JP2017519516A - 乾燥スポットに対する自動化ｈｉｖ−１ウイルス量検査方法 - Google Patents

乾燥スポットに対する自動化ｈｉｖ−１ウイルス量検査方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、診断し、治療進行をモニタリングするために有用なＨＩＶ−１ウイルス量に対する乾燥血液スポット検査の新規且つ自明でない改善を提供する。

Description

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体である（Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ Ｆ，Ｃｈｅｒｍａｎｎ ＪＣ，Ｒｅｙ Ｆら，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ａｔ ｒｉｓｋ ｆｏｒ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ （ＡＩＤＳ），Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８３，２２０：８６８−７１；Ｐｏｐｏｖｉｃ Ｍ，Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ ＭＧ，Ｒｅａｄ Ｅら，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ （ＨＴＬＶ−Ｉ） ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＡＩＤＳ ａｎｄ ｐｒｅ−ＡＩＤＳ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８４，２２４：４９７−５００；Ｇａｌｌｏ ＲＣ，Ｓａｌａｈｕｄｄｉｎ ＳＺ，Ｐｏｐｏｖｉｃ Ｍら，Ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＨＴＬＶ−Ｉ） ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＡＩＤＳ ａｎｄ ａｔ ｒｉｓｋ ｆｏｒ ＡＩＤＳ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８４，２２４：５００−３）。ＨＩＶは性的接触を介して、感染した血液または血液製剤への暴露を介して、または感染している母親から胎児へ伝播される恐れがある（Ｃｕｒｒａｎ ＪＷ，Ｊａｆｆｅ ＨＷ，Ｈａｒｄｙ ＡＭら，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＡＩＤＳ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２３９：６１０−１６）。インフルエンザ様症状を特徴とする急性ＨＩＶ症候群は初期感染から３から５週間後に発現し、高レベルのウイルス血症を伴っている（Ｄａａｒ ＥＳ，Ｍｏｕｄｇｉｌ Ｔ，Ｍｅｙｅｒ ＲＤ，Ｈｏ ＤＤ，Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｖｉｒｅｍｉａ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，１９９１，３２４：９６１−４；Ｃｌａｒｋ ＳＪ，Ｓａａｇ ＭＳ，Ｄｅｃｋｅｒ ＷＤ，Ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒｓ ｏｆ ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｐｒｉｍａｒｙ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，１９９１，３２４：９５４−６０）。症状の発現から４から６週間以内にＨＩＶ特異的免疫応答が検出可能である（Ａｌｂｅｒｔ Ｊ，Ａｂｒａｈａｍｓｓｏｎ Ｂ，Ｎａｇｙ Ｋら，Ｒａｐｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｆｔｅｒ ｐｒｉｍａｒｙ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｈｉｃｈ ｒｅｓｉｓｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｒａ，ＡＩＤＳ，１９９０，４：１０７−１２；Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ ＣＲ Ｊｒ，Ｏｕ ＣＹ，Ｊａｓｏｎ Ｊら，Ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｅｆｏｒｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｌａｎｃｅｔ，１９８９，３３４：６３７−４０）。セロコンバージョン後、末梢血中のウイルス量は減少し、多くの患者は数年間続き得る無症候期に入る（Ｐａｎｔａｌｅｏ Ｇ，Ｇｒａｚｉｏｓｉ Ｃ，Ｆａｕｃｉ ＡＳ，Ｎｅｗ ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ （ＨＩＶ） ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，１９９３，３２８：３２７−３５）。末梢血中のＨＩＶレベルの定量的測定はＨＩＶ感染の病因の理解に大いに寄与し（Ｈｏ ＤＤ，Ｎｅｕｍａｎｎ ＡＵ，Ｐｅｒｅｌｓｏｎ ＡＳら，Ｒａｐｉｄ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｖｉｒｉｏｎｓ ａｎｄ ＣＤ４ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７３：１２３−６；Ｗｅｉ Ｘ，Ｇｈｏｓｈ ＳＫ，Ｔａｙｌｏｒ ＭＥら，Ｖｉｒａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７３：１１７−２２）、ＨＩＶに感染している個人の予後及び管理における必須パラメーターであることが判明している（Ｍｅｌｌｏｒｓ ＪＷ，Ｒｉｎａｌｄｏ ＣＲ ＪＲ，Ｇｕｐｔａ Ｐら，Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７２：１１６７−７０；Ｍｅｌｌｏｒｓ ＪＷ，Ｍｕｎｏｚ Ａ，Ｇｉｏｒｇｉ ＪＶら，Ｐｌａｓｍａ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ ａｎｄ ＣＤ４＋ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｓ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ，１９９７，１２６（１２）：９４６−５４；Ｃｈｅｎｅ Ｇ，Ｓｔｅｒｎｅ ＪＡ，Ｍａｙ Ｍら，Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｌａｎｃｅｔ，２００３，３６２：６７９−８６；Ｅｇｇｅｒ Ｍ，Ｍａｙ Ｍ，Ｃｈｅｎｅ Ｇら，Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｄｒｕｇ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ：ａ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｌａｎｃｅｔ，２００２，３６０：１１９−２９；Ｗｏｏｄ Ｅ，Ｈｏｇｇ ＲＳ，Ｙｉｐ Ｂら，Ｈｉｇｈｅｒ ｂａｓｅｌｉｎｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ＲＮＡ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅ−ｄｒｕｇ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００３，１８８：１４２１−５；アメリカ合衆国保健福祉省 成人及び青少年ＨＩＶ−１感染者における抗レトロウイルス剤使用に関する２００４年ガイドライン；オンラインで入手可能：ＡＩＤＳｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）。抗レトロウイルス治療の開始または変更に関する決定は血漿ＨＩＶ ＲＮＡレベル（ウイルス量）、ＣＤ４＋ Ｔ細胞数及び患者の臨床状態をモニターすることにより導かれる（アメリカ合衆国保健福祉省 成人及び青少年ＨＩＶ−１感染者における抗レトロウイルス剤使用に関する２００４年ガイドライン；オンラインで入手可能：ＡＩＤＳｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）；Ｙｅｎｉ ＰＧ，Ｈａｍｍｅｒ ＳＭ，Ｈｉｒｓｃｈ ＭＳら，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ Ａｄｕｌｔ ＨＩＶ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，２００４ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＩＤＳ Ｓｏｃｉｅｔｙ−ＵＳＡ Ｐａｎｅｌ，ＪＡＭＡ，２００４，２９２：２５１−６５）。抗レトロウイルス治療の目的は、血漿中のＨＩＶウイルスを利用可能なウイルス量検査の検出可能レベル以下に減らすことである（アメリカ合衆国保健福祉省 成人及び青少年ＨＩＶ−１感染者における抗レトロウイルス剤使用に関する２００４年ガイドライン；オンラインで入手可能：ＡＩＤＳｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）；ＡＳ，Ｅｓｓｕｎｇｅｒ Ｐ，Ｃａｏ Ｙら，Ｄｅｃａｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，３８７（６６２９）：１８８−９１）。血漿中のＨＩＶ ＲＮＡレベルは核酸増幅またはシグナル増幅テクノロジーによる従来技術の方法により定量され得る（Ｍｕｌｄｅｒ Ｊ，ＭｃＫｉｎｎｅｙ Ｎ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｃら，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ＲＮＡ ｉｎ ｐｌａｓｍａ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ａｃｕｔｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９４，３２：２９２−３００；Ｄｅｗａｒ ＲＬ，Ｈｉｇｈｂａｒｇｅｒ ＨＣ，Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ ＭＤら，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｎｃｈｅｄ ＤＮＡ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｂｕｒｄｅｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ，Ｊ Ｉｎｆ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１９９４，１７０：１１７２−９；Ｖａｎ Ｇｅｍｅｎ Ｂ，Ｋｉｅｖｉｔｓ Ｔ，Ｓｃｈｕｋｋｉｎｋ Ｒら，Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ−１ ＲＮＡ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｕｓｉｎｇ ＮＡＳＢＡ（ＴＭ） ｄｕｒｉｎｇ ＨＩＶ−１ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９３，４３：１７７−８７）。
Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８３，２２０：８６８−７１ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８４，２２４：４９７−５００ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８４，２２４：５００−３ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２３９：６１０−１６ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，１９９１，３２４：９６１−４ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，１９９１，３２４：９５４−６０ ＡＩＤＳ，１９９０，４：１０７−１２ Ｌａｎｃｅｔ，１９８９，３３４：６３７−４０ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，１９９３，３２８：３２７−３５ Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７３：１２３−６ Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７３：１１７−２２ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７２：１１６７−７０ Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ，１９９７，１２６（１２）：９４６−５４ Ｌａｎｃｅｔ，２００３，３６２：６７９−８６ Ｌａｎｃｅｔ，２００２，３６０：１１９−２９ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００３，１８８：１４２１−５ ２００４ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ａｄｕｌｔｓ ａｎｄ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ（ＡＩＤＳｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ） ＪＡＭＡ，２００４，２９２：２５１−６５ Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，３８７（６６２９）：１８８−９１ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９４，３２：２９２−３００ Ｊ Ｉｎｆ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１９９４，１７０：１１７２−９ Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９３，４３：１７７−８７
末梢血中のＨＩＶ−１レベルの定量的測定は、疾患予後及び感染患者に対する抗レトロウイルス治療の経過を調べるための必須パラメーターである。ウイルスＲＮＡ安定性が制限されているために、従来の血漿からのＨＩＶ−１ウイルス量（ＶＬ）検査はサンプル採取、取り扱い及び発送に関して限定的要件を加え、資源の乏しい環境でのＶＬ検査の更なる拡大を妨害し得る。乾燥血液スポット（ＤＢＳ）を含めた乾燥スポット（ＤＳ）はこれらの物流的及び技術的制限を回避する実行可能なオプションに相当する。ＤＢＳ以外のＤＳは例えば血漿、唾液、血清等であり得る。本発明は、新しいＨＩＶ−１ ＤＳ／ＤＢＳ ＶＬアッセイの新規且つ自明でない方法及び手順を提供する。
ＨＩＩＶ−１ ＲＮＡ及びプロウイルスＤＮＡ（宿主細胞のＤＮＡに取り込まれるウイルスゲノムまたはその一部）を定量するためのＤＢＳアッセイの開発は初期段階にある。これまで当業界で開発されたアッセイはコスト及び効率に関して幾つかの欠点を有している。例えば、現在の方法の多くは更なる核酸抽出手順のためにＤＳまたはＤＢＳ溶出物を手動で移動させなければならず、アッセイにエラー及び汚染物が入る機会が生ずる。ＤＮアーゼ処理が従来技術アッセイにおいて所望または所要されている場合、方法はしばしば追加の試薬（特定ＤＮアーゼ反応バッファー及び非活性化バッファー）、装置（加熱デバイス）、時間（ＤＮアーゼ手順ステップを完了させるために）及び追加の手動操作の使用を含む。
本発明の方法は従来技術のこれらの欠点を減らし、排除する。本発明のＤＳ／ＤＢＳ ＨＩＶ−１ ＶＬアッセイは新規のワークフロー及び革新的な溶出／反応バッファー系を使用する。従来技術に比べたこれらの改善により、従来技術に比して高い精度及び効率でほぼ完全に自動化され得るアッセイが得られる。更に、従来技術に比べたこれらの改善により、ＤＮアーゼを利用する従来技術方法に固有の加算時間及び不便さなしにＤＮアーゼを使用することができる。
本発明は、血液サンプル中のＨＩＶ−１核酸を検出するための自動化方法を意図し、この方法は、ａ）ｉ）固体担体上で乾燥させた、ＨＩＶに感染していると疑われる血液サンプル、ｉｉ）溶出バッファー、ｉｉｉ）自動化プログラマブルサンプル調製装置、ｉｖ）自動化プログラマブルＰＣＲ装置、ｖ）ＤＮアーゼ、及びｖｉ）ＨＩＶ−１核酸を検出するのに適したＰＣＲ試薬を用意するステップ；ｂ）溶出バッファーを用いて、固体担体から血液サンプルを溶出バッファーを用いて溶出させて、溶出サンプルを作成するステップ；ｃ）更なる核酸抽出及び精製のために、溶出サンプルを自動化プログラマブルサンプル調製装置に装入して、処理サンプルを作成するステップ；ｄ）自動化プログラマブルＰＣＲ装置にＰＣＲ試薬を装入するステップ；ｅ）自動化プログラムを開始して、ＰＣＲ試薬を処理サンプルにアリコートするステップ；ｆ）自動化プログラマブルＰＣＲ装置を用いて、処理サンプル中の抽出核酸に対してＰＣＲを実施するステップ；ｇ）自動化プログラマブルＰＣＲ装置より得たＰＣＲ結果を分析して、サンプルがＨＩＶ−１核酸を含んでいるかを決定するステップを含み；ｈ）溶出バッファーはおよそｐＨ６．０でおよそ３．５Ｍ ＧＩＴＣ、およそ５％ Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）２０（ポリソルベート２０の商標；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートとも称される）、およそ５０ｍＭ ＫＯＡｃ（酢酸カリウム）を含み；ｉ）場合により、処理サンプルにＰＣＲ試薬を添加した後に処理サンプル、ＰＣＲ試薬、または完全ＰＣＲ反応物の１つ以上に、ＤＮアーゼを添加する。
本発明は更に、方法が追加的にネガティブ及びポジティブコントロールを含むことを意図する。
本発明は更に、ステップｂ）がゆっくり断続的に混合しながら室温で約２０分間、またはゆっくり断続的に混合しながら５５℃で３０分間であることを意図する。
本発明は更に、自動化方法がソフトウェアコマンドによりプログラムされることを意図する。
本発明は更に、ステップｉ）が実施され、ＤＮアーゼが特定ＤＮアーゼ反応バッファーを必要とせず、周囲温度またはＰＣＲサイクリング段階で使用される温度で有効であり、３０分以内にＤＮＡを効果的に分解し、ＤＮＡを効果的に分解した後に不活化する必要がなく、ＲＮＡ配列の検出に悪影響を及ぼさないことを意図する。
本発明は更に、固体担体が濾紙であることを意図する。
本発明は更に、核酸がＲＮＡであることを意図する。
本発明は更に、核酸がプロウイルスＤＮＡであることを意図する。
ＤＮＡを効果的に除去し、ＲＮＡシグナルに悪影響を与えなかったＤＮアーゼ（Ａｍｂｉｏｎ ＤＮアーゼ１（ＲＮアーゼフリー）（カタログ番号ＡＭ２２２２）、または均等物）を示す。ＰＣＲ反応を実施する前に抽出核酸を直接処理するためにＤＮアーゼを使用した。 ＤＮＡを効果的に除去せず、ＲＮＡシグナルに悪影響を与えなかったＤＮアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓＤＮアーゼＩ（ＲＮアーゼフリー）（カタログ番号ＭＯ３０３Ｓ）、または均等物）がを示す。ＰＣＲ反応を実施する前に抽出核酸を直接処理するためにＤＮアーゼを使用した。 ＤＮＡを効果的に除去し、ＲＮＡシグナルに悪影響を与えたＤＮアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＤＮアーゼ１（増幅グレード）（カタログ番号ＡＭＰＤ１）、または均等物）を示す。ＰＣＲ反応を実施する前に抽出核酸を直接処理するためにＤＮアーゼを使用した。 ＤＮＡを効果的に除去し、ＲＮＡシグナルに悪影響を与えなかったＤＮアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＲＱ１ ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼ（カタログ番号Ｍ６１０１）、または均等物）を示す。ＰＣＲ反応を実施する前に抽出核酸を直接処理するためにＤＮアーゼを使用した。 １０００コピー／ｍＬのＨＩＶ−１で、５５℃で３０分間対室温で２０分間のＤＢＳ溶出条件を比較する。１条件あたり７１個のレプリケートを使用した。５５℃で３０分間でのサイクル閾値（Ｃｔ）は室温で２０分間でのＣｔよりも早い。５５℃で３０分間での最大比（ＭＲ；シグナル強度の測定）は室温で２０分間でのＭＲよりも高い。 ５２から６５℃の範囲の温度で２５から４５分間のＤＢＳ溶出を示す。Ｃｔ値は諸条件にわたって匹敵していたが、最高のＭＲ値の条件は５５℃で３０分間であった。 ５５℃で１０、２０及び３０分間のＤＢＳ溶出を示す。各時点での差は有意でなかったが、溶出時間を延長すると、Ｃｔを改善し、ＭＲを向上させる傾向を示した。５５℃で３０分間インキュベートした後、更に室温で最長２４時間インキュベートしてもＰＣＲ結果は変わらなかった。
現在まで、血漿サンプルの検査は抗レトロウイルス治療（ＡＲＴ）時のＨＩＶ感染個人のウイルス量（ＶＬ）を評価するためのゴールドスタンダードである。資源の乏しい環境では、乾燥血液スポット（ＤＢＳ）の使用はＶＬ検査及び遺伝子型決定の両方のための有望な代替サンプルタイプである。ＤＢＳを自動化サンプル処理及びリアルタイムＰＣＲベースのシステムと組み合わせると、セントラルラボラトリーズでＶＬ測定または遺伝子型決定試験を行うことができる。
ＨＩＶウイルス量アッセイをＤＢＳに適応させるために、最も重要な技術的課題はアッセイ感度及び特異性である。ＤＢＳウイルス量アッセイの臨床的感度及び特異性は、抗レトロウイルス治療についての世界保健機構（ＷＨＯ）２０１３ガイドラインにおいて１０００コピー／ｍＬの閾値を用いることにより規定されている。ＡＲＴ開始から１２ヶ月以上後に血漿ＶＬが＜１０００コピー／ｍＬの患者の割合は後天性薬剤耐性調査の一部として調べられる主要結果である。ＶＬがこのレベル以下の患者は薬物治療がうまくいくと分類される（Ｐａｒｋｉｎ，２０１４ ＡＩＤＳ Ｒｅｖ．）。
アッセイ特異性は細胞フリーＲＮＡ対細胞結合型ＤＮＡまたはＲＮＡの単離／増幅に関連している。アッセイが細胞フリーＲＮＡ及び細胞結合型ＤＮＡまたはＲＮＡの両方を捕らえるならば、細胞ＤＮＡは乾燥血液スポット中の非血漿ウイルス由来核酸の主要ソースであるので低血漿ＶＬ濃度で有意な過定量化が観察されるであろう（Ｐａｒｋｉｎ，２０１４ ＡＩＤＳ Ｒｅｖ．）。ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１ ｍ２０００システムはＲＮＡに対して特異的または少なくとも選択的な試薬及び方法を取り入れている（Ｐａｒｋｉｎ，２０１４ ＡＩＤＳ Ｒｅｖ．）。リポートは、ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１アッセイを用いて血漿及びＤＢＳサンプル中のウイルス量間の許容できる相関関係をも主張している（Ｍａｒｃｏｎｉ、Ａ．ら，２００９ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ；Ａｒｒｅｄｏｎｄｏら，２０１２，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏ）。
アッセイ感度は通常アッセイ検出限界（ＬＯＤ）で表される。ＤＢＳ感度の主要な問題は、容量限定がインプットコピー数を制限していることである（Ｎｅｌｌ Ｔ．Ｐａｒｋｉｎ，２０１４により再検討）。切り出しを必要としない１つの有孔７０μｌ ＤＢＳスポットの使用を含むＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１ ＤＢＳアッセイの改訂版（ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１ ＤＢＳアッセイオープンモード）が開発された。加えて、チューブ間のサンプル移動を必要としない。ＤＢＳを１３００μｌのバッファー中に溶出させ、１０００μｌが処理用インプットとして使用される。従って、抽出のために移動させる全血の実際量はおよそ５３．８μｌである。現在の室温溶出条件（初期ＤＢＳオープンモードプロトコル中に概説されている）を用いた実験的に決定した（血漿と比較した）ＤＢＳ溶出回収率は（血漿と比較して）２４％から４３％の範囲であり、平均３５％であり、これから１０８０コピー／ｍＬから１９３４コピー／ｍＬの算出ＬＯＤ範囲が導かれる（これらの実験では、全血及び血漿の両方に同一濃度のＨＩＶをスパイクした；へマトクリット効果は含まれなかった）。成功するＡＲＴ治療を決定するためのＷＨＯ提案閾値は≦１０００コピー／ｍＬのＶＬであるので（ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ＨＩＶ Ｖｉｒａｌ Ｌｏａｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ，Ｊｕｌｙ ２０１４）、ＨＩＶ ＤＢＳ ＶＬアッセイは≦１０００コピー／ｍＬの検出限界（ＬＯＤ）を有していなければならない。この感度を１つの７０μＬ ＤＢＳを用いて達成するためには、ＬＯＤを１０００ｃｐ／ｍＬ未満に低下させるためにＤＢＳ溶出効率を１０％以上向上させなければならない。
本発明のＤＳ／ＤＢＳ ＨＩＶ−１ ＶＬアッセイは、本発明の核酸抽出及び増幅パラメーターに対してプログラムされ得る自動化デバイスを用いて実施するように設計されている。Ａｂｂｏｔｔリアルタイムｍ２０００ｓｐ及びｍ２０００ｒｔ装置（デバイス；Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，イリノイ州アボットパーク）は本発明のＤＢＳ ＨＩＶ−１ ＶＬアッセイのための適当な自動化プログラマブルデバイスの例である。Ａｂｂｏｔｔリアルタイムｍ２０００ｓｐ及びｍ２０００ｒｔ装置（及び、他の業者から市販されている適当な装置）の操作説明書／パラメーターは当業者に公知であり、参照により本明細書に組み入れる。本発明はこのデバイスの使用に限定されず、他の類似のデバイスが本発明時に当業者に公知であった。本発明のＨＩＶ−１アッセイは、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）テクノロジーと相同リアルタイム蛍光検出を使用する。部分二重鎖蛍光プローブ設計により、グループＭ、Ｏ及びＮを含めた種々のＨＩＶ−１変異体を検出することができる。アッセイは、ＡＩＤＳ臨床トライアルグループのウイルス学品質保証（ＶＱＡ）ラボラトリーからのウイルス標準または他の標準に対して（Ｙｅｎ−Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ Ｂ，Ｂｒａｍｂｉｌｌａ Ｄ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｂら，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｑｕａｌｉｔｙ ａｓｓｕｒａｎｃｅ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ＲＮＡ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｂｙ ｔｈｅ ＡＩＤＳ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｇｒｏｕｐ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９６，３４：２６９５−７０１）、及びＨＩＶ−１ ＲＮＡに対する世界健康機構（ＷＨＯ）国際標準（ＮＩＢＳＣ；Ｈｏｌｍｅｓ Ｈ，Ｄａｖｉｓ Ｃ，Ｈｅａｔｈ Ａら，Ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ １ｓｔ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ ＨＩＶ−１ ＲＮＡ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，９２：１４１−５０；Ｄａｖｉｓ Ｃ，Ｈｅａｔｈ Ａ，Ｂｅｓｔ Ｓら，Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｗｏｒｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ １ｓｔ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ ＨＩＶ−１ ＲＮＡ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈ，２００３，１０７：３７−４４）に対して標準化され得る。アッセイ結果はコピー／ｍＬ、Ｌｏｇコピー／ｍＬ、国際単位／ｍＬ（ＩＵ／ｍＬ）、またはＬｏｇ ＩＵ／ｍＬで報告され得る。
ＨＩＶ−グローバルＨＩＶ Ｗｅｂ研究（ｄｅｐｔｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｇｈｉｖａｉｄｓ／ｒｅｓｌｉｍｉｔｅｄ／ｃａｓｅ７／ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ．ｈｔｍｌ）のＷＨＯ早期乳児診断に示されているように、乾燥血液スポット検査は分析用サンプルを採取するための許容され得る手段であり、液体サンプルよりも少ないバイオハザードリスクしか与えない。更に、査読論文は、感度及び信頼性に関してＤＢＳサンプルの使用は血漿サンプルと比較したとき実行可能であることを示した（Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１１，５０（３）：５６９−５７２）。
Ａｂｂｏｔｔサンプル調製システム（ｍ２０００ｓｐ）及びＡｂｂｏｔｔリアルタイムＰＣＲアナライザー（ｍ２０００ｒｔ）のような自動化サンプル調製及び分析システムの効率、有効性及び精度は査読雑誌論文（Ｍａｒｃｏｎｉら，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｂｂｏｔｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＨＩＶ−１ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ ｄｒｉｅｄ ｂｌｏｏｄ ｓｐｏｔ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ，２００９，１５：９３−９７）で確認されている。更に、ＤＢＳ採取に関する各種論文の比較が公表されている（Ｒｏｔｔｉｎｇｈａｕｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１２，５１（１）：５５−６０）。
多くの研究が調査されているが、高い有用性及び高い感度を与えるためにはＤＢＳの自動化調製及びアッセイシステムでの使用、ワークフロー及び試薬化学の改善がなお必要である。本発明は自動化システムを用いて従来技術のＤＢＳ ＨＩＶ−１ ＶＬアッセイ方法に比して改善された効率、ワークフロー及び性能を与える。
ＤＢＳサンプル採取の利点
液体血液サンプルと比べたＤＢＳ採取の利点は多数である。ＤＢＳの採取は容易である。指またはかかとを刺すだけですみ、静脈穿刺の必要が回避される。瀉血のスキルが不要である。採取装置は最小である。サンプルカードは通常十分なサンプルの大きさを確保するためのスポットサイズ（直径）の表示を有している。通常約７０μｌのサンプル容量で十分である。サンプルを周囲温度で風乾する。ＤＢＳを保存のために冷凍する必要がない。ＤＢＳは密閉容器（例えば、タッパウェア（Ｒ）または密閉エンベロープ）を用いて保存または移送し得る。サンプルは簡単に移送され、周囲条件下で長期間（数週間から数ヶ月）安定である。よって、サンプルを外部の場所で採取し、集中検査施設に移送することができる。ＤＳ／ＤＢＳサンプルは低いバイオハザードしか与えないために、適切に包装されているサンプルは検査施設に郵送され得る（乾燥血液スポット標本の発送ガイドライン，ＣＤＣ，ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｌａｂｓｔａｎｄａｒｄｓ／ｐｄｆ／ｎｓｑａｐ／Ｂｌｏｏｄｓｐｏｔ＿Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎ＿Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．ｐｄｆ及びその中に含まれている文献；Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ． Ｂｌｏｏｄ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ｆｏｒ ｎｅｗｂｏｒｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍｓ；Ａｐｐｒｏｖｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ−Ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．ＣＬＳＩ ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＬＡ４−Ａ６．Ｗａｙｎｅ、ＰＡ： Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；２０１２）。検査施設において一度、サンプルは所望により自動化システムまたは手動手順を用いて抽出され得る。
定義
以下の定義は本明細書に該当する。
用語「約」または「およそ」は、特に明記しない限り、指定されている値から±１０％の変動を指す。具体的言及がなされていてもいなくても、その変動は常に本明細書中に記載されている所与の値に含まれると理解されるべきである。更に、具体的値が実際に記載されていてもいなくても、記載されている範囲はすべてその範囲内のすべての値を含む。よって、１〜１０の範囲は例えば２、３．６、９．０１５等の値を含む。
用語「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」は、ＤＮＡ配列のコピーの作成方法を指す。方法は熱サイクリング（すなわち、それぞれＤＮＡの変性（または溶融）及び複製のために加熱及び冷却のサイクル）を用いる。コピーしようとするＤＮＡ配列に対して相補的な配列を含む短ＤＮＡ断片であるプライマー、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼと称されるテルムス・アクウァティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のポリメラーゼがＤＮＡ配列を選択し、該配列をコピーするために使用される（例えば、それに関する教示のために、すべて参照により本明細書に組み入れられる米国特許Ｎｏｓ．４，６８３，１９５、４，８００，１９５及び４，９６５，１８８を参照されたい）。反復サイクリングで、作成したコピーを更なるコピーを作成するための鋳型として使用する（すなわち、連鎖反応）。ＰＣＲ技術には、標準ＰＣＲ、アレル特異的ＰＣＲ、アセンブリＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、内部配列特異的ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、ライゲーション媒介ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、ミニプライマーＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、オーバーラップエクステンションＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、固相ＰＣＲ、熱非対称インターレースＰＣＲ及びタッチダウンＰＣＲが含まれるが、これらに限定されない。
用語「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）」は、ＲＮＡからの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）転写物の作成により遺伝子発現を質的に検出する方法を指す。
用語「リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応」、「リアルタイムＰＣＲ」及び「定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）」は、蛍光プローブを用いてＤＮＡの増幅を定量的に調べる方法を指す。
本明細書中で使用されている用語「プライマー」は、鋳型依存性核酸合成を開始するオリゴヌクレオチドを指す。温度及びｐＨの適当な条件下で核酸鋳型、ヌクレオシドトリホスフェート前駆体、ポリメラーゼ及び補因子を存在させると、プライマーはポリメラーゼによるヌクレオチドの付加によりその３’末端で延長して、プライマー延長産物を生じ得る。プライマーの長さは使用する具体的条件及び増幅の目的に応じて異なり得る。例えば、診断目的のための増幅用プライマーは典型的には約１５から約３５ヌクレオチドの長さを有する。プライマーは、所望の延長産物の合成をプライムするために所望の鋳型に対して十分に相補的でなければならない。換言すると、プライマーは、ポリメラーゼによる合成開始の際に使用するためにプライマーの３’−ヒドロキシル部分を適切に並置させるのに十分な方法で所望鋳型鎖でアニールできなければならない。プライマーが所望鋳型の正確な相補体である必要はない。例えば、非相補性ヌクレオチド配列を相補性プライマーの５’末端に存在させ得る。或いは、プライマー配列が延長産物の合成のための鋳型−プライマー複合体を与えるために所望の鋳型鎖の配列と十分な相補性を有しているならば、非相補性塩基をオリゴヌクレオチドプライマー内に散在させ得る。
ＰＣＲ
標的配列を当業界で公知の技術を用いて増幅する。最適な技術はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ＰＣＲ増幅は標準のＰＣＲ技術により製造業者の説明書に従って実施され得る。Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００システムは使用者からのインプットに基づいてサンプル調製及びＰＣＲ反応を自動化するデバイスを含む。
増幅反応は、インターナルコントロール（ＩＣ）核酸を増幅するためにＩＣ核酸及びプライマー対を含み得、好ましくは含む。増幅反応がＩＣ核酸を含む場合、増幅を促進させる条件はＩＣ核酸の増幅も促進させる。適当な配列をＩＣとして使用し得る。ＩＣ標的配列の例には、以下の実験欄で使用されているものが含まれる。
本発明では組織または体液の適当なサンプルを核酸、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡのサンプル源として使用し得るが、そのサンプルをＤＢＳから溶出させる。所要または所望により、プロテイナーゼＫのようなプロテイナーゼをサンプルに添加して＜望ましくないタンパク質を消化させてもよい。
アッセイ用のサンプルは当業界で公知の適当な方法を用いて作成され得る。望ましくは、方法は核酸を抽出し、濃縮する。方法により、標的配列は増幅に利用でき、抽出物から潜在する増幅阻害剤を除去することが望ましい。本発明では、核酸を本発明の溶出バッファーを用いてＤＢＳから溶出させる。
サンプルが溶出されたら、ＲＮＡを単離し、逆転写し得、生じたｃＤＮＡを増幅させ得る（例えば、米国特許Ｎｏｓ．５，３１０，６５２、５，３２２，７７０、５，５６１，０５８、５，６４１，８６４及び５，６９３，５１７に記載されている逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））。更に、ＤＮＡを逆転写酵素なしで直接増幅してもよい。プロウイルスＤＮＡはこのように増幅され得る。
標的配列がサンプル中に存在しているならば、標的核酸をプライマーと接触させると、標的配列の特異的増幅が生じ得る。「特異的増幅」は、プライマーが特定標的配列を増幅し、他の配列を増幅させないことを意味する。例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｅｒｌｉｃｈ編，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２））；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９９４−１９９９，最長２００４年４月までの追加アップデートを含む）；及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，第３版，２００１）、並びに国際特許出願公開ＷＯ ９３／２２４５６及び米国特許Ｎｏｓ．４，８５１，３３１、５，１３７，８０６、５，５９５，８９０及び５，６３９，６１１に記載されている方法を参照されたい。これらはいずれも特異的増幅に関する教示のために参照により本明細書に特に組み入れられる。
プライマーは、例えば分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段により検出され得る標識で検出可能に標識され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい）。有用な標識には、蛍光染料のような染料、３２Ｐのような放射活性標識、高電子密度試薬、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素、ビオチン、またはその抗血清またはモノクローナル抗体が使用可能なハプテン及びタンパク質が含まれる。本発明では、蛍光染料が好ましい。この点で、検出可能なオリゴヌクレオチドを例えばフルオレセインで標識し得る。プライマーを染料で標識し、検出可能なオリゴヌクレオチドをフルオレセインで標識し、染料と反対側の新生鎖に結合するように設計すると、ＤＮＡらせんを横断して蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じ得る。他の検出可能なオリゴヌクレオチドには、モレキュラープローブ、ＴＡＱＭＡＮ（Ｒ）プローブ、一本鎖ＤＮＡプローブ、二本鎖ＤＮＡプローブ等が含まれる。
核酸増幅試薬（ＰＣＲ試薬）には、ポリメラーゼ活性を有する酵素（例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ｒ））、１つ以上の酵素補因子（例えば、ＭｇＣｌ２）、及びデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ類；例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＵＴＰ、またはｄＴＴＰ）が含まれる。
増幅を促進させる条件はプライマーのアニーリング及び核酸配列の延長を促進させるものである。アニーリングは各種パラメーター、例えば温度、イオン強度、増幅させる配列の長さ、相補性、及び増幅させる配列のＧ：Ｃ含量に依存する。例えば、温度を低下させると、相補性核酸配列のアニーリングが促進される。高いＧ：Ｃ含量及び長さがより長いと、二重鎖の形成が安定化する。通常、約３０ｂｐ以下及び高いＧ：Ｃ含量を有するプライマー及び検出可能なオリゴヌクレオチドがうまく働く。好ましい増幅条件、プライマー及び検出可能なオリゴヌクレオチドは本明細書中に例示されている。
増幅は、反応混合物を熱サイクリングすることにより約１０から約１００回の適当な回数、例えば約２０から約７５回、例えば約２５から約５０回繰り返され得る。
増幅反応が完了したら、増幅産物の存在を適当な方法を用いて検出し得る。その方法には、非限定的に当業界で公知の方法、例えば蛍光染料を用いるまたは用いないゲル電気泳動（産物を染料標識プライマーを用いて増幅したか否かに応じて）、インターカレート染料を用いる融解曲線（例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｒｌｉｃｈ編，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２，第７章を参照されたい）、及び内部検出可能なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが含まれる。方法の他の例には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、電気化学発光、逆ドットブロット、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、Ｌａｚａｒ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，４：Ｓ１−Ｓ１４（１９９４）を参照されたい）が含まれ、一本鎖ＰＣＲ産物の一本鎖高次構造多型分析（例えば、Ｏｒｉｔａら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８６：２７６６−２７７０（１９８９）を参照されたい）も使用し得る。本発明では、蛍光標識を自動化ＰＣＲ反応デバイスを用いて自動的に検出し得る。
増幅した核酸は反応混合物中の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の全量の増加をモニターすることにより検出され得る（例えば、米国特許Ｎｏ．５，９９４，０５６、及び欧州特許出願公開Ｎｏｓ．４８７，２１８及び５１２，３３４を参照されたい）。ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎのようなＤＮＡ結合染料を使用する。ｄｓＤＮＡに結合すると染料は蛍光を発し、蛍光の増加を使用してｄｓＤＮＡの増加を調べる。
或いは、好ましくは、リアルタイムＰＣＲアッセイでは増幅及び検出を組合せ得る。リアルタイムＰＣＲを使用する場合、混合物は更に核酸検出試薬を含み得る。その例には、二本鎖ＤＮＡとインターカレートする非特異的蛍光染料、または検出可能なオリゴヌクレオチドがその相補的ＤＮＡ標的とハイブリダイズして、増幅及び検出を同時可能とした後でのみ検出し得る配列特異的ＤＮＡ検出可能オリゴヌクレオチドが含まれる。検出可能なオリゴヌクレオチドが増幅中に混合物中に存在している場合、検出可能なオリゴヌクレオチドは増幅を促進し、増幅を干渉してはならず、増幅条件下でその標的配列に結合しなければならず、その標的配列に結合したときのみシグナルを発生する条件下で安定でなければならない。この点で特に適している検出可能なオリゴヌクレオチドの例には、分子ビーコン検出可能なオリゴヌクレオチド、ＴＡＱＭＡＮ（Ｒ）検出可能なオリゴヌクレオチド、及び線状検出可能なオリゴヌクレオチド、例えばＡｂｒａｖａｙａら（米国特許出願公開Ｎｏ．２００５／０２２７２５７）が記載されているものが含まれる。検出可能なオリゴヌクレオチドは分子ビーコンと一緒にループ及びステム配列を形成し得る。一端に蛍光体（例えば、ＦＡＭ）、他端に高性能クエンチャー、例えばブラック・ホール・クエンチャー（ＢＨＱ（Ｒ）；ＢｉｏＳｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州ノバート）を有する検出可能なオリゴヌクレオチドも線状検出可能なオリゴヌクレオチドとして使用し得る。
使用されている用語及び表現は明細書の用語として、非限定的に使用されている。この点で、ある用語が本明細書中に規定、記載または検討されている場合、これらの規定、記載及び検討は前記用語に割り当てられると意図される。示されており、記載されている要件の均等物またはその一部を除外する用語および表現の使用も意図していない。
各種修飾が特許請求されている発明の範囲内で可能であると認識されている。よって、本発明を好ましい実施形態及び任意の特徴の文脈で具体的に開示してきたが、当業者は本明細書中に開示されている概念の修飾及び改変を用い得ると理解すべきである。このような修飾及び改変は添付されている特許請求の範囲に規定されている本発明の範囲内であると見なされる。
本明細書中に挙げられているすべての特許明細書、特許出願公開明細書、雑誌論文、教科書及び他の刊行物は本開示内容が関わる当業界の技術レベルを示している。これらの刊行物はすべて、各刊行物が具体的に、個別に参照により組み入れられると記載されているのと同程度に参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書中に例示的に記載した本発明は本明細書中に具体的に開示されていない要素または限定なしに適当に実施され得る。よって、例えば、本明細書中の用語「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「本質的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の各例は他の２つの用語のいずれかと置き換えられ得る。また、単数形“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、文脈上明白な指示がない限り複数の言及を含む。よって、例えば、「方法」の言及は、本明細書中に記載されている及び／または開示内容を読むと当業者に自明となる１つ以上のタイプの方法及びステップを含む。
実施例１
本発明は好ましくは自動化プログラマブルＰＣＲデバイスを用いて実施され、これらのデバイスの幾つかは当業者に公知であり、本発明の発明概念から逸脱せずに特定システムで使用するために必要であり得る手順の変化を加えて本発明で使用するのに適している。他の場合には、本発明は手動で実施され得る。しかしながら、本発明を手動で実行すると、時間への投資が高まり、操作者のエラーのために精度が低下する可能性が生ずる。
本実施例は、ｍ２０００ｓｐ（サンプル調製）及びｍ２０００ｒｔ（リアルタイム核酸増幅）装置を含むＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００システム、及びＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１試薬を使用する。
Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００装置（または、類似物）及びＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１試薬（または、類似物）と一緒に使用するための乾燥血液スポット標本のＨＩＶ−１ウイルス量検査
下記されている方法は乾燥血液スポット（ＤＢＳ）標本のＨＩＶ−１ウイルス量検査に適用される。下記されているこの方法はＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ及びｍ２０００ｒｔ装置をＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１試薬と一緒に使用する。他のシステム及びデバイスは当業界で市販されており、当業者は本明細書の発明概念を逸脱することなく、本明細書の教示に基づいて他の市販されているシステム及びデバイスで使用するために以下に開示されている方法を修飾することができる。
装置手順
アッセイを実施する前に、ＨＩＶ−１ ＤＢＳウイルス量検査のためのアプリケーションファイル（すなわち、ソフトウェア）をＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ及びＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔシステムにインストールしなければならない。
標本採取及び取り扱い説明書
ＤＢＳを以下のステップに従ってＭｕｎｋｔｅｌｌ ＴＦＮ（スウェーデン）ペーパーカード（または、当業者に公知の均等なペーパーカード）上に作成し得る：
・全血をＭｕｎｋｔｅｌｌ ＴＦＮペーパーカード（または、均等物）上の０．５インチ（１２ｍｍ）の円にスポットして、全円をカバーすることを確実にする。完全適用範囲を確実にするために各円につき少なくとも７０μｌの血液（約３から５滴；圧搾したり、指で絞ったりしない）を使用することが推奨される。全血を採血チューブ中に採取したならば、新たに採血した血液を２〜８℃（冷蔵温度）から１５〜３０℃（周囲温度）でスポットする前に最長２４時間保持し得る。加えて、血液をピペットを用いてスポットする前に混合しなければならない。
・カードを周囲温度が風乾させる。
・移送または保存のために、各カードを乾燥剤パックを入れたバッグまたは他の密閉容器に詰める。カードは周囲温度で最長１２週間保存し得る。或いは、カードは２〜８℃、または−１０℃またはそれより低い温度で最長２４週間保存可能である。
・所要または所望により、標本を上に挙げた推奨される保存温度及び時間に従って発送する。国内及び海外発送の場合、標本は臨床、診断または生物学的標本の移送に該当する適用可能な州、連邦及び国際規制に従って包装し、ラベルを貼らなければならならい。
アッセイプロトコル
１．この典型的なプロトコルはＡｂｂｏｔｔリアルタイムシステムを使用した。当業者は過度の実験をしなくてもこのプロトコルを他の類似のデバイス及びシステムに適応させることができる。各ランで全部で９６個のサンプルを処理することができる。各ランにネガティブコントロール、低ポジティブコントロール及び高ポジティブコントロールを含め、従ってキャリブレーターを含んでいないときには１ランあたり最大９３個のＤＢＳ標本を処理することができる。これらのステップは直接液体サンプルとして処理されなければならないＡｂｂｏｔｔコントロール及びキャリブレーターに適用しない。ＤＢＳ標本をこれらのステップに従って処理する：
・１．３ｍｌのＤＳ／ＤＢＳ溶出バッファー（溶出バッファーはおよそｐＨ６．０で、およそ３．Ｍ ＧＩＴＣ（グアニジニウムチオシアネート）、およそ５％ Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）２０、およそ５０ｍＭ ＫＯＡｃ（酢酸カリウム）を含む）を用いてＡｂｂｏｔｔ移送チューブを作成する。Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）はニュージャージ州ブリッジウォーターのＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．の登録商標である。Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）２０はポリソルベート２０の商品名である。ポリソルベート２０の他のブランドも本発明の方法で機能する。［ＧＩＴＣは１．０〜５．５Ｍ、２．０〜４．５Ｍ、３．０〜４．０Ｍ及び約３．５Ｍで使用され得る；Ｔｗｅｅｎ ２０は０〜２０％、２％〜８％、４％〜６％及び約５％で使用され得る；酢酸カリウムは１０〜５００ｍＭ、２０ｍＭ〜３００ｍＭ、３０ｍＭ〜２００ｍＭ、４０ｍＭ〜１００ｍＭ及び約５０ｍＭで使用され得る；ｐＨは５〜１０、５．２〜８、５．６〜７、５．８〜６．５及び約６．５であり得る。］
・Ｍｕｎｋｔｅｌｌ ＴＦＮペーパーカード（または、均等物）から各標本あたり１つの全ＤＢＳを分離する。各ＤＢＳの直径はおよそ１／２インチ（１２ｍｍ）でなければならない。注：妥当な場合、切断表面がＤＢＳ標本と直接接触するのを避けなけれはならない。所要により標本間のＤＢＳを切断するために使用する装置を優良試験所基準に従って清潔にする。ＤＳ／ＤＢＳ溶出バッファーを収容しているＡｂｂｏｔｔ移送チューブにＤＢＳを入れる。ＤＢＳがＤＳ／ＤＢＳ溶出バッファー中に完全に没していることを確かめる。注：このＤＢＳ移動ステップ中、有孔Ｍｕｎｋｔｅｌｌ ＴＦＮペーパーカードをＡｂｂｏｔｔ移送チューブの上に置き、ＤＢＳをカードから清潔なピペットチップを用いてチューブに直接押出してもよい。
・サンプルをＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ装置または他のロボットシステムに装入する（ステップ７）前に、断続的にゆっくり混合しながら室温で約２０分間インキュベートするか、または５５℃で３０分間インキュベートする。
２．適切なアッセイコントロール及びインターナルコントロール（ＩＣ）を１５から３０℃、または２から８℃（及びその間）で解凍する。キャリブレーションランを実施する場合のみ、キャリブレーターを１５から３０℃、または２から８℃（及びその間）で解凍する。
・一旦解凍したら、アッセイコントロール、ＩＣ及びキャリブレーターは使用前２から８℃で最長２４時間保存し得る。
・使用前、各アッセイキャリブレーター及び各コントロールを２から３秒間３回ボルテックスする（すなわち、ボルテックスミキサーまたは均等物を用いて非常に激しく混合する）。ボルテックス後、液体がバイアルの底部に届くようにバイアルをベンチ上でタップすることにより各バイアルの内容物が底部にあることを確かめる。泡またはフォームが発生してないことを確かめる。泡が存在しているならば、バイアル毎に新しいチップを用いて泡を滅菌ピペットチップで除去する。
・インターナルコントロール（ＩＣ）を当業界で公知のように製造業者の説明書に従って作成する。
３．増幅試薬を１５から３０℃または２から８℃（及びその間）で解凍し、増幅マスターミックス手順のために必要となるまで２から８℃で保存する。
・一旦解凍したら、すぐに使用しない場合には増幅試薬は２から８℃で最長２４時間保存し得る。
・当業界で公知のように、増幅試薬（ＰＣＲ試薬）を製造業者の説明書に従って作成する。
・低及び高ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、妥当な場合にはキャリブレーター、及びＤＢＳ標本をＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐサンプルラック上のＡｂｂｏｔｔ移送チューブ中に入れる。注：Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐサンプルラックがこのＨＩＶ−１ ＤＢＳウイルス量手順のために特に較正されていることを確認する。
・飛び散るのを避けるためにサンプルラックを注意深く装入する。使用する場合、チューブラベル上のバーコードをスキャンニングのために右に向けなければならない。チューブの底がラックの内底に達するように各チューブがサンプルラック中にしっかり置かれていることを確認する。
・装入したサンプルラックをＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ上に連続サンプルラック位置に、第１ラックは作業台の右に対して最も遠い位置に、追加のラックは第１ラックの左に漸次載せる。
５．５ｍｌ反応容器をＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ １ｍｌサブシステムキャリアに置く。
６．Ａｂｂｏｔｔ ｍサンプル調製システム試薬及びＡｂｂｏｔｔ ９６深ウェルプレートをＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ作業台に装入する。
７．プロトコルスクリーンからＨＩＶ−１ ＤＢＳウイルス量アプリケーションファイルを選択する。サンプル抽出プロトコルを開始する。
・キャリブレーター（検量線がＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔに蓄積されていないならば、必要である）及びコントロールロット特性値をサンプル抽出：作業台セットアップ、キャリブレーター及びコントロールフィールドに入れる。ロット特性値は各ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１キャリブレーター及びコントロールキットカードにおいて特定されている。
・サンプル調製の終了から１時間以内にＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐマスターミックス添加プロトコル（ステップ９）を開始しなければならない。
注：増幅試薬を取り扱う前に手袋を交換する。
８．サンプル調製が終了したら、増幅試薬及びマスターミックスバイアルをＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ作業台に装入する。
９．対応するサンプル調製抽出に合う適切な深ウェルプレートを選択する。Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐマスターミックス添加プロトコルを開始する。
・サンプル抽出が終了したら、ラン内で処理したサンプル数が４８個以上のときにはＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐはＡｂｂｏｔｔ ９６ウェルオプティカルリアクションプレート中に空ウェルを自動的に充填する。４８個以下のサンプルを収容しているランに対してはプレート充填を実施しない。
１０．スイッチを入れ、増幅エリアでＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔ装置を初期化する。
１１．Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ装置がＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐオペレーションマニュアルのオペレーション説明欄に従ってサンプル及びマスターミックスの添加を終了させたら、Ａｂｂｏｔｔ ９６ウェルオプティカルリアクションプレートをシールする。
１２．Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔ装置に移動させるために、シールしたオプティカルリアクションプレートをＡｂｂｏｔｔスプラッシュフリーサポートベースに置く。
１３．Ａｂｂｏｔｔ ９６ウェルオプティカルリアクションプレートをＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔ装置に入れる。プロトコルスクリーンから、ＨＩＶ−１ ＤＢＳウイルス量アプリケーションファイルを選択する。Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔオペレーションマニュアルのオペレーション説明欄に記載されているプロトコルを開始する。
１４．オペレーターが必要とみなしたら、ＰＣＲ試薬を溶出サンプルに添加した後ＤＮアーゼを溶出サンプル、ＰＣＲ試薬及び完全ＰＣＲ反応物の１つ以上に添加し得る。ＤＮアーゼ反応試薬／バッファー及び失活試薬／バッファーは必要でない。
結果
標本またはコントロール中のウイルスＨＩＶ−１ ＲＮＡの濃度を蓄積検量線から計算する。Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔ装置は自動的にＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔワークステーションに結果を報告する。アッセイ結果はコピー／ｍｌ、ｌｏｇ［コピー／ｍｌ］、国際単位（ＩＵ）／ｍＬ、またはｌｏｇ［ＩＵ／ｍＬ］で報告され得る。結果を解釈するために、以下の表１を参照されたい。
Figure 2017519516
実施例２
本実施例は、本発明の自動化ＤＢＳアッセイ方法を従来方法と比較して改善された効率及び感度で実施し得る設計要件を示す。
方法は以下のステップを含む：
１．ＤＢＳをＤＢＳカードから分離する。
２．ＤＢＳを処理バッファー中でインキュベートする。
３．バッファー中にＤＢＳを含有している反応容器を自動化ロボットシステム（例えば、Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ）に装入する。
４．チューブを直接取り扱うことにより核酸抽出プロセスを介してＤＢＳサンプルを処理すべくロボットシステムをスクリプトにより運転する。この場合ＤＢＳは手動介入することなくインキュベートした。
５．核酸抽出後、ロボットシステムはＰＣＲマスターミックス（すなわち、標的核酸なしの完全ＰＣＲ反応物）を形成する。或いは、ＰＣＲマスターミックスを事前に形成し、システムに装入するならば、このステップを回避してもよい。
６．ロボットシステムは、ステップ４の終わりに得られた抽出核酸をステップ５の終わりに得たＰＣＲマスターミックスと組み合わせることにより完全ＰＣＲ反応物を形成する。
７．ＰＣＲサイクリング及びデーター整理／結果報告を分析装置（例えば、Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔのようなリアルタイムＰＣＲ装置）で実施する。
８．特定用途により所望されるならば、ＤＮアーゼを添加し、ＤＮＡ含量を排除する／減少するためにステップ４から得た抽出核酸とインキュベートする。そのような場合、ＤＮアーゼ処理した核酸をステップ６から始めて更に処理する。或いは、ＰＣＲマスターミックスの形成前またはその間にＤＮアーゼをＰＣＲ試薬に添加してもよい。更に或いは、ＤＮアーゼをＰＣＲ試薬中に配合し得る。この場合、ＤＮアーゼを含有するＰＣＲマスターミックスをステップ６から始めて更に処理する。ステップ６中、ＤＮアーゼの手動分配を回避して、ＤＮアーゼをロボットシステムにより各サンプルに分配する。加えて、ステップ６の後、ステップ７の前に、ＤＮアーゼ処理インキュベートションが必要なことがある。
注：ＤＮアーゼの使用が所望される特定用途は、プロウイルスＤＮＡからの干渉を排除する／減少させるＨＩＶ ＲＮＡ特定ＰＣＲである。
上記アッセイ方法及びアッセイ性能を可能にするテクノロジーは以下を含む：
１．ＤＳ／ＤＢＳから核酸を高効率で溶出させる処理バッファー。この開示は、ＡｂｂｏｔｔのｍＷａｓｈ １バッファー（３．５Ｍ ＧＩＴＣ；５％ Ｔｗｅｅｎ ２０；５０ｍＭ ＫＯＡｃ，ｐＨ６．０）のＤＢＳ処理／溶出バッファーとしての使用を含む。注：Ａｂｂｏｔｔは以前商業的ＨＩＶ ＤＢＳ ＶＬプロトコル、及びＡｂｂｏｔｔ ｍＬｙｓｉｓバッファーを処理バッファー（４．６６Ｍ ＧＩＴＣ；１０％ Ｔｗｅｅｎ ２０；１００ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ，ｐＨ７．８）として使用する商業的ＣＥ−ＩＶＤ ＨＩＶ定性ＤＢＳアッセイを提供していた。これら２つの方法の比較を以下に提示し、本発明の方法の予期せぬ優位性を示す。
２．ロボットピペットシステムにより、液体移動後チューブ中に≦３００ｕｌのデッドボリュームを残しながら、ロバストで正確に更に処理するために固体ＤＢ材料を収容しているチューブから直接液体を移動させることができるスクリプトパラメーター。
３．特定のＤＮアーゼ反応バッファーを含めずに抽出核酸中のＤＮＡを効果的に分解するＤＮアーゼの使用。
４．ＤＮＡを周囲温度で効果的に分解する項目３に記載されている特性を有するＤＮアーゼの使用。
５．ＤＮＡを３０分以内に効果的に分解する項目３及び４に記載されている特性を有するＤＮアーゼの使用。
６．試薬の導入または高温のいずれかで不活化する必要がない項目３〜５に記載されている特性を有するＤＮアーゼの使用。
７．ＤＮアーゼを抽出核酸への暴露前にＰＣＲ試薬に導入するか、またはＰＣＲ反応物の形成中に導入したときにＰＣＲ反応物中のＤＮＡを効果的に分解するＤＮアーゼの使用。
８．特定ＤＮアーゼ反応バッファーを含めることなく項目７に記載されている特性を有するＤＮアーゼの使用。
９．周囲温度または各種ＰＣＲサイクリング段階中の温度でＤＮＡを効果的に分解する項目７及び８に記載されている特性を有するＤＮアーゼの使用。
１０．ＤＮＡを１０分以内に効果的に分解する項目７〜９に記載されている特性を有するＤＮアーゼの使用。好ましくは、各種ＰＣＲサイクリング段階中の温度がＤＮアーゼ機能を支持している場合、ＤＮアーゼ処理はＰＣＲサイクリングに含まれる時間またはサイクリング段階以外のものを必要としない。
１１．ＰＣＲ前またはその間に試薬の導入または高温で不活化する必要がない項目７〜１０に記載されている特性を有するＤＮアーゼの使用。
１２．ＲＮＡ配列の検出に悪影響を及ぼさない項目３〜１１のＤＮアーゼの使用及び関連するＤＮアーゼ処理条件。
１３．実際のＰＣＲ容量よりも小さい（熱サイクリングパラメーターとしての）「ＰＣＲ容量」設定の使用。この設定により、部分ＰＣＲプレートでのランと比較したとき感度に悪影響を及ぼす完全ＰＣＲプレートで見られる「エッジ」効果が排除される。従来のリアルタイムＰＣＲサイクルの幾つかの状態で見られる「エッジ」効果は熱コントロールユニットによる温度オーバーシュートに起因している。低いＰＣＲ容量設定により、より遅く且つより正確に熱コントロールされ、これにより温度オーバーシュートの大部分が軽減される。
１４．ＰＣＲ反応カットオフは具体的ＤＳ／ＤＢＳ標的サンプルに適当なものに関して当業者により決定される。
本発明のテクノロジーの実例の詳細：
１．ＤＢＳ含有チューブからの液体のロボット移動は以下のステップからなる：
・ＤＢＳを「チューブボトム検出」アルゴリズムを用いて使い捨てチップによりサンプルインプットチューブの底部に押し進める。
・使い捨てチップをサンプルインプットチューブの底部から短距離（例えば、３ｍｍ）だけゆっくり引っ込め、ＤＢＳが使い捨てチップを妨害していないことを確認するために少量（例えば、５０μｌ）の吸引を実施する。少量の吸引が終了したら、使い捨てチップを液体の表面上のポイントまで引っ込める。
・同一の使い捨てチップを用いて、液体の表面を検出し、部分容量追跡吸引（例えば、１ｍＬに達するまで４５０μｌ）をその場所から実施する。最初の部分容量吸引が完了したら、更なる核酸抽出ステップのために使い捨てチップ中に含まれている液体を反応チューブに移動させる。
・全サンプル移動容量が得られるようにこれらのステップを繰り返す。
２．特定ＤＮアーゼ反応バッファーの非存在下で（ＲＮＡ検出に悪影響を与えることなく）抽出核酸に添加したとき本発明の方法及び組成物と一緒に使用するとＤＮＡを効果的に分解し、試薬の導入または高温で不活化する必要がない典型的ＤＮアーゼ。
・Ｐｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マデイソン）ＲＱ１ ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼ（カタログ番号Ｍ６１０１）；２Ｕ／反応物；室温；３０分間。
・Ａｍｂｉｏｎ（ニューヨーク州グランドアイランド）ＤＮアーゼＩ（ＲＮアーゼフリー）（カタログ番号ＡＭ２２２２）；２Ｕ／反応物；室温；３０分間。
・Ｒｏｃｈｅ（スイス国バーゼル）ＤＮアーゼＩ組み換体ＲＮアーゼフリー（カタログ番号０４７１６７２８００１）；２０Ｕ／反応物；室温；３０分間。
・他の適当なＤＮアーゼは公知であり得、過度の実験なしで本明細書中に記載されている方法を用いて当業者により同定され得る。本明細書中にリストされている基準を満たしている限り、本発明は特定のＤＮアーゼに限定されない。以下の図面に記載されているアッセイは例示にすぎず、本発明を特定のＤＮアーゼまたは特定のスクリーニング方法に限定するのに役立たない。
ＤＮＡを効果的に除去し、ＲＮＡシグナルに悪影響を与えなかったＤＮアーゼについて図１を参照されたい。図１は、コントロール（ＤＮアーゼ処理せず、実線）と比較して、ＰＣＲ試薬と組み合わせる前にＤＮアーゼで処理した（破線）ＨＩＶ陽性乾燥血液スポットから抽出した核酸溶出物を示している。次いで、核酸をβグロビンＤＮＡシグナルについてはβグロビンリアルタイムＰＣＲを用いて、ＨＩＶ及びＩＣ ＲＮＡシグナルについてはＨＩＶ−１リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いてアッセイした。ａ）ＤＮアーゼ処理の有効性を立証するためにβグロビンＤＮＡシグナル、ｂ）ＤＮアーゼ処理の影響を立証するためにＨＩＶ ＲＮＡシグナル、ｃ）ＤＮアーゼ処理の影響を立証するためにＩＣ ＲＮＡシグナル。ＤＮアーゼ処理のために使用した条件：Ａｍｂｉｏｎ ＤＮアーゼ１（ＲＮアーゼフリー）（カタログ番号ＡＭ２２２２）；２Ｕ／反応物；室温；３０分間。
ＤＮＡを効果的に除去せず、ＲＮＡシグナルに悪影響を与えなったＤＮアーゼについて図２を参照されたい。図２は、コントロール（ＤＮアーゼ処理せず、実線）と比較して、ＰＣＲ試薬と組み合わせる前にＤＮアーゼで処理した（破線）ＨＩＶ陽性乾燥血液スポットから抽出した核酸溶出物を示している。次いで、核酸をβグロビンＤＮＡシグナルについてはβグロビンリアルタイムＰＣＲを用いて、ＨＩＶ及びＩＣ ＲＮＡシグナルについてはＨＩＶ−１リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いてアッセイした。ａ）ＤＮアーゼ処理の有効性を立証するためにβグロビンＤＮＡシグナル、ｂ）ＤＮアーゼ処理の影響を立証するためにＨＩＶ ＲＮＡシグナル、ｃ）ＤＮアーゼ処理の影響を立証するためにＩＣ ＲＮＡシグナル。ＤＮアーゼ処理のために使用した条件：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＤＮアーゼＩ（ＲＮアーゼフリー）（カタログ番号ＭＯ３０３Ｓ）；２Ｕ／反応物；室温；３０分間。
ＤＮＡを効果的に除去し、ＲＮＡシグナルに悪影響を与えたＤＮアーゼについて図３を参照されたい。図３は、コントロール（ＤＮアーゼ処理せず、実線）と比較して、ＰＣＲ試薬と組み合わせる前にＤＮアーゼで処理した（破線）ＨＩＶ陽性乾燥血液スポットから抽出した核酸溶出物を示している。次いで、核酸をβグロビンＤＮＡシグナルについてはβグロビンリアルタイムＰＣＲを用いて、ＨＩＶ及びＩＣ ＲＮＡシグナルについてはＨＩＶ−１リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いてアッセイした。ａ）ＤＮアーゼ処理の有効性を立証するためにβグロビンＤＮＡシグナル、ｂ）ＤＮアーゼ処理の影響を立証するためにＨＩＶ ＲＮＡシグナル、ｃ）ＤＮアーゼ処理の影響を立証するためにＩＣ ＲＮＡシグナル。ＤＮアーゼ処理のために使用した条件：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＤＮアーゼ１（増幅グレード）（カタログ番号ＡＭＰＤ１）；２Ｕ／反応物；室温；３０分間。
３．抽出核酸に暴露する前にＤＮアーゼをＰＣＲ試薬に導入したとき、またはＰＣＲ反応物の形成中に導入したとき、（ＲＮＡ検出に悪影響を与えることなく）ＰＣＲ反応物中のＤＮＡを効果的に分解する典型的ＤＮアーゼは以下の通りである：
・Ｐｒｏｍｅｇａ ＲＱ１ ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼ（カタログ番号Ｍ６１０１）；２Ｕ／反応物；室温；１０分間。
・Ａｍｂｉｏｎ ＤＮアーゼＩ（ＲＮアーゼフリー）（カタログ番号ＡＭ２２２２）；２Ｕ／反応物；室温；３０分間。
・他のＤＮアーゼが当業者に公知であり得、過度の実験なしで本明細書中に記載されている方法を用いて同定され得る。本明細書中にリストされている基準を満たしている限り、本発明は特定のＤＮアーゼに限定されない。以下の図面に記載されているアッセイは例示にすぎず、本発明を特定のＤＮアーゼに限定するのに役立たない。
ＤＮＡを効果的に除去し、ＲＮＡシグナルに悪影響を与えなかったＤＮアーゼについて図４を参照されたい。図４では、ＤＮアーゼをＰＣＲ試薬に添加し、その後ＰＣＲマスターミックスに組み合わせた（破線）。コントロールとして、ＰＣＲ試薬にＤＮアーゼを添加しなかった（実線）。次いで、抽出核酸をβグロビンＤＮＡシグナル、及びＨＩＶ及びＩＣ ＲＮＡシグナルが検出されるＰＣＲマスターミックスによりアッセイした。ａ）ＤＮアーゼ処理の有効性を立証するためにβグロビンＤＮＡシグナル、ｂ）ＤＮアーゼ処理の影響を立証するためにＨＩＶ ＲＮＡシグナル、ｃ）ＤＮアーゼ処理の影響を立証するためにＩＣ ＲＮＡシグナル。ＤＮアーゼ処理のために使用した条件：Ｐｒｏｍｅｇａ ＲＱ１ ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼ（カタログ番号Ｍ６１０１）；２Ｕ／反応物；室温；１０分間。
Ａｂｂｏｔｔは以前従来技術プロトコルを提供した。このプロトコルを初期ＨＩＶ−１ ＤＢＳ ＶＬオープンモードに最適化した（下表を参照されたい）。初期オープンモードプロトコルを更にＣＥ製品を開発させるために現在のオープンモードに最適化した。以下の表２は、従来技術プロトコル、初期オープンモードプロトコル、及び更に改良したプロトコルの違いを示す。文字“ＣＥ”はフランス語のフレーズ“Ｃｏｎｆｏｒｍｉｔｅ Ｅｕｒｏｐｅｅｎｅ”の略号であり、これは文字通り「欧州適合」を意味する。
Figure 2017519516
Figure 2017519516
表２に詳記したアッセイの変更により、従来技術方法に比して大きな予期せぬ驚くべき改善が生じる。表３は、高い感度が本発明の方法により達成されたことを示している。本発明の方法を使用したとき、１００％検出に関連する標的レベルは、従来技術アッセイの１０，０００コピー／ｍｌから２，０００コピー／ｍｌに低下した。
表３ 検出感受性におけるオープンモードプロトコル(ＤＢＳ溶出条件：ＲＴ２０分間)発明と従来技術プロトコルを比較するために下表を参照されたい。
Figure 2017519516
実施例３
感度及びアッセイロバスト性改善について実施した研究
初期オープンモードアッセイで、およそ２〜３％のインターナル研究サンプル及び＞５％のエクスターナル研究サンプルはｍ２０００ｒｔ ４４５０または４４４２エラーを有しており、よって無効であった。残留グアニジンにより、高い抑制の頻度及び４４５０及び４４４２エラーが生じたと確認された。グアニジンのキャリーオーバー量及び頻度を減らすためにＨＩＶ−１ ＤＢＳアプリケーション仕様ファイルを改変した。廃棄物除去中の撤回速度を遅くすると、ピペットチップから垂下している液滴の分散が減る。サンプルインプットとして１ｍｌでＤＢＳサンプルがＷａｓｈ１バッファー（ＤＢＳ溶出バッファー）中に存在しているので、反応物中の溶解バッファーの容量は２４００から１６００μｌに減少し、各反応物中に存在するＧＩＴＣの量が減少する。洗浄有効性はＷａｓｈ２容量を７００から７５０μｌに増加させることにより向上した。これらの変化を実行すると、４４５０及び４４４２エラーの頻度はおよそ０．２％（データ示さず）に減少した。この最適化により、アッセイロバスト性が大きく改善された。
検査のために２つの７０μＬのＤＢＳ（乾燥血液スポット）／患者を用いてサンプルインプットを増加させることによりアッセイ感度が改善され得る。評価データ（データ示さず）から、室温溶出では１つのＤＢＳと比較して２つのＤＢＳはＨＩＶ低終点検出率を改善させた。５５℃で３０分間の溶出条件では、１つのＤＢＳと比較して２つのＤＢＳの低いＨＩＶ濃度検出率の改善は明らかではなかった。
溶出効率を向上させることによりアッセイ感度も改善され得る。室温で２０分間の溶出と５５℃で３０分間の溶出を直接比較した。結果（図５）から、温度を５５℃に３０分間上昇させることによりＣｔ（サイクル閾値）及びＭＲ（最大比）の両方が有意に改善されたことが示唆された。５５℃の温度及びタイミングが保護帯域された（それぞれ、図６及び７）。結果（図６）は、６０℃以上の温度によりＭＲ値が低下することを示した。全体として、最高のＭＲは５５℃であった。図７は、より効率的なＤＢＳ溶出のためには５５℃で３０分間が必要であったことを示した。５５℃で３０分間インキュベートした後、室温で最長２４時間更にインキュベートしてもＰＣＲ結果に影響を及ぼさなかった。更に、ＤＢＳから回収したＲＮＡ材料とサンプルバッファー中に直接スパイクした全血の比較を室温で２０分間と５５℃で３０分間の間で実施した。結果から、５５℃溶出条件は室温溶出条件と比較して回収率をおよそ１０％上昇させたことが判明した（表４）。バッファー中でのＤＢＳサンプルの連続攪拌を５５℃溶出条件と組み合わせた。結果はＤＢＳからの低いＨＩＶ回収率の僅かな改善を示した。改善は統計上有意でなかった（データ示さず）。
Figure 2017519516
感度を推定するために、ウイルス学的品質保証（ＶＱＡ）ＨＩＶ−１希釈パネル（パネルロット番号２）を用いて予備分析感度評価を５５℃で３０分間実施した。３ロットのキャリブレーターを用いて定量化したＳｅｒａＣａｒｅからの不活性化ＨＩＶ−１を用いても検査した。定量化のために使用したキャリブレーターを、ＶＱＡ ＨＩＶ−１希釈パネル（パネルロット番号１）を用いて定量化した。結果を表５に示す。ＬＯＤ推定値はおよそ８００コピー／ｍＬである。
Figure 2017519516
現在、複数のＤＢＳペーパーカードが市販されている。性能が匹敵しているかどうかを示すことが重要である。３つの異なる販売会社によるＤＢＳペーパーカードを対照比較するために研究を実施した。利用可能ならば、複数ロットのペーパーカードを使用した。結果を表６に要約する。低ＨＩＶ濃度Ｃｔ、ＭＲ及び検出率に基づく性能は同様であった。差は統計上有意でなかった。
Figure 2017519516

Claims (11)

  1. 血液サンプル中のＨＩＶ−１核酸を検出するための自動化方法であって、
    ａ）ｉ）固体担体上で乾燥させた、ＨＩＶに感染していると疑われる血液サンプル、ｉｉ）溶出バッファー、ｉｉｉ）自動化プログラマブルサンプル調製装置、ｉｖ）自動化プログラマブルＰＣＲ装置、ｖ）ＤＮアーゼ、及びｖｉ）ＨＩＶ−１核酸を検出するのに適したＰＣＲ試薬を用意するステップ；
    ｂ）前記溶出バッファーを用いて、前記固体担体から前記血液サンプルを溶出させて、溶出サンプルを作成するステップ；
    ｃ）更なる核酸抽出及び精製のために、前記溶出サンプルを前記自動化プログラマブルサンプル調製装置に装入して、処理サンプルを作成するステップ；
    ｄ）前記自動化プログラマブルＰＣＲ装置に前記ＰＣＲ試薬を装入するステップ；
    ｅ）自動化プログラムを開始して、前記ＰＣＲ試薬を前記処理サンプルにアリコートするステップ；
    ｆ）前記自動化プログラマブルＰＣＲ装置を用いて、前記処理サンプル中の抽出核酸に対してＰＣＲを実施するステップ；
    ｇ）前記自動化プログラマブルＰＣＲ装置より得たＰＣＲ結果を分析して、サンプルがＨＩＶ−１核酸を含んでいるかを決定するステップ；
    を含み、
    ｈ）前記溶出バッファーはおよそｐＨ６．０でおよそ３．５Ｍ ＧＩＴＣ、およそ５％ ポリソルベート２０、およそ５０ｍＭ ＫＯＡｃを含み；
    ｉ）場合により、前記処理サンプルに前記ＰＣＲ試薬を添加した後に前記処理サンプル、前記ＰＣＲ試薬、または完全ＰＣＲ反応物の１つ以上に、ＤＮアーゼを添加する
    方法。
  2. 方法がネガティブ及びポジティブコントロールを更に含む、請求項１に記載の方法。
  3. ステップｂ）が室温で約２０分間である、請求項１に記載の方法。
  4. ステップｂ）をゆっくり断続的に混合しながら実施する、請求項３に記載の方法。
  5. ステップｂ）が約５５℃で約３０分間である、請求項１に記載の方法。
  6. ステップｂ）をゆっくり断続的に混合しながら実施する、請求項５に記載の方法。
  7. 自動化方法がソフトウェアコマンドによりプログラムされている、請求項１に記載の方法。
  8. ステップｉ）が実施され、ＤＮアーゼが特定ＤＮアーゼ反応バッファーを必要とせず、周囲温度またはＰＣＲサイクリング段階中の温度で有効であり、３０分以内にＤＮＡを効果的に分解し、ＤＮＡを効果的に分解した後に不活化する必要がなく、ＲＮＡ配列の検出に悪影響を及ぼさない、請求項１に記載の方法。
  9. 固体担体が濾紙である、請求項１に記載の方法。
  10. 核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  11. 核酸がプロウイルスＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
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