CN110241257A - 一种同时检测和鉴定11种性传播相关微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测11种临床常见的性传播相关微生物的方法。该方法利用多重PCR‑质谱法、双基因检测11种性传播相关微生物。本发明的检测方法，包括以下步骤：1)引物设计；2)多重PCR扩增反应；3)虾碱性磷酸酶(SAP)处理；4)碱基延伸反应；5)树脂脱盐；6)质谱检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物的检测方法，特别涉及一种多重PCR-质谱检测11种性传播相关微生物的方法。
背景技术
性传播感染(Sexually transmitted infections,STIs)是全球公共卫生和医疗保健负担的重要原因之一。性传播感染可导致胎儿/新生儿死亡，不孕不育和生殖器肿瘤，同时也大大增加了HIV的感染风险。据世界卫生组织(WHO)报告，全球每年新发STI病例约3.57亿，包括衣原体感染(1.31亿)、淋病(0.78亿)、梅毒(0.05亿)和阴道滴虫病(1.43亿)。虽然这些感染中的许多是可预防和可治疗的，但与性传播感染相关的死亡率和发病率仍然很高。许多因素导致性传播感染持续的公共卫生负担，其中最重要的是由于不及时诊断导致的延迟治疗。
能够引起人类性传播感染的微生物种类多样，原虫、病毒和细菌均会引起性传播感染。不同性传播病原体的感染通常会出现相似的临床症状，仅通过临床症状很难区分感染的病原体。无法准确鉴定引起STI的病原体会导致临床治疗只能根据经验判断，治疗结果不理想，从而增加医患矛盾，不利于相关疾病的防控。传统的性传播感染病原体检测方法包括分离培养、显微镜检、酶免疫学试验，以及其他血清学试验。这些经典的方法在确定新发传染病的病原时必不可少，但在对大量样本进行病原筛查时有一定的局限性。通过培养鉴定临床样本中的病原体，检测周期长，某些病原体难以培养；经典血清学试验灵敏度欠佳，常常因个体差异而导致假阴性的情况。而且这些方法都不能同时进行病原体的多重检测。在过去二十年里，分子检测已被广泛应用于性传播感染病原体的检测。与传统方法相比，分子检测技术更加快速、灵敏和准确。当前，市面上也有许多基于核酸扩增的商业试剂盒或系统，用于性传播感染病原体的检测。但是这些平台仍存在着许多缺陷，比如检测成本偏高，检测样本通量低，单个反应检测到病原体数量有限等。因此建立一种快速、灵敏和高通量的性传播感染病原体检测方法至关重要。在患者个体层面，准确获取感染病原体信息，可以防止无意识的进一步传播和尽早采取治疗措施；在临床治疗层面，可以及时地根据检测结果选择合适的抗病毒药物或者是抗生素；而在公共卫生层面，快速明确病原体可以在早期将疫情限制在一定规模以下，缩短预警时间。
发明内容
本发明提供了一种检测11种临床常见的性传播相关微生物的方法。该方法利用多重PCR-质谱法、双基因检测11种性传播相关微生物。
本发明检测的11种临床常见的性传播相关微生物包括：
1种原虫：阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis,TV)；
2种病毒：单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus 1，HSV1)和单纯疱疹病毒2型(Herpes simplex virus 2,HSV2)；
8种细菌：淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis,CT)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum,TP)、生殖支原体(Mycoplasmagenitalium,MG)、人型支原体(Mycoplasma hominis,MH)、解脲支原体(Ureaplasmaurealyticum,UU)、细小脲原体(Ureaplasma parvum,UP)和杜克蕾嗜血杆菌(Haemophilusducreyi,HD)。
本发明的检测方法，包括以下步骤：
1)引物设计：针对每一种拟检测微生物，选取种间特异而种内保守的基因作为检测的靶基因，选取两个检测靶基因，根据待测微生物全序列，获取靶基因序列，确定每种待测微生物靶基因的保守区域，根据已选定目标基因的保守序列，设计针对每个待测微生物的特异性扩增引物，在每条扩增引物的5’端加上10个碱基的通用序列ACGTTGGATG，在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，其中，11种性传播感染微生物扩增引物和延伸探针序列见表1；
2)多重PCR扩增反应:将dNuTPs混合物、UNG酶、DNA聚合酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中，先进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，随后作45个循环PCR扩增，获得待测样本中靶基因扩增产物；
3)虾碱性磷酸酶(SAP)处理：多重PCR反应结束后，使用虾碱性磷酸酶(Shrimpalkaline phosphatase，SAP)消化去除反应体系剩余的dNTP，预防干扰下一步碱基延伸反应；
4)碱基延伸反应：加入设计好的延伸探针进行单碱基延伸反应，使用经修饰的双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)作为反应底物，使得延伸探针在特定的单核苷酸位点处延伸一个碱基后终止反应，即在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记；
5)树脂脱盐：采用阳离子交换树脂吸附体系中的盐离子，纯化延伸反应产物；
6)质谱检测：纯化后产物采用质谱技术进行分子量检测，根据分子量差异确定待测性传播微生物类型。
其中，步骤(1)引物设计中，针对检测微生物，选取种间特异而种内保守的基因作为检测的靶基因。为了避免假阴性结果的出现，针对每一种待检测微生物选取两个检测靶基因，分别设计一对扩增引物和一条延伸探针。扩增引物和延伸探针序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.66，详见表1。
优选的，添加人类的HBB基因作为样品质量控制参照，引物序列为SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68，延伸探针序列为SEQ ID NO.69。
优选的，在每次反应中加入阴性对照，所述阴性对照为无核酸酶蒸馏水。
其中，步骤(2)PCR反应体系见表2。
其中，步骤(3)虾碱性磷酸酶反应体系见表3。
其中，步骤(4)碱基延伸反应体系见表4。
其中，步骤(6)质谱检测：将纯化后产物与芯片基质共结晶，芯片在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF mass spectrometry)系统真空管中受到瞬时的强激光激发，伴随着基质晶体的升华，核酸分子解吸附转变为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场下获得动能，在真空小管中飞行到达检测器。检测结果会以可视化的图形呈现到服务器上，即以离子峰的强度为纵坐标、离子质量为横坐标形成分析图谱，根据特异性探针延伸反应前后的分子质量差异来判断样本中的微生物，软件自动处理报告每种微生物的检测结果和可信程度。
最优选的，本发明的检测方法，包括以下步骤：
(1)针对每一种拟检测微生物，选取种间特异而种内保守的基因作为检测的靶基因。为了避免假阴性结果的出现，针对每一种待检测微生物选取两个检测靶基因。根据待测微生物全序列，获取靶基因序列，确定每种待测微生物靶基因的保守区域。根据已选定目标基因的保守序列，利用Agena公司的Assay Design 4.0软件设计针对每个待测微生物的特异性扩增引物。在每条扩增引物的5’端加上10个碱基的通用序列ACGTTGGATG，增加扩增引物的质量，避免扩增引物出现在质谱的检测窗口，干扰检测结果的准确性。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记。本发明涉及的11种性传播感染微生物扩增引物和延伸探针序列见表1。
(2)通过多重PCR扩增反应，获得待测样本中靶基因的扩增产物。总反应体系5μl，PCR反应体系配制见表2。
表2
先用45℃反应2分钟，此步目的是发挥UNG酶作用，进行dUTP的消化，然后94℃4分钟灭活UNG，(同时这一步也达到预变性的效果)，随后开始多重PCR扩增。反应条件为95℃变性30秒，56.5℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行45个循环；最终72℃延补充伸5分钟，完成后于4℃低温保存。
(3)为了消除多重PCR扩增反应后多余的dNTPs，保证质谱检测单碱基延伸的准确性，利用虾碱性磷酸酶(SAP)处理。SAP消化酶反应体系见表3。
表3
将2μl SAP反应混合液加入到上一步的扩增体系中。
反应条件设置为37℃孵育40分钟，SAP发挥作用去除剩余dNTPs；然后用85℃5分钟使SAP酶失活，完成后于4℃低温保存。
(4)单碱基延伸扩增反应，将特异性延伸探针和ddNTPs加入反应体系中，延伸探针可以结合到PCR扩增子上，在专用的扩增酶作用下，使之3’端延伸一个序列特异性单核苷酸，用作分子量标记。延伸反应体系见表4。
表4
将2μl单碱基延伸反应混合液加入到上一步的扩增体系中。
设置整个单碱基延伸反应为400个短阶梯程序，包含两个循环嵌合，开始为94℃变性30秒，随后在94℃5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共40个循环，其中在每个循环内部插入退火和延伸5个小循环；最终72℃补充延伸5分钟。
(5)采用树脂脱盐纯化延伸反应产物。将反应板置于翻转摇床上，80rpm翻转40分钟，使树脂与反应液充分接触，吸附反应液中的阳离子。
(6)将纯化后产物与芯片基质共结晶，芯片在质谱仪真空管中受到瞬时的强激光激发，伴随着基质晶体的升华，核酸分子解吸附转变为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场下获得动能，在真空小管中飞行到达检测器。检测结果会以可视化的图形呈现到服务器上，即以离子峰的强度为纵坐标、离子质量为横坐标形成分析图谱，根据特异性探针延伸反应前后的分子质量差异来判断样本中的微生物。利用TyperAnalyzer软件自动分析和报告结果，导出数据。
本发明的检测方法，能够特异地检测目的微生物，且与其他微生物无交叉反应。检出限介于1.739至10.009拷贝/ul之间，灵敏度高。
本发明的检测方法，与现有检测性传播感染微生物的其它技术和同类技术相比，本发明技术方案有如下优点：首先，由于采用了高灵敏度的MALDI-TOF质谱方法对扩增产物进行鉴定，通过合理选择设计位点、适当添加修饰碱基，可以将延伸探针的质量加以区分，均匀分布于检测范围之内，从而达到多重检测的目的，每孔可以保证20重以上的反应，远高于常用的荧光定量PCR方法；其次，该平台可使用384芯片，如使用单孔反应进行检测，运行一次即可同时分析超过380份样本中的病原信息，全部实验及分析时间不多于10个小时；最后，研究人员可以根据实际情况自行调整检测试剂，方便快捷，不需要专业人士协助。本发明的这些优势，非常适合对于对种类繁多，分型复杂的性传播感染微生物进行快速筛查。另外本发明也是一种检测性传播混合感染的高通量筛查工具，不仅适用于有症状患者的诊断，同样适用对无症状个体进行筛查。
表1、核苷酸序列
表1中列出的核苷酸序列，均采用常规的多核苷酸合成方法合成。
本发明的另一个目的在于提供一种试剂盒，用于临床样本的检测。
本发明的试剂盒，包括一种或多种表1所示的引物组。
优选的，本发明的试剂盒包括以下引物组。
两个检测靶基因的正向、反向扩增引物序列和对应的延伸探针序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.66；以HBB为质控的扩增引物序列SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68，延伸探针序列SEQ ID NO.69。
根据需要，本发明的试剂盒中还可以包括有利于实验室操作的试剂如：溶剂，缓冲溶剂，辅助材料等。
本发明的试剂盒，可以包括以上组分制备而成的试剂，试剂的配制方法均为常规技术，只需要将各种原材料在常温下混合均匀即可，无需特殊设备和条件。
本发明的试剂盒，可以将不同试剂分别盛装，再一同包装在同一包装盒内，使用时根据说明书中描述的方法进行操作。
本发明的另一个目的在于提供试剂盒用于检测性传播相关微生物中的应用。
该试剂盒用于检测11种性传播相关微生物，包括：阴道毛滴虫、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、梅毒螺旋体、生殖支原体、人型支原体、解脲支原体、细小脲原体和杜克蕾嗜血杆菌。
对于文中出现的技术名词作出进一步的解释：
MALDI TOF mass spectrometry：基质辅助激光解析电离飞行时间质谱
ddNTP：双脱氧三磷酸核苷
PCR Buffer：PCR缓冲液
dNuTPs：dATP、dCTP、dGTP和dUTP共4种脱氧核苷酸混合物
扩增引物Mix：多重PCR扩增的引物混合物
DNA polymerase enzyme：DNA聚合酶
uracil-DNA glycosylase：尿嘧啶DNA糖基化酶，也称UNG酶
Template DNA：DNA模板
SAP Buffer：虾碱性磷酸酶缓冲液
shrimp alkaline phosphatase：虾碱性磷酸酶
iPLEX Pro buffer：单碱基延伸反应缓冲液
Terminator mix：终止反应混合物
延伸探针Mix：延伸探针混合物
Total volume：总体积
附图说明
图1、11种性传播感染微生物检测质谱峰图
具体实施方式
本发明包括同时检测11种临床常见的性传播感染微生物的一种或多种，针对每种微生物选取种间特异而种内保守的基因作为检测的靶基因。此处所描述的具体实施方式仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1、检测方法
本发明实施方式提供的高灵敏度检测和/或鉴定性传播感染微生物的方法，待检测11种临床常见的性传播感染微生物包括：阴道毛滴虫、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、梅毒螺旋体、生殖支原体、人型支原体、解脲支原体、细小脲原体和杜克蕾嗜血杆菌。本发明实施包括如下步骤：
(1)针对每一种拟检测微生物，选取种间特异而种内保守的基因作为检测的靶基因。首先从GenBank数据库中下载各微生物经过完整注释作为参考序列的代表株基因序列，选择的微生物包括：TV、HSV1、HSV2、NG、CT、TP、MG、MH、UU、UP和HD。将参考序列与NCBI的nr数据库进行核酸序列BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，下载比对得到的结果，获取更多检测靶基因序列。使用Geneious R10软件自带的Pairwise/MultipleAlign程序进行多序列比对，确定每种待测病毒靶基因的保守区域。根据已选定目标基因的保守序列，利用Agena公司的Assay Design 4.0软件设计针对每个待测微生物的特异性扩增引物。在每条扩增引物的5’端加上10个碱基的通用序列ACGTTGGATG，增加扩增引物的质量，避免扩增引物出现在质谱的检测窗口，干扰检测结果的准确性。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记。为了避免假阴性结果的出现，针对每一种待检测微生物选取两个检测靶基因，分别设计一对扩增引物以及一条检测探针。另外为了确保反应体系的特异性，保证临床样本核酸提取成功和PCR反应正常进行，同时添加人类的HBB基因作为质控基因。各种性传播相关微生物的扩增引物和延伸探针序列见表1。
(2)通过多重PCR扩增反应，获得待测样本中靶基因的扩增产物。总反应体系5μl，PCR反应体系配制见表2。
表2
先用45℃反应2分钟，此步目的是发挥UNG酶作用，进行dUTP的消化，然后94℃4分钟灭活UNG，(同时这一步也达到预变性的效果)，随后开始多重PCR扩增。反应条件为95℃变性30秒，56.5℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行45个循环；最终72℃延补充伸5分钟，完成后于4℃低温保存。
(3)为了消除多重PCR扩增反应后多余的dNTPs，保证质谱检测单碱基延伸的准确性，利用虾碱性磷酸酶(SAP)处理。SAP消化酶反应体系见表3。
表3
将2μl SAP反应混合液加入到上一步的扩增体系中。
反应条件设置为37℃孵育40分钟，SAP发挥作用去除剩余dNTPs；然后用85℃5分钟使SAP酶失活，完成后于4℃低温保存。
(4)单碱基延伸扩增反应，将特异性延伸探针和ddNTPs加入反应体系中，延伸探针可以结合到PCR扩增子上，在专用的扩增酶作用下，使之3’端延伸一个序列特异性单核苷酸，用作分子量标记。延伸反应体系见表4。
表4
将2μl单碱基延伸反应混合液加入到上一步的扩增体系中。
设置整个单碱基延伸反应为400个短阶梯程序，包含两个循环嵌合，开始为94℃变性30秒，随后在94℃5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共40个循环，其中在每个循环内部插入退火和延伸5个小循环；最终72℃补充延伸5分钟。
(5)采用树脂脱盐纯化延伸反应产物。将反应板置于翻转摇床上，80rpm翻转40分钟，使树脂与反应液充分接触，吸附反应液中的阳离子。
(6)将纯化后产物与芯片基质共结晶，芯片在质谱仪真空管中受到瞬时的强激光激发，伴随着基质晶体的升华，核酸分子解吸附转变为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场下获得动能，在真空小管中飞行到达检测器。检测结果会以可视化的图形呈现到服务器上，即以离子峰的强度为纵坐标、离子质量为横坐标形成分析图谱，根据特异性探针延伸反应前后的分子质量差异来判断样本中的微生物。利用TyperAnalyzer软件自动分析和报告结果，导出数据。
实施例2、试剂盒
本发明提供的试剂盒用于检测11种性传播相关微生物中的应用，包括以下步骤：
1)核酸提取：使用核酸提取试剂盒提取测试换着的分泌物或者尿液样本。
2)多重PCR反应:配合专用的扩增反应体系，经过一轮的多重PCR，实现对多条目的基因扩增。在PCR过程中引入尿嘧啶N糖基化酶(UNG酶)技术，在首次PCR反应体系中，采用以dUTP替代常规PCR的dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG酶处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG酶在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR反应及产物，彻底排除了PCR扩增产物污染引起的假阳性问题。通过第一轮PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
3、虾碱性磷酸酶(SAP)处理：多重PCR反应结束后，使用虾碱性磷酸酶(Shrimpalkaline phosphatase，SAP)消化去除反应体系剩余的dNTP，预防干扰下一步碱基延伸反应。
4、碱基延伸反应：加入设计好的延伸探针进行单碱基延伸反应，使用经修饰的双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)作为反应底物，使得延伸探针在特定的单核苷酸位点处延伸一个碱基后终止反应。即在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记。
5、树脂脱盐：脱盐纯化延伸反应产物。
6、质谱检测：将纯化后产物与芯片基质共结晶，芯片在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF mass spectrometry)系统真空管中受到瞬时的强激光激发，伴随着基质晶体的升华，核酸分子解吸附转变为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场下获得动能，在真空小管中飞行到达检测器。检测结果会以可视化的图形呈现到服务器上，即以离子峰的强度为纵坐标、离子质量为横坐标形成分析图谱，根据特异性探针延伸反应前后的分子质量差异来判断样本中的微生物，软件自动处理报告每种微生物的检测结果和可信程度。
序列表
<110> 中国医学科学院病原生物学研究所
<120> 一种同时检测和鉴定11种性传播相关微生物的方法
<130>
<160> 4
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）
<400> 1
ACGTTGGATGTTCCGTACACTCAAGCTCAC
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）
<400> 2
ACGTTGGATGGCCGGACATAACCATGGAAA
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）
<400> 3
CCTCACAACACCAACATA
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）
<400> 4
ACGTTGGATGCACTCAAGGTCAAAGTGGCT
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）
<400> 5
ACGTTGGATGCTTTGCGAACTGAGGGTAAG
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）
<400> 6
CCTTAGTAACCACATTAAAACCTAT
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus 1）
<400> 1
ACGTTGGATGCTGCGGCTCGTGAAGATAAA
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus 1）
<400> 2
ACGTTGGATGCGTACTTACAGGAGCCCTTG
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus 1）
<400> 3
ATAAACGACTGGACGG
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus 1）
<400> 4
ACGTTGGATGCGTGCCGTTGTTCCCATTAT
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus 1）
<400> 5
ACGTTGGATGTGGTGGAGGAGACGTTGGTG
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus 1）
<400> 6
CGGTTCTTGTCGGTGTATCG
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 单纯疱疹病毒2型（Herpes simplex virus 2）
<400> 1
ACGTTGGATGCAGCTTAAAAATCGCCGGGT
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 单纯疱疹病毒2型（Herpes simplex virus 2）
<400> 2
ACGTTGGATGTTCCGGAACGAGTTCGGGT
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> 单纯疱疹病毒2型（Herpes simplex virus 2）
<400> 3
GACACCACCAACGC
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 单纯疱疹病毒2型（Herpes simplex virus 2）
<400> 4
ACGTTGGATGGTCGTCCGTCACGAGCCCC
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 单纯疱疹病毒2型（Herpes simplex virus 2）
<400> 5
ACGTTGGATGTTGCGTTGGGTGCGCCAAAT
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 单纯疱疹病毒2型（Herpes simplex virus 2）
<400> 6
CGCTCGTTCCTCACGG
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 淋病奈瑟菌(Neisseria Gonorrhoeae)
<400> 1
ACGTTGGATGTATATCGGTGTGCGTGTCGG
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 淋病奈瑟菌(Neisseria Gonorrhoeae)
<400> 2
ACGTTGGATGGCGGTAAGAGTATTTTTCGT
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 淋病奈瑟菌(Neisseria Gonorrhoeae)
<400> 3
TCAGACACGGTATCGAT
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 淋病奈瑟菌(Neisseria Gonorrhoeae)
<400> 4
ACGTTGGATGCGTGGCGTTTGAAAATACCC
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> 淋病奈瑟菌(Neisseria Gonorrhoeae)
<400> 5
ACGTTGGATGGTTTGACGATGCCAGCAAAG
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 淋病奈瑟菌(Neisseria Gonorrhoeae)
<400> 6
TCGTTTGAAAATACCCAATTGC
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）
<400> 1
ACGTTGGATGTTTCTTCAGCGCTACACACG
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）
<400> 2
ACGTTGGATGTGACAAGCTTAGATCCGTTT
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）
<400> 3
TCACACGCTCAAATCATC
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）
<400> 4
ACGTTGGATGGTTTCGGCGGAGATCCTTG
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）
<400> 5
ACGTTGGATGCACGGTCGAAAACAAAGTCA
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）
<400> 6
ACTTGGTGTGACGC
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> 梅毒螺旋体（Treponema pallidum）
<400> 1
ACGTTGGATGACGTCCGGAACAATAAGAGG
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> 梅毒螺旋体（Treponema pallidum）
<400> 2
ACGTTGGAGTGTGAAACGGATGGATTGCAT
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> 梅毒螺旋体（Treponema pallidum）
<400> 3
TGCTTCCTGAAAGCAGAT
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> 梅毒螺旋体（Treponema pallidum）
<400> 4
ACGTTGGATGCAGGCTGACTTTGATTGCGA
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> 梅毒螺旋体（Treponema pallidum）
<400> 5
ACGTTGGATGCAGCATCCATCAGAGTCTCC
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> 梅毒螺旋体（Treponema pallidum）
<400> 6
GCCTTCCCAAGTACGA
<210> 37
<211> 33
<212> DNA
<213> 生殖支原体（Mycoplasma genitalium）
<400> 1
ACGTTGGATGCCCAAATCAATGTTTGGTCTC
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> 生殖支原体（Mycoplasma genitalium）
<400> 2
ACGTTGGATGGGAACTAGAAAGATTGTCGT
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> 生殖支原体（Mycoplasma genitalium）
<400> 3
CATTTGGTCAGTTTGTATCC
<210> 40
<211> 33
<212> DNA
<213> 生殖支原体（Mycoplasma genitalium）
<400> 4
ACGTTGGATGCCTTAACCCCTTGGACTTGA
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> 生殖支原体（Mycoplasma genitalium）
<400> 5
ACGTTGGATGGTTGTCATTTTGGCTTCTTAC
<210> 42
<211> 33
<212> DNA
<213> 生殖支原体（Mycoplasma genitalium）
<400> 6
GATTACTGGAGAGAACCCA
<210> 43
<211> 33
<212> DNA
<213> 人型支原体（Mycoplasma hominis）
<400> 1
ACGTTGGATGCAGGCGCTTCATGTACTACT
<210> 44
<211> 33
<212> DNA
<213> 人型支原体（Mycoplasma hominis）
<400> 2
ACGTTGGATGTGGTCTGCTGTATATGAGTG
<210> 45
<211> 33
<212> DNA
<213> 人型支原体（Mycoplasma hominis）
<400> 3
CCTGTTTAGCTCCTATTGC
<210> 46
<211> 33
<212> DNA
<213> 人型支原体（Mycoplasma hominis）
<400> 4
ACGTTGGATGTAGCTCTTGTCCAGAACCGA
<210> 47
<211> 33
<212> DNA
<213> 人型支原体（Mycoplasma hominis）
<400> 5
ACGTTGGATGTATTATTTTTGGCTATCGG
<210> 48
<211> 33
<212> DNA
<213> 人型支原体（Mycoplasma hominis）
<400> 6
ATTTTACAGTAAATGATTGTACACAAC
<210> 49
<211> 33
<212> DNA
<213> 解脲支原体（Ureaplasma urealyticum）
<400> 1
ACGTTGGATGCAGGGTAGATTTTATTGCCC
<210> 50
<211> 33
<212> DNA
<213> 解脲支原体（Ureaplasma urealyticum）
<400> 2
ACGTTGGATGGGTCGTGACTCAAATCCTAA
<210> 51
<211> 33
<212> DNA
<213> 解脲支原体（Ureaplasma urealyticum）
<400> 3
CTTTGACCTGCTTTAGTAGATTGC
<210> 52
<211> 33
<212> DNA
<213> 解脲支原体（Ureaplasma urealyticum）
<400> 4
ACGTTGGAGTTTACAATCATGGTTCCACA
<210> 53
<211> 33
<212> DNA
<213> 解脲支原体（Ureaplasma urealyticum）
<400> 5
ACGTTGGATGCAACCACGTAAAAATGATG
<210> 54
<211> 33
<212> DNA
<213> 解脲支原体（Ureaplasma urealyticum）
<400> 6
GGGTTCCACAATAATGATAGCC
<210> 55
<211> 33
<212> DNA
<213> 细小脲原体（Ureaplasma parvum）
<400> 1
ACGTTGGATGTACCAACCATTGTATCTACA
<210> 56
<211> 33
<212> DNA
<213> 细小脲原体（Ureaplasma parvum）
<400> 2
ACGTTGGATGGACTTAATGCAATCTGCTCG
<210> 57
<211> 33
<212> DNA
<213> 细小脲原体（Ureaplasma parvum）
<400> 3
CCATAACTTGATCAACACGTAA
<210> 58
<211> 33
<212> DNA
<213> 细小脲原体（Ureaplasma parvum）
<400> 4
ACGTTGGATGAAAGGACGTACAATCCACGC
<210> 59
<211> 33
<212> DNA
<213> 细小脲原体（Ureaplasma parvum）
<400> 5
ACGTTGGATGTATCTGGAGCATGTCCACCA
<210> 60
<211> 33
<212> DNA
<213> 细小脲原体（Ureaplasma parvum）
<400> 6
TACGCTTACCATACAGAAG
<210> 61
<211> 33
<212> DNA
<213> 杜克蕾嗜血杆菌（Haemophilus ducreyi）
<400> 1
ACGTTGGATGGTAGAAAGTCTGAGTAATC
<210> 62
<211> 33
<212> DNA
<213> 杜克蕾嗜血杆菌（Haemophilus ducreyi）
<400> 2
ACGTTGGATGCGCGAGGCATATTGATATAC
<210> 63
<211> 33
<212> DNA
<213> 杜克蕾嗜血杆菌（Haemophilus ducreyi）
<400> 3
ATAATCTAAAATCTTAGCTGAACAAA
<210> 64
<211> 33
<212> DNA
<213> 杜克蕾嗜血杆菌（Haemophilus ducreyi）
<400> 4
ACGTTGGATGCGACACTTTTACACGCGCTT
<210> 65
<211> 33
<212> DNA
<213> 杜克蕾嗜血杆菌（Haemophilus ducreyi）
<400> 5
ACGTTGGATGTTTCTAGCGGAGTATAAGCA
<210> 66
<211> 33
<212> DNA
<213> 杜克蕾嗜血杆菌（Haemophilus ducreyi）
<400> 6
GCTGAATTAGATTATCAATTCGCT
<210> 67
<211> 33
<212> DNA
<213> 人β球蛋白基因（Human β-globin gene）
<400> 1
ACGTTGGATGAAAGCAGCACTTGACTAGAG
<210> 68
<211> 33
<212> DNA
<213> 人β球蛋白基因（Human β-globin gene）
<400> 2
ACGTTGGATGACTGTGCTTGACCTAGGAAC
<210> 69
<211> 33
<212> DNA
<213> 人β球蛋白基因（Human β-globin gene）
<400> 3
TCTACTGTTTAGTCTAAAATTCC
Claims (10)
1.一种检测临床常见的性传播相关微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)引物设计：针对每一种拟检测微生物，选取种间特异而种内保守的基因作为检测的靶基因，选取两个检测靶基因，根据待测微生物全序列，获取靶基因序列，确定每种待测微生物靶基因的保守区域，根据已选定目标基因的保守序列，设计针对每个待测微生物的特异性扩增引物，在每条扩增引物的5’端加上10个碱基的通用序列ACGTTGGATG，在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，其中，11种性传播感染微生物扩增引物和延伸探针序列见表1；
2)多重PCR扩增反应:将dNuTPs混合物、UNG酶、DNA聚合酶酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中,先进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，随后作45个循环PCR扩增，获得待测样本中靶基因扩增产物；
3)虾碱性磷酸酶(SAP)处理：多重PCR反应结束后，使用虾碱性磷酸酶(Shrimpalkaline phosphatase，SAP)消化去除反应体系剩余的dNTP，预防干扰下一步碱基延伸反应；
4)碱基延伸反应：加入设计好的延伸探针进行单碱基延伸反应，使用经修饰的双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)作为反应底物，使得延伸探针在特定的单核苷酸位点处延伸一个碱基后终止反应，即在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记；
5)树脂脱盐：采用阳离子交换树脂吸附体系中的盐离子，纯化延伸反应产物；
6)质谱检测：纯化后产物采用质谱技术进行分子量检测，根据分子量差异确定待测性传播微生物类型。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，11种临床常见的性传播相关微生物包括：
1种原虫：阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis,TV)；
2种病毒：单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus 1,HSV1)和单纯疱疹病毒2型(Herpes simplex virus 2,HSV2)；
8种细菌：淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis,CT)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum,TP)、生殖支原体(Mycoplasmagenitalium,MG)、人型支原体(Mycoplasma hominis,MH)、解脲支原体(Ureaplasmaurealyticum,UU)、细小脲原体(Ureaplasma parvum,UP)和杜克蕾嗜血杆菌(Haemophilusducreyi,HD)。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
其中，步骤(1)引物设计中，针对检测微生物，选取种间特异而种内保守的基因作为检测的靶基因。为了避免假阴性结果的出现，针对每一种待检测微生物选取两个检测靶基因，分别设计一对扩增引物和一条延伸探针。扩增引物和延伸探针序列为SEQ ID NO.1至SEQID NO.66，详见表1，
其中，步骤(1)引物设计中，添加人类的HBB基因作为样品质量控制参照，引物序列为SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68，延伸探针序列为SEQ ID NO.69，其中，步骤(1)引物设计中，在每次反应中加入阴性对照，所述阴性对照为无核酸酶蒸馏水。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中，步骤(2)PCR反应体系见表2。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中，步骤(3)虾碱性磷酸酶反应体系见表3。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中，步骤(4)碱基延伸反应体系见表4。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中，步骤(6)质谱检测：将纯化后产物与芯片基质共结晶，芯片在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF massspectrometry)系统真空管中受到瞬时的强激光激发，伴随着基质晶体的升华，核酸分子解吸附转变为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场下获得动能，在真空小管中飞行到达检测器。检测结果会以可视化的图形呈现到服务器上，即以离子峰的强度为纵坐标、离子质量为横坐标形成分析图谱，根据特异性探针延伸反应前后的分子质量差异来判断样本中的微生物，软件自动处理报告每种微生物的检测结果和可信程度。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)针对每一种拟检测微生物，选取种间特异而种内保守的基因作为检测的靶基因，为了避免假阴性结果的出现，针对每一种待检测微生物选取两个检测靶基因，根据待测微生物全序列，获取靶基因序列，确定每种待测微生物靶基因的保守区域，根据已选定目标基因的保守序列，利用Agena公司的Assay Design 4.0软件设计针对每个待测微生物的特异性扩增引物，在每条扩增引物的5’端加上10个碱基的通用序列ACGTTGGATG，在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，扩增引物和延伸探针序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.66，添加人类的HBB基因作为样品质量控制参照，引物序列为SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68，延伸探针序列为SEQ ID NO.69，
(2)通过多重PCR扩增反应，获得待测样本中靶基因的扩增产物，总反应体系5μl，PCR反应体系配制见表2，
表2
先用45℃反应2分钟，此步目的是发挥UNG酶作用，进行dUTP的消化，然后94℃4分钟灭活UNG，，随后开始多重PCR扩增，反应条件为95℃变性30秒，56.5℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行45个循环；最终72℃延补充伸5分钟，完成后于4℃低温保存，
(3)为了消除多重PCR扩增反应后多余的dNTPs，保证质谱检测单碱基延伸的准确性，利用虾碱性磷酸酶(SAP)处理，SAP消化酶反应体系见表3，
表3
将2μl SAP反应混合液加入到上一步的扩增体系中，
反应条件设置为37℃孵育40分钟，SAP发挥作用去除剩余dNTPs；然后用85℃5分钟使SAP酶失活，完成后于4℃低温保存，
(4)单碱基延伸扩增反应，将特异性延伸探针和ddNTPs加入反应体系中，延伸探针可以结合到PCR扩增子上，在专用的扩增酶作用下，使之3’端延伸一个序列特异性单核苷酸，用作分子量标记，延伸反应体系见表4，
表4
将2μl单碱基延伸反应混合液加入到上一步的扩增体系中，
设置整个单碱基延伸反应为400个短阶梯程序，包含两个循环嵌合，开始为94℃变性30秒，随后在94℃5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共40个循环，其中在每个循环内部插入退火和延伸5个小循环；最终72℃补充延伸5分钟，
(5)采用树脂脱盐纯化延伸反应产物，将反应板置于翻转摇床上，80rpm翻转40分钟，使树脂与反应液充分接触，吸附反应液中的阳离子，
(6)将纯化后产物与芯片基质共结晶，芯片在质谱仪真空管中受到瞬时的强激光激发，伴随着基质晶体的升华，核酸分子解吸附转变为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场下获得动能，在真空小管中飞行到达检测器，检测结果会以可视化的图形呈现到服务器上，即以离子峰的强度为纵坐标、离子质量为横坐标形成分析图谱，根据特异性探针延伸反应前后的分子质量差异来判断样本中的微生物，利用TyperAnalyzer软件自动分析和报告结果，导出数据。
9.一种试剂盒，其特征在于，包括一种或多种表1所示的引物组。
10.权利要求9所述的试剂盒用于检测性传播相关疾病中的应用。
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111394438A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-07-10 | 中国医学科学院病原生物学研究所 | 一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法 |
| CN112301169A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-02-02 | 爱科睿特生物医疗科技(南京)有限公司 | 一种同步检测多种生殖道感染相关的病原体的引物组、探针组及试剂盒 |
| CN112458195A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-03-09 | 广州迈景基因医学科技有限公司 | 基于高通量测序检测性传播病原体的多重pcr引物组、试剂盒及其方法 |
| CN112831581A (zh) * | 2021-02-10 | 2021-05-25 | 华东医院 | 可治愈性传播感染病原体检测体系及其试剂盒和应用 |
| CN113215322A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-08-06 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | Maldi-tof ms检测生殖道病原体的引物组合物及用途 |
| CN113215321A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-08-06 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | Maldi-tof ms检测生殖道病原体的检测产品及用途 |
| CN113355456A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-09-07 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | 一种maldi tof-ms检测生殖道病原体的核酸指纹图谱库的制备方法 |
| CN115074456A (zh) * | 2022-08-09 | 2022-09-20 | 江苏格诺生物科技有限公司 | 一种基于多重荧光pcr检测性传播病原体的引物探针组和试剂盒及其使用方法 |
| CN118166135A (zh) * | 2024-05-11 | 2024-06-11 | 深圳闪量科技有限公司 | 同时检测生殖道感染多种病原体的引物池及pcr快速检测试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090280486A1 (en) * | 2006-02-23 | 2009-11-12 | Jong Yoon Chun | Oligonucleotides for Detecting Nucleic Acids of Pathogen Causing Sexually Transmitted Diseases |
| WO2012100370A1 (zh) * | 2011-01-26 | 2012-08-02 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 检测呼吸道病原体的方法和试剂盒 |
| CN103484564A (zh) * | 2013-07-23 | 2014-01-01 | 中国医学科学院病原生物学研究所 | 一种高灵敏度检测和鉴定人冠状病毒的方法 |
-
2019
- 2019-06-18 CN CN201910527364.8A patent/CN110241257B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090280486A1 (en) * | 2006-02-23 | 2009-11-12 | Jong Yoon Chun | Oligonucleotides for Detecting Nucleic Acids of Pathogen Causing Sexually Transmitted Diseases |
| WO2012100370A1 (zh) * | 2011-01-26 | 2012-08-02 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 检测呼吸道病原体的方法和试剂盒 |
| CN103484564A (zh) * | 2013-07-23 | 2014-01-01 | 中国医学科学院病原生物学研究所 | 一种高灵敏度检测和鉴定人冠状病毒的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 程鹏飞等: "淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体多重荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用", 《中国生物制品学杂志》 * |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111394438A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-07-10 | 中国医学科学院病原生物学研究所 | 一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法 |
| CN112458195A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-03-09 | 广州迈景基因医学科技有限公司 | 基于高通量测序检测性传播病原体的多重pcr引物组、试剂盒及其方法 |
| CN112301169A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-02-02 | 爱科睿特生物医疗科技(南京)有限公司 | 一种同步检测多种生殖道感染相关的病原体的引物组、探针组及试剂盒 |
| CN112301169B (zh) * | 2020-12-30 | 2021-03-23 | 爱科睿特生物医疗科技(南京)有限公司 | 一种同步检测多种生殖道感染相关的病原体的引物组、探针组及试剂盒 |
| CN112831581A (zh) * | 2021-02-10 | 2021-05-25 | 华东医院 | 可治愈性传播感染病原体检测体系及其试剂盒和应用 |
| CN113215321A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-08-06 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | Maldi-tof ms检测生殖道病原体的检测产品及用途 |
| CN113215322A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-08-06 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | Maldi-tof ms检测生殖道病原体的引物组合物及用途 |
| CN113355456A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-09-07 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | 一种maldi tof-ms检测生殖道病原体的核酸指纹图谱库的制备方法 |
| CN113215321B (zh) * | 2021-05-26 | 2022-09-30 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | Maldi-tof ms检测生殖道病原体的检测产品及用途 |
| CN113215322B (zh) * | 2021-05-26 | 2022-09-30 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | Maldi-tof ms检测生殖道病原体的引物组合物及用途 |
| WO2022247284A1 (zh) * | 2021-05-26 | 2022-12-01 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | Maldi-tof ms检测生殖道病原体的检测产品及用途 |
| CN115074456A (zh) * | 2022-08-09 | 2022-09-20 | 江苏格诺生物科技有限公司 | 一种基于多重荧光pcr检测性传播病原体的引物探针组和试剂盒及其使用方法 |
| CN115074456B (zh) * | 2022-08-09 | 2024-09-20 | 江苏格诺生物科技集团有限公司 | 一种基于多重荧光pcr检测性传播病原体的引物探针组和试剂盒及其使用方法 |
| CN118166135A (zh) * | 2024-05-11 | 2024-06-11 | 深圳闪量科技有限公司 | 同时检测生殖道感染多种病原体的引物池及pcr快速检测试剂盒 |
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