的DMSO(V/V)、315mM的 Sorbitol
所述恒温扩增酶溶液的溶剂为50%甘油，溶质及浓度如下：AMV逆转录酶0.32U/μL，T7RNA聚合酶1.6U/μL，核糖核酸酶H 0.008U/μL，RNA酶抑制剂0.5U/μL，BSA 0.2µg/μL。
所述核苷酸混合液的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.15% 的PEG8000、5mM 的DTT、1mM 的dNTP Mix、2mM 的rNTP Mix。
所述阳性对照品为：含甲型流感病毒目的片段的病毒样颗粒和新型冠状病毒（2019-nCoV）S靶基因核酸。
本发明的优点在于检测速度快、病毒种类多。除新型冠状病毒2019-nCoV外，本产品还可在1.5小时内同时检测其它5种呼吸道常见病毒亚型和甲型流感病毒感染情况，达到快速（比已获批产品快一倍）确认新型冠状病毒、同时排查其它引起相似症状的病毒的目的，实现快速鉴别诊断、及时针对性治疗，大幅度降低目前居高不下的疑似病例数量，大大减轻医院无法确诊病例的负担，使紧缺的大医院救治资源合理的用于新型肺炎病人的救治上。
本发明提供的检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用中所用试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1、引物和探针组的筛选与制备
检测引物和探针的性能决定了试剂盒检测效果的优劣。本发明针对每个检测指标筛选了多组引物探针组合，最终筛选到一组最优的引物探针组合。本实施例以2019-nCoV检测指标为例，说明引物筛选过程。
引物设计：
针对2019-nCoV病毒的S基因和N基因分别设计引物和探针（表2），通过试验筛选出引物与探针组合检测效果最优的一组，所用引物和探针序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
表2 用于检测2019-nCoV病毒的引物和探针序列
Figure 60818DEST_PATH_IMAGE008
续表
Figure 858879DEST_PATH_IMAGE010
续表
Figure 353445DEST_PATH_IMAGE012
续表
Figure 354899DEST_PATH_IMAGE014
上述的引物与探针组合中，各单链DNA均各自独立包装。
实验样本：
本单位自制并经过测序验证的2019-nCoV病毒S基因和N基因RNA裸核酸作为检测样本。
实验设计：
以2019-nCoV病毒S基因和N基因RNA裸核酸(1×104 copies/μL)为模板，分别采用制备的引物与探针组对模板进NASBA等温扩增检测，每组引物进行3次重复。
试验仪器：
超净工作台
恒温扩增微流控芯片核酸分析仪：晶芯 RTisochipTM-A或RTisochipTM W
加热离心机：MINI-smart Centrifuge
漩涡振荡器
离心机：Mini spin
实验步骤：
扩增反应体系如表3：
表3
Figure 475171DEST_PATH_IMAGE016
用移液器吸取55 μL配制好的上述核酸扩增反应体系，从进样口1匀速注入到芯片主通道中，待其充满芯片主通道（此时出样口有液体溢出）后，即停止加样，用无尘纸拭去多余液体。
取1张封口膜，覆盖于进出样口上，并用洁净吸头（倒置）向一个方向按压封口膜至贴合紧密。将上述加样后的芯片置于芯片加热离心机中离心后，迅速置于微流控芯片核酸分析仪仓盒中进行扩增。设置41℃，恒温扩增反应40 min，配套软件同时完成实时荧光扫描。
实验结果：
引物筛选结果如图2所示，图2（A）~图2（J）每张图中的三条扩增曲线为三次重复实验的结果。结果显示，2019-nCoV-S引物组1和2019-nCoV-N引物组2与其它引物组相比：三次重复实验扩增曲线为典型的S型，且出峰时间最早，三次重复结果最好。
实施例2、试剂盒准确性和特异性分析
实验样本：
为了验证试剂盒的准确性和特异性，选取了部分第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品（表4）、2019-nCoV核酸检测试剂国家参考品（表5）以及SARS质粒载体（来源于广州医科大学呼吸疾病国家重点实验室），对试剂盒进行检测。
表4 流感病毒国家标准品
Figure 612891DEST_PATH_IMAGE018
表5 2019-nCoV核酸检测试剂国家参考品
Figure 793205DEST_PATH_IMAGE020
续表
Figure 281956DEST_PATH_IMAGE022
实验设计：
采用部分第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品和2019-nCoV核酸检测试剂国家参考品对六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒（恒温扩增芯片法）检测各指标的准确性和特异性。
试验仪器：
超净工作台
恒温扩增微流控芯片核酸分析仪：晶芯 RTisochipTM-A或RTisochipTM W
加热离心机：MINI-smart Centrifuge
漩涡振荡器
离心机：Mini spin
实验步骤：
扩增反应体系如表6：
表6
Figure 487809DEST_PATH_IMAGE024
用移液器吸取55 μL配制好的上述核酸扩增反应体系，从进样口1匀速注入到芯片主通道中，待其充满芯片主通道（此时出样口有液体溢出）后，即停止加样，用无尘纸拭去多余液体。
取1张封口膜，覆盖于进出样口上，并用洁净吸头（倒置）向一个方向按压封口膜至贴合紧密。将上述加样后的芯片置于芯片加热离心机中离心后，迅速置于微流控芯片核酸分析仪仓盒中进行扩增。设置41℃，恒温扩增反应40 min，配套软件同时完成实时荧光扫描。
实验结果：
本试剂盒对流感国家参考品阳性参考品PC01、PC02、PC04~PC09和阴性参考品NC01~NC10检测结果均与理论结果相符，详细结果见表7和表8。本试剂盒对2019-nCoV核酸检测试剂国家参考品中的阳性参考品和阴性参考品检测，P1~P5正确检出。P7为质粒DNA，不适用于NASBA技术。N1-N22参考品检测结果均与预期符合，详细结果见表9至表11。以上检测结果表明本试剂盒无交叉反应性，准确性和特异性良好。
表7 第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品检测结果
（PC01、PC02、PC04-PC09）
Figure 201075DEST_PATH_IMAGE026
表8 第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品检测结果
（NC01-NC10）
Figure 568602DEST_PATH_IMAGE028
表9 2019-nCoV新型冠状病毒国家参考品检测结果（P1-P7）
Figure 731599DEST_PATH_IMAGE030
表10 2019-nCoV新型冠状病毒国家参考品检测结果（N1-N11）
Figure 944406DEST_PATH_IMAGE032
续表
Figure 322297DEST_PATH_IMAGE034
续表
Figure 578835DEST_PATH_IMAGE036
续表
Figure 42177DEST_PATH_IMAGE038
续表
Figure DEST_PATH_IMAGE040
续表
Figure DEST_PATH_IMAGE042
续表
Figure DEST_PATH_IMAGE044
续表
Figure DEST_PATH_IMAGE046
表11 2019-nCoV新型冠状病毒国家参考品检测结果（N12-N22）
Figure DEST_PATH_IMAGE048
续表
Figure DEST_PATH_IMAGE050
实施例3、试剂盒最低检测限分析
实验样本：
为了验证试剂盒的最低检测限，以本单位自制并经过测序验证的6种呼吸道病毒裸核酸作为检测样本，因甲型流感为通用指标，因此新型甲型H1N1流感病毒（2009）裸核酸和甲型H3N2流感病毒裸核酸均能检测到甲型流感病毒，样本信息如表12。
表12 试剂盒最低检测限样品信息
Figure DEST_PATH_IMAGE052
实验设计：
最低检测限浓度的确定方法：将6种呼吸道病毒裸核酸参考品（rP1～rP6），分别稀释至250 copies/μL、25 copies/μL、10 copies/μL，并对以上浓度的裸核酸参考品进行检测。每个浓度做1个重复，将所有的指标阳性检出率均能达到为100%的最低浓度确定为本试剂盒的最低检测限。
试验仪器：
超净工作台
恒温扩增微流控芯片核酸分析仪：晶芯 RTisochipTM-A或RTisochipTM W
加热离心机：MINI-smart Centrifuge
漩涡振荡器
离心机：Mini spin
实验步骤：
扩增反应体系如表13：
表13
Figure DEST_PATH_IMAGE054
用移液器吸取55 μL配制好的上述核酸扩增反应体系，从进样口1匀速注入到芯片主通道中，待其充满芯片主通道（此时出样口有液体溢出）后，即停止加样，用无尘纸拭去多余液体。
取1张封口膜，覆盖于进出样口上，并用洁净吸头（倒置）向一个方向按压封口膜至贴合紧密。将上述加样后的芯片置于芯片加热离心机中离心后，迅速置于微流控芯片核酸分析仪仓盒中进行扩增。设置41℃，恒温扩增反应40 min，配套软件同时完成实时荧光扫描。
实验结果：
试剂盒检测结果分别见表14，统计试剂盒对6种呼吸道病毒裸核酸3个浓度的检测结果可以看出：试剂盒对部分指标的裸核酸RNA的最低正确检出浓度可达10 copies/μL，对其余指标的最低正确检出浓度为25 copies/μL。为了保证本试剂盒的有效性，我们在统计时取所有最低正确检出浓度值中的最大值，即认为本试剂盒对呼吸道病毒裸核酸的最低检测限为25 copies/μL。对于本试剂盒的芯片，每个反应池中大约能进入1 μL的样品，所以最低检测限也可以定义为25 copies/反应。
表14 试剂盒对呼吸道病毒最低检测参考品限检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE056
续表
Figure DEST_PATH_IMAGE058
实施例4、试剂盒精密度分析
实验样本：
使用流感病毒国家精密性参考品CV1和CV2以及本单位自制并经过测序验证的新型冠状病毒2019-nCoV-S基因RNA裸核酸和N基因RNA裸核酸混合参考品（浓度为5×103 copies/mL）进行试剂盒精密度检测。
实验设计：
采用部分第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家精密性参考品和新型冠状病毒2019-nCoV-S基因RNA裸核酸和N基因RNA裸核酸混合参考品对六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒（恒温扩增芯片法）检测各指标的精密性进行评估。
试验仪器：
超净工作台
恒温扩增微流控芯片核酸分析仪：晶芯 RTisochipTM-A或RTisochipTM W
加热离心机：MINI-smart Centrifuge
漩涡振荡器
离心机：Mini spin
实验步骤：
扩增反应体系如表15：
表15
Figure DEST_PATH_IMAGE060
用移液器吸取55 μL配制好的上述核酸扩增反应体系，从进样口1匀速注入到芯片主通道中，待其充满芯片主通道（此时出样口有液体溢出）后，即停止加样，用无尘纸拭去多余液体。
取1张封口膜，覆盖于进出样口上，并用洁净吸头（倒置）向一个方向按压封口膜至贴合紧密。将上述加样后的芯片置于芯片加热离心机中离心后，迅速置于微流控芯片核酸分析仪仓盒中进行扩增。设置41℃，恒温扩增反应40 min，配套软件同时完成实时荧光扫描。
实验结果：
本试剂盒对流感病毒国家参考品CV1和CV2分别重复检测10次，10次重复均能正确检出，CV1检测10次的CV值为5.19%，CV2检测10次的CV值为：甲型流感病毒（6.43%）、新型甲型H1N1流感病毒（2009）（5.79%）、甲型H3N2流感病毒（6.02%），具体见表16和表17。
表16 第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品检测结果
（CV1）
Figure DEST_PATH_IMAGE062
续表
Figure DEST_PATH_IMAGE064
表17 第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品检测结果
（CV2）
Figure DEST_PATH_IMAGE065
续表
Figure DEST_PATH_IMAGE066
续表
Figure DEST_PATH_IMAGE067
本试剂盒对新型冠状病毒2019-nCoV-S基因RNA裸核酸和N基因RNA裸核酸混合参考品重复检测10次，结果与预期一致，重复性实验扩增Tp值见表18。该实施例结果表明，试剂盒重复性良好。
表18 新型冠状病毒（2019-nCoV）S基因和N基因重复性实验扩增Tp值结果
Figure DEST_PATH_IMAGE069
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 博奥生物集团有限公司
<120> 检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用
<130> MP2003990
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caaatacttc taaccaggtt gctg 24
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattctaata cgactcacta tagggagaac acgccaagta ggagtaagtt ga 52
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccgtcagaa gtccctgttg ctattcatgc acggg 35
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgattacaaa cattggccgc 20
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aattctaata cgactcacta tagggagaat ggcagctgtg taggtcaacc 50
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccgtccatt ggcatggaag tcacacctta acggg 35
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cactdggcac ggtgagcgtg aa 22
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aattctaata cgactcacta tagggagatt ctaaccgagg tcgaaacg 48
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccgtcttta gccaytccat gagagcctca cggg 34
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgataatac cagatccagc a 21
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aattctaata cgactcacta tagggagagt tcaagccgga aatagcaat 49
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cccgtaatgc atatctcggt accactagat ttcacggg 38
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cataagggta acagttgct 19
<210> 14
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aattctaata cgactcacta tagggagaat gctactgagc tggttca 47
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgcgtttgag ggtctcccaa tagagcatca cgcg 34
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccaaaactgt ttcacccatt 20
<210> 17
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aattctaata cgactcacta tagggagaac aataaacaga gaggtatc 48
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cccgttcaat acctccatgt tgtcagagag tacggg 36
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tttatdatyc cacgattttt 20
<210> 20
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aattctaata cgactcacta tagggagaat gaacagtttr acattacc 48
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cccgtgagct gcttayrtct gtttttgadg tcaacggg 38
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cagaagtccc tgttgctatt catgc 25
<210> 23
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aattctaata cgactcacta tagggagaga gttgttgaca tgttcagccc c 51
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cccgtggggc tgaacatgtc aacaactcac ggg 33
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggggctgaac atgtcaacaa ctc 23
<210> 26
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aattctaata cgactcacta tagggagagt aggcaatgat ggattgacta gc 52
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cccgtcagac tcagactaat tctcctcggc gacggg 36
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tttgtggtga ttcaactgaa tgc 23
<210> 29
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aattctaata cgactcacta tagggagacc tcttgcttgg ttttgatgga tc 52
<210> 30
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cccgtcaccc aagaagtttt tgcacaagtc acggg 35
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cgtgctttaa ctggaatagc tgttg 25
<210> 32
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aattctaata cgactcacta tagggagagc cagcatctgc aagtgtcac 49
<210> 33
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cccgtgatcc atcaaaacca agcaagagga cggg 34
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tcttggttca ccgctctcac t 21
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aattctaata cgactcacta tagggagatg gtcatctgga ctgctattgg 50
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cccgtcaaga ccttaaattc cctcgaggac acggg 35
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gcatcatatg ggttgcaact g 21
<210> 38
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
aattctaata cgactcacta tagggagaca cgattgcagc attgttagc 49
<210> 39
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cccgttgcaa aagatcacat tggcaccctg acggg 35
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
atcgtgctac aacttcctca agg 23
<210> 41
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
aattctaata cgactcacta tagggagaaa ctgttgcgac tacgtgatga g 51
<210> 42
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cccgtaacta cgcagaaggg agcagagggc acggg 35
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gtaaaggcca acaacaacaa gg 22
<210> 44
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
aattctaata cgactcacta tagggagagt ctgccgaaag cttgtgttac 50
<210> 45
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cccgttgaag cctcggcaaa aacgtactca cggg 34

Claims (9)

1.引物探针组合，其特征在于，包括如下组合中的一种或两者以上：
组合一：
（1）、上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；和
（2）、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；和
（3）、荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；
和/或
组合二：
（4）、上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；和
（5）、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示；和
（6）、荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示；
和/或
组合三：
（7）、上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；和
（8）、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示；和
（9）、荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示；
和/或
组合四：
（10）、上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；和
（11）、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示；和
（12）、荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示；
和/或
组合五：
（13）、上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；和
（14）、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示；和
（15）、荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示；
和/或
组合六：
（16）、上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；和
（17）、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 17所示；和
（18）、荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示；
和/或
组合七：
（19）、上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示；和
（20）、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 20所示；和
（21）、荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 21所示。
2.如权利要求1所述的引物探针组合在制备病毒检测的试剂盒中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述病毒为呼吸道病毒或肠道病毒。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述呼吸道病毒为流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒或冠状病毒中的一种或多种。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述流感病毒为甲型流感病毒H1N1、H3N2亚型或乙型流感病毒；所述冠状病毒为新型冠状病毒2019-nCoV。
6.病毒检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物探针组合以及常用的助剂。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述病毒为呼吸道病毒或肠道病毒。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述呼吸道病毒为流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒或冠状病毒中的一种或多种。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述流感病毒为甲型流感病毒H1N1、H3N2亚型或乙型流感病毒；所述冠状病毒为新型冠状病毒2019-nCoV。
CN202010173666.2A 2020-03-13 2020-03-13 检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用 Active CN111041129B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010173666.2A CN111041129B (zh) 2020-03-13 2020-03-13 检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010173666.2A CN111041129B (zh) 2020-03-13 2020-03-13 检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111041129A true CN111041129A (zh) 2020-04-21
CN111041129B CN111041129B (zh) 2020-06-05

Family

ID=70231062

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010173666.2A Active CN111041129B (zh) 2020-03-13 2020-03-13 检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111041129B (zh)

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111254227A (zh) * 2020-04-27 2020-06-09 上海吉玛制药技术有限公司 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组及其制备方法、用途
CN111321253A (zh) * 2020-04-26 2020-06-23 圣湘生物科技股份有限公司 检测呼吸道相关病毒并分型的组合物、试剂盒、用途及方法
CN111363858A (zh) * 2020-05-26 2020-07-03 南京黎明生物制品有限公司 新型冠状病毒s基因检测核酸组合物及试剂盒与生产方法
CN111455112A (zh) * 2020-04-27 2020-07-28 中山大学孙逸仙纪念医院 一种检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒的核酸初筛试剂盒
CN111719016A (zh) * 2020-05-25 2020-09-29 深圳市疾病预防控制中心 检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物及应用
CN111778356A (zh) * 2020-07-10 2020-10-16 青岛国际旅行卫生保健中心(青岛海关口岸门诊部) 以n基因为基础的nasba技术检测新冠病毒核酸试剂盒及其检测方法
CN111826469A (zh) * 2020-08-18 2020-10-27 杭州昱鼎生物科技有限公司 基于分子信标的2019-nCoV核酸恒温扩增引物和分子信标、试剂盒及检测方法
CN112063756A (zh) * 2020-09-17 2020-12-11 中山大学达安基因股份有限公司 多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒
CN112176106A (zh) * 2020-10-13 2021-01-05 华芯生物科技(武汉)有限公司 一种呼吸道病原微生物检测用引物及其应用
CN112301161A (zh) * 2020-08-18 2021-02-02 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种检测新型冠状病毒的引物组及试剂盒
CN112831605A (zh) * 2021-02-19 2021-05-25 杭州宝临生物科技有限公司 多酶恒温扩增检测试剂盒及其应用
CN113637795A (zh) * 2020-04-27 2021-11-12 上海星耀医学科技发展有限公司 一种甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测方法与试剂盒
CN114561495A (zh) * 2022-04-28 2022-05-31 广东国盛医学科技有限公司 核酸组合及其应用、病毒检测试剂盒和检测病毒的方法
CN114632558A (zh) * 2021-12-17 2022-06-17 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种微流控芯片及其制备方法与应用
CN115725795A (zh) * 2022-10-28 2023-03-03 圣湘生物科技股份有限公司 一种引起呼吸道症状的病原体联检的组合物

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1802440A (zh) * 2003-07-14 2006-07-12 北京博奥生物芯片有限责任公司 用于检测sars病毒和其它感染性物质的方法和组合物
CN1802438A (zh) * 2003-05-09 2006-07-12 北京博奥生物芯片有限责任公司 用于检测sars病毒的方法和组合物
CN105018648A (zh) * 2015-08-03 2015-11-04 博奥生物集团有限公司 一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应用
CN105112559A (zh) * 2015-08-03 2015-12-02 博奥生物集团有限公司 一种用于检测冠状病毒的试剂盒及其应用
CN109988869A (zh) * 2019-04-23 2019-07-09 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 核酸组合物、检测单元、微流控芯片及检测装置

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1802438A (zh) * 2003-05-09 2006-07-12 北京博奥生物芯片有限责任公司 用于检测sars病毒的方法和组合物
CN1802440A (zh) * 2003-07-14 2006-07-12 北京博奥生物芯片有限责任公司 用于检测sars病毒和其它感染性物质的方法和组合物
CN105018648A (zh) * 2015-08-03 2015-11-04 博奥生物集团有限公司 一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应用
CN105112559A (zh) * 2015-08-03 2015-12-02 博奥生物集团有限公司 一种用于检测冠状病毒的试剂盒及其应用
CN109988869A (zh) * 2019-04-23 2019-07-09 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 核酸组合物、检测单元、微流控芯片及检测装置

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JASPER FUK-WOO CHAN等: "A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster", 《LANCET》 *
PENG ZHOU等: "A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin", 《NATURE》 *
PENG ZHOU等: "Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin", 《BIORXIV》 *
ROUJIAN LU等: "Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor", 《LANCET》 *
RUI LIU等: "Positive rate of RT-PCR detection of SARS-CoV-2 infection in 4880 cases from one hospital in Wuhan, China, from Jan to Feb 2020", 《CLINICA CHIMICA ACTA》 *
VICTOR M CORMAN等: "Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR", 《EURO SURVEILL》 *
WU,F.等: "NCBI Reference Sequence: NC_045512.2", 《NCBI》 *

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111321253A (zh) * 2020-04-26 2020-06-23 圣湘生物科技股份有限公司 检测呼吸道相关病毒并分型的组合物、试剂盒、用途及方法
CN113637795A (zh) * 2020-04-27 2021-11-12 上海星耀医学科技发展有限公司 一种甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测方法与试剂盒
CN111455112A (zh) * 2020-04-27 2020-07-28 中山大学孙逸仙纪念医院 一种检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒的核酸初筛试剂盒
CN111254227B (zh) * 2020-04-27 2020-09-01 上海吉玛制药技术有限公司 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组及其制备方法、用途
CN111254227A (zh) * 2020-04-27 2020-06-09 上海吉玛制药技术有限公司 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组及其制备方法、用途
CN111719016A (zh) * 2020-05-25 2020-09-29 深圳市疾病预防控制中心 检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物及应用
CN111363858A (zh) * 2020-05-26 2020-07-03 南京黎明生物制品有限公司 新型冠状病毒s基因检测核酸组合物及试剂盒与生产方法
CN111363858B (zh) * 2020-05-26 2020-09-29 南京黎明生物制品有限公司 2019-nCoV S基因检测核酸组合物及试剂盒与生产方法
CN111778356A (zh) * 2020-07-10 2020-10-16 青岛国际旅行卫生保健中心(青岛海关口岸门诊部) 以n基因为基础的nasba技术检测新冠病毒核酸试剂盒及其检测方法
CN111826469A (zh) * 2020-08-18 2020-10-27 杭州昱鼎生物科技有限公司 基于分子信标的2019-nCoV核酸恒温扩增引物和分子信标、试剂盒及检测方法
CN112301161A (zh) * 2020-08-18 2021-02-02 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种检测新型冠状病毒的引物组及试剂盒
CN112063756A (zh) * 2020-09-17 2020-12-11 中山大学达安基因股份有限公司 多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒
CN112176106A (zh) * 2020-10-13 2021-01-05 华芯生物科技(武汉)有限公司 一种呼吸道病原微生物检测用引物及其应用
CN112831605A (zh) * 2021-02-19 2021-05-25 杭州宝临生物科技有限公司 多酶恒温扩增检测试剂盒及其应用
CN114632558A (zh) * 2021-12-17 2022-06-17 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种微流控芯片及其制备方法与应用
CN114632558B (zh) * 2021-12-17 2023-08-18 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种微流控芯片及其制备方法与应用
CN114561495A (zh) * 2022-04-28 2022-05-31 广东国盛医学科技有限公司 核酸组合及其应用、病毒检测试剂盒和检测病毒的方法
CN115725795A (zh) * 2022-10-28 2023-03-03 圣湘生物科技股份有限公司 一种引起呼吸道症状的病原体联检的组合物

Also Published As

Publication number Publication date
CN111041129B (zh) 2020-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111041129B (zh) 检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用
CN111020064B (zh) 新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒
CN111004870B (zh) 新型冠状病毒n基因核酸检测试剂盒
CN112063756B (zh) 多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒
WO2022095723A1 (zh) 用于检测SARS-CoV-2的试剂盒及方法
CZ20033516A3 (cs) Diagnostické zkoušky pro parvovirus B19
HRP20050037A2 (en) Identification of oligonucleotides for the capture of nucleic acid
CN111270017A (zh) 一种基于数字pcr检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用
US20230151444A1 (en) Pcr based diagnostic kit, compositions and methods for amplification and detection of sars-cov-2
CN105936946A (zh) 一步法反转录pcr检测和分型寨卡病毒的试剂盒及其检测方法
Hui et al. Reverse transcriptase PCR diagnostic assay for the coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome
Okamoto et al. Development of a novel TaqMan real-time PCR assay for detecting rubella virus RNA
US20180127836A1 (en) Improved compositions and methods for detection of viruses
US9650685B2 (en) Selective detection of human rhinovirus
KR101158934B1 (ko) 핵산 검출 방법
CN110527747B (zh) 一种检测猪瘟病毒野毒株的试剂盒
CN109593887B (zh) 一种丙型肝炎病毒核酸定量检测的试剂盒
JP2007514440A (ja) Ｓａｒｓコロナウイルスを検出するための高感度かつ特異的な検査
Callison et al. Rapid differentiation of avian infectious bronchitis virus isolates by sample to residual ratio quantitation using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction
Wu et al. Development of Taqman RT-nested PCR system for clinical SARS-CoV detection
TW202144587A (zh) 用以檢測或鑑別嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）之引子組、方法及套組
CA2645883C (en) Selective detection of human rhinovirus
Patel et al. Development of a simple restriction fragment length polymorphism assay for subtyping of coxsackie B viruses
US20160032411A1 (en) Selective detection of hepatitis a, b, c, d, or e viruses or combination thereof
CN116940678A (zh) 用于RT-qPCR检测的SARS-CoV-2检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20240920

Address after: 102206 No. 18, life science Road, Beijing, Changping District

Patentee after: CAPITALBIO Corp.

Country or region after: China

Patentee after: TSINGHUA University

Address before: 102206 No. 18, life science Road, Beijing, Changping District

Patentee before: CAPITALBIO Corp.

Country or region before: China

TR01 Transfer of patent right