CN112210625A - 定量检测人类免疫缺陷病毒1型dna载量的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了定量检测人类免疫缺陷病毒1型DNA载量的试剂盒及方法，具体地本发明采用数字PCR技术，定量检测人外周血样品中每百万单个核细胞中人类免疫缺陷病毒1型HIV‑1 DNA的含量，能实现核酸分子的绝对定量，无需定量标准品，对于样本的定量检测具有更高的准确性和灵敏度。

Description

定量检测人类免疫缺陷病毒1型DNA载量的试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及利用数字PCR技术定量检测人类免疫缺陷病毒1型DNA载量的试剂盒及方法。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus；abbr:HIV)，即艾滋病(AIDS，获得性免疫缺陷综合征)病毒，是造成人类免疫系统缺陷的一种病毒。HIV-1病毒是一种RNA病毒，主要侵染人体中的免疫细胞，进入人体的HIV-1病毒经逆转录后将自身序列整合至人基因组序列上，之后再利用人细胞的转录翻译系统进行大量复制，严重破坏人体的免疫系统。
目前的HIV-1的检测还是以全血中RNA检测为主，市面上有很多RNA的定量定性检测产品，但缺乏定量检测人体中单个核细胞中HIV-1前病毒的准确载量的产品。
目前HIV-1主要采用核苷酸类药物治疗，但有很多研究和文献报告了针对HIV-1DNA整合在人体细胞基因组的治疗方法，意在彻底去除人体中的HIV-1，例如细胞疗法等。因此定量检测人体中HIV-1DNA载量的方法或者试剂盒就尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定量检测人类免疫缺陷病毒1型DNA载量的试剂盒及方法。
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测人类免疫缺陷病毒1型DNA载量的引物对集，所述引物对集包括：
第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.2所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第二引物对，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.5所示的反向引物。
本发明的第二方面，提供了一种用于检测人类免疫缺陷病毒1型DNA载量的探针集，所述探针集包括：SEQ ID NO.3所示的第一探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括：SEQ ID NO.6所示的第二探针。
在另一优选例中，所述第一探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述第一探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，所述第二探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述第二探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，所述第一探针标记的荧光报告基团不同于所述第二探针标记的荧光报告基团。
本发明的第三方面，提供了一种用于检测人类免疫缺陷病毒1型DNA载量的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含第一引物探针混合液，所述第一引物探针混合液中包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内包含第二引物探针混合液，所述第二引物探针混合液中包含SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含PCR反应缓冲液。优选地，所述PCR反应缓冲液包含选自下组的一种或多种组分：(NH4)2SO4、KCl、Tris-HCl、和MgCl2。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含PCR酶系；优选地所述PCR酶系包括dNTPs、和Taq酶。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第五容器，所述第五容器内包含阴性对照。优选地，所述阴性对照为纯水。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第六容器，所述第六容器内包含阳性对照(HIV-1DNA片段的8E5细胞核酸提取液)。
本发明的第四方面，提供了一种检测人类免疫缺陷病毒1型DNA载量的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的核酸样本；
(2)制备dPCR反应体系并进行dPCR检测：
其中，所述dPCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针集。
在另一优选例中，所述dPCR反应体系包括第一反应体系，所述第一反应体系包括步骤(1)提供的所述核酸样本和第一引物探针混合液，所述第一引物探针混合液包含SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述dPCR反应体系还包括第二反应体系，所述第二反应体系包括步骤(1)提供的所述核酸样本和第二引物探针混合液，所述第二引物探针混合液包含SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。
在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。
在另一优选例中，所述核酸样本可来自血液样本、或环境样本。
本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测HIV-1核酸。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1：检测HIV-1DNA核酸线性检测结果；
图2：检测内参核酸线性检测结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，开发出了基于数字PCR研制定量检测人外周血样品中每百万单个核细胞中人类免疫缺陷病毒1型HIV-1DNA含量的试剂盒及方法。可以对HIV-1DNA核酸分子进行绝对定量，无需定量标准品，对于样本的定量检测具有更高的准确性和灵敏度等优势，可以满足目前对人外周血中每百万单个核细胞中HIV-1DNA载量定量的标准和需求。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
数字PCR(digital PCR，dPCR)
数字PCR(digital PCR，dPCR)，dPCR能实现核酸分子的绝对定量，在检测新型冠状病毒核酸时具有较高的灵敏度、特异性及准确度。其通过物理或化学分割的方式，将一个荧光PCR反应体系分配到上万个微小的反应器中，在每个微反应器中包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子，进行“单分子模板PCR扩增”。扩增结束后，通过阳性反应单元的数目和统计学方法计算原始样本中靶基因的拷贝数。该方法具有灵敏度高，抗干扰能力强，检测结果稳定，不依赖标准曲线进行绝对定量等优点。
利用数字PCR技术针对HIV-1DNA核酸进行检测，具有较高的灵敏度。但是，由于数字PCR的灵敏度极高，因此对检测体系中引物探针组合的特异性要求很高，引物探针组合的设计难度较大。
本发明的目的在于提供一种定量检测人外周血样品中每百万单个核细胞中人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)DNA含量的试剂盒及方法。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种定量检测人外周血样品中每百万单个核细胞中人类免疫缺陷病毒1型HIV-1DNA含量的试剂盒及方法，具体地，本发明公开了一种使用数字PCR法定量检测HIV-1患者全血样本中HIV-1DNA核酸序列的5’LTR区拷贝数和人基因组β-Actin基因拷贝数的方法、引物、探针及试剂盒预混液。
在本发明的一个优选的实施方式中，本发明公开了一种可定量检测HIV-1患者全血样本中HIV-1病毒DNA核酸序列的5’LTR区拷贝数和人基因组β-Actin基因拷贝数的引物、探针。
在本发明的一个优选的实施方式中，本发明公开了用于定量检测HIV-1DNA核酸序列5’LTR区PCR扩增引物对和探针，所述PCR扩增引物对和探针包括：如SEQ ID NO.1所示的PCR上游引物；如SEQ ID NO.2所示的RCR下游引物，如SEQ ID NO.3所示的RCR探针。
在本发明的一个优选的实施方式中，本发明公开了用于定量检测人基因组β-Actin基因的PCR扩增引物对和探针，所述PCR扩增引物对和探针包括：如SEQ ID NO.4所示的PCR上游引物；如SEQ ID NO.5所示的RCR下游引物，如SEQ ID NO.6所示的RCR探针。
进一步地，所述SEQ ID NO.3核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有MGB，所述SEQ ID NO.6核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有MGB。
优选地，所述上游引物在反应体系中的终浓度为约0.10μmol/L，所述下游引物在反应体系中的终浓度为约0.10μmol/L，所述探针在反应体系中的终浓度为约0.05μmol/L。
所述HIV-1DNA核酸序列的5’LTR区拷贝数和人基因组β-Actin基因拷贝数的引物探针序列如下表：
表1.检测针对HIV-1DNA核酸序列的5’LTR区拷贝数和人基因组β-Actin基因拷贝数的引物探针核苷酸序列信息
Figure BDA0002756170250000051
Figure BDA0002756170250000061
所述的PCR扩增引物对和探针的用途，用于制备数字PCR定量检测试剂盒，所述数字PCR定量检测试剂盒用于定量检测人外周血样品中每百万单个核细胞中人类免疫缺陷病毒1型HIV-1DNA载量。
本发明还公开了一种定量检测人外周血样品中每百万单个核细胞中人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)DNA载量的试剂盒，包括用于配制dPCR反应的引探混合物、5×DNAbuffer、PCR酶系、对照样本，其中，引物探针混合液包括如下成分，如表2。
表2.引物探针混合液
Figure BDA0002756170250000062
其中，所述内控引物与探针是根据人管家基因保守片段设计并合成的，用于样本和实验过程的监控；
所述PCR反应液的5×DNA buffer包括如下成分，如表3，
表3. 5×DNA buffer
编号 组分 组分中的主要成分
1 5×DNA buffer (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>、KCl、Tris-HCl、MgCl<sub>2</sub>
所述PCR酶系成分如下，如表4，
表4.PCR酶系
编号 组分 组分中的主要成分
1 PCR酶系 dNTPs、Taq酶
所述对照品包括如下成分，如表5，
表5.对照样本
编号 组分 组分中的主要成分
1 阴性对照 灭菌去离子纯水
2 阳性对照 含HIV-1DNA片段的8E5细胞核酸提取液
本发明所述试剂盒适用样本为人外周血。
本发明所述试剂盒用于判定检测有效性的标准为：
(1)总分区数量：总分区数量在8500-11500个范围内，且芯片轮廓完整；
(2)HIV-1阴性质控品：HIV-1DNA PCR反应管和HIV-1HIV-1内参PCR反应管无阳性信号或阳性信号个数≤3个；
(3)HIV-1阳性质控品：检测结果为HIV-1DNA PCR反应管有阳性信号点，而且浓度在90-110copies/μL；HIV-1内参PCR反应管有阳性信号，且浓度在90-110copies/μL；
以上要求需在一次实验中同时符合要求，否则，本实验无效，需重新进行实验。本发明所述试剂盒的检测线性范围：2.0×101copies/106cells-1.0×106copies/106cells，线性相关程度R2≥98％；检出限：1.0×101copies/106cells。
本发明提出一定量检测人外周血样品中每百万单个核细胞中人类免疫缺陷病毒1型HIV-1DNA含量的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的HIV-1DNA样本；
(2)分别制备检测HIV-1DNA基因扩增反应体系和人基因组β-Actin基因(作为内参)扩增反应体系：
(3)使用步骤(2)的反应体系分别进行数字PCR芯片分区和封闭的制备；
(4)将步骤(3)处理好的数字PCR管内芯片上机进行PCR扩增；
(5)待步骤(4)PCR反应结束后，移至数字PCR的阅读仪上进行定量检测分析。
本发明基于数字PCR平台。通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元不含或者至少包含一个拷贝的目标核酸分子，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。
可使用DAAN StarryTMSky 10K数字PCR仪器(可购自中山大学达安基因股份有限公司)，进行数字PCR检测。也可采用其他数字PCR如微滴式数字PCR系统QX200(伯乐生命医学产品(上海)有限公司)进行数字PCR检测。
本发明人采用数字PCR技术，定量检测人外周血样品中每百万单个核细胞中人类免疫缺陷病毒1型HIV-1DNA的含量。具有核酸分子的绝对定量，无需定量标准品，对于样本的定量检测具有更高的准确性和灵敏度等优势。
在一个优选的实施方式中，本发明的实施步骤如下：
步骤一、待测样本DNA模板提取
用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血3mL，注入含乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀。用于样本DNA的提取。采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20170666号)，具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。模板DNA可直接用于后续实验。
步骤二、PCR体系的制备
dPCR体系配制前准备：从试剂盒中取出HIV-1DNA PCR反应液A1、HIV-1内参PCR反应液A2、5×DNA buffer、PCR酶系、HIV-1阴性质控品，HIV-1阳性质控品，室温融化后振荡混匀，8,000rpm离心数秒后使用。配制PCR体系，PCR体系中含HIV-1DNA PCR反应液A1 1.75μL；5×DNA buffer 7.50μL和PCR酶系0.75μL。
定量检测HIV-1DNA核酸序列5’LTR区拷贝数dPCR反应液如表6，定量检测人基因组β-Actin基因拷贝数dPCR反应液如表7。
表6.HIV-1DNA核酸序列5’LTR区拷贝数dPCR反应液
Figure BDA0002756170250000081
表7.人基因组β-Actin基因拷贝数dPCR反应液
Figure BDA0002756170250000091
步骤三、制备微反应
1.打开DAAN StarryTMSky 10K样本前处理系统，从芯片盒中取出八联管芯片及样本前处理辅助器；
2.打开八联管芯片的盖子，将样本前处理辅助器中的梳样平板插入到八连管芯片中，然后固定至DAAN StarryTMSky 10K样本前处理系统微反应制备模块；
3.将样本前处理辅助器中的推样器安置在DAAN StarryTMSky 10K样本前处理系统微反应制备模块上，关紧闩锁；
4.吸取15μL dPCR反应混合液至推样器的三角形尖端，注意避免产生气泡；
5.按“开始”按钮使推样器将dPCR反应混合液轻轻推至芯片上；
6.松开闩锁，取下推样器和梳样平板，取出芯片，观察并确认dPCR反应液是否已均匀的涂抹在八联管中的芯片上；
7.打开DAAN StarryTMSky 10K样本前处理系统封闭模块，将制备的载有dPCR反应液的八联管芯片插入DAAN StarryTMSky 10K样本前处理封闭模块卡槽中，关闭DAANStarryTMSky 10K样本前处理系统封闭模块仓门，按“开始”按钮使残留在芯片表面的PCR反应混合液完全进入微反应室中，完成芯片的制备；
8.芯片制备完成后，取出八联管芯片，观察芯片表面是否存在液体残留，若存在残留重复7一次(仅能重复一次)；
步骤四、PCR扩增
1.将制备的芯片取出加入235μL封闭液，盖紧管盖，置入PCR仪中进行扩增。
2.按以下程序设置PCR扩增同时热盖温度设定为：100℃，体积为100μL。条件如表8。
表8.PCR扩增程序
Figure BDA0002756170250000101
步骤五、结果读取及分析
1.用DAAN StarryTMSky 10K阅读仪和软件进行结果分析，并基于泊松分布统计原理计算出各样本中靶标分子的拷贝数；
2.阳性结果判定标准：HIV-1DNA PCR反应管阳性信号点数＞3个，且HIV-1内参PCR反应管检测浓度≥60copies/μL。
3.阴性结果判定标准：HIV-1DNA PCR反应管阳性信号点数≤3个，且HIV-1内参PCR反应管检测浓度≥60copies/μL。
4.报告建议采用以下格式：
4.1阴性结果报告格式为：样本未检测到人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)DNA，浓度低于试剂盒的检测下限；
4.2阳性结果报告格式为：
1)当样本的试验结果为HIV-1DNA浓度：20copies/106cells≤C≤1×105copies/106cells时，报告格式为：样本检测到人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)DNA，其浓度为Ccopies/106cells；
2)当样本的试验结果为HIV-1DNA阳性信号数＞3，HIV-1DNA浓度＜20copies/106cells，且HIV-1内参PCR反应管检测浓度≥60copies/μL，报告格式为：样本的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)DNA载量较低，测量值仅供参考；
3)当样本的试验结果为HIV-1DNA阳性信号数≤3，且HIV-1内参PCR反应管检测浓度≥60copies/μL，报告格式为：样本的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)DNA载量低于试剂盒的检测下限。
4.3若结果显示内参通道检测无信号或者低于60copies/μL，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复检测。
本发明的主要优点在于：
(1)本试剂盒采用数字PCR技术，定量检测人外周血样品中每百万单个核细胞中人类免疫缺陷病毒1型HIV-1DNA的含量。数字PCR技术能实现核酸分子的绝对定量，无需定量标准品，对于样本的定量检测具有更高的准确性和灵敏度。
(2)本试剂盒基于数字PCR技术，设计两管PCR扩增体系分别对外周血中HIV-1DNA拷贝数与人单个核细胞数进行定量检测，准确性和特异性更高。
本发明适用于人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)DNA测定试剂盒应用数字PCR平台，定量检测人外周血样品中每百万单个核细胞中人类免疫缺陷病毒1型HIV-1DNA的含量。检测结果仅供临床参考。人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)DNA测定试剂盒(数字PCR法)不可作为血液或血液制品HIV筛查使用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如可以用于HIV-1新药研发。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1试剂盒及其使用方法
本实施例提供了一种定量检测人外周血样品中每百万单个核细胞中人类免疫缺陷病毒1型HIV-1DNA含量的试剂盒，其组成成分、包装及数量(8反应/盒)，如表9。
表9.试剂盒的组成成分、包装及数量
Figure BDA0002756170250000111
Figure BDA0002756170250000121
实施例2：核酸线性范围检测实验
核酸检测限样本为含HIV-1DNA完整片段的8E5细胞(购自ATCC，含有缺陷的HIV基因组)核酸，稀释到1.0×106copies/106cells、1.0×104copies/106cells、1.0×103copies/106cells、1.0×102copies/106cells、2.0×101copies/106cells作为目的核酸线性参考品，稀释到1.0×106copies/μL、1.0×104copies/μL、1.0×103copies/μL、1.0×102copies/μL、2.0×101copies/μL作为内参核酸线性参考品；阳性对照为8E5细胞核酸提取液，阴性对照为灭菌去离子水；
取提取后的阴性对照和线性参考品核酸加样至步骤二配制的PCR反应体系的八连管中，使每管PCR反应体系的总体积为15μL；盖紧八连管管盖。充分混匀，高速离心10秒；用于PCR扩增；
PCR的扩增条件：
第一阶段，95℃5分钟预变性；第二阶段(95℃50秒→58℃1分30秒)×40个循环扩增；第三阶段，72℃延伸5分钟；最后维持温度25℃；
将PCR反应完的反应管置于数字PCR仪器上，检测、分析并计算没百万细胞中HIV-1DNA的拷贝数。
用数字PCR仪器对本发明的线性范围进行检测，实际测得结果如表10所示。
表10.线性参考品
Figure BDA0002756170250000131
图1为检测HIV-1DNA核酸线性检测结果；
图2为检测内参核酸线性检测结果。
试剂盒的线性参考品L0～L9检出为阳性，且符合定量范围，定量范围要求r≥0.98。表明引物具有较好的特异性，线性范围检测良好；因此，本发明的检测限核酸线性范围为2.0×101至1.0×106copies/106cells。
实施例3：最低检测限检测
核酸检测限样本为含HIV-1DNA完整片段的8E5细胞核酸，稀释到1.0×101copies/106cells作为目的核酸最低检出限参考品，稀释到1.0×101copies/μL作为内参核酸最低检出限参考品；阳性对照为8E5细胞核酸提取液，阴性对照为阴性全核酸提取液；
取提取后的阴性对照和最低检测限参考品核酸加样至步骤二配制的PCR反应体系的八连管中，使每管PCR反应体系的总体积为15μL；盖紧八连管管盖。充分混匀，高速离心10秒；用于PCR扩增；
PCR的扩增条件：
第一阶段，95℃5分钟预变性；第二阶段(95℃50秒→58℃1分30秒)×40个循环扩增；第三阶段，72℃延伸5分钟；最后维持温度25℃；
将PCR反应完的反应管置于数字PCR仪器上，检测、分析并计算每百万细胞中HIV-1DNA的拷贝数。
用数字PCR仪器对本发明的线性范围进行检测，得到结果如表11：
表11.最低检测限
Figure BDA0002756170250000141
试剂盒的最低检测限参考品M1、M2，重复检测3次，检测结果均为阳性；因此，本发明的检测限核酸最低检出限为1.0×101copies/106cells。
实施例4：精密度检测
精密度参考品共5份，编号分别为R1-R5，为含有HIV-1DNA完整片段的8E5细胞核酸，阳性质控品定值应在：
(1)HIV-1反应管：HIV-1阳性质控品定值范围在7.0×101～1.3×102copies/μL；
(2)内参反应管：检测定值范围在7.0×101～1.3×102copies/μL。
取提取后的阴性对照和精密度参考品核酸加样至步骤二配制的PCR反应体系的八连管中，使每管PCR反应体系的总体积为15μL；盖紧八连管管盖。充分混匀，高速离心10秒；用于PCR扩增；
PCR的扩增条件：
第一阶段，95℃5分钟预变性；第二阶段(95℃50秒→58℃1分30秒)×45个循环扩增；第三阶段，72℃延伸5分钟；最后维持温度25℃；
将PCR反应完的反应管置于数字PCR仪器上，检测、分析并计算每百万细胞中HIV-1DNA的拷贝数。
用数字PCR仪器对本发明的线性范围进行检测，得到结果如表12：
表12.精密度参考品
Figure BDA0002756170250000151
对比例1
由于数字PCR的灵敏度极高，因此对检测体系中引物探针组合的性能要求很高，引物和探针组合的设计难度较大。在试剂盒开发过程中，本发明人针对靶基因和内参基因设计并筛选了大量PCR引物和探针，并进行了效果测试，最终获得了灵敏度和特异性能够满足检测需求的引物、探针组合。
例举部分典型引物和探针序列如下：
HIV核酸对照引物对和探针组1：
上游引物：GCCTCAATAAAGCTTGCCT(SEQ ID NO.7)
下游引物：GGAAGCACATTGTACTGTCT(SEQ ID NO.8)
探针：TCAAGTAGTGTGTGCCCGTCT(SEQ ID NO.9)
HIV核酸对照引物对和探针组2：
上游引物：ATCACTAGGGAACCCACTC(SEQ ID NO.10)
下游引物：GGAAGCACATTGTACTGTCT(SEQ ID NO.11)
探针：ACACAACAGACGGGCACAC(SEQ ID NO.12)
内参核酸对照引物对和探针组1：
上游引物：AAATGCTTCTAGGCGGACT(SEQ ID NO.13)
下游引物：AAACAAATAAAGCCATGCCAA(SEQ ID NO.14)
探针：ATGACTTAGTTGCGTTACACCCTT(SEQ ID NO.15)
内参核酸对照引物对和探针组2：
上游引物：CTCATGAAGATCCTCACCGA(SEQ ID NO.16)
下游引物：CATCTCTTGCTCGAAGTCC(SEQ ID NO.17)
探针：CTCCTTAATGTCACGCACGAT(SEQ ID NO.18)
分别将上述对照引物对和探针组进行数字PCR检测，检测步骤、检测条件同上。
使用HIV核酸对照引物对和探针组1的检测体系进行检出限验证，检出限降低到了1000copies/106cells。
使用HIV核酸对照引物对和探针组2的检测体系进行检出限验证检出限降低到了200copies/106cells。
使用内参核酸对照引物对和探针组1的检测体系进行检出限验证，检出限降低到了300copies/μL。
使用内参核酸对照引物对和探针组2的检测体系进行检出限验证，检出限降低到了200copies/μL。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中山大学达安基因股份有限公司
<120> 定量检测人类免疫缺陷病毒1型DNA载量的试剂盒及方法
<130> 200073
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gagcaactgt ctgttacac 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gaactgcgtc cagagtact 19
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ccataagcca gcatgga 17
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
cagccatgta cgttgctat 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
catctacgag gggtatgcc 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
caggctgtgc tatccctgta 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
gcctcaataa agcttgcct 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
ggaagcacat tgtactgtct 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
tcaagtagtg tgtgcccgtc t 21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
atcactaggg aacccactc 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
ggaagcacat tgtactgtct 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
acacaacaga cgggcacac 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
aaatgcttct aggcggact 19
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
aaacaaataa agccatgcca a 21
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
atgacttagt tgcgttacac cctt 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
ctcatgaaga tcctcaccga 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
catctcttgc tcgaagtcc 19
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
ctccttaatg tcacgcacga t 21

Claims (10)

1.一种用于检测人类免疫缺陷病毒1型DNA载量的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：
第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
2.如权利要求1所述的引物对集，其特征在于，所述引物对集还包括：
第二引物对，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物。
3.一种用于检测人类免疫缺陷病毒1型DNA载量的探针集，其特征在于，所述探针集包括：SEQ ID NO.3所示的第一探针；优选地，所述探针集还包括：SEQ ID NO.6所示的第二探针。
4.一种用于检测人类免疫缺陷病毒1型DNA载量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对集；优选地，所述试剂盒还包括权利要求3所述的探针集。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含第一引物探针混合液，所述第一引物探针混合液中包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的多核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内包含第二引物探针混合液，所述第二引物探针混合液中包含SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列。
7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含PCR反应缓冲液。
8.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含PCR酶系；优选地所述PCR酶系包括dNTPs、和Taq酶。
9.一种检测人类免疫缺陷病毒1型DNA载量的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的核酸样本；
(2)制备dPCR反应体系并进行dPCR检测：
其中，所述dPCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、权利要求1所述的引物对集、和权利要求2所述的探针集。
10.权利要求1所述的引物对集、和/或权利要求3所述的探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测HIV-1核酸。
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