CN116940678A - 用于RT-qPCR检测的SARS-CoV-2检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了：包含SARS相关冠状病毒CoV‑2(SARS‑CoV‑2)基因组的N1和N2基因区和/或3’非编码区的10‑30个核苷酸的合成核酸序列，以及包含与这些区域中至少一个互补的核酸序列的10‑30个核苷酸的合成核酸序列。还提供了包含所述序列的组合物以及所述序列在诊断试剂盒中的用途。本发明还提供了用于确定生物样品中是否存在SARS相关冠状病毒CoV‑2的引物对和探针组，其中所述引物对包含至少一种合成核酸序列。还提供了包含所述引物对和探针组的组合物，以及所述引物对和探针组在诊断试剂盒中的应用。最后，本发明提供了用于确定生物样品中是否存在SARS相关冠状病毒CoV‑2(SARS‑CoV‑2)的试剂盒和方法。

Description

用于RT-qPCR检测的SARS-CoV-2检测试剂盒

声明

所有相关人员：

我们：孙清，加利福尼亚州费尔菲尔德市居民，美国公民；M·Y·沙(SHA,Michael,Y)，加利福尼亚州卡斯特罗谷市居民，美国公民；任辉，加利福尼亚州南旧金山市居民，美国公民；J·李(Jonathan Li)，加利福尼亚州丹维尔市居民，美国公民；张爱国，加利福尼亚州圣拉蒙市居民，美国公民；在“用于RT-qPCR检测的SARS-CoV-2检测试剂盒”中发明了一些新的、有用改进；以下是其说明书。

根据美国专利法35U.S.C.第119部分，本申请要求2020年4月16日提交的题为“用于RT-qPCR检测的SARS-CoV-2检测试剂盒”的美国临时专利申请No.63/010,840的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及医学领域，更具体地涉及传染病。本发明还涉及分子生物学领域，更具体地涉及生物样品中病毒物质的检测。

本发明还总体上涉及鉴定核酸的领域。更具体地，本发明涉及可用于诊断感染了能够引起严重急性呼吸系统综合症CoV-2(“SARS-CoV-2”)或SAR样症状的病原体的患者的诊断方法。

本发明的特征在于用于检测生命体样品中的SARS-CoV-2的方法，以及用于实施所述方法的试剂盒。

本发明还涉及可用于病毒诊断领域的核酸序列，更具体地，用于诊断引起严重急性呼吸系统综合症CoV-2(SARS-CoV-2)的新型人类冠状病毒的感染。

本发明还涉及用于检测严重急性呼吸综合征(SARS CoV-2)病毒的PCR引物和Taqman探针、检测SARS CoV-2病毒的方法和试剂盒。本发明还涉及用于检测严重急性呼吸综合征相关病毒(CoV-2SARS相关病毒)的定量实时RT-PCR方法，以及用于检测SARS相关CoV-2病毒的寡核苷酸和试剂盒。

本发明还涉及可用于病毒诊断领域的核酸序列，更具体地，用于诊断引起严重急性呼吸系统综合症CoV-2病毒(SARS CoV-2病毒)的新型人类冠状病毒的感染。

发明背景

严重急性呼吸系统综合症(SARS)CoV-2病毒是一种在亚洲出现的疾病，并导致对健康和经济造成破坏性影响的流行病。这种疾病从受感染的患者迅速传播到受感染的患者，包含许多医护人员。由于这种疾病具有这样的传染性，开发诊断方法以快速诊断这种高度传染性的疾病非常重要。2019年发现了一种新的冠状病毒，命名为SARS-CoV-2。这种新病毒在人与人之间迅速传播。由于密集的人类旅行活动，SARS-CoV-2感染了全世界的人。2020年3月，世卫组织宣布其符合大流行的所有标准。在年轻人中，SARS-CoV-2会引起类似流感的症状，如咳嗽、喉咙痛、腹泻或发烧。然而，在某些情况下也会发生致命的严重肺炎，特别是在免疫抑制人群、老年人或患有支气管哮喘等肺部疾病的人群中。到目前为止，还没有合适的疗法可用。因此，国际社会依靠早期诊断和随后隔离感染者，以减缓SARS-CoV-2的进一步传播。因此，自2020年3月以来，许多国家都采取了特殊措施，作为限制人们行动自由的国家大流行病计划的一部分。使用核酸扩增技术可以进行早期诊断。这可以直接检测病毒。然而，由于感染人数呈指数增长，这种检测方法也存在试剂短缺，因此并非所有首次接触SARS-CoV-2感染者或患有轻度流感样症状的人都可以接受诊断检查。

严重急性呼吸系统综合症(SARS Cov-1和CoV-2)是相对较新的潜在威胁人类生命的传染病。SARS Cov-1和SARS CoV-2分别发现后，疾病迅速传播，全球五大洲多个月份均有病例报道(世界卫生组织)。严重急性呼吸系统综合症(SARS I.Wkly.Epidemiol.Rec.2003,78:81-3；Peiris,et al.Coronavirus as a possible cause of severe acuterespiratory syndrome.Lancet 2003,361:1319-25；Lee,et al.A major outbreak ofsevere acute respiratory syndrome in Hong Kong.N.Eng.J.Med.2003,348:1986-94；Tsang,et al.Acluster of cases of severe acute respiratory syndrome in HongKong.N.Eng.J.Med.2003,348:1977-85；Poutanen,et al.Identification of severeacute respiratory syndrome in Canada.N.Eng.J.Med.2003,348:1995-2005；Kuiken,etal.Newly discovered coronavirus as the primary cause of severe acuterespiratory syndrome.Lancet 2003,362:263-70；World Health OrganizationMulticentre Collaborative Network for Severe Acute Respiratory Syndrome(SARS)Diagnosis and Amulticentre collaboration to investigate the cause of severeacute respiratory syndrome.Lancet 2003,361:1730-3)。截至2003年7月3日，这一流行病导致全球报告病例8,439例，其中812例是致命性的(严重急性呼吸系统综合症(SARS)报告的可能病例累积数目。引用自2003年7月8日的电子出版物)和Zhu N,Zhang D,Wang W,LiX,Yang B,Song J,et al.A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia.N EnglJ Med.2020Jan 24。

Cov-1和CoV-2最常见的SARS早期症状包含发烧(测量温度高于100.4°F(38.0℃))、发冷、头痛、肌痛、头晕、寒颤、咳嗽、喉咙痛、和流鼻涕(WHO Weekly EpidemiologicalRecord,No.12,Mar.21,2003)。SARS疾病通常以发烧、剧烈头痛、头晕和肌痛开始。2-7天后，SARS患者通常会出现非排痰性的干咳。在某些情况下，病情可能会迅速恶化，出现低氧饱和度和急性呼吸窘迫。

SARS相关的冠状病毒CoV-1和CoV-2病原体很快被分离出来，它们的基因组已被中国、加拿大和美国的科学家测序(Ksiazek et al.,A novel coronavirus associatedwith severe acute respiratory syndrome.N.Engl.J.Med.,Apr.10,2003,e-pub；Drosten et al.,Identification of a novel coronavirus in patients with severeacute respiratory syndrome.N.Engl.J.Med.,Apr.10,2003,e-pub；WHO Update 31,Coronavirus never before seen in humans is the cause of SARS,Apr.16,2003，以及Lu,R.et al.Genomic characterization and epidemiology of 2019novelcoronavirus:implications for virus origins and receptor binding.Lancet,doi:10.1016/S0140-6736(20)30251-8,2020)。将病原体快速鉴定为新型冠状病毒(SARS-CoV-1)代表了全球卫生史上的一项非凡成就，并有助于遏制该流行病(World HealthOrganization Multicentre Collaborative Network for Severe Acute RespiratorySyndrome(SARS)Diagnosis.A multicentre collaboration to investigate the causeof severe acute respiratory syndrome.Lancet 2003 361:1730-3)。尽管如此，对于SARS的Cov-1和CoV-2的流行病学和发病机制仍然知之甚少，并且尚未建立明确的诊断测试或特定治疗方法。由于病毒的起源及其动物宿主仍有待确定，因此复发的可能性尚不清楚。这一事实强调了建立灵敏和有效的诊断和监测方法的重要性。

与SARS Cov-1和CoV-2有关的冠状病毒代表了一种新的冠状病毒谱系的原型，这种冠状病毒能够导致临床显著和经常致命的人类疾病的暴发。冠状病毒于1937年首次从鸡中分离出来，并于1965年从人类中分离出来。冠状病毒家族包含大约15个物种，可感染广泛的动物，包括人、猫、狗、牛、猪、啮齿动物和鸟类(例如鸡、蝙蝠)。冠状病毒是一种单链(+)有义RNA病毒。所述病毒通过内吞作用进入宿主细胞，并在细胞质中自我繁殖；不涉及DNA阶段。新的病毒粒子通过出芽进入高尔基体、被运输到细胞表面，并从宿主细胞中分泌出来而形成。

迄今为止，只有有限的灵敏、特异性诊断检测方法可用于对Cov-1和CoV-2的SARS和SARS相关疾病进行监测和临床管理。随着特定抗病毒疗法的确立，早期诊断对于将发病率和死亡率降至最小将变得越来越重要。据报道，免疫荧光和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别在症状出现后第10天或第20天之前检测到的SARS-CoV-1和CoV-2的抗体不一致(WorldHealth Organization Multicentre Collaborative Network for Severe AcuteRespiratory Syndrome(SARS)Diagnosis.Amulticentre collaboration to investigatethe cause of severe acute respiratory syndrome.Lancet 2003,361:1730-3；Li GChen X and Xu A.Profile of specific antibodies to the SARS-associatedcoronavirus.N.Eng.J.Med.2003,349:5-6)。因此，尽管这些血清学工具有助于在人群水平上追踪感染过程，但在早期检测感染方面的用处不大，而此时有可能实施治疗性干预或措施如隔离，以减少传染给幼小人群的风险。相比之下，基于聚合酶链式反应(PCR)的检测有可能在更早的时间点检测SARS Cov-1和SARS CoV-2以及SARS相关感染。然而，人们需要一种灵敏、可靠和快速的诊断方法来在最早可能感染阶段检测生物样品中是否存在的SARS相关冠状病毒Cov-1和CoV-2。

此外，众所周知，自COVID-19大流行病开始以来，鼻咽拭子(NFS)和口咽拭子(OPS)样品被广泛接受为用于检测SARS-CoV-2的试样。但是，NPS和OPS试样的采集程序可能会引起不适，并且在某些人中会引起打喷嚏和咳嗽。后者反过来会产生液滴或气溶胶颗粒，使收集这些试样的医护人员面临风险，需要大量使用个人防护设备(PPE)。NFS和OPS采样的耐受性差可能会由于试样采集量不足或质量差而导致假阴性检测。最近的研究表明，唾液是NPS试样的一种可行且更敏感的替代品，并且还可以在家中进行自我管理的样品采集，以进行大规模的SARS-CoV-2分子检测。其他研究人员还报道，在确诊的COVID-19患者的初始唾液试样中，有91.7％(n＝11)检测到SARS-CoV-2。从NPS试样COVID-19检测呈阴性的患者身上采集的所有唾液试样(n＝33)也呈阴性。显然，唾液中SARS CoV-2的检测可以用作诊断COVID-19的更具吸引力和成本效益的替代方法。事实上，一项使用唾液样品的分子测试于2020年5月8日在紧急使用授权(EUA)下首次获得FDA批准。

唾液试样的使用可能会降低COVID-19医院内传播的风险，并且非常适合NPS或OPS试样采集可能不切实际的情况。收集唾液对患者来说更容易且更容易忍受，可以降低交叉感染的风险，并且可以用于不易获得PPE的环境中。它还可用于测试日托设施和学校中的婴幼儿。

Quanti Virus^TMSARS-CoV-2测试是一种实时逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测，包含定性检测收集自疑似感染有COVID-19患者的NPS、OPS、唾液或痰试样中SARS-CoV-2病毒RNA的检测控制。提取的RNA在一个反应中进行逆转录和扩增。在这种多重qPCR方法中，SARS-CoV-2基因组的Orflab、N和E基因在RT-PCR测定中被靶向。为SARS-CoV-2病毒基因组的保守区域设计的引物和TaqMan探针，允许特异性扩增和检测呼吸道试样中所有SARS-CoV-2毒株的病毒RNA。人RNase P基因用作内参对照(IC)，以监测病毒RNA提取效率，并评估待测样品中可扩增的RNA。该检测是一种多重RT-PCR检测，由在一个管中的针对病毒基因靶标(Orf1ab,N和E基因)和IC的引物和探针的一个反应组成，旨在提高检测通量。

附图说明

图1显示了SARS-CoV-2基因组上的扩增子靶标。

图2是模板10倍系列稀释的扩增曲线，显示了阈值设置。

图3描述了SARS-COV-2检测的高通量工作流程，从样品收集到获得结果为大约4小时内。

整个说明书中使用的缩写

CLIA 临床实验室改进修正案

Ct 截止阈值

DNA 脱氧核糖核酸

EC 提取对照

E基因 包膜小膜蛋白

EUA 紧急使用授权

FDA 食品和药品管理局

IFU 使用说明

mL 毫升

LoD 检测限

μL 微升

N/A 无法使用

N基因 核蛋白

NPA 负百分比协议

NPV 负预测值

NTC 无模板对照

Orflab基因 开放阅读框1ab

PC 阳性对照

PCR 聚合酶链式反应

POS 阳性

PPA 正百分比协议

PPV 阳性预测值

RNA 核糖核酸

RP 核糖核酸酶P

SAE 严重不良事件

VTM DiaCarta QuantiVirus^TM病毒转运培养基

UTM HealthLink转运培养基

发明概述

本发明提供了SARS-CoV-2特异性引物和Taqman探针。

本发明还提供了一种使用所述引物和探针特异性检测SARS-CoV-2的方法。

本发明还提供了包含上述引物和Taqman探针的SARS-CoV-2检测试剂盒。

本发明还涉及用于检测严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS CoV-2)的有效、灵敏和可靠的定量实时RT-PCR方法，以及用于检测SARS CoV-2的寡核苷酸和试剂盒。

本发明的QuantiVirus^TMSARS-CoV-2检测试剂盒是一种实时RT-PCR检测，旨在定性检测疑似COVID-19个体的鼻咽拭子、口咽拭子和痰液中的SARS-CoV-2核酸。测试仅限于实验室—由1988年临床实验室改进修正案(CLIA)、42U.S.C.§263a认证，执行高复杂度测试，或由具有类似资格的非美国实验室认证。

结果用于鉴定SARS-CoV-2RNA。SARS-CoV-2RNA通常可在感染急性期的痰液和上呼吸道试样中检测到。阳性结果表明活性感染。美国及其领土内的实验室必须向相应的公共卫生当局报告所有阳性结果。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于检测SARS-CoV-2的方法，包括使用本发明的引物和探针通过PCR扩增从个体获得的核酸样品。

根据本发明的又一方面，提供了一种包含所述引物和探针的SARS-CoV-2检测试剂盒。

本发明也是一种检测SARS相关的冠状病毒CoV-2(SARS-CoV-2)的方法，通过将生物样品与一组引物和探针接触，在允许使用所述引物扩增核酸的条件下孵育，并确定所述探针与扩增的核酸的结合，其中检测到所述探针与扩增的核酸的结合表明存在SARS相关病毒，其中所述引物选自以下引物对：(a)引物对，其包含由WHnCoVF2 SEQ ID NO:1GTTCCAATTAACACCAATAGCA组成的引物和由WHnCoVR2a SEQ ID NO:2ATTCGTCTGGTAGCTCTTC组成的引物；(b)引物对，其包含由WHnCoVF3 SEQ ID NO:4GCAAATTCTATGGTGGTTGG组成的引物和由WHnCoVR3 SEQ ID NO:5GCATGGCTCTATCACATTTAG组成的引物；(c)引物对，其包含由WHnCoVF4 SEQ ID NO:7GCTTCGATTGTGTGCGTAC组成的引物和由WHnCoVR4 SEQ ID NO:8GACCAGAAGATCAGGAACTCTA组成的引物；以及(d)引物对，其包含由RP-F SEQ ID NO:10AGATTTGGACCTGCGAGCG组成的引物和由RP-R SEQ ID NO:11GAGCGGCTGTCTCCACAAGT组成的引物；并且其中所述探针选自下组：WHnCoVPr2(探针)SEQ ID NO:3TCCAGATGACCAAATTGGCTAC；WHnCoVPr3(探针)SEQ ID NO:6ACTGTTTATAGTGATGTAGAAAACCCTCA；WHnCoVPr4(探针)SEQ ID NO:9CTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGT；以及RP-P(探针)SEQ ID NO:12TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG；并且其中所述探针被两种染料标记，其中一种染料是荧光报告染料，并且其中一种染料是淬灭剂染料，并且其中至少一种染料是荧光染料；如果发生病毒特异性序列的扩增，则通过实时荧光检测来检测SARS病毒。

本发明还提供了一种用于检测生物样品中的SARS相关冠状病毒CoV-2(SARS-CoV-2)的试剂盒，所述试剂盒包含选自以下引物对的PCR引物对：(a)引物对，其包含由WHnCoVF2SEQ ID NO:1GTTCCAATTAACACCAATAGCA组成的引物和由WHnCoVR2a SEQ ID NO:2ATTCGTCTGGTAGCTCTTC组成的引物；(b)引物对，其包含由WHnCoVF3 SEQ ID NO:4GCAAATTCTATGGTGGTTGG组成的引物和由WHnCoVR3 SEQ ID NO:5GCATGGCTCTATCACATTTAG组成的引物；(c)引物对，其包含由WHnCoVF4 SEQ ID NO:7GCTTCGATTGTGTGCGTAC组成的引物和由WHnCoVR4 SEQ ID NO:8GACCAGAAGATCAGGAACTCTA组成的引物；以及(d)引物对，其包含由RP-F SEQ ID NO:10AGATTTGGACCTGCGAGCG组成的引物和由RP-R SEQ ID NO:11GAGCGGCTGTCTCCACAAGT组成的引物；其中所述引物对在聚合酶链式反应(PCR)中特异性扩增严重急性呼吸综合征冠状病毒CoV-2(SARS-CoV-2)的靶区域。

发明详述

尽管传统的病毒诊断主要基于病毒抗原或其特异性抗体的检测，但近年来注意力已转移到直接和快速检测病毒基因组或其衍生的核酸序列(RNA和DNA)的方法上。在这方面，极短的获得结果时间是选择核酸检测的关键因素。这些方法通常基于核酸杂交。核酸杂交是基于含有互补序列的两条核酸链在适当条件下相互退火、从而形成双链结构的能力。当互补链被标记时，可以检测到标记并指示靶序列的存在。尤其是与核酸序列扩增方法相结合，使这些方法已成为病毒诊断的重要工具。

在血清学方法给出可疑结果的情况下，或者在感染和病毒抗体产生之间可能有相当长的时间段的情况下，核酸扩增技术作为一种附加技术特别有用。

选择在核酸序列的扩增和检测中用作引物和探针的寡核苷酸，对于测定的灵敏度和特异性至关重要。待扩增的序列通常仅以微量存在于样品(例如从怀疑患有病毒感染的患者获得的血液样品)中。引物应与靶序列充分互补，以允许有效扩增样品中存在的病毒核酸。如果引物没有与靶序列正确退火(由于两条链中核苷酸的碱基错配)，则扩增受到严重阻碍。这将影响检测的灵敏度，并可能导致假阴性检测结果。由于病毒基因组的异质性，如果引物和探针能够识别仅存在于部分病毒变体中的序列，则可能会获得假阴性测试结果。

本发明提供了一种用于检测SARS-CoV-2的PCR引物对，其选自以下引物对：(a)引物对，其包含由WHnCoVF2 SEQ ID NO:1GTTCCAATTAACA CCAATAGCA组成的引物和由WHnCoVR2a SEQ ID NO:2ATTCGTCTGGTAGCTCTTC组成的引物；(b)引物对，其包含由WHnCoVF3SEQ ID NO:4GCAAATTCTATGGTGGTTGG组成的引物和由WHnCoVR3

SEQ ID NO:5GCATGGCTCTATCACATTTAG组成的引物；(c)引物对，其包含由WHnCoVF4SEQ ID NO:7GCTTCGATTGTGTGCGTAC组成的引物和由WHnCoVR4 SEQ ID NO:8GACCAGAAGATCAGGAACTCTA组成的引物；以及(d)引物对，其包含由RP-F SEQ ID NO:10AGATTTGGACCTGCGAGCG组成的引物和由RP-R SEQ ID NO:11GAGCGGCTGTCTCCACAAGT组成的引物；其中所述引物对在聚合酶链式反应(PCR)中特异性扩增严重急性呼吸综合征冠状病毒CoV-2(SARS-CoV-2)的靶区域。

本发明还提供寡核苷酸，用作探针以检测在SARS冠状病毒-2基因组内的靶序列进行扩增所产生的扩增核酸序列，所述扩增基于权利要求1所述的寡核苷酸对，所述探针选自下组：WHnCoVPr2(探针)SEQ ID NO:3TCCAGATGACCAAATTGGCTAC；WHnCoVPr3(探针)SEQ IDNO:6ACTGTTTATAGTGATGTAGAAAACCCTCA；WHnCoVPr4(探针)SEQ ID NO:9CTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGT；以及RP-P(探针)SEQ ID NO:12TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。

本发明涉及一种检测严重急性呼吸综合征相关病毒CoV-2(SARS-CoV-2)的方法，其中使用生物样品进行实时RT-PCR反应。基于序列数据，开发了一种高效、灵敏、可靠的定量实时RT-PCR方法。在一个实施方案中，引物选自以下引物对：(a)引物对，其包含由WHnCoVF2 SEQ ID NO:1GTTCCAATTAACA CCAATAGCA组成的引物和由WHnCoVR2a SEQ ID NO:2ATTCGTCTGGTAGCTCTTC组成的引物；(b)引物对，其包含由WHnCoVF3 SEQ ID NO:4GCAAATTCTATGGTGGTTGG组成的引物和由WHnCoVR3 SEQ ID NO:5GCATGGCTCTATCACATTTAG组成的引物；(c)引物对，其包含由WHnCoVF4 SEQ ID NO:7GCTTCGATTGTGTGCGTAC组成的引物和由WHnCoVR4 SEQ ID NO:8GACCAGAAGATCAGGAACTCTA组成的引物；以及(d)引物对，其包含由RP-F SEQ ID NO:10AGATTTGGACCTGCGAGCG组成的引物和由RP-R SEQ ID NO:11GAGCGGCTGTCTCCACAAGT组成的引物；并且其中所述探针选自下组：WHnCoVPr2(探针)SEQID NO:3TCCAGATGACCAAATTGGCTAC；WHnCoVPr3(探针)SEQ ID NO:6ACTGTTTATAGTGATGTAGAAAACCCTCA；WHnCoVPr4(探针)SEQ ID NO:9CTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGT；以及RP-P(探针)SEQ ID NO:12TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG；并且其中所述探针被两种染料标记，其中一种染料是荧光报告染料，并且其中一种染料是淬灭剂染料，并且其中至少一种染料是荧光染料；如果发生病毒特异性序列的扩增，则通过实时荧光检测来检测SARS病毒。

与探针一起使用的有用的荧光染料和淬灭剂列于下表。

本发明还提供了一种用于检测生物样品中的SARS相关冠状病毒CoV-2(SARS-CoV-2)的试剂盒，其包含选自以下引物对的PCR引物对：(a)引物对，其包含由WHnCoVF2 SEQ IDNO:1GTTCCAATTAACA CCAATAGCA组成的引物和由WHnCoVR2a SEQ ID NO:2ATTCGTCTGGTAGCTCTTC组成的引物；(b)引物对，其包含由WHnCoVF3 SEQ ID NO:4GCAAATTCTATGGTGGTTGG组成的引物和由WHnCoVR3 SEQ ID NO:5GCATGGCTCTATCACATTTAG组成的引物；(c)引物对，其包含由WHnCoVF4 SEQ ID NO:7GCTTCGATTGTGTGCGTAC组成的引物和由WHnCoVR4 SEQ ID NO:8GACCAGAAGATCAGGAACTCTA组成的引物；以及(d)引物对，其包含由RP-F SEQ ID NO:10AGATTTGGACCTGCGAGCG组成的引物和由RP-R SEQ ID NO:11GAGCGGCTGTCTCCACAAGT组成的引物；其中所述引物对在聚合酶链式反应(PCR)中特异性扩增严重急性呼吸综合征冠状病毒CoV-2(SARS-CoV-2)的靶区域。

本发明的引物和探针可以特异性检测SARS-CoV-2，而不与其他冠状病毒发生反应。也就是说，当使用本发明的引物和探针组进行qPCR时，从感染SARS-CoV-2的个体获得PCR产物，但从感染其他冠状病毒的个体不获得PCR产物。本发明用于SARS-CoV-2检测的PCR引物和探针，选自SARS-CoV-2基因组序列中的非结构区和结构区。包含针对本发明的引物和探针的靶核苷酸序列的SARS-CoV-2区域如图1所示。

本发明还提供了一种检测SARS-CoV-2的方法，其包括使用用于检测SARS-CoV-2的引物和探针，通过qPCR扩增从个体获得的核酸样品。

如本文所用，术语“PCR”在相关领域中是众所周知的。通常，PCR包括以下步骤：(a)从样品中获得含有靶cDNA或DNA分子的粗提物；(b)将包含酶、缓冲液、dNTP和寡核苷酸引物的水溶液加入所述粗提物中；(c)通过所得混合物的两步或三步热循环(例如，90-96℃、72℃和37-55℃)扩增所述靶DNA分子；以及(d)检测扩增的DNA。在本发明中，所述PCR可以在聚丙烯管、96孔板或硅基微型PCR芯片中进行。

当在硅基微型PCR芯片上进行PCR时，可以使用两步热循环和三步热循环。在硅基微型PCR芯片上进行PCR所需的时间可以短至30分钟或更短。例如，硅基微型PCR芯片包含硅片，其一个表面由硅光刻技术制成的PCR腔组成，别的表面由用于加热PCR腔的加热器组成；以及具有入口和出口的玻璃晶片。

在本发明中，所述PCR可以使用0.2-1.μM的每种引物和0.01pg至1μg的模板DNA进行。

在本发明中，PCR可以在86-97℃变性1-30秒、50-70℃退火1-30秒、并在60-72℃下延伸1-30秒的三步热循环条件下，或在86-97℃变性1-30秒和在50-70℃退火和延伸5-30秒的两步热循环条件下进行。

本发明还提供了一种SARS-CoV-2检测试剂盒，其包含用于检测SARS-CoV-2的引物和探针。

本发明的SARS-CoV-2检测试剂盒可以包含引物、探针、PCR溶液、缓冲液、酶等。

在一个优选实施方案中，申请人使用实时聚合酶链式反应(实时PCR)，也称为定量聚合酶链式反应(qPCR)，是基于聚合酶链式反应(PCR)的分子生物学实验室技术。它在PCR期间(即实时)监测靶DNA分子的扩增，而不是像在传统PCR中那样在其结束时监测。实时PCR可用于定量(定量实时PCR)和半定量(即高于/低于一定数量的DNA分子)(半定量实时PCR)。

在实时PCR中检测PCR产物的两种常用方法是：(1)嵌入任何双链DNA的非特异性荧光染料，以及(2)由标记有荧光报告基因的寡核苷酸组成的序列特异性DNA探针，它只允许在探针与其互补序列杂交后进行检测。

众所周知，实时PCR在热循环仪中进行，所述热循环仪能够用至少一个特定波长的光束照射每个样品，并检测由激发的荧光基团发射的荧光。热循环仪还能够快速加热和冷却样品，从而利用核酸和DNA聚合酶的物理化学特性。

PCR过程通常由重复25-50次的一系列温度变化组成。这些循环通常由三个阶段组成：第一阶段，在约95℃，允许核酸的双链分离；第二阶段，在约50-60℃的温度下，允许引物与DNA模板结合；第三阶段，在68-72℃之间，促进DNA聚合酶实施的聚合。由于片段的尺寸较小，在这种类型的PCR中最后一步通常被省略，因为酶能够在对齐阶段和变性阶段之间的变化中增加它们的数量。此外，在四步PCR中，在每个循环中仅持续几秒钟的短温度阶段测量荧光，温度为例如80℃，以在使用非特异性染料时减少由引物二聚体的存在引起的信号。每个循环使用的温度和时间取决于多种参数，诸如：用于合成DNA的酶、反应中二价离子和脱氧核糖核苷酸(dNTP)的浓度，以及引物的键合温度。

在另一个实施方案中，申请人发现唾液采样是NPS和OPS采样的充分替代方案，并且可以使用本发明的QuantiVirus SARS-CoV-2测试用于检验COVID-19。唾液试样的使用可能会降低COVID-19在医院内传播的风险，并且非常适合NPS或OPS试样采集可能不切实际的情况。收集唾液对患者来说更容易且更容易忍受，可以降低交叉感染的风险，并且可以用于不易获得PPE的环境中。它还可用于检验日托设施和学校中的婴幼儿。

SARS-CoV-2唾液检测是一种实时逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测，包括从疑似COVID-19感染患者收集的NPS、OPS、唾液或痰液试样中定性检测SARS-CoV-2病毒RNA的检测对照。提取的RNA在一个反应中进行逆转录和扩增。在这种多重qPCR方法中，SARS-CoV-2基因组的Orflab、N和E基因在RT-PCR测定中被靶向(见图1)。为SARS-CoV-2病毒基因组的保守区域设计的引物和TaqMan探针，允许特异性扩增和检测呼吸道试样中所有SARS-CoV-2变体的病毒RNA。人类RNase P基因用作内参对照(IC)，以监测病毒RNA的提取效率并评估待测样品中可扩增的RNA。所述检测是一种多重RT-PCR检测，由一个反应组成，所述反应在一管中具有用于病毒基因靶标(Orflab、N和E基因)和IC的引物和探针，该设计旨在提高检测通量。

下文通过实施例来更具体地描述本发明。然而，提供以下实施例仅用于说明，因此本发明不受其限制。

实施例I

检测概述

本发明的QuantiVirus^TMSARS-CoV-2检测试剂盒是一种实时逆转录聚合酶链式反应(rRT-PCR)检测。SARS-CoV-2引物和探针组被设计为按照公共卫生当局指南的建议检测患者呼吸道试样和唾液中SARS-CoV-2的RNA。

从临床样品中提取的RNA在一个反应中进行逆转录和扩增。SARS-CoV-2的三个基因(图1)(包含N、Orflab和E基因)在qRT-PCR分析中被靶向。引物和Taqman探针被设计在SARS-CoV-2病毒特定基因组区域的保守区域，以允许特异性扩增和检测呼吸道试样中所有SARS-CoV-2毒株的病毒RNA。人Rnase P基因用作内参和提取对照，以监测病毒RNA提取效率并评估待测样品中可扩增的RNA/DNA。所述检测是一种多重RT-PCR检测，由一个反应组成，该反应在一管中具有针对病毒基因靶标(Orflab、N和E基因)和内参对照的引物和探针，因此具有提高的检测通量和易用性以及其他的多重检测优势。

图1显示了SARS-CoV-2基因组上的扩增子靶标。E：包膜蛋白基因；M：膜蛋白基因；N：核衣壳蛋白基因；ORF：开放阅读框；RdRp：RNA依赖性RNA聚合酶基因；S：刺突蛋白基因。红色箭头表示DiaCarta检测试剂盒在SARS-CoV-2基因组上的扩增子靶标。

术语、试剂盒组分、仪器和操作注意事项

术语

a.阳性对照(PC)

阳性对照是SARS-CoV2基因组的N、E和Orflab基因序列的每个靶标的合成DNA模板的混合物，浓度为1x10⁴拷贝/μL。阳性对照必须在两个靶(FAM和HEX)通道中显示适当的值才能使运行有效。阳性对照监测每个检测组分的功能。

b.无模板对照(NTC)

使用无核酸酶的水代替模板。在所有通道中都不应观察到扩增，以确保在检测设置期间没有污染。

c.提取/内参基因靶标

人Rnase P基因用于监测每个样品的RNA提取。它还用于监测检测(逆转录酶和qPCR)。阳性Rnase P检测表明成功的RNA提取和检测。

表1：RNA提取和检测对照

对照	用于监测	检测
			阳性对照	RT-PCR反应	三基因检测
无模板对照	检测步骤的交叉感染	三基因检测
			提取/内参基因靶标	RNA提取、逆转录和qPCR	Rnase P基因检测

试剂盒组分–试剂盒组分列于表2中。

表2：包装内容—24个反应和48个反应试剂盒

引物和探针序列

Quanti Virus^TMSARS-CoV-2检测试剂盒合成靶标由IDT合成：

a.用于N1基因的WHnCoV gBlock1

SEQ ID NO:13

b.用于N2基因的WHnCoV gBlock2

SEQ ID NO:14

c.用于Orf1ab基因的WHnCoV gBlock3

SEQ ID NO:15

d.用于E基因的WHnCoV gBlock4

SEQ ID NO:16

·引物有下划线，探针用粗体和斜体显示。所需的材料：

A.用于病毒RNA分离的试剂

RNA的质量和数量对于检测的准确性至关重要。推荐使用以下商业*试剂盒从临床样品中分离病毒RNA。

1.Qiagen QIAamp病毒RNA小提试剂盒，货号/ID：52904

2.Thermo Fisher PureLink病毒RNA/DNA小提试剂盒货号：122800500

*遵循供应商的使用说明(IFU)/产品说明书

B.消耗品

无核酸酶、低结合微量离心管、带气溶胶屏障的无核酸酶移液器吸头

C.其他试剂

分子级无DNase/RNase的水

D.设备

qPCR仪(相当于ABI 7500Dx)

用于样品制备的专用移液器*(可调，10-100μL、100-200μL、1000pL)

用于PCR预混液制备的专用移液器*(可调，1-20μL、10-100μL、100-200μL、1000pL)。

用于分配模板RNA/DNA的专用移液器*(可调，1-20μL，10-100pL)

用于将反应转移到PCR板的12通道多通道移液器(P-10)。

微型离心机

台式离心机，*配有用于1.5mL管的转子

台式微型离心机，配有用于PCR条的转子

台式平板离心机

漩涡混匀装置

96孔PCR板/384孔PCR板

透明PCR板封口剂

试剂池(可容纳25ml或以上液体)

分光光度计

注：*在使用前，确保仪器和设备已按照制造商的建议进行维护和校准。

仪器

已在下表3中所示的仪器上开发了这些检测。

重要提示：为了获得可靠的结果，必须使用经过校准/验证的仪器进行检测。

表3：本试剂盒的推荐仪器清单

公司	型号
		BioRad	CFX384
Thermo Fisher(ABI)	QuantStudio 5
		Thermo Fisher(ABI)	7500Fast Dx

处理和存储

该试剂盒在干冰上运输。如果试剂盒的任何组分在到达时没有被冷冻，外包装在运输过程中被打开，或者货物没有包装说明或试剂，请尽快与DiaCarta或当地经销商联系。

试剂盒在-15℃至-25℃的条件下收到后，应立即在-20℃的恒温冰箱中储存并且必须避光。当在指定的储存条件下储存时，该试剂盒在规定的有效期之前是稳定的。建议将PCR试剂(盒1和盒2)存放在预扩增区域，将对照(盒3)存放在扩增后(DNA模板处理)区域。该试剂盒最多可以进行6次冻融循环而不影响性能。

所有试剂在使用前必须在室温下至少解冻30分钟。在室温下不要超过2小时。所述引物和探针混合物含有荧光团标记的探针，应避光。

应注意所有组分的包装盒和标签上印刷的有效期和储存条件。不要使用过期或储存不当的组分。

一般注意事项

qPCR检测的有效使用需要良好的实验室实践，包括维护专门用于分子生物学的设备。进行检测时使用无核酸酶的实验室器具(移液器、移液器吸头、反应瓶)并戴上手套。在所有移液步骤中使用防气溶胶移液器吸头，以避免样品和试剂的交叉污染。

仅使用专用于该应用的设备，在指定的预扩增区域制备检测混合物。在单独的区域(最好是单独的房间)添加模板RNA/DNA。极其小心地防止可能导致模板RNA/DNA降解的RNase和DNase污染，或可能导致假阳性信号的PCR携带污染。

提供的试剂是专门为与该试剂盒一起使用而配制的。请勿进行替换以确保试剂盒的最佳性能。进一步稀释试剂或改变孵育时间和温度可能会导致错误或不一致的数据。

警告和注意事项

使用提供的阳性和阴性对照物时要格外小心，以防止PCR反应受到污染。

尽量减少4X PCR预混液暴露于室温，以获得最佳扩增效果。

避免将引物-探针混合物过度暴露在光线下，以获得最佳荧光信号。

使用未推荐的试剂量可能会导致性能下降，也可能会降低测试结果的可靠性。

使用未推荐体积和浓度的RNA/DNA样品可能会导致性能下降，也可能会降低测试结果的可靠性。

将非推荐消耗品与仪器一起使用，可能会对测试结果产生不利影响。

PCR扩增完成后，不要重复使用任何剩余的试剂。

使用非推荐仪器时，可能需要用户进行额外的验证测试。

使用无菌技术在适当的无菌条件下进行所有实验。

使用通用预防措施执行所有步骤。

在整个检测过程中穿戴个人防护服，包含一次性手套。

请勿在处理试剂或试样的区域进食、饮水、吸烟或涂抹化妆品。

根据您所在机构的做法处理危险的或生物污染的材料。

按照所有法律要求，以安全和可接受的方式丢弃所有材料。

将试剂完全溶解，然后通过上下吹打数次或根据需要进行旋涡震荡彻底混合。

如果接触到皮肤或粘膜，请立即用大量水清洗该区域。立即就医。

请勿使用超过试剂盒上印刷的到期日期的组分。

不要混合不同批次的试剂。

准备好工作试剂后，将所有组分放回适当的储存条件。

不要互换小瓶或瓶盖，因为可能会发生交叉污染。

使用时将所有材料放在冰上。

不要将组分在室温下放置超过2小时。

提供的试剂是专门为与该试剂盒一起使用而配制的。请勿进行替换以确保试剂盒的最佳性能。进一步稀释试剂或改变孵育时间和温度可能会导致错误或不一致的数据。

该产品不含在给定浓度下被认为对健康或环境有害的物质。

HMIS

健康 0

易燃性 0

反应性 0

使用说明

病毒RNA分离

有关使用详情，请参阅所选商业提取试剂盒的IFU(使用说明)。有几种可用于RNA分离的方法。为了保持一致性，我们建议使用以下商业试剂盒：

病毒RNA小提试剂盒(Qiagen Cat.52904/52906)

PureLink^TM病毒RNA/DNA小提试剂盒(Invitrogen Cat.12280050)

根据制造商的说明遵循RNA分离步骤。1次反应最多可使用5.5μL提取的RNA。RNA分离后，使用分光光度计检查RNA浓度，确保A260/A280值为约2.0。处理RNA样品时要格外小心，以防止RNase引起的RNA降解，整个过程中始终戴着手套，最好在专门用于RNA工作的区域，使用DEPC处理过的水和容器等。使用前将提取的RNA储存在-80℃。

试剂和检测混合物的制备

解冻提供的所有引物和探针混合物、阳性对照、无核酸酶的水和4X qRT-PCR预混液。在室温下解冻所有反应混合物至少30分钟。涡旋除PCR预混液以及引物和探针混合液外的所有组分5秒，并快速离心。qRT-PCR预混液和引物/探针混合液应通过倒置试管数次轻轻混合。

使用前，确保qRT-PCR预混液中的任何沉淀物通过上下移液多次重新悬浮。不要将试剂盒组分在室温下放置超过2小时。PCR反应的总体积为10μL/反应。表4显示了每个10ul反应的组分体积。

表4：检测组分和反应体积

为准确起见，应将4x PCR预混液、引物和探针预混合到下面表5中所述的检测混合物中。

检测混合物的制备

检测混合物应在正要使用前制备好。为每个反应混合物标记一个微型离心管(未提供)，如表5所示。对于每个对照和病毒检测反应，根据表4中的体积，制备足够的针对RNA样品的工作检测混合物、一种阳性对照、一种用于无模板对照(NTC)的无核酸酶的水。包含用于1个额外样品的试剂，以便为PCR设置提供足够的过量。除所述样品外，检测混合物包含PCR所需的所有组分。

表5：检测混合物的制备

	4X PCR预混液的体积	引物和探针混合液的体积
			混合液A	2.5μL x(n+1)	2μL x(n+1)
混合液B	2.5μL x(n+1)	2μL x(n+1)
			混合液C	2.5μL x(n+1)	2μL x(n+1)
混合液D	2.5μL x(n+1)	2μL x(n+1)

n＝反应数目(RNA样品加2个对照)。为1个额外样品(n+1)制备足够的量，以便为qRT-PCR设置留出足够的过量。

为一次运行中要检测的样品和对照的总数，制备除RNA样品或对照模板外包含所有试剂的反应混合物。每次运行都应包含阳性对照(PC)和无模板对照(NTC)。

建议的运行布局(96孔板、384孔板、管条或管)

对于每个反应，将4.5μL的适当检测混合物添加到板或管中。添加多达5.5μL的模板。

表6：建议的板布局

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

混合物A

NTC

S1

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

S10

PC

B

混合物B

NTC

S1

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

S10

PC

C

混合物C

NTC

S1

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

S10

PC

D

混合物D

NTC

S1

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

S10

PC

E

混合物A

S11

S12

S13

S14

S15

S16

S17

S18

S19

S20

S21

S22

F

混合物B

S11

S12

S13

S14

S15

S16

S17

S18

S19

S20

S21

S22

G

混合物C

S11

S12

S13

S14

S15

S16

S17

S18

S19

S20

S21

S22

H

混合物D

S11

S12

S13

S14

S15

S16

S17

S18

S19

S20

S21

S22

PC：阳性对照，NTC：无模板对照(水)，S1-22：样品1-22。

表6是针对分析22个未知样品的单个实验建议的板设置。

将所有试剂添加到所述板中后，将板紧紧密封以防止蒸发。以1000rpm转速旋转1分钟以收集所有试剂。立即放入实时PCR仪中。

仪器设置

在经过验证的仪器上设置PCR反应热循环条件：Bio-Rad CFX 384和ABIQuantStudio 5，或ABI 7500Fast Dx。

检测器的选择

A.对于Bio-Rad CFX 384，选择所有通道；

B.对于ABIQuantStudio 5和ABI 7500Fast Dx，分别将每个混合物A、混合物B、混合物C中的单个靶标指定为“FAM”，并将混合物D指定为“HEX”。

3.4.2.设置不同仪器的循环参数，如表7a或表7b所示；

3.4.3.开始运行；

有关设置不同qPCR仪的更详细说明，请参阅仪器设置和数据分析文件。该文件可应要求提供。

表7a：Bio-Rad CFX 384的循环参数

表7b：ABIQuantStudio 5和ABI 7500Fast Dx**的循环参数

**如果使用ABI FAST 7500Dx，请使用具有自动变温速率设置的FAST模式

数据分析

qPCR结果评估

对于Bio-Rad CFX 384、ABIQuant Studio 5和ABI 7500Fast Dx，按照仪器制造商的说明保存和分析数据。将高于任何背景信号的阈值调整到log视图中扩增曲线的指数期中间附近(例如图2)。选择用于设置阈值的程序应始终如一地使用。图2是模板的10倍连续稀释的扩增曲线，显示了阈值设置。

检测运行的评估

检测运行需要满足以下标准才能有效。

·确证NTC中没有观察到每种反应混合物的扩增。FAM和HEX通道的Cq均应为未确定

·NEC在FAM通道中为混合物D生成Cq<30

·阳性对照在FAM通道中为混合物A、混合物B和混合物C生成18-26的Cq

结果解释

根据表8中的Cq值评估每个单独检测的结果。

根据每个单独检测获得的Cq值评估结果。下表显示了该检测的截止值和结果解释。

表8a：个体检测结果-1

靶标	截止值	结果
			靶病毒基因(A、B、C)	Cq<38	POS
靶病毒基因(A、B、C)	Cq≥38	NEG
			Rnase P(D)	Cq<36	病毒RNA输入OK
Rnase P(D)	Cq≥36	病毒RNA输入失败

表8b：个体检测结果-2

结果解释

试剂盒中的阳性对照和NTC(无模板对照)必须按要求发挥作用，才能使用表9进行解释。如果阳性对照或NTC(无模板对照)没有按要求发挥作用，则该测试无效。所有样品都需要重新测试。

表9a：结果解释-1

表9b：结果解释-2

检测性能

SARS-CoV-2检测的性能特征是在ABI 7500Fast Dx和ABIQuantStudio 5qPCR仪上建立的。在BioRadCFX 384上进行了额外的检测。

分析特异性

Quanti Virus^TM实时PCR冠状病毒(SARS-CoV-2)检测分析，设计为检测所有公开可用的COVID-19病毒RNA序列。同时，在SARS-CoV-2病毒特异性基因组区域内设计引物和探针，确保特异性检测SARS-CoV-2病毒。对SARS-CoV-2检测设计的硅基分析表明，该检测可以检测所有SARS-CoV2病毒株，并且与非SARS-CoV-2物种没有交叉反应。

精确度

精确度研究包括运行内、运行间、仪器和操作员可变性评估。通过对三种不同模板浓度的样品进行重复测试来评估检测准确度。

·通过同一用户在同一仪器上检测的同一批次试剂，建立了检测间％CV。

·通过试剂盒对参考样品的9次重复操作，确定了检测内％CV。

·通过两名操作人员使用一批试剂，评估了操作员可变性。

基于Cq值的％CV，证明了可重复性。

检测内重现性

在三种样品模板浓度下，每个检测重复10次，并在样品板上运行。计算平均Ct和CV。

表10：针对SARS-CoV-2检测试剂盒各靶点的检测内

检测内的总CV<3％，且对于该检测是可接受的。

操作员可重复性

检测反应由两名操作员使用相同批次的试剂设置，并在同一台仪器上运行。计算平均Ct和CV。

表11：不同操作员的重现性

两名操作员的总体CV<1.5％，并且对于该检测是可以接受的。

仪器间的重现性

检测反应设置为三个重复，并在三种不同的qPCR仪上运行，包含BioRadCFX 384、ABIQS5和ABI 7500Fast Dx。计算平均Ct和CV。

表12：仪器重现性

结果表明，三种仪器的CV<5％，是可以接受的。

分析灵敏度和检测限(LOD)

为了确定试剂盒的检测限(LoD)和分析灵敏度，使用分析物的连续稀释进行研究，并确定LoD是在所有测试阳性的95％中可以可靠检测到情况下的最低模板浓度。

使用SeraCare AccuPlex SARS-CoV-2参考材料试剂盒(货号：0505-0126)，确定QuantiVirus^TMSARS-CoV-2检测中每个靶检测的LoD并加以验证。将AccuPlex SARS-CoV-2参考材料试剂盒中的非传染性病毒颗粒，从5000拷贝/mL的储液浓度以不同浓度(50拷贝/mL、100拷贝/mL、150拷贝/mL、200拷贝/mL和300拷贝/mL)稀释后，加标到痰液中。使用提供的试剂盒试剂进行实时RT-PCR检测，并在ABIQS5和ABI 7500Fast Dx PCR仪上进行测试。

加标样品的制备过程如下：

1.按照CDC痰液样品采集指南，采集痰液样品。

2.将100μL痰液与100μL裂解缓冲液以1:1的比例混合。

3.将携带N基因、ORF1ab和E基因的SARS-CoV-2病毒颗粒(SeraCare AccuPlex参考材料试剂盒，货号：0505-0126)分别以下述浓度添加到200uL痰液混合物中：50拷贝/mL、100拷贝/mL、150拷贝/mL、200拷贝/mL、300拷贝/mL。

4.使用Thermo Fisher病毒RNA提取试剂盒(PureLink^TM病毒RNA/DNA小提试剂盒，货号：12280050)，处理上述第3步中的200μL加标样品。用无菌无RNase的水将提取的RNA洗脱至25μL。

5.每次反应取5.5μL纯化的RNA样品，并使用QuantiVirus^TMSARS-CoV-2检测试剂盒运行qRT-PCR。

我们在痰液样品中检测了50拷贝/mL、100拷贝/mL、150拷贝/mL、200拷贝/mL和300拷贝/mL的病毒RNA。表13显示N基因、ORF1ab和E基因可检测到低至100拷贝/mL。阴性对照未显示任何信号(Ct>39)。阳性对照显示Ct<24。阳性样品的截止Ct值确定为Ct<38。在100拷贝/mL检测水平下，其N基因的平均(Avg)Ct为34.2，ORF1ab为35.7，E基因为37.7。这些数据表明检测灵敏度(LOD)为100拷贝/mL。

表13：痰液中加标病毒RNA的检测敏感性

通过以20次重复来测试病毒RNA的lxLoD确认了LOD。若20次重复中>95％(19/20)被检测为阳性，则该LoD被确定为是最低浓度(拷贝数/mL)。再次，病毒RNA被加标到痰液中，通过Quanti Virus SARS-CoV-2RT-qPCR进行提取和检测。N基因、ORF1ab和E基因的20个样品的平均Ct在Ct 33-36之间，具有95％CI。在该实验中可检测到20个具有100拷贝/mL病毒RNA的样品。其正确调用率为95-100％(表14)。

表14：用于LOD确认的20次重复检测

*NTC-无靶标对照；PC-阳性对照

通过用20次重复来测试病毒RNA的lxLoD确认了LOD。若20次重复中>95％(19/20)被检测为阳性，则该LoD被确定为是最低浓度(拷贝数/mL)。数据证实，在ABIQS5(表15a)中该检测的检测分析灵敏度为200拷贝/mL，在ABI7500Dx中该检测的检测分析灵敏度为100拷贝/mL(表15b)。

ABIQuantStudio 5的LoD

数据证实ABIQuantStudio 5的检测分析灵敏度为200拷贝/mL。

表15a：检测灵敏度的20次重复的总结(ABIQuantStudio 5)

ABI 7500Fast Dx的LoD

数据证实ABI 7500Fast Dx的检测分析灵敏度为100拷贝/mL。

表15b：检测灵敏度的20次重复总结(ABI 7500Fast Dx)

靶标	RNA(拷贝/mL)	总计	AVE Ct	SD	CV	阳性	阴性	调用率
									N基因	100拷贝/mL	20	33.73	0.79	0.02	20	0	100％
ORF1ab	100拷贝/mL	20	35.13	0.87	0.02	20	0	100％
									E基因	100拷贝/mL	20	35.59	0.95	0.03	20	0	100％

交叉反应性

QuantiVirus^TMSARS-CoV-2检测试剂盒被设计为检测所有公开可用的SARS-CoV-2毒株。同时，在SARS-CoV-2病毒特异性基因组区域内设计了引物和探针，确保了SARS-CoV-2病毒RNA的特异性检测。对SARS-CoV2检测设计进行了硅片分析，并根据待在硅片中分析的微生物推荐清单(见表16和17)或通过直接实验室湿法检测(表18)与普通呼吸道菌群和来自与SARS-CoV-2相同遗传家族的其他病毒病原体进行了比较。

表16：通过硅基分析检测交叉反应性的微生物清单

#	微生物	#	微生物
				1	人冠状病毒229E	14	鼻病毒
2	人冠状病毒OC43	15	肠病毒
				3	人冠状病毒HKU1	16	肺炎衣原体
4	人冠状病毒NL63	17	流感嗜血杆菌
				5	SARS-冠状病毒	18	嗜肺性军团菌
6	MERS-冠状病毒	19	结核分枝杆菌
				7	腺病毒	20	肺炎链球菌
8	人类偏肺病毒(hMPV)	21	化脓性链球菌
				9	副流感病毒1-4	22	百日咳杆菌
10	甲型流感	23	白色念珠菌
				11	乙型流感	24	铜绿假单胞菌
12	肠病毒	25	表皮葡萄球菌
				13	呼吸道合胞病毒A	26	唾液葡萄球菌

为了预测硅基假阳性结果，所有其他同源性对于该引物对和探针都不显著。对常见呼吸道微生物的硅基序列同源性分析结果表明，一种微生物——SARS-冠状病毒(MK062184.1)显示出与我们检测的3个基因中2个的引物和探针的显著同源性(>80％)。表格形式的分析如表17所示。产生显著同源性(>80％)的所有结果在表17中突出显示。为了预测硅基假阳性结果，所有其他同源性对于该引物对均不显著。

表17：针对特定冠状病毒和常见呼吸道病原体的硅基序列同源性(搜索于2020年3月25日进行)

*NSH-无显著同源性；黄色高亮——同源性超过80％

硅基分析的结果表明，SARS冠状病毒(MK062184.1)与我们的N基因和E基因分析引物/探针具有显著的同源性。因此，通过湿实验室实验检测了与SARS冠状病毒(MK062184.1)的交叉反应性。

我们已经在湿实验室测试了交叉反应性。MERS-冠状病毒、SARS-CoV冠状病毒样品购自IDT，NATtrol呼吸验证板购自ZeptoMetrix(货号：NATRVP-3)。RNA/DNA是从潜在交叉反应微生物的高滴度储备液中提取的(估计为1.0E+05个单位/mL)，使用Thermo Fisher病毒RNA提取试剂盒(PureLink^TM病毒RNA/DNA小提试剂盒，货号：12280050)和Qiagen QIAampDNA小提试剂盒(货号：51304)，从100μL微生物储备液中提取RNA/DNA。用无菌无RNase的水将提取的RNA/DNA样品洗脱至100μL。每次反应取5.5μL纯化的RNA/DNA样品，并使用QuantiVirus SARS-CoV-2检测试剂盒运行qRT-PCR。交叉反应性检测结果总结在表18中。检测一式三份进行。所有检测对照均通过了(三个靶标的阳性对照通过了(Ct<25)，无靶标对照通过了(Ct>45)，提取对照的RP为约Ct 28)。被测微生物对SARS-CoV-2的三个靶基因均呈阴性，这表明SARS-CoV-2与被测微生物之间不存在交叉反应。

表18：SARS-CoV-2试剂盒与被测微生物之间的交叉反应总结

*PC-阳性对照；NTC-无靶标对照；EC-提取对照

临床评估(加标掺入痰液的体外转录病毒RNA)

ABIQuantStudio 5的临床评估

QuantiVirus^TMSARS-CoV-2检测试剂盒的临床评估是使用人为的痰试样进行的，该痰试样包含60个阳性和38个阴性样品(表13a)。痰样品与提取试剂盒中的裂解缓冲液以1:1的比例混合，然后加标非传染性病毒颗粒(SeraCare AccuPlex SARS-CoV-2参考材料试剂盒，货号：0505-0126)。

痰液样品(20个样品)用0.75X LoD(150拷贝/mL)的非传染性病毒颗粒模板人为设计，20个样品在1xLoD(1x200拷贝/mL)，10个痰液样品中加标添加了1.5xLoD的非传染性病毒(300拷贝/mL)，另外10个痰液样品以2.5xLoD(500拷贝/mL)的浓度加标。从加标样品中提取病毒RNA，并使用QuantiVirus^TMSARS-CoV-2RT-qPCR进行盲测。

数据显示在1xLoD(1x200拷贝/mL)下与加标样品有95％的一致性，在所有其他浓度(包括300拷贝/mL和500拷贝/mL)下具有100％的一致性(表19a)。对于阴性对照，有一个样品因污染而被排除。其余37个样品为阴性。

表19a：使用体外转录的RNA进行人为临床样品的评估

在ABI 7500Fast Dx上的临床评估

QuantiVirus^TMSARS-CoV-2检测试剂盒的临床评估使用人为的痰试样进行，该试样包括40个阳性和38个阴性样品(表13b)。痰样品与提取试剂盒中的裂解缓冲液以1:1的比例混合，然后加标添加到非传染性病毒颗粒(SeraCare AccuPlex SARS-CoV-2参考材料试剂盒，货号：0505-0126)。

痰液样品(20个样品)用1xLoD(1x100拷贝/mL)的非感染性病毒颗粒模板人为设计，10个痰液样品用3xLoD(3x100拷贝/mL)的非传染性病毒加标，另外10个痰液样品加标5xLoD(5x100拷贝/mL)的浓度。从加标样品中提取病毒RNA并进行盲测。数据显示，在1xLoD(1x100拷贝/mL)下与加标样品有100％的一致性，在包括3xLoD和5x LoD在内的所有其他浓度下也有100％的一致性(表19b)。对于阴性对照，有一个样品因污染而被排除。其余37个样品为阴性。

表19b：使用体外转录的RNA进行人为临床样品评估(ABI 7500Fast Dx)

实际患者样品

DiaCarta已使用DiaCarta实验室的ABI 7,500Dx Fast仪，通过我们的QuantiVirus SARS-CoV-2测试对5个真实患者样品进行了检测。我们将我们的结果与位于旧金山退伍军人管理医院的M2000仪上使用的雅培(Abbott)实时SARS-CoV-2试剂盒的结果进行了比较(表20)。我们的结果还与位于旧金山加利福尼亚大学的ABI 7,500Dx仪上使用的CDC 2019-nCoV实时RT-PCR试剂盒进行了比较。我们的试剂盒在两个患者样品中检测到COVID-19，但未检测三个患者样品。我们的检测试剂盒的结果与雅培和CDC检测试剂盒的结果相同。两个检测试剂盒和两个仪器的一致性是100％。

表20：使用本发明的试剂盒在ABI 7500Dx Fast仪上检测5个真实患者样品，并将测试数据与使用雅培实时SARS-CoV-2试剂盒在M2000仪(SFVA医院)和使用CDC 2019-nCoV实时RT-PCR试剂盒在ABI 7500Dx仪(UCSF)上获得的数据进行比较。

保质期

根据类似产品的单个组分保质期和其他内部稳定性数据，该试剂盒的大致保质期估计为12个月。

该产品不含在给定浓度下被认为对健康有害的物质。

实施例II

方法

唾液临床试样

临床样品是从先前被检测为SARS-CoV-2阳性的患者收集的。QuantiVirusTM唾液采集试剂盒(DiaCarta,Inc.货号：DC-11-0021)(参见图1)用于唾液采集，遵循试剂盒插页说明并在医疗保健提供者的监督下进行。唾液样品采集前30分钟不吃不喝。每个唾液样品含有2mL液体唾液和2mL病毒转运培养基。唾液样品在采集后24小时内冷藏并处理以供测试。使用的详细程序如下：

1.采集唾液样品前30分钟不吃不喝。

2.用记号笔标记2mL线。(如果没有标记则收集线很难看见)

3.拿起带有口腔适配器的收集管，将舌尖压在口腔顶部或牙根上，以丰富唾液。吐出唾液，直到它填充到2毫升标记。

4.拧下蓝色顶部的防腐液，将其倒入带有口腔适配器的收集管中，同时保持管处于直立位置。

5.拧下口腔适配器件。用粉红色的顶部盖住收集管，上下混合至少5分钟。

6.如果将其交给医疗保健专业人员，请确保您的试管贴有标签，至少标有您的姓名和出生日期。

7.提供者和医务人员现在可以按照以下标签说明对样品进行标记。将唾液试剂盒擦干净，然后放入干净的小型生物危害运输袋中。

病毒RNA提取

使用华大智造公司(MGI)的自动RNA/DNA提取仪MGISP-960(华大智造科技有限公司，中国)，按照制造商的说明使用200μL唾液样品提取SARS-CoV-2病毒RNA。对于每批要测试的临床样品，都包括一个提取对照(EC)(将来自QuantiVirus^TMSARS-CoV-2多重试剂盒的20μL EC加标到180μL无菌无RNase的水中)。临床样品和加标EC在MGI平台上进行处理和提取。提取产量为30-50μL无RNase水中的RNA，其中5.5μL用于每次检测的PCR反应。从样品提取到PCR最终报告的周转时间约为4小时。在处理提取的RNA样品时，采取了预防措施以避免RNA降解。如果不立即用于RT-PCR，提取的RNA样品将储存在-80℃。

实时逆转录PCR(rRT-PCR)

一次RT-PCR反应对所有靶标的总体积为10μL，包括5.5μL RNA、2.0μL5x引物和探针混合物(终浓度分别为0.2μM和0.1μM)，以及2.5μL的4xTaqPath^TM1-Step RT-qPCR预混液(货号：A28526，Thermo Fisher,Waltham,MA)或4x耐抑制剂的(Inhibitor-Tolerant)RT-qPCR混合液(MDX016-50,Meridian Bioscience,Tennessee)。热循环按下述流程进行：25℃下2分钟进行尿嘧啶-N-糖苷酶基因(UNG)孵育，53℃下10分钟进行逆转录，95℃下2分钟，然后95℃下3秒、60℃下30秒进行45个循环。QuantStudio^TM5实时PCR系统(Thermo Fisher,USA)被用于rRT-PCR扩增和检测。

统计数据分析

平均循环阈值(Ct)、标准偏差(SD)和变异系数(CV)，使用Microsoft OfficeExcel 365软件(Microsoft,Redmond,WA)计算。使用MedCalc软件版本19.3.1，分析在两侧95％置信区间(CI)的临床敏感性、特异性、阳性百分比一致性(PPA)和阴性百分比一致性(NPA)。

结果

分析灵敏度

来自AccuPlex SARS-CoV-2参考材料试剂盒(SeraCare Bioscience)的非传染性病毒颗粒，以不同浓度(50、100和200拷贝/mL)加标到唾液中。使用提供的试剂盒试剂，进行实时RT-PCR检测。个体检测结果评估为：样品Ct<40表明为阳性，而Ct>40表示为阴性。因此，由于50拷贝/ml样品无法检测到，因此将100拷贝/mL确定为暂定LOD(表21)。

表21：通过系列稀释确定暂定LOD*

*对于每个单独的RT-PCR检测，Ct值<40表明为阳性，Ct>40表明为阴性。因此，100拷贝/mL被确定为暂定LOD。

然后，我们使用人为的唾液样品进行20次测量，在源自不同供应商的四台qPCR仪上验证了QuantiVirus^TMSARS-CoV-2试剂盒。在95％置信区间下，总体分析灵敏度(检测下限或LOD)约为100-200拷贝/mL(表2)。验证数据确定了：ABI 7500Fast Dx上的检测LOD为200拷贝/mL(表22a)，Bio-Rad CFX384上为100拷贝/mL(表22b)，Roche LightCycler 480II上为200拷贝/mL(表22c)，以及在Thermo Fisher QuantStudio 5上为200拷贝/mL(表22d)。

表22a：在ABI 7500Dx上进行分析灵敏度确认的20次重复的总结

表22b：在BioRad CFX 384上进行分析灵敏度确认的20次重复的总结

表22c：在Roche LC 480上进行分析灵敏度确认的20次重复的总结

表22d：在ABIQS5上进行分析灵敏度确认的20次重复的总结

临床评估

收集唾液样品并使用QuantiVirus^TMSARS-CoV-2试剂盒进行检测。使用ABIQuantStudio 5，通过QuantiVirus^TMSARS-CoV-2检测对一组具有已知状态的患者唾液样品进行了检测。共检测了40个唾液阳性样品和40个阴性样品。数据表明，唾液样品具有100％的敏感性和100％的特异性(表23和24)。

表23：通过QuantiVirus^TMSARS-CoV-2检测测定的唾液阳性样品

表24：通过QuantiVirus^TMSARS-CoV-2检测测定的唾液阴性样品

总结，使用QuantiVirus^TMSARS-CoV-2检测，我们测定了已知状态的临床唾液样品，包括40个阳性样品和40个阴性样品(表25)。数据显示，阳性百分比值(PPA)为100％(95％CI：0.891-1.00)，阴性百分比值(NPA)为100％(95％CI：0.891-1.00)。

表25：使用ABIQS5 qPCR仪，通过QuantiVirus^TMSARS-CoV-2检测进行临床唾液样品评估

申请人还对本发明的Quanti Virus^TMSARS-CoV-2多重试剂盒与经FDA EUA批准的雅培实时SARS-CoV-2试剂盒进行比较。我们使用QuantiVirus^TMSARS-CoV-2试剂盒与雅培m2000实时SARS-CoV-2PCR试剂盒平行检测了来自COVlD-19康复患者的24个唾液样品(表26)。数据显示检测的一致性约为88％。用QuantiVirus^TMSARS-CoV-2试剂盒共检测到的三个样品，但用雅培试剂盒无法检测到(患者#8、11和12)，这与所报道的QuantiVirus^TMSARS-COV-2PCR检测的更高灵敏度一致。

表26：雅培m2000 SARS-CoV-2PCR检测和DiaCarta QuantiVirus^TMSARS-CoV-2PCR检测在临床唾液样品中检测SARS-CoV-2的比较

我们还检测了在洛杉矶和旧金山湾区县的无症状个体(即无症状筛查)的一般人群中收集的389份唾液试样。筛选的人群由非裔美国人、白人、亚洲人和拉丁裔代表，年龄范围从18岁到80岁(平均41岁)。2020年5月8日至8月26日，对301份唾液样品进行了检测，其中5份样品通过QuantlViras^TMSARS-CoV-2检测呈SARS-CoV-2阳性。5个阳性对应于4名19、51、52和54岁的男性和1名34岁的女性。总检出率为1.66％(表27)。在对88份唾液样品的另一个检测中，2份样品呈阳性，86份呈阴性，总阳性检出率为2.27％。我们一共筛查了普通人群中的389人，发现7人针对SARS-CoV-2呈阳性，总体检出率为1.8％，与报道的两个大都市区同期的平均阳性检测率一致。

表27：在当地社区使用QuautiVirus^TMSARS-CoV-2检测进行基于唾液的COVID-19筛查总结

日期	总计(N)	阳性	阴性	检出率(％)
					2020.05.08-08.26	301	5	296	1.66％
2020.08.28	88	2	86	2.27％
					总计	389	7	382	1.80％

我们还检测了汇集唾液试样用于筛查无症状患者的可行性，我们汇集了阴性和阳性唾液样品，并检测了总共77个汇集的阳性样品(1个患者样品与5个健康唾液样品混合；1:6的比例)和54个汇集的阴性样品(混合6个健康样品)(表28)。在77份汇集的阳性唾液样品中，73份检测为阳性(三个基因的平均Ct：O基因Ct为约29.8；E基因为30.9和N基因Ct为约31.0)，以及4份被报告为未检测到。所有131份汇集样品的平均内部参照(IC)RP Ct为21.9。阳性预测值(PPV)为100％(95％CI:93.8％-100％)。阴性预测值(NPV)为93.1％(95％CI:82.5-97.8％)。此外，我们测试了总共49份汇集的阳性唾液样品，这些样品是通过将1个患者样品与11个健康样品(比例为1：12)混合而成的。在49份汇集的阳性样品中，44份检测为阳性(O基因、E基因和N基因平均Ct分别为：31.8、32.1和31.9)，以及5份报告未检测到。所有49个汇集的唾液样品和另外20个汇集的健康唾液样品的IC RP平均Ct为22.3。PPV分别为100％(95％CI：89.9％-100％)和NPV分别为80.0％(95％CI：58.7％-92.4％)。

表28：采用QuantiVirus^TMSARS-COV-2检测试剂盒将唾液样品汇集用于SARS-CoV-2测定

实施例III

方法

研究设计和伦理

除了人为的唾液样品外，该研究中还使用了未识别的剩余患者NPS和唾液样品。所有患者试样均采集于2020年5月至9月，并且之前在UCSF附属的旧金山VAMC临床实验室和DiaCarta的CLIA实验室进行了临床诊断或筛查目的检测。除了定性RT-PCR结果(阳性或阴性)外，该研究分析中仅包括PCR循环阈值(Ct)的值，并且未进行患者临床图表回顾。该研究被UCSF的机构审查委员会(IRB)(UCSF IRB#11-05207)批准为无受试者接触研究，放弃知情同意并根据第4类豁免。

临床试样

临床样品是从之前被检测出SARS-CoV-2呈阳性的患者身上收集的。同时收集成对的NPS和唾液样品。QuantiVirus^TM唾液采集试剂盒(DiaCarta,Inc.货号：DC-11-0021)用于唾液采集，遵循试剂盒的插页说明并在医疗保健提供者的监督下进行。唾液样品采集前30分钟不吃不喝。

每个唾液样品包含约2mL液体唾液和2mL病毒转运培养基。NPS和唾液样品在收集后24小时内冷藏并处理以供检测。

样品汇集

根据实验设计，将阳性唾液和阴性唾液样品分别以1:6(即1个阳性与5个阴性混合)和1:12(即1个阳性与11个阴性混合)的比例汇集在一起。总共77个阳性患者样品和385个阴性样品被用于以1:6的比率汇集以产生77个汇集的阳性样品和54个汇集的阴性样品。混合汇集的样品后，根据检测方案提取RNA用于RT-PCR。

病毒RNA提取

使用华大智造公司(MGI)的自动RNA/DNA提取仪MGISP-960(华大智造科技有限公司，中国)，根据制造商的说明进行SARS-CoV-2病毒RNA提取，使用200μL每个NPS VTM或唾液样品。对于每批要检测的临床样品，都包括一个提取对照(EC)(将20μL来自QuantiVirus^TMSARS-CoV-2试剂盒的EC加标至180μL无菌无RNase的水中)。临床样品和加标的EC在MGI平台上进行处理和提取。提取产量为30–50μL无RNase水中的RNA，其中5.5μL用于每次检测的PCR反应。从样品提取到PCR最终报告的周转时间约为4小时(图1B)。在处理提取的RNA样品时采取了预防措施以避免RNA降解。如果不立即用于RT-PCR，提取的RNA样品将储存在-80℃。

多重引物和探针设计

SARS-CoV-2基因组中的靶基因序列、N基因、E基因和ORF1ab基因被鉴定，并选择用于检测开发。从GenBank和GISAID数据库中检索基因序列进行引物和探针设计，以确保覆盖所有SARS-CoV-2毒株。使用Qiagen CLC主要工作平台20.0.4，对收集的序列进行多重比对，并在引物和探针设计之前使用BioEditor 7.2.5鉴定每个靶基因中的保守区域。使用Primer3plus软件并遵循实时PCR设计的一般规则，设计引物和探针以靶向病毒基因组每个靶基因的最保守区域。所有引物均设计为具有约60℃的解链温度(Tm)，而探针设计为具有约65℃的Tm。每个引物对的扩增子大小尽可能小，保持在70bp至150bp的范围内，以实现更好的扩增效率和检测灵敏度。所有引物和探针均分别由Integrated DNA Technologies公司(IDT,Coralville,IA,USA)和LGC Biosearch Technologies公司(Novato,CA,USA)合成。

实时逆转录PCR(RRT-PCR)

针对所有靶标的一次RT-PCR反应的总体积为10μL，包括5.5μL RNA、2.0μL 5x引物和探针混合物(最终浓度分别为0.2μM和0.1μM)，以及2.5μL 4x TaqPath^TM1-Step RT-qPCR预混液(货号：A28526，Thermo Fisher，Waltham，MA)或4x耐抑制剂的(Inhibitor-Tolerant)RT-qPCR混合液(MDX016-50，Meridian Bioscience，Tennessee)。热循环流程如下：25℃下2分钟进行尿嘧啶-N-糖苷酶基因(UNG)孵育，53℃下10分钟进行逆转录，95℃下2分钟，然后在95℃下3秒、60℃ 30秒进行45个循环。QuantStudio^TM5实时PCR系统(ThermoFisher,USA)、Applied Biosystems^TM7500Fast Dx实时PCR仪(Thermo Fisher,USA)、BioRadCFX384(Bio-Rad,USA)和Roche LightCycler 480II(Roche,USA)被用于rRT-PCR扩增和检测。

分析灵敏度和检测限(LOD)

为确定QuantiVirus SARS CoV-2检测试剂盒的检测限(LoD)和分析灵敏度，使用经验方法进行研究，使用分析物的连续稀释液，并将LoD确定为在所有检测呈阳性的95％中可以可靠检测到情况下的最低模板浓度。使用SeraCare AccuPlex SARS-CoV-2参考材料试剂盒(货号：0505–0126)，对QuantiVirus^TMSARS-CoV-2测试中每个靶标的LoD进行检测和验证。将AccuPlex SARS-CoV-2参考材料试剂盒中的非传染性病毒颗粒，从5000拷贝/mL浓度的预混液以不同浓度稀释(50拷贝/mL、100拷贝/mL和200拷贝/mL)加标到唾液中。使用提供的试剂盒试剂进行实时RT-PCR检测，并在ABIQS5、ABI 7500Fast Dx、Bio-Rad CFX 384PCR和Roche LightCycler 480II仪器上重复三次进行检测。然后通过20次重复测试1xLoD的病毒RNA来确认LOD。若20次重复中有>95％(19/20)被检测为阳性，则该LoD被确定为最低浓度(拷贝数/ml)。

精确度

精确度研究包括运行内、运行间、仪器和操作员可变性评估。通过对具有三个或更多不同模板浓度的样品进行重复检测来评估检测精确度。(1)通过同一用户在同一仪器上检测的同一批次试剂，建立了检测间％CV；(2)通过试剂盒对参考样品的9次重复操作，确定了检测内％CV；(3)由两名操作人员使用一批试剂，评估了操作员的可变性。基于Ct值的％CV，证明了可重复性。

用于交叉反应性的微生物板

MERS-冠状病毒、SARS-CoV冠状病毒样品是从IDT订购的。NATtrol呼吸验证板是从ZeptoMetrix(货号：NATRVP-3,Buffalo,NY)订购的。RNA/DNA是从潜在的交叉反应微生物的高效价储备液中提取的。

统计数据分析

使用Microsoft Office Excel 365软件(Microsoft,Redmond,WA)，计算平均循环阈值(Ct)、标准偏差(SD)和变异系数(CV)。使用MedCalc软件版本19.3.1，分析两侧95％置信区间(CI)的临床敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。通过Wilcoxon符号秩检验进行NP和唾液对分析。

结果

QUANTIVIRUS^TMSARS-GOV-2检测试剂盒的验证

分析灵敏度

将来自AccuPlex SARS-CoV-2参考材料试剂盒(SeraCare Bioscience)的非传染性病毒颗粒，以不同浓度(50、100和200拷贝/mL)加标到唾液中。使用提供的试剂盒试剂，进行实时RT-PCR检测。个体检测结果的评估为：样品Ct<40表明为阳性，Ct>40表明为阴性。因此，由于从E基因靶标中检测不到50拷贝/mL样品，因此将100拷贝/mL确定为暂定的LOD。

然后，我们使用人为的唾液样品进行了20次测量，在来自不同供应商的四台qPCR仪器上验证了QuantiVirus SARS-CoV-2试剂盒。在95％置信区间下，总体分析灵敏度(检测下限或LOD)约为100-200拷贝/mL。

本发明经验证的多重rRT-PCR检测用于唾液样品中的SARS-CoV-2检测，临床敏感性为98.8％(95％CI：92.7％-99.9％)，特异性为100％(95％CI：94.9％-100％)。其PPV为100％(95％CI 94.6％-100％)，NPV为98.9％(95％CI 93.1％-99.9％)。在一个PCR管中检测三个病毒靶基因，使得使用RT-qPCR进行高通量检测成为可能。对于这些经过验证的384孔板PCR平台，每次运行可以检测381个患者样品(加上3个对照)。我们已经验证并集成了MGISP-960高通量自动样品制备系统，可在约80分钟内提取192个样品(2x96)。对于拥有两台MGI-960机器的CL1A实验室，可以检测380个样品，并在4小时内获得结果。

我们将SARS-CoV-2病毒颗粒加标到健康供体唾液中，并确认QuantiVirus^TMRT-qPCR检测的分析灵敏度(LOD)，对于Bio-Rad CFX 384为约100拷贝/mL，对于ABIQS5、ABI7500Dx和Roche LC 480为约200拷贝/mL。与其他FDA批准的检测试剂盒相比，我们已确认，通过FDA参考板测试，我们的检测试剂盒具有600NAAT可检测单位/mL(NDU/mL)，在FDA批准的所有SARS-CoV-2检测试剂盒中名列前茅。多重RT-qPCR检测可以同时检测三个病毒基因靶标，这可以最大限度地减少假阴性结果，因为病毒基因组中所有三个靶基因同时突变的可能性极小。此外，结果证实人类唾液样品不会抑制RT-qPCR反应，这可能是由于QuantiVirus^TMSARS-CoV-2检测试剂盒中使用了耐抑制剂的RT-PCR预混液。

SARS-CoV-2检测结果与FDA EUA批准的雅培实时SARS-CoV-2唾液样品检测结果一致率为87.5％，总体检出率更高。事实上，这一观察结果与最近报道的各种SARS-CoV-2分子检测的敏感度一致。FDA于2020年9月15日在其网站上发布了其SARS-CoV-2参考板比较数据。据报道，QuantiVirus^TMSARS-CoV-2试剂盒的LOD为600NDU/mL，而雅培实时SARS-CoV-2检测的LOD为2700NDU/mL。因此，在三个患者样品中通过QuantiVirus^TMSARS-CoV-2检测到SARS-CoV-2病毒RNA、但通过雅培实时SARS-COV-2检测未检测到的原因，可能是由于QuantiVirus^TMSARS-CoV-2检测的更高灵敏度。它还表明，唾液试样代表了一种可行的试样类型，当使用更敏感的测试时，可以轻松地将其应用于COVID-19检测。

对来自普通人群的389份唾液试样进行了测试，证明了使用唾液进行大规模人群筛查的可行性。唾液是一种非侵入性和易于收集的用于COVID-19筛查的试样。鉴于鼻咽和口咽拭子样品采集的弊端，唾液采样可以作为一种可接受的替代方法。

通过唾液汇集策略，我们证明了6个样品汇集(1名患者与5个健康唾液样品混合，或1:6的比例)具有94.8％的灵敏度(95％CI：86.5-98.3％)和100％的特异性(95％CI：91.7–100％)。如前所述，在77个汇集的唾液样品中，4个汇集的样品检测为阴性。事实上，对于这4个汇集的样品，用于汇集的个体阳性样品的ORF1ab基因Ct分别为34.4、34.8、35.7和37.5，与开始时的低病毒载量(小于100-200拷贝/mL)一致(见表1a-1d)。因此，为了检测汇集的样品中的弱阳性患者，需要进行LOD为100-200拷贝/mL或更高的RT-PCR检测。如果考虑汇集检测，每个临床实验室应根据SARS-CoV-2分子检测的LOD建立实验室特定的汇集方案。汇集检测的一个优势是其成本效益，即使检测供应有限，也允许基于人群的无症状筛查或监测。

总之，我们已经证明唾液试样可以可靠地用于SARS-CoV-2检测，并且基于唾液的COVID-19大规模人群筛查(无论是否汇集)都是可行的。

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序列表

<110> 帝基生物有限责任公司

<120> 用于RT-qPCR检测的SARS-CoV-2检测试剂盒

<130> TPF02665A

<160> 16

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

gttccaatta acaccaatag ca 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

attcgtctgg tagctcttc 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

tccagatgac caaattggct ac 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 4

gcaaattcta tggtggttgg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

gcatggctct atcacattta g 21

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 6

actgtttata gtgatgtaga aaaccctca 29

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

gcttcgattg tgtgcgtac 19

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

gaccagaaga tcaggaactc ta 22

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 9

ctgcaatatt gttaacgtga gtcttgt 27

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 10

agatttggac ctgcgagcg 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 11

gagcggctgt ctccacaagt 20

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

ttctgacctg aaggctctgc gcg 23

<210> 13

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

gacaaggaac tgattacaaa cattggccgc aaattgcaca atttgccccc agcgcttcag 60

cgttcttcgg aatgtcgcgc attggcatgg aagtcacacc ttcgggaacg tggttgacct 120

acacaggtgc catcaaattg gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc 180

tgaataagca tattgacgca 200

<210> 14

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 14

accgctctca ctcaacatgg caaggaagac cttaaattcc ctcgaggaca aggcgttcca 60

attaacacca atagcagtcc agatgaccaa attggctact accgaagagc taccagacga 120

attcgtggtg gtgacggtaa aatgaaagat ctcagtccaa gatggtattt ctactaccta 180

ggaactgggc cagaagctgg 200

<210> 15

<211> 270

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 15

accgtagctg gtgtctctat ctgtagtact atgaccaata gacagtttca tcaaaaatta 60

ttgaaatcaa tagccgccac tagaggagct actgtagtaa ttggaacaag caaattctat 120

ggtggttggc acaacatgtt aaaaactgtt tatagtgatg tagaaaaccc tcaccttatg 180

ggttgggatt atcctaaatg tgatagagcc atgcctaaca tgcttagaat tatggcctca 240

cttgttcttg ctcgcaaaca tacaacgtgt 270

<210> 16

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 16

atgtactcat tcgtttcgga agagacaggt acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt 60

cttgctttcg tggtattctt gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt 120

gcgtactgct gcaatattgt taacgtgagt cttgtaaaac cttcttttta cgtttactct 180

cgtgttaaaa atctgaattc ttctagagtt cctgatcttc tggtctaaac gaactaaata 240

ttatattagt ttttctgttt ggaactttaa ttttagccat ggcagattcc aacggtacta 300

ttaccgttga agagcttaaa aagctccttg aacaat 336

Claims (15)

1.用于检测SARS-CoV-2的PCR引物对，其选自下述引物对：(a)引物对，其包含由WHnCoVF2 SEQ ID NO:1GTTCCAATTAACA CCAATAGCA组成的引物和由WHnCoVR2a SEQ ID NO:2ATTCGTCTGGTAGCTCTTC组成的引物；(b)引物对，其包含由WHnCoVF3 SEQ ID NO:4GCAAATTCTATGGTGGTTGG组成的引物和由WHnCoVR3 SEQ ID NO:5GCATGGCTCTATCACATTTAG组成的引物；(c)引物对，其包含由WHnCoVF4 SEQ ID NO:7GCTTCGATTGTGTGCGTAC组成的引物和由WHnCoVR4 SEQ ID NO:8GACCAGAAGATCAGGAACTCTA组成的引物；以及(d)引物对，其包含由RP-F SEQ ID NO:10AGATTTGGACCTGCGAGCG组成的引物和由RP-R SEQ ID NO:11GAGCGGCTGTCTCCACAAGT组成的引物；其中所述引物对在聚合酶链式反应(PCR)中特异性扩增严重急性呼吸综合征冠状病毒CoV-2(SARS-CoV-2)的靶区域。

2.寡核苷酸，用作探针以检测在SARS冠状病毒-2基因组内的靶序列进行扩增所产生的扩增核酸序列，所述扩增基于权利要求1所述的寡核苷酸对，所述探针选自下组：WHnCoVPr2(探针)SEQ ID NO:3TCCAGATGACCAAATTGGCTAC；WHnCoVPr3(探针)SEQ ID NO:6ACTGTTTATAGTGATGTAGAAAACCCTCA；WHnCoVPr4(探针)SEQ ID NO:9CTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGT；以及RP-P(探针)SEQ ID NO:12TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。

3.确定生物样品中是否存在SARS相关冠状病毒CoV-2(SARS-CoV-2)的方法，所述方法包括：(a)使来自生物样品的核酸与至少一条引物接触，所述引物是权利要求1的核酸，(b)使所述核酸和引物经受扩增条件，和(c)确定是否存在扩增产物，其中扩增产物的存在表明所述样品中存在与冠状病毒相关的RNA。

4.检测SARS相关冠状病毒CoV-2(SARS-CoV-2)的方法，其通过使生物样品与一组引物和探针接触，在允许使用所述引物扩增核酸的条件下孵育，并确定所述探针与扩增的核酸的结合，其中检测到所述探针与扩增的核酸的结合表明存在SARS相关病毒，其中所述引物选自下组的引物对：(a)引物对，其包含由WHnCoVF2 SEQ ID NO:1GTTCCAATTAACACCAATAGCA组成的引物和由WHnCoVR2a SEQ ID NO:2ATTCGTCTGGTAGCTCTTC组成的引物；(b)引物对，其包含由WHnCoVF3 SEQ ID NO:4GCAAATTCTATGGTGGTTGG组成的引物和由WHnCoVR3 SEQ IDNO:5GCATGGCTCTATCACATTTAG组成的引物；(c)引物对，其包含由WHnCoVF4 SEQ ID NO:7GCTTCGATTGTGTGCGTAC组成的引物和由WHnCoVR4 SEQ ID NO:8GACCAGAAGATCAGGAACTCTA组成的引物；以及(d)引物对，其包含由RP-F SEQ ID NO:10AGATTTGGACCTGCGAGCG组成的引物和由RP-R SEQ ID NO:11GAGCGGCTGTCTCCACAAGT组成的引物；并且其中所述探针选自下组：WHnCoVPr2(探针)SEQ ID NO:3TCCAGATGACCAAATTGGCTAC；WHnCoVPr3(探针)SEQ ID NO:6ACTGTTTATAGTGATGTAGAAAACCCTCA；WHnCoVPr4(探针)SEQ ID NO:9CTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGT；以及RP-P(探针)SEQ ID NO:12TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG；并且其中所述探针被两种染料标记，其中一种染料是荧光报告染料，并且其中一种染料是淬灭剂染料，并且其中至少一种染料是荧光染料；如果发生病毒特异性序列的扩增，则通过实时荧光检测来检测SARS病毒。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述扩增和检测是使用实时RT-PCR进行的。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述引物对是WHnCoVF2 SEQ ID NO:1GTTCCAATTAACACCAATAGCA和WHnCoVR2a SEQ ID NO:2ATTCGTCTGGTAGCTCTTC，并且其中所述探针具有如WHnCoVPr2(探针)SEQ ID NO:3TCCAGATGACCAAATTGGCTAC所示的序列。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述报告染料是FAM、6-FAM、5-FAM和ALEXA-288。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述淬灭剂染料是TAMRA、DABCYL或QSY。

9.根据权利要求4所述的方法，其中所述检测是实时荧光信号强度的定量检测。

10.根据权利要求4所述的方法，其中所述生物样品是体液。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述体液是痰液、唾液、鼻咽液、口咽液或血液。

12.用于检测生物样品中的SARS相关冠状病毒CoV-2(SARS-CoV-2)的试剂盒，其包含选自以下引物对的PCR引物对：(a)引物对，其包含由WHnCoVF2 SEQ ID NO:1GTTCCAATTAACACCAATAGCA组成的引物和由WHnCoVR2a SEQ ID NO:2ATTCGTCTGGTAGCTCTTC组成的引物；(b)引物对，其包含由WHnCoVF3 SEQ ID NO:4GCAAATTCTATGGTGGTTGG组成的引物和由WHnCoVR3SEQ ID NO:5GCATGGCTCTATCACATTTAG组成的引物；(c)引物对，其包含由WHnCoVF4 SEQ IDNO:7GCTTCGATTGTGTGCGTAC组成的引物和由WHnCoVR4 SEQ ID NO:8GACCAGAAGATCAGGAACTCTA组成的引物；以及(d)引物对，其包含由RP-F SEQ ID NO:10AGATTTGGACCTGCGAGCG组成的引物和由RP-R SEQ ID NO:11GAGCGGCTGTCTCCACAAGT组成的引物；其中所述引物对在聚合酶链式反应(PCR)中特异性扩增严重急性呼吸综合征冠状病毒CoV-2(SARS-CoV-2)的靶区域。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述报告染料是FAM、6-FAM、5-FAM和ALEXA-288。

14.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述淬灭剂染料是TAMRA、DABCYL或QSY。

15.根据权利要求12所述的试剂盒，还包含进行实时RT-PCR反应所需的酶和试剂。