CN112831581A - 可治愈性传播感染病原体检测体系及其试剂盒和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可治愈性传播感染病原体检测体系及其试剂盒和应用，分别检测梅毒螺旋体、阴道毛滴虫、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体和人型支原体的6对引物和1对人DNA内参引物，1对系统质控内参引物。本发明的可治愈性传播感染病原体检测体系及其试剂盒不需要采用常规培养等步骤，可在同一反应体系内直接对生殖道分泌物样本进行6种难培养病原体的同步鉴定和半定量分析，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、快速准确的优势，能在第一时间为临床和患者提供全面、精准、低成本的病原学诊断依据，为个体化用药和精准医疗提供重要参考。

Description

可治愈性传播感染病原体检测体系及其试剂盒和应用
技术领域
本发明涉及一种多重基因检测产品以及该产品所用到的检测体系，属于生物技术领域。
背景技术
性传播感染(sexually transmitted infections,STIs)是临床上较为常见的传染性疾病之一，是指通过性接触行为而传染的疾病，主要病变部位在生殖系统部位，不仅可引起生殖系统炎症，严重时还可引起不孕不育，甚至累及神经、心血管、骨骼等系统，造成局部或全身的病变。
引起STIs的可治愈性病原体主要包括梅毒螺旋体、淋病奈瑟菌、支原体、衣原体、阴道毛滴虫等。其中，沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟菌(NG)、阴道毛滴虫(TV)和梅毒螺旋体(TP)是四种最常见的可治愈性传播感染病原体，自1995年以来，世界卫生组织(WHO)每隔5年会对这四种病原体在全球和区域范围内的流行率进行定期评估。据统计，每年约有3.57亿人由于感染这四种病原体而引起性传播疾病。国内流行病学调查表明，沙眼衣原体和淋病奈瑟菌在女性中的感染率分别为2.6％和0.08％，在男性中的感染率分别为2.1％和0.02％。沙眼衣原体和淋病奈瑟菌可引起男性附睾炎，女性盆腔炎和子宫内膜炎，最终引起两性不育。解脲支原体和人型支原体也属于性传播病原体，主要存在于泌尿生殖道，与生殖道和泌尿道感染有关，在世界范围内高度流行，泌尿生殖道支原体感染患者及病毒携带者是主要的传染源。根据相关资料显示，生殖道支原体感染的发病率位居全国监测的8种性传播疾病的首位。这两种病原体同时也是引起非淋菌性尿道炎的主要病原体，还与宫颈炎、盆腔炎、不孕症、流产和宫外孕等疾病密切相关。有研究表明，不孕女性中感染解脲支原体和人型支原体的概率显著高于具有生育能力的女性。此外，由于支原体、衣原体和淋病奈瑟菌引起的常见性传播感染在临床表现上不具有特异性或不表现任何临床症状，梅毒感染后存在一定的潜伏期，其诊断较为困难，而延迟诊断会严重影响患者的生殖系统功能，同时增加患者和医院的医疗负担。性传播疾病病原体因未及时筛查和发现而造成的持续性感染同时也是导致性传播疾病传染和广泛流行的重要原因，而这几种病原体因为感染过程较为隐匿而被患者忽略，从而错过最佳治疗时期，因此目前急需一种能对高危群体进行性传播病原体全面筛查的方法。
培养法是目前诊断感染性疾病的金标准，但上述常见的可治愈性传播感染病原体由于生长缓慢、培养程序复杂、需要特殊营养物质和培养基等原因，无法通过培养法完成同步筛查。例如，沙眼衣原体是寄生在细胞内，需要有专门的设施对其进行培养，并且工作量大，不适于中小型医院开展；支原体是能在人工培养基中增殖的最小微生物，菌落直径在10μm～600μm之间，但需要专门的培养基，并借助显微镜观察，检测流程和鉴定过程较为繁琐，不适用于临床实验室常规筛查。
近年来基因检测技术的迅速发展和普及弥补了培养法的缺陷，能不依赖培养法而直接检测人组织或样本中的病原体。现阶段，实时荧光定量PCR技术已经在国内医院基本普及和广泛应用，但该方法检测通量低，目前主要用于对疑似感染性疾病患者的样本或组织内单个病原体进行检测，无法通过一次单孔PCR反应同步对5种以上病原体完成筛查。当前国内临床实验室还尚未存在能对这些病原体进行同步筛查的检测技术和方法。
综上所述，目前常见可治愈性传播感染难培养病原体的检测和诊断方法不能满足临床需求，急需一种可以同步定量检测上述几种常见性传播感染难培养致病菌的检测技术和方法，从而帮助患者和临床医师及时全面筛查高危病性传播原体，发现潜在的感染，及时采取治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有快速、全面、准确、低成本优势的可治愈性传播感染病原体检测体系，以及试剂盒，以及采用该检测体系在制备诊断产品方面的应用。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种可治愈性传播感染病原体检测体系，包括分别针对梅毒螺旋体、阴道毛滴虫、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体和人型支原体进行检测的正反向引物，检测样本为生殖道分泌物。
针对梅毒螺旋体的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，针对梅毒螺旋体的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
针对阴道毛滴虫的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对阴道毛滴虫的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
针对沙眼衣原体的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，针对沙眼衣原体的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
针对淋病奈瑟菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，针对淋病奈瑟菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
针对解脲脲原体的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，针对解脲脲原体的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
针对人型支原体的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，针对人型支原体的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。
上述可治愈性传播感染病原体检测体系还包括针对人DNA内参进行检测的正反向引物和针对系统质控内参进行检测的正反向引物；所述人DNA内参对应的是人类10号染色体全基因组序列上的RP11-320F15位点，所述系统质控内参对应的是人工构建的假病毒的特征序列，检测样本为生殖道分泌物与系统质控内参的混合物；针对人DNA内参的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，针对人DNA内参的反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.14所示；针对系统质控内参的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，以及针对系统质控内参的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。
针对梅毒螺旋体和阴道毛滴虫的正向引物在检测体系中的终浓度均为400nM，针对梅毒螺旋体和阴道毛滴虫的反向引物在检测体系中的终浓度均为400nM；针对沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体、人型支原体、人DNA内参和系统质控内参的正向引物在检测体系中的终浓度均为200nM；针对沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体、人型支原体、人DNA内参和系统质控内参的反向引物在检测体系中的终浓度均为200nM。
上述可治愈性传播感染病原体检测体系还包括多重PCR预混液、多重PCR酶液和无核酸酶纯水；所述多重PCR预混液由10×PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs混合而成；所述多重PCR酶液由热启动DNA聚合酶和UNG酶混合而成。
所有正向引物的5’端设有荧光标记，所述荧光标记为CY5或CY3或FAM。
上述可治愈性传播感染病原体检测体系还包括阳性对照物和阴性对照物；所述阳性对照物是包括所有目的基因靶点的质粒混合物；所述阴性对照物是无核酸酶超纯水。
反应时体系中的组分用量为10×的PCR缓冲液1体积，10μM的dNTPs共0.2体积，25mmol/L的MgCl2溶液0.8体积，引物混合物1体积，5U/μL的热启动DNA聚合酶0.4体积，1U/μL的UNG酶0.5体积，DNA模板5体积，无核酸酶纯水1.1体积；所述DNA模板的使用量为5～50ng/体系。
本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种包括上述检测体系的可治愈性传播感染病原体检测试剂盒。
本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述的检测体系制备可治愈性传播感染病原体检测和诊断产品的应用。
本发明具有积极的效果：
(1)本发明的可治愈性传播感染病原体检测产品可以通过生殖道分泌物，同时鉴别多种性传播感染病原体，将所有目的基因的质粒等拷贝数混合在一起，通过调整各病原体的引物浓度，使各靶点出现的峰高相当，达到等效扩增所有靶基因的目的。选取目标病原体单拷贝的保守序列作为检测靶点，可通过标准曲线法半定量检测所有病原体，根据病原体检测峰面积大小评估患者分泌物样本中病原体含量。该方法能对常见性传播感染患者或疑似患者的生殖道分泌物样本进行检测，提供关于常见可治愈性传播感染难培养病原体的病原学诊断信息，帮助临床医师在及时明确病原体种类并采取有效治疗方案，同时减少经验性抗生素使用，降低医疗成本。
(2)本发明的可治愈性传播感染病原体检测产品，加入了防污染的UNG酶，在基因扩增前有效消除基因扩增片段污染，确保结果的准确性和可靠性。
(3)本发明的可治愈性传播感染病原体检测产品，不同于传统凝胶电泳分析模式，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，因而检测结果无杂峰，确保了检测的特异性和灵敏度。经测试，本方法杂峰较少，显示高特异性；并可检测低至1000cfu/mL或10拷贝/μL的病原体，灵敏度较高。
(4)本发明的可治愈性传播感染病原体检测产品加入了人DNA内参和系统质控内参，确保了检测的可靠性准确性。人DNA内参可监控样品核酸提取质量，人DNA内参特征峰出现说明核酸提取成功，可有效避免核酸提取失败造成的假阴性；人DNA内参特征峰不出现说明核酸提取失败，可有效避免杂峰造成的假阳性。系统质控内参IC可监控PCR和毛细电泳的反应过程，IC特征峰不出现说明反应失败，可有效避免假阴性。在对样本进行核酸抽提的同时加入系统质控内参IC，作为系统质控内参用于监控整个检测过程的同时，系统质控内参IC是人工构建的假病毒，并针对其设计特异引物，可以对病原体进行相对定量。
(5)不同的病原体引起的性传播感染的用药方案和治疗方法各不相同。《国家卫计委2015年抗菌药物临床应用指导原则》明确指出：“抗菌药物的应用必须根据患者的症状、体征和实验室检查结果，明确诊断后可应用”。但是，目前的常规检测方法存在检出率低、耗时长、尤其无法同时对多种病原体进行准确鉴定等缺点，导致临床普遍采用广谱性抗菌药物进行经验性治疗，造成疗效低下、不能及时控制常见性传播感染、耐药菌株高发和增加医患医疗成本等问题。本发明采用建立了一种高通量、快速、准确、低成本的常见可治愈性传播感染难培养病原体鉴定系统，可以同步检测6种常见性传播感染常见的难培养病原体，有效弥补常规检测方法检出率低、耗时长和不能同时进行多种病原体鉴定等缺点，可在第一时间内明确性传播感染病原体种类，以便临床采取正确的治疗方案，有效防止感染加剧和减少耐药菌株的产生。对性传播感染难培养病原体进行半定量检测有利于了解患者体内感染的病原体载量和评估病情严重程度，同时对病原体进行定性和定量检测能为临床提供更全面的诊断信息，有助于临床医生采取更准确的治疗方案。例如，由于解脲脲原体在正常人的中的携带率高达50％，临床只针对感染量＞104CCU/mL的人群给予抗生素干预治疗。因此脲原体感染量对于临床医生评估患者的感染程度、决定是否采取治疗以及制定合理的治疗方案具有重要意义。此外，定量检测发现常见可治愈性传播感染难培养病原体含量较低时提示患者可能处于感染早期，从而警示临床医师及时采取治疗干预，避免患者病情加重。
附图说明
图1是本发明实施例1的试剂盒对混合阳性对照进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
图2是本发明实施例1的试剂盒对阴性对照进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
图3是本发明实施例1的试剂盒对样本1进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
图4是本发明实施例1的试剂盒对样本2进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
图5是本发明实施例1的试剂盒对样本3进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
图6是本发明实施例1的试剂盒对样本4进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
图7是本发明实施例1的试剂盒检测人型支原体的梯度浓度模拟尿液的定量标准曲线；
图8是本发明实施例1的试剂盒检测沙眼衣原体的梯度浓度模拟尿液的定量标准曲线。；
图9是本发明实施例1的试剂盒检测淋病奈瑟菌的梯度浓度模拟尿液的定量标准曲线；
图10是本发明实施例1的试剂盒检测解脲脲原体的梯度浓度模拟尿液的定量标准曲线；
图11是本发明实施例1的试剂盒对230例临床样本进行检测后得到的各病原体的检测峰面积分布图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1
一、试剂盒的组成
本实施例的可治愈性传播感染病原体检测试剂盒包括：多重PCR预混液、多重PCR酶液、引物混合物、阳性对照物、阴性对照物、系统质控内参(IC)和无核酸酶纯水。多重PCR预混液由10×PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs混合而成。多重PCR酶液由热启动DNA聚合酶和UNG酶混合而成。
多重PCR预混液和多重PCR酶液均来自Roche公司(货号：210212)。
系统质控内参(IC)是人工构建的稳定的假病毒。
阳性对照物是包括所有目的基因靶点的质粒混合物。
阴性对照物是无核酸酶超纯水。
引物混合物包括分别检测梅毒螺旋体、阴道毛滴虫、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体和人型支原体靶基因的引物对，检测人DNA内参的引物对和检测系统质控内参(IC)的引物对，人DNA内参对应的是人类10号染色体全基因组序列上的RP11-320F15位点。各引物序列的特征如表1所示，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。
表1引物序列特征表
Figure BDA0002942576750000071
二、试剂盒的使用方法
本实施例的可治愈性传播感染病原体检测试剂盒的具体检测步骤如下：
(1)采集患者生殖道分泌物样本：采集疑似或确诊为性传播感染患者的分泌物样本。对于女性患者，使用无菌拭子擦拭宫颈表面的粘液，收集阴道分泌物样本。对于男性患者，将无菌棉签旋转插入尿道口1～2cm，收集尿道分泌物。将采集的拭子放入含有1.5mL样本保存液的收集管中，用于检测。
(2)样本核酸提取：取300μL分泌物样本保存液进行核酸提取，阳性对照和阴性对照各取80μL进行提取，每个参与提取的样本需加入5μL的IC共同提取。
(3)配制反应体系：根据说明书，按照每个反应多重PCR预混液2μL、多重PCR酶液0.9μL、引物混合物1μL、无核酸酶纯水1.1μL的比例配制反应体系，涡旋混匀后，用离心机进行离心，然后分装于PCR反应管中。
(4)加入核酸模板：将提取好的核酸加入到装有配制好的反应体系的PCR反应管中，每人份加入5μL核酸。
(5)多重PCR扩增；本试剂盒的PCR扩增反应条件见表2。
表2多重PCR扩增条件
Figure BDA0002942576750000081
(6)对扩增产物进行毛细电泳分析，并根据峰型图进行结果判读。
取3500Dx遗传分析仪配套高度去离子甲酰胺(HiDi)8.75μL、SIZE-500Plus0.25μL，混合后加入PCR产物1μL进行毛细电泳分离样品。根据峰型图的出峰位置大小判断病原体种类和数量，根据峰面积大小可判断分泌物样本内病原体含量。
三、试剂盒的检测结果判定
1.试剂盒有效性判定
同时满足下列条件，才可进行结果判定：
1)阴性对照：只检测到人DNA内参和系统质控内参特异峰。
2)阳性对照：在各扩增片段长度处各检测到一个荧光信号，且荧光信号值高于500。
2.样本有效性判定：
若检测样本的荧光信号值均低于500，则样本加入量较低，可适当增加PCR产物加入量或增加PCR反应循环数；若仍然不符合要求，需重新制备样本。
3.结果判定标准
可治愈性传播感染难培养病原体鉴定：人DNA内参、系统质控内参和病原体基因的目的片段区域出现了相应的峰且荧光信号值均高于500，可以判断感染了相关病原体。
定量方法：通过检测6种常见可治愈性传播感染难培养病原体的梯度浓度质粒，确定不同梯度浓度和相应的检测峰面积之间的相关性，制定标准曲线，进而根据检测样本的峰面积对病原体浓度进行相对定量，评估样本中所感染的病原体载量。具体的方法是以每种病原体的梯度浓度为横坐标，以各梯度浓度的检测峰面积为纵坐标，绘制定量标准曲线，确定不同浓度和相应的检测峰面积之间的相关性。所使用的数据分析软件为GraphpadPrism8，R2值越接近1表示各病原体的梯度浓度和检测峰面积之间的相关性越强。
4.结果判断实例
采用本实施例的试剂盒使用方法对所有阳性对照的混合液进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后图谱如图1所示。基因的目标片段区域梅毒螺旋体、阴道毛滴虫、淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲脲原体、人型支原体、人DNA内参、系统质控内参共8个检测靶点均出现了相应的峰。该结果非常直观，基因均扩增良好。说明各引物之间没有干扰，能同时有效扩增所有目的基因。
采用本实施例的试剂盒使用方法对阴性对照进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图2所示，只出现了人DNA内参(Hum_DNA)和系统质控内参(IC)的特征峰，没有出现任何病原体的特征峰，只在小于100nt处有非特异性背景荧光信号。说明该检测体系特异性良好。
采用本实施例的试剂盒使用方法对常见可治愈性传播感染难培养病原体的阳性对照进行系列稀释，进行PCR反应后采用毛细管电泳分析，用于评估本方法检测6种病原体的灵敏度。如表3所示，本方法对6种病原体的灵敏度可达到10copies/μL。说明该检测系统对常见可治愈性传播感染难培养病原体单重感染检测的灵敏度很高。
表3可治愈性传播感染难培养病原体检测灵敏度
Figure BDA0002942576750000101
采用本实施例的试剂盒使用方法对样本1进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图3所示。人DNA内参和系统质控内参同时出现且信号值大于500，人型支原体(MH)基因的目标片段区域均出现了相应的峰且信号值大于500。根据结果判定标准，说明该患者感染了人型支原体。检测结果非常直观。
采用本实施例的试剂盒使用方法对样本2进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图4所示。人DNA内参和系统质控内参同时出现且信号值大于500，沙眼衣原体(CT)基因的目标片段区域均出现了相应的峰且信号值大于500。根据结果判定标准，说明该患者感染了沙眼衣原体。检测结果非常直观。
采用本实施例的试剂盒使用方法对样本3进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图5所示。人DNA内参和系统质控内参同时出现且信号值大于500，淋病奈瑟菌(NG)基因的目标片段区域均出现了相应的峰且信号值大于500。根据结果判定标准，说明该患者感染了淋病奈瑟菌。检测结果非常直观。
采用本实施例的试剂盒使用方法对样本4进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图6所示。人DNA内参和系统质控内参同时出现且信号值大于500，人型支原体(MH)和沙眼衣原体(CT)基因的目标片段区域均出现了相应的峰且信号值大于500。根据结果判定标准，说明该患者同时感染了人型支原体和沙眼衣原体。检测结果非常直观。
采用本实施例的试剂盒使用方法对人型支原体的梯度浓度质粒进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图7所示。系列稀释的梯度浓度质粒(10拷贝/微升～104拷贝/微升)的峰面积随着质粒拷贝数的增高而增高，人型支原体的梯度质粒的浓度(copies/μL)和检测峰面积之间的相关系数R2＝0.9829。
采用本实施例的试剂盒使用方法对沙眼衣原体的梯度浓度质粒进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图8所示。系列稀释的梯度浓度质粒(10拷贝/微升～104拷贝/微升)的检测峰面积随着质粒拷贝数的增高而增高，沙眼衣原体的梯度质粒的浓度(copies/μL)和检测峰面积之间的相关系数R2＝0.9410。
采用本实施例的试剂盒使用方法对淋病奈瑟菌的梯度浓度质粒进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图9所示。系列稀释的梯度浓度质粒(10拷贝/微升～104拷贝/微升)的检测峰面积随着质粒拷贝数的增高而增高，淋病奈瑟菌的梯度质粒的浓度(copies/μL)和检测峰面积之间的相关系数R2＝0.9799。
采用本实施例的试剂盒使用方法对解脲脲原体的梯度浓度质粒进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图10所示。系列稀释的梯度浓度质粒(10拷贝/微升～104拷贝/微升)的检测峰面积随着质粒拷贝数的增高而增高，解脲脲原体的梯度质粒的浓度(copies/μL)和检测峰面积之间的相关系数R2＝0.9588。
采用本实施例的试剂盒使用方法对230例临床分泌物样本进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图11所示。纳入230例患者和健康人群入组，包括生殖道感染患者105例，不孕不育症患者86例，健康体检39例，共收集230例临床分泌物样本。使用本方法检测对230份生殖道分泌物样本进行检测，检测到31例CT感染患者，29例UU感染患者，21例HN感染患者，15例MH感染患者和1例TV感染患者。各病原体检测峰面积分布情况如图11，各病原体在不同样本中检测到的峰面积大小不同，说明各病原体在分泌物样本中的含量不同，证明本方法能对临床分泌物样本中病原体含量进行半定量分析。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 华东医院
宁波海尔施基因科技有限公
<120> 可治愈性传播感染病原体检测体系及其试剂盒和应用
<130> 无
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 1
ttggtgatga gttgattatg cgt 23
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 2
gtgtttaaat tcatccatcc gctaac 26
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 3
ttcagcagat gaggtacaag aa 22
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 4
gtagttctgt gaagttagtt tccaa 25
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 5
agggcttcct tacccataaa cttacgca 28
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 6
atgctgtgac ttgttgtagt gtgtgaa 27
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 7
tatcgatgcg gacacccaat acctgc 26
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 8
gtttgaaatc tccgttgccc ataccgg 27
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 9
tgccatagaa atgcacgaga ttacaa 26
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 10
gttggtgtac cattccaata ccagtt 26
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 11
cgcccataag tgccttacca agtata 26
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 12
tctgataccg caaccgctat tgtatac 27
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 13
tgtccgtgcc ccaaattcca g 21
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 14
gtctcggtca ggtctccca 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 15
ttgatggcac agtcgaggct g 21
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 16
gtggccgctt ttctggattc at 22

Claims (10)

1.一种可治愈性传播感染病原体检测体系，其特征在于：包括分别针对梅毒螺旋体、阴道毛滴虫、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体和人型支原体进行检测的正反向引物，检测样本为生殖道分泌物。
2.根据权利要求1所述的可治愈性传播感染病原体检测体系，其特征在于：针对梅毒螺旋体的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，针对梅毒螺旋体的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
针对阴道毛滴虫的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对阴道毛滴虫的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
针对沙眼衣原体的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，针对沙眼衣原体的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
针对淋病奈瑟菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，针对淋病奈瑟菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
针对解脲脲原体的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，针对解脲脲原体的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
针对人型支原体的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，针对人型支原体的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。
3.根据权利要求2所述的可治愈性传播感染病原体检测体系，其特征在于：还包括针对人DNA内参进行检测的正反向引物和针对系统质控内参进行检测的正反向引物；所述人DNA内参对应的是人类10号染色体全基因组序列上的RP11-320F15位点，所述系统质控内参对应的是人工构建的假病毒的特征序列，检测样本为生殖道分泌物与系统质控内参的混合物；针对人DNA内参的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，针对人DNA内参的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；针对系统质控内参的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，以及针对系统质控内参的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。
4.根据权利要求3所述的可治愈性传播感染病原体检测体系，其特征在于：针对梅毒螺旋体和阴道毛滴虫的正向引物在检测体系中的终浓度均为400nM，针对梅毒螺旋体和阴道毛滴虫的反向引物在检测体系中的终浓度均为400nM；针对沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体、人型支原体、人DNA内参和系统质控内参的正向引物在检测体系中的终浓度均为200nM；针对沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体、人型支原体、人DNA内参和系统质控内参的反向引物在检测体系中的终浓度均为200nM。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的可治愈性传播感染病原体检测体系，其特征在于：还包括多重PCR预混液、多重PCR酶液和无核酸酶纯水；所述多重PCR预混液由10×PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs混合而成；所述多重PCR酶液由热启动DNA聚合酶和UNG酶混合而成。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的可治愈性传播感染病原体检测体系，其特征在于：所有正向引物的5’端设有荧光标记，所述荧光标记为CY5或CY3或FAM。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的可治愈性传播感染病原体检测体系，其特征在于：还包括阳性对照物和阴性对照物；所述阳性对照物是包括所有目的基因靶点的质粒混合物；所述阴性对照物是无核酸酶超纯水。
8.根据权利要求5所述的可治愈性传播感染病原体检测体系，其特征在于：反应时体系中的组分用量为10×的PCR缓冲液1体积，10μM的dNTPs共0.2体积，25mmol/L的MgCl2溶液0.8体积，引物混合物1体积，5U/μL的热启动DNA聚合酶0.4体积，1U/μL的UNG酶0.5体积，DNA模板5体积，无核酸酶纯水1.1体积；所述DNA模板的使用量为5～50ng/体系。
9.一种包括如权利要求1所述的检测体系的可治愈性传播感染病原体检测试剂盒。
10.一种采用如权利要求1所述的检测体系制备可治愈性传播感染病原体检测和诊断产品的应用。
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