CN101405411A

CN101405411A - 高通量检测生物样品中微生物的存在

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Publication number: CN101405411A
Application number: CNA200780010303XA
Authority: CN
Inventors: 安德烈·塞米科霍德斯基; 西蒙·格林
Original assignee: Stirus Global Solutions Ltd
Current assignee: Green Simon; Semikhodskii Andrei
Priority date: 2006-01-23
Filing date: 2007-01-23
Publication date: 2009-04-08
Also published as: EP1984520B1; GB0601302D0; JP2009523458A; RU2435865C2; CA2639069A1; WO2007083147A2; GB2434644A; WO2007083147A3; US20160108467A1; UA100495C2; GB0701298D0; EP1984520A2; SG169342A1; RU2008134195A; JP5650887B2; US20090306230A1

Abstract

本发明提供了高通量检测包含或者不包含微生物的生物样品的方法和装置。所述方法包括使用经专门设计用于经由引物延伸反应同时鉴定生物样品中多种可能的微生物的诊断性复合板，所述引物延伸反应是针对检测的微生物中的高度保守的核酸序列。在将所述生物样品转移至第二场所用于利用DMP分析前，通常将其固定于第一场所的固体基质上。本发明的方法和装置特别适宜生物样品中是否存在感染性病原体的诊断，例如传播性感染的诊断。

Description

高通量检测生物样品中微生物的存在

技术领域

本发明涉及利用基于核酸的酶促技术高通量复合检测(high throughputmultiplex testing)可能存在于生物样品中的微生物。具体来说，本发明是针对致病微生物的鉴定。

背景技术

自从19世纪将微生物确定为发病率和死亡率的主要原因之一以来，人们一直致力于监控和控制感染性疾病的传播。新兴学科流行病学的开拓者如John Snow最早做了努力，最著名的是他将伦敦Broad街的抽水泵(handle ofLondon’s Broad Street Pump)确定为城市范围内霍乱爆发的源头后，极好地将其移除。在20世纪，抗生素、大规模接种和抗病毒治疗的出现至少在发达国家为此类疾病的传播提供了空前的控制水平。然而，在世界范围内，传染性疾病仍然是死亡的主要原因之一，而且似乎每年都出现“新型”微生物杀手这种不断的延续。MRSA、SARS、禽流感、HIV和疟疾仅代表了在全球范围内引起恐慌和担忧的许多传染性病原体的一部分。

国际健康组织如UN和WHO一贯对无节制地使用抗生素化合物表示担忧，因其会促使许多微生物物种的抗生素耐受水平增加。另外，目前在世界范围内和某些地区，性传播感染(sexually transmitted infections，STIs)代表着一种最具传染性的疾病难题，特别是非洲和前苏联很流行此类疾病。根据一项研究(Adler，M.，2005，Why sexually transmitted infections are important.In：ABC of sexually Transmitted infections.5^th ed.BMJ Books)，报道的感染人数在西欧为1700万，在美国为1500万，在非洲为7千万，全世界为4亿。

防止性传播感染和HIV/AIDS在世界性政府健康议程上仍然是最重要的，而且很明显，需要在获得健康服务方面进行改进以及为所有需要的人建立和提供可用的诊断服务。许多STIs是无症状的，并且仅可通过检测进行诊断，然而，常规的筛选方法非常少，社会污名高，资金不足，并且公众意识有限。

感染性疾病的影响并非限于人群，在家畜和农作物中疾病的爆发也会引起严重的经济损失。猪瘟、牛口蹄疫以及禽流感的爆发可迅速传播并毁坏农村的农业产量和经济。2001年在英国，口蹄疫的爆发导致杀死超过7百万头牛羊并对农村地区实施了有效“隔离”。

目前，筛选宿主(如患者、动物或植物源)样品中是否存在微生物的可用系统是低通量的。在临床环境中，通常对每个样品仅进行一种微生物检测，除非宿主有遭受几种微生物疾病的医学症状。这意味着，每次检测仅能检验单个感染，而这会明显影响费用和检测时间。此外，对于无症状宿主通常难以决定应该检测哪种微生物。两种或三种感染性生物体的阴性结果会提供错误的安全判断。

临床实践中所用的现代化系统使用基于DNA的分析方法来检测微生物感染。最常见的方法是基于多聚酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应、链置换扩增(Strand displacement amplification)、转录介导的扩增(transcriptionmediated amplification)、基于序列的扩增分析(sequence based amplificationassay)和其他的几种方法。这些方法也是低通量、耗时的，需要大量的实践时间且难以自动化。另外，现在还没有一种可靠的方法能利用采集自宿主生物体的单个样品在单个试验中检测多种病原体。

因此，需要提供可靠且低廉的检测可能存在于生物样品中的多种微生物的工具。特别是，需要提供能有效地对室内或野外的可靠生物样品采集品进行检测的工具。

发明概述

就广义而言，本发明通过提供高通量检测包含或者不包含微生物的生物样品的方法和装置，克服了现有技术中的上述问题。所述方法包括使用经专门设计用于同时鉴定存在或不存在于生物样品中的多种可能的微生物的诊断性复合板(diagnostic multiplexing panel，DMP)。

第一方面，本方面提供了测定一种或多种特定微生物是否存在于可能含有这些微生物的生物样品中的方法，所述方法包括：

(a)在第一场所将生物样品固定于固体基质上和/或固体基质中；

(b)将固定的生物样品转移至至少第二场所并在固体基质上进行提取步骤，以便提取固定于基质上和/或基质中的微生物DNA；

(c)对步骤(b)中提取的微生物DNA进行核酸扩增步骤，其中扩增步骤是扩增来自一种或多种特定微生物的至少一种高度保守序列，并且其中将扩增的序列指定为靶序列；

(d)将所述靶序列与包含于诊断性复合板(DMP)中的多种引物序列结合，其中每种引物序列都会促进靶序列的基因分型；

(e)对步骤(d)中靶序列和DMP的结合物进行引物延伸反应，从而生产DMP反应产物；以及

(f)分析反应产物以测定存在的靶序列的基因型，并且使反应产物中的靶序列基因型与存在于生物样品中的特定微生物的鉴定相关联。

第二方面，本发明提供了DMP，其适用于对存在于生物样品中的已知能引起至少一种感染性疾病的致病微生物进行基因分型，所述DMP包含多种引物序列，所述引物序列当用于引物延伸反应中时能鉴定出已知能引起感染性疾病的至少一种微生物的高度保守的等位基因中的至少两种或多种SNPs。

第三方面，本发明提供了适宜位于第一场所的用户个人使用的微生物检测试剂盒，所述试剂盒包含位于密封小室内的检测表面，所述检测表面还包含能将生物样品固定于其中或其表面的固体基质，其中一旦生物样品沉积于该检测表面，就在检测表面周围将所述小室密封，以便能将所述试剂盒运送到用于分析的第二场所，从而测定一种或多种微生物是否存在于所述生物样品中。

第四方面，本发明提供了治疗疑似携带一种或多种感染性微生物的动物(包括人)的方法，所述方法包括从所述动物中获得生物样品，根据本文所述的方法检测所述生物样品，由此诊断所述动物是否感染了一种或多种感染性微生物，并且为所述动物实施治疗，其中所述治疗是根据发现的存在于生物样品中的感染性微生物类型的信息而适当设计的。任选地，还根据生物样品中发现的一种或多种感染性微生物对抗生素耐受情况的信息，适当设计所述治疗方法。根据本文提供的教导，本发明的这些以及其他用途、特征以及优势对本领域熟练的技术人员来说是显而易见的。

附图说明

图1示出高度保守的DNA共有序列的示意图-所述共有序列通过比较相同种的几种菌株而产生-图中示出选出的在本发明DMP中所用的用于扩增或引物延伸反应的引物位置。对每种引物而言，最初的两个字母确定生物体，之后的字母确定对应物种的靶序列(1-3)；1stPCRP表示第一次PCR引物；2ndPCRP表示第二次PCR引物；E1或E2表示延伸引物；对于脲原体属(Ureaplasma)而言，有两个设计引物的位点(UU1和UU2)。引物的特征列于表1中。生物体是：(a)白色念珠菌(Candida albicans)、(b)沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、(c)阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)、(d)生殖支原体(mycoplasma genitalium)、(e)人型支原体(Mycoplasma hominis)、(f)奈瑟氏淋病双球菌(Neisseria gonorrhoeae)、(g)梅毒螺旋体(Treponemapallidum)、(h)阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、(i)解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum)。

本发明的详细描述

在阐明本发明中，提供了许多辅助理解本发明的定义。为了避免疑惑，将本文引用的参考文献的全部内容以参考方式引入。除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域内的普通技术人员所理解的具有相同的意义。在此描述了常规的分子生物学技术，期望本领域的技术人员具备此类技术知识，例如，标准的教科书如Sambrook J.等(2001)Molecular Cloning：a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，NY中的知识。

如本文所用的术语“特定微生物”旨在表示存在于或不存在于生物样品中的一种或多种微生物。适宜的特定微生物是病毒、细菌、真菌(包括单细胞酵母)和/或原生动物(包括原质团)来源的。通常，特定微生物在动物宿主生命周期的某点上对该动物是致病的。然而，对于检测表现出潜伏、共生感染或亚临床感染的微生物种类而言，本发明是足够的。

如本文所用的术语“生物样品”意指包括含有本发明检测的一种或多种特定微生物的样品。根据DMP的意图，生物样品可从人类患者、非人类动物、植物或食品中获得。在后者的情况下，DMP意在测定食源性病原体导致的食品污染。样品可适宜地包括，如尿；排泄物；阴道、鼻、直肠或口腔拭样；血液，唾液；和/或痰；精液；阴道或尿道排放物以及其拭样；泪液(即泪腺分泌物)；活组织检查样品；以及任何上述分泌物和物质沉积于其上的表面拭样。尽管本发明的生物样品可含有来源于宿主生物体如人类患者的细胞、组织或DNA，但本发明的意图是检测存在于该宿主中的微生物的存在，而不是检测宿主自身的DNA。

本发明的固体基质适宜地选自浸有一种或多种试剂的有吸收能力的纤维材料，所述的一种或多种试剂的作用是固定或失活存在于生物样品中的微生物，或更简单地是使微生物中的核酸固定。此类试剂可包括洗涤剂化合物：阴离子或阳离子洗涤剂、螯合剂(如EDTA)、尿素和/或尿酸。固体基质自身可并入(incorporate)吸附剂，所述吸附剂是选自下述各项的一种材料：含纤维素的纸(如吸水纸)、微纤维膜、玻璃纤维材料、聚合纤维材料(如尼龙过滤膜)、织物(woven fabric)以及无纺布。适宜的固体基质描述于例如美国专利号5496562、6756126、5807527、5939259、5972386、5985327、6168922、6746841以及6750059中。在本发明的具体实施方案中，固体基质包括用Whatman

或Whatman FTA

试剂处理过的过滤纸，如Whatman

纸或Whatman FTA

纸。

本发明方法的一个显著优势是，用试剂如Whatman FTA

试剂处理的固体基质可由非临床环境中的个人使用。例如，可以想象，本发明方法的最初样品采集阶段可由个体购买试剂盒并简单地用如尿样或唾液样品湿润固体基质来进行。固体基质将存在于尿液或唾液中的微生物固定，因而，感染性的病原体安全地变成非感染性的，而且可将样品例如通过常规邮寄服务而运送到检测场所，而无需高昂的处理(即冷藏或其他的化学固定)。在检测场所，可便利地从固体基质中提取固定的微生物DNA，通常利用简单的热洗脱和水洗脱步骤来进行。因此本发明提供了一种可在家或野外进行生物样品的采集，样品可无限期保存且可之后进行检测的系统。这种安排的优点很明显，因为目前大多数诊断学检测受到样品采集需要在临床环境中进行的束缚，而这从整体上降低了对群体的了解。

本发明实施方案的适宜的家庭检测试剂盒包括封闭检测表面的可密封小室。试剂盒包括使用说明书，其指导用户将生物样品如尿滴置于检测表面上。检测表面包含上述类型的固体基质。在将样品沉积于检测表面上后，关闭密封小室，以便封装和保护检测表面免受其他的干扰。在密封状态下，试剂盒免受外界的干扰或污染而保持安全，并可运送至远离用户家庭的检测设备处。在检测设备处，出于根据本发明方法的分析目的，可打开密封的小室(如果需要，破坏小室使其打开)，以便对检测表面进行分析。

“核酸序列”是单链或双链共价连接的核苷酸序列，其中在每个核苷酸上3’和5’端通过磷酸二酯键连接。核酸序列通常是多核苷酸，其可由脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成。多核苷酸包括DNA和RNA，并可以合成的方式体外制造或从天然来源中分离。对于双链多核苷酸而言，核酸序列的大小通常表示为碱基对(bp)数目，或者在单链多核苷酸的情况下，其表示为核苷酸(nt)数目。1000个bp或nt等于一个千碱基(kilobase，kb)。长度少于约40个核苷酸的多核苷酸通常称为“寡核苷酸”。在本发明中所用的核酸扩增和引物延伸步骤的引物序列是单链寡核苷酸。

如本文所用的“核酸扩增反应”表示一些与酶相关的技术，其利用引物延伸、变性和杂交的连续循环，采用热稳定性DNA聚合酶扩增指定的DNA序列。通常，PCR是本发明方法使用的优选核酸扩增反应。

术语“引物延伸反应”意在表示这样一种反应，即在该反应中，设计核酸引物以便使其与靶序列杂交并通过向引物的3’端添加一个或多个核苷酸而酶促延伸。引物在给定的靶序列的某位置处杂交，该位置直接是多态性如单核苷酸多态性位置的5’端或几个碱基上游。在本发明的实施方案中，如果引物在已知的SNP位点的碱基上游处杂交，则单碱基-引物延伸反应就作用于引物-靶序列杂合体，以便加入单链终止核苷酸，通常为双脱氧核苷酸。4个核苷酸中仅有一个核苷酸能够使引物延伸，该核苷酸就是与靶链中的序列互补的核苷酸。在下文中更详细描述了在本发明方法的分析阶段，添加的核苷酸特性的确定。

术语“多态性等位基因”在本文中用于表示占据相同的染色体基因座并调控相同的遗传性状的基因序列的任何两个或多个可选形式。等位基因变异可通过突变自然发生，并在群体内导致表型多态性，或导致保守的(非多态性的)多态性。基因突变通常导致核苷酸序列的改变。如本文中所用的，等位基因多态性现象的利用有单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)、插入、缺失、倒位和取代，这些甚至都可在给定种类的高度保守的基因中发生。SNPs是多态性的，其中等位基因由于基因组给定位置的DNA序列中的单个核苷酸的取代/替代而不同。在高度保守的基因中，如细菌的16S rRNA，SNPs是物种和菌株高度特异性的，据此可获得准确的基因分型信息。在微生物中其他的高度保守区域包括细菌32S rRNA基因、酵母16S和18S rRNA基因以及病毒聚合酶基因。然而，利用生物信息学技术确定给定微生物基因组的其他可选的保守区域在熟练的技术人员的考虑范围内。可将多态性，如上文所述的那些，与检测的微生物的具体多态性结合起来。例如，抗生素耐受与突变有关，因此具有多态性。然而，本发明的方法不限于仅确定检测的微生物基因组中的多态性位点。当给给定的保守靶序列使用竞争调控序列时，术语“多态性等位基因”宽松地用于表示在野生型序列(正检测的)和人工竞争序列之间给定的序列部分中的变异。在此情况下，应该理解，所谓的多态性仅仅是帮助区分引物延伸对竞争模版和野生型模版相比的反应产物，因为，各自的反应产物会具有不同的相对分子量。

本发明部分基于可靠且高通量地检测一种或多种生物样品中微生物存在的方法。使用诊断性复合板(DMP)使高通量分析成为可能，该复合板是对可能存在于生物样品中的多种微生物进行基因分型。DMP提供了引物组合，每个引物都会特异性地与存在于生物样品中的微生物的DNA中的高度保守序列杂交。DMP允许同时进行引物延伸反应，以确定多种生物体中的一种或多种是否可能存在于单个样品中。本发明的DMPs可适宜地针对具体的治疗或诊断领域，其中被检测的微生物从广义上讲落入疾病的范围或类型内。在下文更详细描述的本发明用途的实例中，针对诊断取自人类患者的生物样品中性传播感染的存在而装配DMP。这种DMP类型可适宜地检测细菌病原体的存在如支原体属的种类(Mycoplasma spp.)、衣原体属的种类(Chlamydiaspp.)、脲原体属的种类(Ureaplasma spp)、奈瑟氏菌属的种类(Neisseria spp.)、加德纳氏菌属的种类(Gardnerella spp.)、毛滴虫属的种类(Trichomonas spp.)、密螺旋体的种类(Treponema spp.)；或检测酵母白色念珠菌(Candida albicans)的存在；或检测病毒病原体的存在如细胞肥大病毒(CMV)、肝炎病毒(如HAV、HBV和HCV等)，人免疫缺陷病毒(HIV)、人类乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(herpes simplex viruses，HSV)、传染性软疣病毒(Molluscumcontagiosum virus，MCV)、流感病毒、埃巴氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)和水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)。DMP适宜针对的其他疾病领域包括：食物中毒、肺结核、病毒诱发性癌症、脑炎、疟疾、肝炎、脑膜炎、利什曼病、非洲锥虫病(African trypanosomiasis)、肺炎、瘟疫、SARS、MRSA、狂犬病、炭疽、裂谷热(Rift valley fever)、兔热病、志贺氏菌病(Shigella)、肉毒中毒(botulism)、黄热病(yellow fever)、Q热(Q fever)、伊波拉病(ebola)、登革热(dengue fever)、西尼罗河热(West Nile fever)、痢疾、流感、麻疹和斑疹伤寒症。

本发明还能通过在DMP检测设计中包括在细菌病原体中赋予抗生素敏感性的序列，而检测该序列。它通过排除额外的抗生素敏感性的微生物学鉴定的分离步骤，而加快开始治疗发现携带此类病原体的个体的速度。而且，本发明通过测定检测的病原体浓度，在某些情况下该浓度会反应疾病的进程，从而提供有关某些疾病进程的信息。浓度可以包括例如病毒负荷的评估。从反应的引物延伸阶段可获得定量信息，例如，通过将竞争序列包括到给定的靶序列内，其中竞争序列与靶序列相比，在其序列的指定位置包含引入的多态性。竞争序列可适宜地包括在已知的SNP位置处的可选的核苷酸，其余则是相同的。如果在核酸扩增阶段以已知的浓度(或拷贝数)提供竞争序列，则其可充当用于定量来自目的微生物的包含多态性的靶序列浓度的基准。在本发明具体的实施方案中，提供不同浓度(如低、中和高浓度)的其他竞争序列是可能的，他们都具有针对靶序列中的特异性位点而引入的序列变异，以使更准确的定量最初生物样品中微生物的浓度成为可能。除定量外，在本发明的诊断性方法中，包括竞争序列也为所有的酶促步骤提供了内部对照。

适宜提供的本发明的DMP是在溶液内的多种适当成丛的引物(plexedprimers)，但是DMP还可以包括固定在诸如微阵列型的固体表面上的引物。适宜的固体表面类型是硅基质或玻璃基质。

引物延伸后，DMP反应产物的解析可通过结合荧光标记的核苷酸(如Beckman Coulter’s

或美国应用生物系统公司的)或其他的标记(如抗原、生物素或放射性标记)，利用许多技术来实现，包括质谱(如MALDI-TOF)、电泳(如毛细管电泳)、DNA微阵列(如Affymetrix’s GeneChip^TM或已印好的DNA阵列(printed DNA arrays))。解析引物延伸产物的优选方法包括根据相对分子量测定，对此，质谱和毛细管电泳两者是优选的。

在本发明的一个具体实施方案中，包含于DMP中的每个引物根据总核苷酸长度而变化，以便两个引物在引物延伸反应前或引物延伸反应后的相对分子量都不是相同的。纯化反应产物，以便优化质谱分析。纯化后，将产物点样于适当的元件，通常是引入质谱分析位点的高密度光抵抗阵列(photo-resistant array)的硅芯片(如

)上，并在基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪中进行分析(如美国专利号6500621、6300076、6258538、5869242、6238871、6440705和6994969中描述的Sequenom’s质谱仪)。利用适当的软件包处理质谱分析的结果，以便提供引物延伸产物存在或缺失的信息，所述产物与生物样品中具体特定微生物的存在或缺失相关联。

一些非限制性实施例进一步说明了本发明。

实施例

本发明人研发了一种廉价、耐用、准确度高的检测，其具有测定单个样品中任何数目感染物的潜力。所述检测包括两个部分：简单的家庭采集试剂盒(利用Whatman FTA

纸作为样品携带基质)和作为诊断性复合板(DMP)的新型性传播感染复合板(sexually transmitted infection Multiplex Panel，STIMP)，其可利用基于DNA的技术测定给定个体是否感染了一种或多种性传播细菌、病毒、原生动物和/或真菌病原体。

本发明的实例表明：

·Whatman FTA纸是来自人尿样的细菌、真菌和原生动物病原体的适当载体。

·存在于Whatman FTA

纸或尿液中的化合物不干扰下游的酶检测过程。

·新型STIMP发挥如DMP的作用，并且能从病原体混合物中检测出各个病原体。

材料和方法

·临床样品

从参与乌克兰私人GUM(Genito-Urinary Medicine，泌尿生殖医学)门诊的患者中获得共44个样品。

要求出席会诊的实验组患者将初段尿(first void urine)样品(大约30ml-50ml)提供于无菌的采集瓶中。提供的所有样品均获得患者同意、满足伦理要求和规章(包括采集样品的方法)，并按照乌克兰卫生部(Department ofHealth)的规定进行。

各尿样转移到Whatman FTA

(Whatman plc，Brentford，UK)样品卡上，是通过将无菌末端泡沫应用仪(

Maine，USA)浸入到尿样瓶中，然后在样品卡的4个独立区域点样4次来完成。

样品转移后，将每个单独的Whatman FTA

卡室温干燥，直到完全干燥。为了避免交叉污染，将干燥的样品卡单独放置于自我密封的聚乙烯包内，并在室温下进一步保存。

随后将第一批样品和第二批样品(分别为31和13个单独的样品)以两次发货的形式海运(通过联邦快递的快送服务(Federalcourier servier))至德国实验室的检测场所。第一批样品采集是在2006年12月12至2006年12月26日(含该区间的两个端点)进行，第二批样品采集是在2007年1月5日至2007年1月12日(含该区间的两个端点)进行。

当地的独立实验室(乌克兰基辅)对所有的样品进行了并行分析，该实验室由乌克兰卫生部推荐，利用常规的基于DNA的检测技术专门从事性传播感染的检测。

检测所有样品是否存在下列微生物：

白色念珠菌

沙眼衣原体

阴道加德纳氏菌

生殖支原体

人型支原体

奈瑟氏淋病双球菌

阴道毛滴虫

梅毒螺旋体

解脲脲原体

随后，利用采用STIMP/DMP法获得的结果(称为“实验室”)，与由当地检测实验室获得的结果(称为“临床”)进行比较。

·实验程序

DNA提取

为了说明DNA浓度的差异，按下列顺序利用手持打孔设备从每个Whatman FTA

样品卡上切除6个6mm的样品圆盘：1×环/2ml管、2×环/2ml管、3×环/2ml管。每个样品卡切除后，通过穿透洁净的滤纸3次随后再穿透70％EtOH浸泡的滤纸3次，使打孔设备清洁。为了解决交叉污染，接着再将干净的FTA卡打孔一次，并按如下提取DNA(试管编号4)。

为了说明6mm样品圆盘打孔与推荐的3mm样品圆盘打孔相比较，利用我们改良的Whatman’s FTA Elute

DNA提取方案进行DNA提取。将1、2和3个6mm样品圆盘或切离的纸碎片(EPF)放置于分别加入了0.7ml、1.4ml和2.1ml ddH₂O的单独的2ml圆底Eppendorf试管中。

将每个样品涡旋3次每次5秒，接着将样品圆盘转移至单独的干净的0.5ml Eppendorf试管中。

将50μl、80μl和100μl ddH₂O分别加入含有1、2和3个样品圆盘的试管中，此后，将试管再95℃温育30分钟。温育后，将样品以12000g离心2分钟并保存于+4℃。为了进行PCR扩增，直接使用1μl各样品或与ddH₂O以1∶1稀释。

阳性对照

使用从国家典型微生物保藏中心(National collection of Type cultures，NCTC)获得的下列细胞系作为阳性对照：

细胞系编号物种

NC12700 奈瑟氏淋病双球菌

NC11148 奈瑟氏淋病双球菌

NC08448 奈瑟氏淋病双球菌

NC10177 解脲脲原体

NC10111 人型支原体

NC10915 阴道加德纳氏菌

NCPF3179 白色念珠菌

NC10195 生殖支原体

将细胞用500μl新鲜尿液稀释，随后，从每个样品中取出50μl制备如下阳性对照：

阳性对照1

NC12700 奈瑟氏淋病双球菌

NC10177 解脲脲原体

NC10111 人型支原体

NC10915 阴道加德纳氏菌

NCPF3179 白色念珠菌

NC10195 生殖支原体

阳性对照2

NC11148 奈瑟氏淋病双球菌

NC10177 解脲脲原体

NC10111 人型支原体

NC10915 阴道加德纳氏菌

NCPF3179 白色念珠菌

NC10195 生殖支原体

阳性对照3

NC08448 奈瑟氏淋病双球菌

NC10177 解脲脲原体

NC10111 人型支原体

NC10915 阴道加德纳氏菌

NCPF3179 白色念珠菌

NC10195 生殖支原体

将阳性对照和用于稀释细胞的新鲜尿样按Whatman(50μl/cm²板)所推荐吸至单个FTA

卡上。施加了样品后，将板在60℃干燥1小时，并如上提取DNA。

另外，各阳性对照和新鲜尿样(用于稀释细胞)的等分试样都是直接使用或用ddH₂O以1∶5稀释而用于PCR扩增。

在实验时，我们未能获得沙眼衣原体、阴道加德纳氏菌或梅毒螺旋体的阳性对照。

试验设计

DMP试验设计以各目标物种的不同菌株之间高度保守的DNA序列为基础。为了说明高度可变性，用保守区域的3个不同区为每种病原体设计3个试验。除了白色念珠菌，其所选的保守区域是18S rRNA基因(参阅图1)之外，所有病原体的所选保守区域都是16S rRNA。

对于解脲脲原体，用两种不同的保守区域设计6个试验。PCR和引物延伸(primer extension，PE)引物的精确序列显示于表1中。

试验确定品中下列细菌、真菌和原生动物物种的存在：

白色念珠菌

沙眼衣原体

阴道加德纳氏菌

生殖支原体

人型支原体

奈瑟氏淋病双球菌

阴道毛滴虫

梅毒螺旋体

解脲脲原体

进行两种类型试验。第一种类型包括每个靶标的对照竞争序列，第二种类型不含有任何竞争剂(competitor)。竞争剂的作用是充当PCR、PE、和其他酶促反应以及芯片点样(chip spotting)的内部阳性对照。在具有竞争剂的样品中，即使样品不含有来自病原体的相应DNA靶标，也可预料会至少看到竞争剂的信号。将竞争剂设计为与在目的SNP位点带有已知的单个核苷酸差异的靶标DNA序列相同，所述的竞争剂的序列显示于表1中。以每个PCR扩增的每个靶标约30个拷贝的量加入竞争剂。在没有竞争剂的情况下分析的样品中，仅当来自病原体的靶DNA存在于样品中时，信号才是可以期望的。来自相同复合体(multiplex)的靶标彼此充当内部阳性对照，然而，如果一起扩增的所有靶标都没有信号，则不能推定样品不含任何靶标病原体DNA或者一个或多个酶促反应失败。

PCR扩增

以5μl反应体积(含有1.25×

PCR缓冲液、1.625mM MgCl₂、每种dNTP 0.04mM、每种引物0.1μm以及0.1U Hot)进行PCR扩增。循环参数如下：

95℃ 15分钟

94℃ 20秒

56℃ 30秒

72℃ 1分钟

循环45次

72℃ 3分钟

4℃ 5分钟

15℃待机(forever)在MJR Tetrad热循环仪上进行扩增。

虾碱性磷酸酯(shrimp alkaline phosphate，SAP)处理

PCR扩增后，向每个试管中加入下列物质：1.53μl H₂O、0.17μl TS缓冲液和0.30μl的SAP。反应以下列参数进行：

37℃ 20分钟

85℃ 5分钟

4℃待机

在MJR Tetrad热循环仪上进行反应。

引物延伸反应

根据iPLEX^TM方案(Sequenom，Inc.，San Diego，CA，USA)，进行引物延伸。温育后，将含有1×iPLEX缓冲液、1×iPLEX终止混合物、每种延伸引物0.625μM和1×iPLEX酶的2μl iPLEX引物延伸混合物加入到各试管中。使用下列参数进行iPLEX反应：

94℃ 30秒

94℃ 5秒

52℃ 5秒

80℃ 5秒

回到步骤3，×5次

回到步骤2，×40次

72℃ 3分钟

4℃ 待机

在MJR Tetrad热循环仪上进行反应。

脱盐

将16μl H₂O和6mg

树脂加入到上述混合物中，并在圆形震荡器(circular shaker)上旋转30分钟，随后3,000g离心5分钟，沉淀树脂。

样品点样

根据每个制造商的说明书，使用

纳米点样自动仪(Nanospotter robot)，将9纳升的各样品点样于384个

上。随后在MALDI-TOF质谱仪(小型分析仪)上对各芯片读数，使用Typer v 3.3(或更高级的软件)收集数据，并保存于数据库中。

基因分型得分和样品感染状态的测定

对于每个试验(DNA靶标)来说，通过人工引入单核苷酸多态性(SNP)来设计具体的竞争剂以区别靶DNA。基因分型软件将后者称为MUT(突变体)基因型。致病性SNP称为C(对照)基因型。当竞争剂和靶DNA两者都存在于反应中时，软件对称为C.MUT或MUT.C的异质基因型进行评分。异质基因型中等位基因的顺序反映了反应中相应DNA的相对比例。

如果3个试验中有2个试验显示致病性DNA存在于单个DNA样品中，则认为所述样品是受到了感染。如果从每个患者的样品卡中获得3种不同的DNA样品，则可以预料，这3种样品应该显示相同的结果(注意：因为每个样品可能含有不同拷贝数的病原体，由于与从单个样品圆盘中提取的DNA相比，致病性DNA数量的增加会使来自2个和3个样品圆盘中的DNA样品产生更可靠的结果)。偶尔，会仅有1个或2个试验显示致病性DNA存在于患者的样品中，而大多数对所有DNA样品的此病原体的分析却是阴性的。认为这些结果是一种假象(最可能的原因是交叉污染)，但样品的评价是阳性，且在结果一览表(表2)中紧邻该结果处用“X”叉号来表示存在。

·结果和讨论

Whatman FTA纸

为了研究存在于Whatman FTA

纸或尿液中的任何化合物是否会干扰下游的酶促过程，将一系列含有已知优质DNA的等分式样的模拟样品(mock samples)用提取1个、2个和3个样品圆盘后获得的洗提液或用新鲜的尿液进行1∶1稀释。样品随后用于PCR和其他的下游酶促过程。对于所有的样品而言，均获得优质的PCR产物和质谱(数据未提供)。这表明，所选的提取方法和洗涤方案对MALDI-TOF分析来说是适当的，也表明人尿中的物质未显著影响DMP分析的可靠性。

为了测定Whatman FTA

纸是否能捕获并保存尿液样品的致病性DNA，将属于由当地实验室分析鉴定为阳性的患者的几个DNA样品(从卡上提取而来)(临床)，利用来自STIMP/DMP的引物在50μl反应液中进行扩增，并在2％琼脂糖凝胶上在1×TBE缓冲液中对产物进行分离(参阅图1)。在所有的情况下，观察到了正确大小的扩增子的优良信号，表明致病性DNA以足够进行可靠的PCR扩增的量存在于Whatman FTA

纸中。

用阳性对照尿液样品进行了相同的实验，并观察到相似的结果(数据未提供)。

这些结果证实，含纤维素的产品如Whatman FTA

纸可用作既能收集患者样品又能转运患者样品的适宜固体基质，并未显示可见的时间依赖性退化。然而，可以想到，原尿样品以及固定于其他类型的基质上的生物样品也可以利用本发明的STIMP/DMP方法进行检测。

STIMP/DMP方法

在具有竞争性对照序列或不具有竞争性对照序列的情况下，检测所有的样品。在大多数包括阳性对照的情况下，包括竞争剂的实验产生了竞争性DNA的信号。

在这部分中，讨论了当竞争剂未包括于反应中时从实验中获得的结果。

表2显示了实验结果。

阳性对照

为了证实STIMP/DMP方法是否可以用于从病原体混合物中检测出单个病原体，用尿液作为介质，产生了通过混合由NCTC获得的性传播病原体而获得的3种阳性对照(参阅上文)。阳性对照样品都以尿液样品和WhatmanFTA

纸样品进行了分析(表3)。在所有的情况下，不依赖于其特性，检测到了样品中每种病原体的存在。样品中存在奈瑟氏淋病双球菌菌株时阳性对照有些不同。在对奈瑟氏淋病双球菌进行的所有分析中，STIMP/DMP方法能不依赖菌株的类型而检测到奈瑟氏淋病双球菌的存在。这表明，为研发奈瑟氏淋病双球菌分析而选择的DNA区域未表现出菌株依赖特异性，并且可用于检测样品中任何已知奈瑟氏淋病双球菌属的存在。

临床样品

当分析临床样品时，STIMP/DMP实验结果验证了在所有情况下独立地从临床会诊中获得和分析的结果(表2)。对于未通过检测实验室而检测的感染来说，许多样品也确定为阳性。然而，因为所有的试验都没有检测到病原体而仅有一个(很少地有2个)DNA样品具有阳性信号，这些结果应该被认为是这种初步研究的假象。在大多数情况下，当样品在先前点样的样品卡上的患者对一种特定感染是阳性时，就会发生这种情况(例如患者2&3-解脲脲原体，患者11&12-生殖支原体等)。这些假象最可能的解释是携带了以前样品的DNA。支持该观点的事实是，还发现在患者样品间使用的污染对照样品(洁净的Whatman FTA

卡)对相同的感染也是阳性的。显然，此证明了本发明的DMP的高度敏感性，而且为了避免交叉污染，需要优化今后的实验程序。

从每个患者的样品卡中收集两种不同的DNA样品。所述样品含有不同拷贝数的致病性DNA(如果存在)。在大多数情况下，鉴定从两个或多个样品圆盘中提取的阳性患者的DNA样品中的感染物是可能的。

对于来自阳性患者的多数DNA样品而言，所有的3个试验都确定出感染物。在极少的情况下，3个试验中有1个试验未产生优良的信号并且由基因分型软件进行了标记。

还可以通过滴定竞争剂的量或者在同一反应中包括已知初始浓度的3种不同的竞争剂，来测定反应中存在的靶DNA的拷贝数是可能的。对于根据临床观察其感染负荷水平很高的病原体而言，例如感染了HIV或阴道加德纳氏菌的个体，推荐使用后一种方法。

表2

尽管本文已经详细公开了本发明的具体实施方案，但其仅以实施例的方式和出于说明的目的而进行的。对于紧随其后的附加的权利要求，上述的实施方案并非意在限制。本发明人考虑到，在没有偏离权利要求所界定的本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做各种替换、改变和修饰。

序列表

<110>安德烈·塞米科霍德斯基

西蒙·格林

<120>高通量检测生物样品中微生物的存在

<130>P14717WO/DJC/ASM

<140>PCT/GB2007/000195

<141>2007-01-23

<160>120

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人型支原体(Mycoplasma hominis)

<400>1

acgttggatg catactactc aggcggatca 30

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人型支原体

<400>2

acgttggatg cgatgatcat tagtcggtgg 30

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人型支原体

<400>3

acgttggatg gcttacctct atctaactc 29

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人型支原体

<400>4

acgttggatg aagtctggag ttaaatcccg 30

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum)

<400>5

acgttggatg aacccaacat ctcacgacac 30

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>6

acgttggatg aacaatatga caggtggtgc 30

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)

<400>7

acgttggatg ttcgccactg gtgttcttcc 30

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>沙眼衣原体

<400>8

acgttggatg agatggagaa aagggaatt 29

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)

<400>9

acgttggatg ttggagcatc cagcattacc 30

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>阴道加德纳氏菌

<400>10

acgttggatg agtaatgcgt gaccaacctg 30

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>梅毒螺旋体

<400>11

acgttggatg gtccgccact ctagagaaac 30

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>梅毒螺旋体(Treponema pallidum)

<400>12

acgttggatg gcgttttaag catgcaagtc 30

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>梅毒螺旋体

<400>13

acgttggatg tcaatccgga ctacgattgc 30

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>梅毒螺旋体

<400>14

acgttggatg acaatggttg ctacagagcg 30

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>15

acgttggatg tacgtgttac tcacccgttc 30

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>16

acgttggatg tggcggcatg cctaatacat 30

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>阴道加德纳氏菌

<400>17

acgttggatg acaagctgat aggacgcgac 30

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>阴道加德纳氏菌

<400>18

acgttggatg ttgacgcatg tcttgttggg 30

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>生殖支原体(Mycoplasma genitalium)

<400>19

acgttggatg ttgctcccca cactttcaag 30

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>生殖支原体

<400>20

acgttggatg tggcgaaggc gaaaacttag 30

<210>21

<211>30

<212>DNA

<213>阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)

<400>21

acgttggatg atgaggtcaa cttttcctcc 30

<210>22

<211>30

<212>DNA

<213>阴道毛滴虫

<400>22

acgttggatg ctctggtgct aatacatgcg 30

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>23

acgttggatg aaattcccta ctgctgcctc 30

<210>24

<211>30

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>24

acgttggatg gtactgagag gtagaacagc 30

<210>25

<211>30

<212>DNA

<213>白色念珠菌(Candida albicans)

<400>25

acgttggatg ttattccagc tccaaaagcg 30

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>白色念珠菌

<400>26

acgttggatg aagcccaagg ttcaactacg 30

<210>27

<211>30

<212>DNA

<213>阴道毛滴虫

<400>27

acgttggatg tcatgagaga gaagctgagg 30

<210>28

<211>30

<212>DNA

<213>阴道毛滴虫

<400>28

acgttggatg cgcccttgat cgacagaaac 30

<210>29

<211>30

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>29

acgttggatg cgatcctacc ctagacgcat 30

<210>30

<211>30

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>30

acgttggatg cgtcaaacta tgggagctgg 30

<210>31

<211>16

<212>DNA

<213>人型支原体

<400>31

tcactgacgc agctaa 16

<210>32

<211>16

<212>DNA

<213>人型支原体

<400>32

cggctcgctt tggata 16

<210>33

<211>16

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>33

ggtggtgcat ggttgt 16

<210>34

<211>17

<212>DNA

<213>沙眼衣原体

<400>34

cgtgtagcgg tgaaatg 17

<210>35

<211>18

<212>DNA

<213>阴道加德纳氏菌

<400>35

ccccatgctc cagaatag 18

<210>36

<211>19

<212>DNA

<213>梅毒螺旋体

<400>36

aagcatgcaa gtcgaacgg 19

<210>37

<211>19

<212>DNA

<213>梅毒螺旋体

<400>37

gttgtgaagt ggagcaaac 19

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>38

cctaatacat gcaaatcgaa 20

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>阴道加德纳氏菌

<400>39

gttgggaaag tgtttagtgg 20

<210>40

<211>21

<212>DNA

<213>生殖支原体

<400>40

aggcgaaaac ttaggccatt a 21

<210>41

<211>22

<212>DNA

<213>阴道毛滴虫

<400>41

ctaatacatg cgattgtttc tc 22

<210>42

<211>22

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>42

aggtagaaca gccacaatgg ga 22

<210>43

<211>23

<212>DNA

<213>白色念珠菌

<400>43

aggttcaact acgagctttt taa 23

<210>44

<211>24

<212>DNA

<213>阴道毛滴虫

<400>44

cccttgatcg acagaaaccc tcta 24

<210>45

<211>24

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>45

tcaaactatg ggagctggta atat 24

<210>46

<211>30

<212>DNA

<213>奈瑟氏淋病双球菌(Neisseria gonorrhoeae)

<400>46

acgttggatg tagcgtagct aacgcgtgaa 30

<210>47

<211>30

<212>DNA

<213>奈瑟氏淋病双球菌

<400>47

acgttggatg gagttttaat cttgcgaccg 30

<210>48

<211>30

<212>DNA

<213>沙眼衣原体

<400>48

acgttggatg tgtgtacaag gcccgggaac 30

<210>49

<211>30

<212>DNA

<213>沙眼衣原体

<400>49

acgttggatg tgctagtaat ggcgtgtcag 30

<210>50

<211>30

<212>DNA

<213>人型支原体

<400>50

acgttggatg cagcgtcagt atagacccag 30

<210>51

<211>30

<212>DNA

<213>人型支原体

<400>51

acgttggatg tgaagcggtg aaatgcgtag 30

<210>52

<211>30

<212>DNA

<213>白色念珠菌

<400>52

acgttggatg gaaagcattt accaaggacg 30

<210>53

<211>30

<212>DNA

<213>白色念珠菌

<400>53

acgttggatg acggtatctg atcatcttcg 30

<210>54

<211>30

<212>DNA

<213>生殖支原体

<400>54

acgttggatg gctgcttaac agttgtatgc 30

<210>55

<211>30

<212>DNA

<213>生殖支原体

<400>55

acgttggatg caaaactccc taccacactc 30

<210>56

<211>30

<212>DNA

<213>奈瑟氏淋病双球菌

<400>56

acgttggatg tgggtgatga ttgtatcgac 30

<210>57

<211>30

<212>DNA

<213>奈瑟氏淋病双球菌

<400>57

acgttggatg tgttgtgtct taatcctgcc 30

<210>58

<211>31

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>58

acgttggatg gagctaatac cgaataataa c 31

<210>59

<211>28

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>59

acgttggatg ctcatccaaa agcgtcgc 28

<210>60

<211>29

<212>DNA

<213>白色念珠菌

<400>60

acgttggatg attagagtgt tcaaagcag 29

<210>61

<211>30

<212>DNA

<213>白色念珠菌

<400>61

acgttggatg agaaccataa cgtcctattc 30

<210>62

<211>30

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>62

acgttggatg cgtgctacaa tggctaatac 30

<210>63

<211>30

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>63

acgttggatg ctatccgaac tgagactaac 30

<210>64

<211>30

<212>DNA

<213>生殖支原体

<400>64

acgttggatg ctatcgttta cggtgtggac 30

<210>65

<211>30

<212>DNA

<213>生殖支原体

<400>65

acgttggatg cttaggcttg aaagtgtggg 30

<210>66

<211>30

<212>DNA

<213>阴道加德纳氏菌

<400>66

acgttggatg tggcgaacgg gtgagtaatg 30

<210>67

<211>30

<212>DNA

<213>阴道加德纳氏菌

<400>67

acgttggatg agagctattc tggagcatgg 30

<210>68

<211>30

<212>DNA

<213>阴道毛滴虫

<400>68

acgttggatg attcctggtt catgacgctg 30

<210>69

<211>30

<212>DNA

<213>阴道毛滴虫

<400>69

acgttggatg gagggtgcgc tactcttata 30

<210>70

<211>29

<212>DNA

<213>奈瑟氏淋病双球菌

<400>70

acgttggatg aagtcggacg gcagcacag 29

<210>71

<211>30

<212>DNA

<213>奈瑟氏淋病双球菌

<400>71

acgttggatg ggtacgttcc gatatgttac 30

<210>72

<211>30

<212>DNA

<213>沙眼衣原体

<400>72

acgttggatg cccttccgcc actaaacaat 30

<210>73

<211>29

<212>DNA

<213>沙眼衣原体

<400>73

acgttggatg attgaacgct ggcggcgtg 29

<210>74

<211>30

<212>DNA

<213>梅毒螺旋体

<400>74

acgttggatg tcaatcatcg gccagaaacc 30

<210>75

<211>30

<212>DNA

<213>梅毒螺旋体

<400>75

acgttggatg tgtaggggtg gaatctgtag 30

<210>76

<211>16

<212>DNA

<213>奈瑟氏淋病双球菌

<400>76

cgaccgtact ccccag 16

<210>77

<211>16

<212>DNA

<213>沙眼衣原体

<400>77

cgtgtcagcc ataacg 16

<210>78

<211>17

<212>DNA

<213>人型支原体

<400>78

aacaccaaag gcgaagg 17

<210>79

<211>18

<212>DNA

<213>白色念珠菌

<400>79

tcatcttcga tcccctaa 18

<210>80

<211>19

<212>DNA

<213>生殖支原体

<400>80

ccctaccaca ctctagact 19

<210>81

<211>19

<212>DNA

<213>奈瑟氏淋病双球菌

<400>81

tcctgccttt tgtgtttca 19

<210>82

<211>21

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>82

cgactttcta catcttctca t 21

<210>83

<211>21

<212>DNA

<213>白色念珠菌

<400>83

ttccatgcta atatattcga g 21

<210>84

<211>22

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>84

tgagactaac tttttctgtt tc 22

<210>85

<211>22

<212>DNA

<213>生殖支原体

<400>85

gggagcaaat aggattagat ac 22

<210>86

<211>23

<212>DNA

<213>阴道加德纳氏菌

<400>86

tattctggag catggggcag gtt 23

<210>87

<211>24

<212>DNA

<213>阴道毛滴虫

<400>87

gtgcgctact cttataatcc ctaa 24

<210>88

<211>26

<212>DNA

<213>奈瑟氏淋病双球菌

<400>88

ggtacgttcc gatatgttac tcaccc 26

<210>89

<211>16

<212>DNA

<213>沙眼衣原体

<400>89

gcgtggatga ggcatg 16

<210>90

<211>21

<212>DNA

<213>梅毒螺旋体

<400>90

tgtagatatt tggaagaaca c 21

<210>91

<211>69

<212>DNA

<213>人型支原体

<400>91

catactactc aggcggatca tttaatgcat tagctgcgtc agtgattctc caccgactaa 60

tgatcatcg 69

<210>92

<211>77

<212>DNA

<213>人型支原体

<400>92

gcttacctct atctaactct agtttgctaa tatccaaagc gagccggggt tgagccccgg 60

gatttaactc cagactt 77

<210>93

<211>57

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>93

aacccaacat ctcacgacac gagctgacaa caaccatgca ccacctgtca tattgtt 57

<210>94

<211>70

<212>DNA

<213>沙眼衣原体

<220>

<221>各种特征(misc_feature)

<222>(51)..(51)

<223>n是a、c、g或t

<400>94

ttcgccactg gtgttcttcc acatatctac acatttcacc gctacacgtg naattccctt 60

ttctccatct 70

<210>95

<211>73

<212>DNA

<213>阴道加德纳氏菌

<400>95

ttggagcatc cagcattacc acccgtttcc aagaactatt ctggagcatg gggcaggttg 60

gtcacgcatt act 73

<210>96

<211>63

<212>DNA

<213>梅毒螺旋体

<400>96

gtccgccact ctagagaaac gaaaattcgc ttccttaccg ttcgacttgc atgcttaaaa 60

cgc 63

<210>97

<211>75

<212>DNA

<213>梅毒螺旋体

<400>97

tcaatccgga ctacgattgc ctttttgcag tttgctccac ttcacaacct cgcatcgctc 60

tgtagcaacc attgt 75

<210>98

<211>73

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<220>

<221>各种特征

<222>(33)..(33)

<223>n是a、c、g或t

<400>98

tacgtgttac tcacccgttc accactaagc ctnaaaggct tcattcgatt tgcatgtatt 60

aggcatgccg cca 73

<210>99

<211>65

<212>DNA

<213>阴道加德纳氏菌

<400>99

acaagctgat aggacgcgac cccatcccat accactaaac actttcccaa caagacatgc 60

gtcaa 65

<210>100

<211>59

<212>DNA

<213>生殖支原体

<400>100

ttgctcccca cactttcaag cctaagcgtc aataatggcc taagttttcg ccttcgcca 59

<210>101

<211>64

<212>DNA

<213>阴道毛滴虫

<400>101

atgaggtcaa cttttcctcc ataattcaca tctagagaaa caatcgcatg tattagcacc 60

agag 64

<210>102

<211>76

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>102

aaattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt atgggccgtg tctcaatccc attgtggctg 60

ttctacctct cagtac 76

<210>103

<211>69

<212>DNA

<213>白色念珠菌

<400>103

ttattccagc tccaaaagcg tatattaaag ttgttgcaat taaaaagctc gtagttgaac 60

cttgggctt 69

<210>104

<211>60

<212>DNA

<213>阴道毛滴虫

<400>104

cgcccttgat cgacagaaac cctctacgta gacgccttcg cctcagcttc tctctcatga 60

<210>105

<211>77

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<220>

<221>各种特征

<222>(21)..(21)

<223>n是a、c、g或t

<220>

<221>各种特征

<222>(42)..(42)

<223>n是a、c、g或t

<400>105

cgatcctacc ctagacgcat ncctccaaaa ggttagcttt gncggtttta aatattacca 60

gctcccatag tttgacg 77

<210>106

<211>59

<212>DNA

<213>奈瑟氏淋病双球菌

<400>106

gagttttaat cttgcgaccg tactccccag ccggtcaatt tcacgcgtta gctacgcta 59

<210>107

<211>58

<212>DNA

<213>沙眼衣原体

<400>107

tgtgtacaag gcccgggaac gtattcacga cgttatggct gacacgccat tactagca 58

<210>108

<211>75

<212>DNA

<213>人型支原体

<400>108

cagcgtcagt atagacccag taagctacct tcgcctttgg tgttcttcca tatatctacg 60

catttcaccg cttca 75

<210>109

<211>72

<212>DNA

<213>白色念珠菌

<400>109

gaaagcattt accaaggacg ttttcattaa tcaagaacga aaattagggg atcgaagatg 60

atcagatacc gt 72

<210>110

<211>59

<212>DNA

<213>生殖支原体

<400>110

caaaactccc taccacactc tagactcata gtttccaatg catacaactg ttaagcagc 59

<210>111

<211>59

<212>DNA

<213>奈瑟氏淋病双球菌

<400>111

tgttgtgtct taatcctgcc ttttgtgttt cacgattaag tcgatacaat catcaccca 59

<210>112

<211>80

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<220>

<221>各种特征

<222>(19)..(22)

<223>n是a、c、g或t

<220>

<221>各种特征

<222>(25)..(26)

<223>n是a、c、g或t

<400>112

ctcatccaaa agcgtcgcnn nnaanngcga ctttctacat cttctcatcc gatattgatg 60

ttattattcg gtattagctc 80

<210>113

<211>72

<212>DNA

<213>白色念珠菌

<400>113

attagagtgt tcaaagcagg cctttactcg aatatattag catggaataa tagaatagga 60

cgttatggtt ct 72

<210>114

<211>80

<212>DNA

<213>解脲脲原体

<400>114

ctatccgaac tgagactaac tttttctgtt tcccttcatc ttacgatttt gcagcagttt 60

gtattagcca ttgtagcacg 80

<210>115

<211>67

<212>DNA

<213>生殖支原体

<400>115

ctatcgttta cggtgtggac tactagagta tctaatccta tttgctcccc acactttcaa 60

gcctaag 67

<210>116

<211>55

<212>DNA

<213>阴道加德纳氏菌

<400>116

agagctattc tggagcatgg ggcaggttcg tcacgcatta ctcacccgtt cgcca 55

<210>117

<211>73

<212>DNA

<213>阴道毛滴虫

<400>117

attcctggtt catgacgctg attacaaacg tcaatcccaa ctacattagg gattataaga 60

gtagcgcacc ctc 73

<210>118

<211>78

<212>DNA

<213>奈瑟氏淋病双球菌

<220>

<221>各种特征

<222>(45)..(45)

<223>n是a、c、g或t

<220>

<221>各种特征

<222>(59)..(59)

<223>n是a、c、g或t

<400>118

ggtacgttcc gatatgttac tcaccccttc gccactcgcc acccnagaag caagcttcnc 60

tgtgctgccg tccgactt 78

<210>119

<211>78

<212>DNA

<213>沙眼衣原体

<220>

<221>各种特征

<222>(21)..(23)

<223>n是a、c、g或t

<220>

<221>各种特征

<222>(28)..(28)

<223>n是a、c、g或t

<220>

<221>各种特征

<222>(35)..(35)

<223>n是a、c、g或t

<400>119

cccttccgcc actaaacaat nnncgaanca attgntccgt tcgacttaca tgcctcatcc 60

acgccgccag cgttcaat 78

<210>120

<211>70

<212>DNA

<213>梅毒螺旋体

<400>120

tcaatcatcg gccagaaacc cgccttcgcc accagtgttc ttccaaatat ctacagattc 60

cacccctaca 70

Claims

1.测定生物样品中是否存在一种或多种特定微生物的方法，其包括：

(b)将所述固定的生物样品转移至至少第二场所并在所述固体基质上进行提取步骤，以便提取固定于所述固体基质上和/或所述固体基质中的微生物DNA；

(c)对步骤(b)中提取的微生物DNA进行核酸扩增步骤，其中所述扩增步骤是扩增来自一种或多种特定微生物的至少一种高度保守的序列，且将扩增后的序列称为靶序列；

(d)将靶序列与包含在诊断性复合板(DMP)中的多种引物序列结合，其中每种引物序列都会促进靶序列的基因分型；

(e)对步骤(d)中的靶序列和所述DMP的结合物进行引物延伸反应，从而产生DMP反应产物；以及

(f)分析反应产物以测定存在的靶序列的基因型并使反应产物中的靶序列的基因型和存在于所述生物样品中的特定微生物的鉴定相关联。

2.权利要求1所述的方法，其中所述第一场所远离所述第二场所。

3.权利要求1和2所述的方法，其中微生物是致病性生物体。

4.上述任一项权利要求所述的方法，其中所述生物样品包含组成如下的组中的至少一种：尿液、唾液、血液、痰、精液、排泄物、鼻拭样、泪液、阴道拭样、直肠拭样、子宫颈涂片、组织活检以及尿道拭样。

5.上述任一项权利要求所述的方法，其中在第一场所将所述生物样品固定于固体基质上和/或固体基质中，并在所述固体基质上进行提取步骤以便在第二场所提取固定于所述固体基质上和/或固体基质中的微生物DNA。

6.权利要求5所述的方法，其中所述固体基质包含浸有一种或多种试剂的有吸收能力的纤维材料，所述的一种或多种试剂的作用是固定和失活存在于生物样品中的微生物。

7.权利要求6所述的方法，其中所述固体基质包含选自含纤维素的纸、微纤维膜、玻璃纤维材料、聚纤维材料、织物和无纺布的材料。

8.权利要求6和7所述的方法，其中所述固体基质包含Whatman

或Whatman

Elute试剂。

9.权利要求6和7所述的方法，其中所述固体基质包括WhatmanElute纸。

10.上述任一项权利要求所述的方法，其中所述特定微生物选自下组中的一种或多种：细菌、真菌、病毒和原生动物。

11.权利要求10所述的方法，其中所述特定微生物包括一种或多种感染性致病微生物。

12.权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种致病微生物包括引起选自下组中的一种或多种疾病的人病原体：性传播感染、食物中毒、肺结核、病毒诱发性癌症、脑炎、疟疾、肝炎、脑膜炎、利什曼病、非洲锥虫病、肺炎、瘟疫、SARS、MRSA、狂犬病、炭疽、裂谷热、兔热病、志贺氏菌病、肉毒中毒、黄热病、Q热、伊波拉病、登革热、西尼罗河热、痢疾、流感、麻疹和斑疹伤寒症。

13.权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述细菌选自以下组成的组：支原体属、衣原体属、脲原体属、奈瑟氏菌属、加德纳氏菌属、毛滴虫属以及密螺旋体。

14.权利要求10-13中任一项所述的方法，其中酵母包括白色念珠菌。

15.权利要求10-14中任一项所述的方法，其中所述病毒选自组成如下的组：细胞肥大病毒(CMV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、戊型肝炎病毒(HEV)、庚型肝炎和GB病毒(hepatitis G andGB virus，GBV-C)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人类乳头瘤病毒(HPV)、单纯性疱疹病毒(HSV)、传染性软疣病毒(MCV)、流感病毒、埃巴氏病毒(EBV)和水痘带状疱疹病毒(VZV)。

16.上述任一项权利要求所述的方法，其中所述DMP是针对来自可能存在于所述生物样品中的微生物组合的等位基因的鉴定，其中所述的组合包括细菌、病毒和真菌。

17.权利要求16所述的方法，其中所述微生物是所有病原体。

18.权利要求16或17所述的方法，其中所述DMP是针对与某种疾病有关的微生物的鉴定。

19.权利要求18所述的方法，其中所述的疾病选自组成如下的组：性传播感染、食物中毒、肺结核、病毒诱发性癌症、脑炎、疟疾、肝炎、脑膜炎、肺炎、瘟疫以及流感。

20.权利要求19所述的方法，其中所述疾病是性传播感染并且DMP包含与从选自下组的微生物中获得的一种或多种靶序列杂交的引物序列：生殖支原体、人型支原体、沙眼衣原体、解脲脲原体、奈瑟氏淋病双球菌、阴道加德纳氏菌、阴道毛滴虫、梅毒螺旋体、CMV、HAV、HBV、HCV、HEV、GBV-C、HIV-1、HIV-2、HPV、HSV-1、HSV-2、MCV、VZV、EBV以及白色念珠菌。

21.上述任一项权利要求所述的方法，其中所述高度保守的多态性等位基因包含完整的微生物基因或其一部分，所述微生物基因选自：细菌16S rRNA、细菌32S rRNA、酵母16S rRNA、酵母18S rRNA和病毒聚合酶。

22.上述任一项权利要求所述的方法，其中所述高度保守的序列包含选自组成如下的组中的多态性等位基因：单核苷酸多态性(SNP)、插入、缺失、倒位和取代。

23.上述任一项权利要求所述的方法，其中如果一种或多种特定微生物存在于所述的生物样品中，则引物延伸反应产生的DMP反应产物包含至少一种预定分子量已知的延伸的引物序列。

24.权利要求23所述的方法，其中如果两个或多个特定微生物存在于所述的生物样品中，则引物延伸反应产生的DMP反应产物包含至少两个彼此不同的、预定分子量已知的延伸的引物序列。

25.权利要求23和24任一项所述的方法，其中DMP反应产物是利用根据其分子量溶解延伸的引物序列的技术来进行分析。

26.权利要求25所述的方法，其中DMP反应产物是利用选自以下的技术进行分析：MALDI-TOF质谱和/或毛细管电泳。

27.权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述引物延伸反应包括引物标记试剂，以便如果一种或多种特定微生物存在于所述的生物样品中则所述引物延伸反应可将所述标记试剂引入到所述的引物延伸产物中，从而产生含有所述标记试剂的DMP反应产物。

28.权利要求27所述的方法，其中所述的引物标记试剂包含选自以下的标记：放射性标记、荧光标记以及抗原。

29.权利要求27和23所述的方法，其中DMP反应产物是利用能鉴定引物延伸产物中是否存在引入的标记试剂的技术来进行分析。

30.权利要求29所述的方法，其中所述分析技术选自和/或

31.上述任一项权利要求所述的方法，其中将包含于DMP中的多种引物序列固定于固体支持体上。

32.权利要求31所述的方法，其中所述固体支持体选自玻璃以及硅中的一种。

33.上述任一项权利要求所述的方法，其中所述核酸扩增步骤包含多种扩增引物，这些引物能对一种或多种特定微生物的多个高度保守的序列进行扩增。

34.权利要求33所述的方法，其中所述多种扩增引物包含选自组成如下的组中的一种或多种引物对：SEQ ID NOS：1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16、17/18、19/20、21/22、23/24、25/26、27/28以及29/30。

35.权利要求33所述的方法，其中所述多种扩增引物包含选自组成如下的组中的一种或多种引物对：SEQ ID NOS：46/47、48/49、50/51、52/53、54/55、56/57、58/59、60/61、62/63、64/65、66/67、68/69、70/71、72/73以及74/75。

36.上述任一项权利要求所述的方法，其中所述DMP包含选自SEQ IDNOS：31-45中的一种或多种引物序列。

37.上述任一项权利要求所述的方法，其中所述DMP包含选自SEQ IDNOS：76-90中的一种或多种引物序列。

38.上述任一项权利要求所述的方法，其中在(c)核酸扩增步骤前，将一种或多种对照竞争序列与靶序列结合，其中与对应的靶序列相比除了竞争序列在特定位置处含有序列变异外，每个竞争序列与对应的靶序列相同。

39.权利要求38所述的方法，其中所述的序列变异包含人工引入的SNP。

40.上述任一项权利要求所述的方法，其中在(c)核酸扩增步骤前，将一种或多种对照序列与靶序列结合，其中所述一种或多种对照序列包含选自以下种类的DNA序列：与生物样品无关的种类、与被检测的微生物无关的种类和合成的DNA序列，其中，核酸扩增步骤以及DMP包含与一种或多种对照序列特异性杂交的相应引物序列。

41.上述任一项权利要求所述的方法，其中所述生物样品获自人。

42.权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述生物样品是从下组中的一种获得的：非人类动物、植物以及食品。

43.诊断性复合板(DMP)，其适用于对生物样品中可能存在的已知引起至少一种感染性疾病的病原性微生物进行基因分型，所述DMP当用于引物延伸反应时，其包含多种能针对已知引起感染性疾病的至少一种微生物的至少两个或多个高度保守序列进行鉴定的引物序列。

44.权利要求43所述的DMP，其中所述的感染性疾病选自下组中的一种或多种：性传播感染、食物中毒、肺结核、病毒诱发性癌症、脑炎、疟疾、肝炎、脑膜炎、肺炎、瘟疫以及流感。

45.权利要求43和44所述的DMP，其中所述DMP包含适宜对选自下组中的微生物进行基因分型的引物序列：生殖支原体、人型支原体、沙眼衣原体、解脲脲原体、奈瑟氏淋病双球菌、阴道加德纳氏菌、阴道毛滴虫、梅毒螺旋体、CMV、HAV、HBV、HCV、HEV、GBV-C、HIV-1、HIV-2、HPV、HSV-1、HSV-1、MCV、VZV、EBV以及白色念珠菌。

46.权利要求43-45中任一项所述的DMP，其中所述高度保守的序列包含选自以下微生物基因的全部或部分：细菌16S rRNA、细菌32S rRNA、酵母16S rRNA、酵母18S rRNA以及病毒聚合酶。

47.权利要求43-46中任一项所述的DMP，其中所述高度保守的序列包含选自组成如下的组中的多态性等位基因：单核苷酸多态性(SNP)、插入、缺失、倒位、以及取代。

48.权利要求43-47中任一项所述的DMP，其中设计所述多种引物序列，以使引物延伸反应产生的DMP反应产物包含至少一种预定的相对分子量已知的延伸的引物序列。

49.权利要求43-48中任一项所述的DMP，其中设计所述多种引物序列，以使如果两种或多种微生物存在于所述生物样品中，则所述引物延伸反应产生的延伸反应产物包含至少两种彼此不同的预定相对分子量已知的延伸的引物序列。

50.权利要求48和49所述的DMP，其中DMP反应产物是利用根据其相对分子量溶解延伸的引物序列的技术来进行分析。

51.权利要求48-50中任一项所述的DMP，其中包含于DMP中的每种引物序列的相对分子量都不同。

52.权利要求48-51中任一项所述的DMP，其中包含于DMP中的每种引物序列与DMP中的其他引物序列的长度都不同。

53.权利要求48-52中任一项所述的DMP，其中DMP反应产物用选自MALDI-TOF质谱和/或毛细管电泳中的一种技术来进行分析。

54.权利要求43-53中任一项所述的DMP，其中所述DMP包含选自SEQID NOS：31-45中的一种或多种引物序列。

55.权利要求43-53中任一项所述的DMP，其中所述DMP包含选自SEQID NOS：76-90中的一种或多种引物序列。

56.权利要求43-55中任一项所述的DMP，其中将包含于所述DMP中的多种引物序列固定于固体支持体上。

57.权利要求56所述的DMP，其中所述固体支持体选自玻璃和硅中的一种。

58.适宜位于第一场所的用户个人使用的微生物检测试剂盒，所述试剂盒包含位于密封小室内的检测表面，所述检测表面还包括能将生物样品固定于其内或其表面上的固体基质，而且其中一旦生物样品沉积于所述检测表面上，就会在检测表面的周围将所述小室密封，以便可将所述检测试剂盒运送至用于分析的第二场所来测定所述生物样品中是否含有一种或多种微生物。

59.权利要求58所述的检测试剂盒，其中在第二场所打开所述检测试剂盒，并且在所述固体基质上进行提取步骤，以提取固定于所述固体基质上或/固体基质中的微生物DNA。

60.权利要求58和59所述的检测试剂盒，其中所述的固体基质包含浸有一种或多种试剂的有吸收能力的纤维材料，所述的一种或多种试剂的作用是固定和失活存在于生物样品中的微生物。

61.权利要求60所述的检测试剂盒，其中所述固体基质包含选自含纤维素的纸、微纤维膜、玻璃纤维材料、聚合纤维材料、织物以及无纺布的材料。

62.权利要求60和61所述的检测试剂盒，其中所述的固体基质包含Whatman

或Whatmanelute试剂。

63.权利要求60和61所述的检测试剂盒，其中所述的固体基质包括Whatman

Elute纸。

64.权利要求58-63中任一项所述的检测试剂盒，其中所述生物样品包含选自下组中的至少一种：尿液、唾液、血液、痰、精液、排泄物、鼻拭样、泪液、阴道拭样、直肠拭样、子宫颈涂片、组织活检以及尿道拭样。

65.权利要求58-64中任一项所述的检测试剂盒，其中所述一种或多种微生物是致病性的，其导致下述疾病：性传播感染、食物中毒、肺结核、病毒诱发性癌症、脑炎、疟疾、肝炎、脑膜炎、肺炎、瘟疫以及流感。

66.权利要求58-65中任一项所述的检测试剂盒，其中所述第二场所远离第一场所。

67.权利要求58-66中任一项所述的检测试剂盒，其中所述的运送方式是通过普通的邮寄服务。

68.一种治疗疑似携带一种或多种感染性微生物的动物的方法，包括从所述动物中获得生物样品、根据权利要求1-42中任一项所述的方法检测所述生物样品，由此诊断所述动物是否感染了一种或多种感染性微生物，并向所述动物实施治疗，其中根据在所述生物样品中发现的感染性微生物的类型信息适当地设计治疗方法。

69.权利要求68所述的方法，其中所述的动物是人。

70.权利要求68或69所述的方法，其中还根据在所述生物样品中发现的一种或多种感染性微生物的抗生素耐受状态的信息适当的设计所述治疗方法。