CN107827960B - Hpv的l1蛋白的定量检测方法 - Google Patents

Hpv的l1蛋白的定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及病毒学领域。特别地,本发明涉及用于定量检测HPV16 L1蛋白和HPV18 L1蛋白的特征肽,以及一种定量检测HPV16 L1蛋白和HPV18 L1蛋白的方法。

Description

HPV的L1蛋白的定量检测方法
技术领域
本发明涉及病毒学领域。特别地,本发明涉及用于定量检测HPV16 L1蛋白和HPV18L1蛋白的特征肽,以及一种定量检测HPV16L1蛋白和HPV18 L1蛋白的方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(HPV)属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属,是一类无包膜嗜上皮组织的小双链DNA病毒。天然的HPV呈现T=7的等二十面体对称结构。HPV基因组大约有7.2-8kb,包含8个开放阅读框架,编码6个早期蛋白和2个晚期蛋白。晚期基因区(L区)长约3000bp,编码2个病毒衣壳蛋白,即病毒主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2,L1、L2蛋白以5:1的比例共同组成病毒的衣壳,与病毒包装、入胞、感染等密切相关。L1衣壳蛋白是HPV衣壳蛋白的主要成分,蛋白表观分子量为55-60kD,占病毒衣壳蛋白总量的80%-90%。L2蛋白位于五聚体中心的长轴上,在病毒基因组DNA的包装中可能起主要作用,并参与病毒侵入宿主细胞的多个步骤。
在临床上,根据HPV致病力大小或致癌危险性大小不同,可将HPV分为低危型和高危型。高危型持续性感染是宫颈癌发生的主要原因。世界范围内每年宫颈癌新发病例约50万,其中86%的病例发生在发展中国家,我国每年宫颈癌新发病例约10万,死亡病例约3万。此外,HPV还与口腔癌,肛门癌,女性的阴道癌、外阴癌,男性的阴茎癌有着高度的相关性。因此,研究和开发HPV预防性疫苗,以防止HPV感染及由其引起的恶性肿瘤有着重要意义。
在所有高危型HPV中,HPV16和HPV18流行最广,存在于70%的肿瘤样本中。HPV的晚期衣壳蛋白L1可以自组装成病毒样颗粒(VLP)。其超微结构与天然病毒类似,免疫动物可以诱导产生同等水平的高滴度中和抗体。目前三种基于HPV VLP的疫苗已获准上市。Merck生产的四价Gardasil疫苗源自酵母表达系统,分别针对引起尖锐湿疣的主要型别HPV-6,11,及引起宫颈癌的HPV-16,18。GSK生产的两价Cervarix源自昆虫杆状病毒表达系统,主要针对HPV16,18所引起的宫颈癌。Merck生产的九价疫苗在上述四种型别的基础上,增加了针对宫颈癌的HPV-31,33,45,52,58。由L1蛋白自组装成的VLP颗粒是HPV预防性疫苗诱导宿主产生保护性抗体的关键,因此准确测定单一型别L1蛋白的量对于HPV预防性疫苗的质控和监管至关重要。
国际上尚未建立测定多价HPV预防性疫苗中单一型别L1蛋白组分的方法。常规的蛋白定量方法包括Smith Bicinchoninic Acid(BCA)法和Bradford法,只能停留在总蛋白含量测定水平上,而不能测定单一型别L1蛋白组分。尽管酶联免疫吸附试验(ELISA)是测定HPV预防性疫苗中各型别抗原的常规方法,但目前该方法仍有很多的局限性。首先,该方法是利用型别特异性抗体对各型别抗原进行检测,极大限制了该方法的通量性。此外,由于目前没有统一的标准抗体,厂家利用自己的抗体对其抗原进行检测,使得定量结果难统一,极大限制了对HPV预防性疫苗的质控和监管。此外,ELISA方法无法直接测定吸附了佐剂的样品,需要在测定之前解吸附佐剂,然而解吸附步骤的解吸附率极大影响了该方法的准确度。
发明内容
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的蛋白定量、层析、质谱等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的,术语“HPV16 L1蛋白”是指,人乳头瘤病毒16型(HPV16)中的主要衣壳蛋白L1,其氨基酸序列是本领域公知的,可参见各种公共数据库(例如,GenBank数据库登录号:ACN91182.1)。
如本文中所使用的,术语“HPV18 L1蛋白”是指,人乳头瘤病毒18型(HPV18)中的主要衣壳蛋白L1,其氨基酸序列是本领域公知的,可参见各种公共数据库(例如,GenBank数据库登录号:AGU90398.1)。
如本文中所使用的,术语“可检测的标记”是指,可通过质谱、荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的,包括但不限于,同位素(例如,稳定同位素,如自2H、13C、15N、17O、18O)、酶(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶,等)、荧光染料(例如,异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、吖啶酯类化合物、磁珠(例如,
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)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如,聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶,等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如,链霉亲和素)的生物素。
如本文中所使用的,术语“稳定同位素标记”是指,由不发生放射性衰变或基于目前的检测技术无法测量出放射性衰变的同位素标记,所述稳定同位素是本领域公知的,其实例包括但不限于2H、13C、15N、17O、18O、33S、34S。在本发明中,表述“多肽带有稳定同位素标记”是指,所述多肽的氨基酸序列中存在至少一个氨基酸,该氨基酸中的至少一种原子(例如C、H、O、N或S)被其稳定同位素替换。获得稳定同位素标记的多肽的方法是本领域熟知的,例如代谢标记法、化学标记法(参见例如,张菁等人,有机化学,2011年第31卷第12期,2043-2051)。
如本文中所使用的,术语“同位素稀释质谱法(isotope dilution massspectrometry;IDMS)具有本领域技术人员通常理解的含义,其操作步骤可参见,例如Barcelo-Barrachina,E.等人.Journal of chromatography.A 2006,1125,195-203;Mezcua,M.等人.Journal of chromatography.A 2006,1109,222-227;Wang,X.等人.Analytica chimica acta 2007,594,265-273;Zhang,Y.等人.Journal of chroma-tography.A 2007,1142,194-198;Yu,K.等人.Rapid communications in massspectrometry:RCM 2007,21,893-902;Williams,T.L.等人.Vaccine 2008,26,2510-2520;Williams,T.L.等人.Vaccine 2012,30,2475-2482;Luna,L.G.等人.Analyti-calchemistry 2008,80,2688-2693;以及,国际专利申请WO 03/016861;其全部通过引用并入本文。
如本文中所使用的,术语“酶消化产物”是指,样品中的蛋白成分经蛋白酶消化后得到的水解产物,其包含该样品中的蛋白的氨基酸片段。在本发明中,表述“胰蛋白酶消化产物”意指,样品中的蛋白成分经胰蛋白酶消化后得到的水解产物。
如本文中所使用的,术语“纯化”是指,相对于样品中一种或多种其它成分,富集一种或多种待测成分的量的过程。因此,本领域技术人员理解,本发明所述的纯化不是指将样品中除待测成分(例如,如本文所述的特征肽或内标肽)之外的其它所有成分全部去除,并且,本发明所述的纯化也不必然需要将待测成分与其它所有成分分离。在某些优选的实施方案中,所述纯化可以用于去除一种或多种干扰物质,其可能干扰质谱对待测成分离子的检测。可用于纯化的方法是本领域熟知的,其实例包括但不限于过滤、层析(例如气相色谱或液相色谱,如高效液相色谱或超高效液相色谱)或电泳(例如凝胶电泳或毛细管电泳)。
如本文中所使用的,术语“离子化”具有本领域技术人员通常理解的含义。在本发明中,可用于质谱检测的离子化方法包括但不限于,电子轰击电离(EI)、化学电离(CI)、电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、大气压光电离(APPI)、快原子电离(FAB)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离源(FI)、场解吸源(FD)、表面增强激光解吸电离(SELDI)等。本领域技术人员已知根据待测物、待测样品的物理化学性质、质量分析器的类型(例如,四极杆质量分析器、离子阱质量分析器或飞行时间质量分析器)等选择适当的离子化方法。
如本文中所使用的,术语“变性剂”是指,能够阻碍蛋白质二级与三级结构的产生,防止蛋白质之间的交互作用的物质。这类物质是本领域熟知的,其实例包括但不限于尿素、硫脲、盐酸胍或离子型表面活性剂,其中所述离子型表面活性剂详细描述于美国专利申请US7229539和US8580533,其全部通过引用并入本文。
如本文中所使用的,术语“还原剂”是指,能够破坏蛋白质的二硫键,使蛋白质处于还原状态,防止蛋白质氧化的物质。这类物质是本领域熟知的,其实例包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇或TCEP。
如本文中所使用的,术语“烷基化试剂”具有本领域技术人员通常理解的含义。在本发明中,优选地所述烷基化试剂是指能够与氨基酸(例如半胱氨酸)中游离的疏基(SH-)反应,以防止其被氧化进而形成二硫键的试剂;这类试剂是本领域熟知的,例如碘乙酸、碘乙酰胺等。
本申请的发明人基于质谱检测技术,首次发现了可用于测定HPV16 L1蛋白和HPV18 L1蛋白含量的特征肽,该特征肽可灵敏、准确地实现对多价HPV疫苗中单一型别L1蛋白的定量,由此完成了本发明。而在本申请之前,本领域尚未建立测定多价HPV疫苗中单一型别L1蛋白含量的方法。
因此,在一个方面,本发明提供了一种多肽,其具有选自下列的氨基酸序列:AGAVGENVPDDLYIK(SEQ ID NO:1)和FSLDLDQYPLGR(SEQ ID NO:2)。
在某些优选的实施方案中,所述多肽未经标记。
在某些优选的实施方案中,所述多肽具有如下所示的序列:AGAVGENVPDDLYIK(SEQID NO:1),其用于测定样品中HPV16 L1蛋白的量。在某些优选的实施方案中,所述样品为包含HPV16 L1蛋白的单价或多价HPV疫苗。
在某些优选的实施方案中,所述多肽具有如下所示的序列:FSLDLDQYPLGR(SEQ IDNO:2),其用于测定样品中HPV18 L1蛋白的量。在某些优选的实施方案中,所述样品为包含HPV18 L1蛋白的单价或多价HPV疫苗。
在本发明中,本发明的特征肽不受任何特定的合成多肽的方法限制,可通过本领域技术人员已知的常规技术产生,例如DNA重组技术或化学合成技术。在某些实施方式中,本发明的特征肽通过DNA重组技术获得,例如通过使用无细胞表达系统从编码这些蛋白或多肽的多核苷酸获得(无细胞表达系统包括例如基于网织红细胞裂解物的表达系统、基于麦胚提取物的表达系统以及基于大肠杆菌提取物的表达系统);或通过使用体内表达系统(例如,大肠杆菌原核表达系统、酵母真核表达系统)从编码这些蛋白或多肽的多核苷酸获得。作为另外一种选择,本发明的特征肽可以通过化学合成产生。蛋白或多肽化学全合成的方法在本领域内是熟知的(参见,例如,Raibaut L,et al.,Top Curr Chem.2015;363:103-54;Thapa P,et al.Molecules.2014;19(9):14461-83;Dawson PE,et al.,Science,1994;266(5186):776-9;和Wang P,et al.,Tetrahedron Lett,1998,39(47):88711-14;其通过引用并入本文),并且包括但不限于:固相肽合成技术(Solid Phase Peptide Synthesis,SPPS)或液相分段合成技术(例如,天然化学连接法(Native Chemical Ligation,NCL)、叠氮法(Azide method)、转移活化酯法(Transfer Active Ester Condensation,TAEC))。
在某些优选的实施方案中,所述多肽带有可检测的标记。
在某些优选的实施方案中,所述多肽带有同位素标记。
在某些优选的实施方案中,所述多肽中的一个或多个(例如,1个、2个或3个)氨基酸残基带有稳定同位素标记。在某些优选的实施方案中,所述稳定同位素标记选自2H、13C、15N、17O、18O及其任意组合。在某些优选的实施方案中,所述稳定同位素标记为13C和/或15N。
在某些优选的实施方案中,所述多肽用于测定样品中HPV16 L1蛋白的量,其具有如下所示的序列:AGAVGENVPDD[L]YIK(SEQ ID NO:1),其中,[L]表示该亮氨酸中的一个或多个原子被其对应的稳定同位素替换。在一个具体的实施方案中,所述亮氨酸([L])中的全部碳原子被13C替换。
在某些优选的实施方案中,所述样品为包含HPV16 L1蛋白的单价或多价HPV疫苗。
在某些优选的实施方案中,所述多肽用于测定样品中HPV18 L1蛋白的量,其具有如下所示的序列:FS[L]DLDQYPLGR(SEQ ID NO:2),其中,[L]表示该亮氨酸中的一个或多个原子被其对应的稳定同位素替换。在一个具体的实施方案中,所述亮氨酸([L])中的全部碳原子及氮原子分别被13C和15N替换。
在某些优选的实施方案中,所述样品为包含HPV18 L1蛋白的单价或多价HPV疫苗。
在另一个方面,本发明提供了一种分离的核酸,其编码如上所述的多肽。
在另一个方面,本发明提供了一种载体,其包含如上所述的分离的核酸。可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的,包括但不限于克隆载体和表达载体。在某些实施方式中,所述载体是例如质粒,粘粒,噬菌体等。
在另一个方面,本发明还涉及包含如上所述的分离的核酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于,原核细胞例如大肠杆菌细胞,以及真核细胞例如酵母细胞,昆虫细胞,植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞,例如灵长类动物细胞、人类细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系,例如293T细胞。
在另一个方面,本发明提供了一种试剂盒,其包含:
第一多肽,其具有选自下列的氨基酸序列:AGAVGENVPDDLYIK(SEQ ID NO:1)和FSLDLDQYPLGR(SEQ ID NO:2),并且所述第一多肽未经标记;和/或
第二多肽,其具有与所述第一多肽相同的氨基酸序列,并且带有同位素标记。
在某些优选的实施方案中,所述试剂盒任选地还包含用于质谱检测所述第一多肽和/或第二多肽的试剂。
在某些优选的实施方案中,所述试剂盒用于测定样品中HPV16 L1蛋白的量,其包含:
(1)不同已知量的所述第一多肽,其具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;和/或
(2)已知量的所述第二多肽。
在某些优选的实施方案中,所述第二多肽中的一个或多个(例如,1个、2个或3个)氨基酸残基带有稳定同位素标记。在某些优选的实施方案中,所述稳定同位素标记选自2H、13C、15N、17O、18O及其任意组合。在某些优选的实施方案中,所述稳定同位素标记选自13C、15N或其组合。
在某些优选的实施方案中,所述第二多肽具有如下所示的序列:AGAVGENVPDD[L]YIK(SEQ ID NO:1),其中,[L]表示该亮氨酸中的一个或多个原子被其对应的稳定同位素替换。在一个具体的实施方案中,所述亮氨酸([L])中的全部碳原子被13C替换。
在某些优选的实施方案中,所述样品为包含HPV16 L1蛋白的单价或多价HPV疫苗。
在某些优选的实施方案中,所述试剂盒用于测定样品中HPV18 L1蛋白的量,其包含:
(1)不同已知量的所述第一多肽,其具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;和/或
(2)已知量的所述第二多肽。
在某些优选的实施方案中,所述第二多肽中的一个或多个(例如,1个、2个或3个)氨基酸残基带有稳定同位素标记。在某些优选的实施方案中,所述稳定同位素标记选自2H、13C、15N、17O、18O及其任意组合。在某些优选的实施方案中,所述稳定同位素标记选自13C、15N或其组合。
在某些优选的实施方案中,所述第二多肽具有如下所示的序列:FS[L]DLDQYPLGR(SEQ ID NO:2),其中,[L]表示该亮氨酸中的一个或多个原子被其对应的稳定同位素替换。在一个具体的实施方案中,所述亮氨酸([L])中的全部碳原子及氮原子分别被13C和15N替换。
在某些优选的实施方案中,所述样品为包含HPV18 L1蛋白的单价或多价HPV疫苗。
在某些优选的实施方案中,所述试剂盒任选地还包含一种或多种选自1)-5)的试剂:
1)变性剂(例如,尿素、盐酸胍或离子型表面活性剂);
2)还原剂(例如,二硫苏糖醇、巯基乙醇或TECP);
3)烷基化试剂(例如,碘乙酰胺)
4)蛋白酶(例如,胰蛋白酶、LysC蛋白酶、GluC蛋白酶、AspN蛋白酶或胰凝乳蛋白酶);
5)水(例如,纯水、超纯水、去离子水或蒸馏水)。
在另一个方面,本发明提供了一种测定样品中HPV16 L1蛋白的量的方法,其包括使用质谱测定所述样品的酶消化产物中第一多肽的量的步骤,所述第一多肽具有如下所示的序列:AGAVGENVPDDLYIK(SEQ ID NO:1),并且未经标记。
在本发明中,使用质谱测定所述样品的酶消化产物中所述第一多肽的量的方法是本领域熟知的,其实例包括但不限于详细描述于“Guoan Zhang等人,Methods MolBiol.2010;673:211–222.”中的那些。在某些优选的实施方案中,使用同位素稀释质谱法(IDMS;其可参见例如WO 03/016861)测定所述样品的酶消化产物中所述第一多肽的量。
在某些优选的实施方案中,所述酶消化产物为胰蛋白酶消化产物。
在某些优选的实施方案中,在使用质谱测定所述样品的酶消化产物中第一多肽的量之前,还包括对所述酶消化产物进行纯化的步骤。在某些优选的实施方案中,所述纯化选自过滤、层析(例如气相色谱或液相色谱,如高效液相色谱或超高效液相色谱)、电泳(例如凝胶电泳或毛细管电泳)或其任意组合。在某些优选的实施方案中,所述纯化为层析,例如液相色谱。在某些优选的实施方案中,所述纯化为高效液相色谱或超高效液相色谱。
在某些优选的实施方案中,所述质谱选自四极杆质谱、离子阱质谱、飞行时间质谱或串联质谱。在某些优选的实施方案中,所述质谱为串联质谱,例如三重四极杆质谱(QqQ)或四极杆飞行时间串联质谱(QTOF)。在一个具体的实施方案中,所述质谱为三重四极杆质谱。
在某些优选的实施方案中,所述质谱的检测模式为单离子监测(SIM)、选择反应监测(SRM)、多反应监测(MRM)或多选择反应监测(mSRM)。在一个具体的实施方案中,所述质谱的检测模式为MRM。
在某些优选的实施方案中,所述方法还包括使用质谱测定所述酶消化产物中第二多肽的量的步骤,其中,所述第二多肽具有与所述第一多肽相同的氨基酸序列,并且带有同位素标记。在某些优选的实施方案中,所述第二多肽中的一个或多个(例如,1个、2个或3个)氨基酸残基带有稳定同位素标记。在某些优选的实施方案中,所述稳定同位素标记选自2H、13C、15N、17O、18O及其任意组合。在某些优选的实施方案中,所述稳定同位素标记为13C和/或15N。在某些优选的实施方案中,所述第二多肽具有如下所示的序列:AGAVGENVPDD[L]YIK(SEQ ID NO:1),其中,[L]表示该亮氨酸中的一个或多个原子被其对应的稳定同位素替换。在一个具体的实施方案中,所述亮氨酸([L])中的全部碳原子被13C替换。
在某些优选的实施方案中,所述样品包含HPV16 L1蛋白。在某些优选的实施方案中,所述样品为包含HPV16 L1蛋白的单价或多价HPV疫苗。
在某些优选的实施方案中,所述方法包括以下步骤:
(1)使用蛋白酶将所述样品消化,并获得酶消化产物;
(2)对步骤(1)所获得的酶消化产物进行质谱分析,并获得所述第一多肽的信号强度;
(3)将步骤(2)所获得的信号强度与标准曲线比较,并获得所述第一多肽的含量,该含量为所述样品中HPV16 L1蛋白的量;其中,所述标准曲线是所述第一多肽的已知量与所述信号强度之间的数学关系。
在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,所述蛋白酶为胰蛋白酶。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)和(3)中,所述信号强度为峰高或峰面积。在某些优选的实施方案中,在步骤(2)和(3)中,所述信号强度为峰面积。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)之前,还包括对所述酶消化产物进行纯化的步骤。在某些优选的实施方案中,所述纯化为层析,例如液相色谱。在某些优选的实施方案中,所述纯化为高效液相色谱或超高效液相色谱。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)中,所述质谱为串联质谱,例如三重四极杆质谱(QqQ)或四极杆飞行时间串联质谱(QTOF)。在一个具体的实施方案中,所述质谱为三重四极杆质谱。在另一个具体的实施方案中,所述质谱中的质谱模式为MRM。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)中,所述质谱分析包括以下步骤:
(2a)对步骤(1)所获得的酶消化产物进行离子化,获得所述第一多肽的母离子和子离子;
(2b)测定步骤(2a)中获得的所述子离子的信号强度,该信号强度为所述第一多肽的信号强度。
在某些优选的实施方案中,所述离子化的方法为ESI。
在某些优选的实施方案中,所述母离子是质荷比为781±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)的离子碎片,所述子离子是质荷比分别为1263±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)和864±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)的离子碎片。
在某些优选的实施方案中,所述方法包括以下步骤:
(1)使用蛋白酶将所述样品消化,并获得酶消化产物;
(2)将已知量的所述第二多肽加入步骤(1)所获得的酶消化产物中,并获得混合物;
(3)对步骤(2)所获得的混合物进行质谱分析,并获得所述第一多肽和所述第二多肽的信号强度;
(4)计算所述第一多肽与所述第二多肽的信号强度的比值;
(5)将所述比值与标准曲线比较,并获得所述第一多肽的含量,该含量为所述样品中HPV16 L1蛋白的量;其中,所述标准曲线是所述第一多肽的已知量与所述比值之间的数学关系。
在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,所述蛋白酶为胰蛋白酶。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)~(4)中,所述信号强度为峰高或峰面积。在某些优选的实施方案中,在步骤(2)~(4)中,所述信号强度为峰面积。
在某些优选的实施方案中,在步骤(3)之前,还包括对所述混合物进行纯化的步骤。在某些优选的实施方案中,所述纯化为层析,例如液相色谱。在某些优选的实施方案中,所述纯化为高效液相色谱或超高效液相色谱。
在某些优选的实施方案中,在步骤(3)中,所述质谱分析为三重四极杆质谱。在某些优选的实施方案中,在步骤(3)中,所述质谱分析的检测模式为MRM。
在某些优选的实施方案中,在步骤(3)中,所述质谱分析包括以下步骤:
(3a)对步骤(2)所获得的混合物进行离子化,获得所述第一多肽的母离子和子离子和所述第二多肽的母离子和子离子;
(3b)测定步骤(3a)中获得的所述第一多肽的子离子和所述第二多肽的子离子的信号强度,其中所述第一多肽的子离子的信号强度为所述第一多肽的信号强度,所述第二多肽的子离子的信号强度为所述第二多肽的信号强度。
在某些优选的实施方案中,所述离子化的方法为ESI。
在某些优选的实施方案中,所述第一多肽的母离子是质荷比为781±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)的离子碎片,所述子离子是质荷比分别为1263±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)和864±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)的离子碎片。
在一个具体的实施方案中,所述第二多肽具有如下所示的序列:AGAVGENVPDD[L]YIK(SEQ ID NO:1),其中,[L]所示的亮氨酸中的全部碳原子被13C替换,并且所述第二多肽的母离子是质荷比为784±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)的离子碎片,所述子离子是质荷比分别为1269±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)和869±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)的离子碎片。
在另一个方面,本发明提供了一种测定样品中HPV18 L1蛋白的量的方法,其包括使用质谱测定所述样品的酶消化产物中第一多肽的量的步骤,所述第一多肽具有如下所示的序列:FSLDLDQYPLGR(SEQ ID NO:2),并且未经标记。
在本发明中,使用质谱测定所述样品的酶消化产物中所述第一多肽的量的方法是本领域熟知的,其实例包括但不限于详细描述于“Guoan Zhang等人,Methods MolBiol.2010;673:211–222.”中的那些。在某些优选的实施方案中,使用同位素稀释质谱法(IDMS;其可参见例如WO 03/016861)测定所述样品的酶消化产物中所述第一多肽的量。
在某些优选的实施方案中,所述酶消化产物为胰蛋白酶消化产物。
在某些优选的实施方案中,在使用质谱测定所述样品的酶消化产物中第一多肽的量之前,还包括对所述酶消化产物进行纯化的步骤。在某些优选的实施方案中,所述纯化选自过滤、层析(例如气相色谱或液相色谱,如高效液相色谱或超高效液相色谱)、电泳(例如凝胶电泳或毛细管电泳)或其任意组合。在某些优选的实施方案中,所述纯化为层析,例如液相色谱。在某些优选的实施方案中,所述纯化为高效液相色谱或超高效液相色谱。
在某些优选的实施方案中,所述质谱选自四极杆质谱、离子阱质谱、飞行时间质谱或串联质谱。在某些优选的实施方案中,所述质谱为串联质谱,例如三重四极杆质谱(QqQ)或四极杆飞行时间串联质谱(QTOF)。在一个具体的实施方案中,所述质谱为三重四极杆质谱。
在某些优选的实施方案中,所述质谱的检测模式为单离子监测(SIM)、选择反应监测(SRM)、多反应监测(MRM)或多选择反应监测(mSRM)。在一个具体的实施方案中,所述质谱的检测模式为MRM。
在某些优选的实施方案中,所述方法还包括使用质谱测定所述酶消化产物中第二多肽的量的步骤,其中,所述第二多肽具有与所述第一多肽相同的氨基酸序列,并且带有同位素标记。在某些优选的实施方案中,所述第二多肽中的一个或多个(例如,1个、2个或3个)氨基酸残基带有稳定同位素标记。在某些优选的实施方案中,所述稳定同位素标记选自2H、13C、15N、17O、18O及其任意组合。在某些优选的实施方案中,所述稳定同位素标记为13C和/或15N。在某些优选的实施方案中,所述第二多肽具有如下所示的序列:FS[L]DLDQYPLGR(SEQID NO:2),其中,[L]表示该亮氨酸中的一个或多个原子被其对应的稳定同位素替换。在一个具体的实施方案中,所述亮氨酸([L])中的全部碳原子及氮原子分别被13C和15N替换。
在某些优选的实施方案中,所述样品包含HPV18 L1蛋白。在某些优选的实施方案中,所述样品为包含HPV18 L1蛋白的单价或多价HPV疫苗。
在某些优选的实施方案中,所述方法包括以下步骤:
(1)使用蛋白酶将所述样品消化,并获得酶消化产物;
(2)对步骤(1)所获得的酶消化产物进行质谱分析,并获得所述第一多肽的信号强度;
(3)将步骤(2)所获得的信号强度与标准曲线比较,并获得所述第一多肽的含量,该含量为所述样品中HPV18 L1蛋白的量;其中,所述标准曲线是所述第一多肽的已知量与所述信号强度之间的数学关系。
在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,所述蛋白酶为胰蛋白酶。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)和(3)中,所述信号强度为峰高或峰面积。在某些优选的实施方案中,在步骤(2)和(3)中,所述信号强度为峰面积。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)之前,还包括对所述酶消化产物进行纯化的步骤。在某些优选的实施方案中,所述纯化为层析,例如液相色谱。在某些优选的实施方案中,所述纯化为高效液相色谱或超高效液相色谱。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)中,所述质谱为串联质谱,例如三重四极杆质谱(QqQ)或四极杆飞行时间串联质谱(QTOF)。在一个具体的实施方案中,所述质谱为三重四极杆质谱。在另一个具体的实施方案中,所述质谱中的质谱模式为MRM。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)中,所述质谱分析包括以下步骤:
(2a)对步骤(1)所获得的酶消化产物进行离子化,获得所述第一多肽的母离子和子离子;
(2b)测定步骤(2a)中获得的所述子离子的信号强度,该信号强度为所述第一多肽的信号强度。
在某些优选的实施方案中,所述离子化的方法为ESI。
在某些优选的实施方案中,所述母离子是质荷比为712±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)的离子碎片,所述子离子是质荷比分别为442±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)和605±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)的离子碎片。
在某些优选的实施方案中,所述方法包括以下步骤:
(1)使用蛋白酶将所述样品消化,并获得酶消化产物;
(2)将已知量的所述第二多肽加入步骤(1)所获得的酶消化产物中,并获得混合物;
(3)对步骤(2)所获得的混合物进行质谱分析,并获得所述第一多肽和所述第二多肽的信号强度;
(4)计算所述第一多肽与所述第二多肽的信号强度的比值;
(5)将所述比值与标准曲线比较,并获得所述第一多肽的含量,该含量为所述样品中HPV18 L1蛋白的量;其中,所述标准曲线是所述第一多肽的已知量与所述比值之间的数学关系。
在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,所述蛋白酶为胰蛋白酶。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)~(4)中,所述信号强度为峰高或峰面积。在某些优选的实施方案中,在步骤(2)~(4)中,所述信号强度为峰面积。
在某些优选的实施方案中,在步骤(3)之前,还包括对所述混合物进行纯化的步骤。在某些优选的实施方案中,所述纯化为层析,例如液相色谱。在某些优选的实施方案中,所述纯化为高效液相色谱或超高效液相色谱。
在某些优选的实施方案中,在步骤(3)中,所述质谱分析为三重四极杆质谱。在某些优选的实施方案中,在步骤(3)中,所述质谱分析的检测模式为MRM。
在某些优选的实施方案中,在步骤(3)中,所述质谱分析包括以下步骤:
(3a)对步骤(2)所获得的混合物进行离子化,获得所述第一多肽的母离子和子离子和所述第二多肽的母离子和子离子;
(3b)测定步骤(3a)中获得的所述第一多肽的子离子和所述第二多肽的子离子的信号强度,其中所述第一多肽的子离子的信号强度为所述第一多肽的信号强度,所述第二多肽的子离子的信号强度为所述第二多肽的信号强度。
在某些优选的实施方案中,所述离子化的方法为ESI。
在某些优选的实施方案中,所述第一多肽的母离子是质荷比为712±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)的离子碎片,所述子离子是质荷比分别为442±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)和605±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)的离子碎片。
在一个具体的实施方案中,所述第二多肽具有如下所示的序列:FS[L]DLDQYPLGR(SEQ ID NO:2),其中,[L]所示的亮氨酸中的全部碳原子及氮原子分别被13C和15N替换,并且所述第二多肽的母离子是质荷比为716±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)的离子碎片,所述子离子是质荷比分别为442±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)和232±1m/z(例如±0.8m/z、±0.5m/z、±0.2m/z、±0.1m/z)的离子碎片。
发明的有益效果
国际上尚未建立测定多价HPV预防性疫苗中单一型别L1蛋白组分的方法。常规的蛋白定量方法包括Smith Bicinchoninic Acid(BCA)法和Bradford法,只能停留在总蛋白含量测定水平上,而不能测定单一型别L1蛋白组分。尽管酶联免疫吸附试验(ELISA)是测定HPV预防性疫苗中各型别抗原的常规方法,但目前该方法仍有很多的局限性。首先,该方法是利用型别特异性抗体对各型别抗原进行检测,极大限制了该方法的通量性。此外,由于目前没有统一的标准抗体,厂家利用自己的抗体对其抗原进行检测,使得定量结果难统一,极大限制了对HPV预防性疫苗的质控和监管。此外,ELISA方法无法直接测定吸附了佐剂的样品,需要在测定之前解吸附佐剂,然而解吸附步骤的解吸附率极大影响了该方法的准确度。
本发明首次提供了可用于测定HPV16 L1蛋白和HPV18 L1蛋白含量的特征肽,以及基于该特征肽和同位素稀释串联质谱技术建立的测定HPV疫苗中单一型别L1蛋白组分的方法。与传统方法(例如,ELISA法)相比,本发明的方法可以实现对HPV16和HPV18 L1蛋白在肽段水平上的定量监测,具有更高的精密度;并且,本发明的方法不需要解吸附步骤,且待测样品中L1蛋白的解吸附的程度不会明显影响本发明的方法的准确度;同时,本发明的方法不需要获得和使用型别特异性抗体,可以同时测定多个型别HPV L1蛋白的含量。
因此,本发明的基于特征肽的HPV16 L1蛋白和HPV18 L1蛋白定量检测方法具有显著的有利技术效果,便于普及,且为HPV疫苗中单一型别L1蛋白含量的检测标准的制定提供了参考。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了HPV16 L1蛋白的特征肽的MS/MS谱图。
图2显示了HPV18 L1蛋白的特征肽的MS/MS谱图。
图3显示了HPV16 L1蛋白的特征肽及内标肽的LC-MRM图。
图4显示了HPV18 L1蛋白的特征肽及内标肽的LC-MRM图。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1:序列的描述
Figure BDA0001445784590000181
Figure BDA0001445784590000191
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明,否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓,实施例以举例方式描述本发明,且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1.HPV16 L1及HPV18 L1特征肽的鉴定
1.1候选特征肽的确定
本发明人首先选择特异性切割赖氨酸和精氨酸C末端的胰蛋白酶,利用ExPASy软件的PeptideMass模块分别对HPV16 L1及HPV18 L1蛋白序列(由江苏瑞科生物技术有限公司提供)进行模拟酶解,然后利用Bioedit软件的ClustalW模块将上述模拟酶解片段分别与HPV预防性疫苗中涉及型别的L1蛋白(包括HPV6、HPV11、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59)进行序列比对,以分别获得仅存在于HPV16或HPV18 L1蛋白的理论酶解产物中的肽段(即,候选型别特异性信号肽/特征肽)。结果分别如表2和表3所示,理论上,HPV16 L1有21条候选型别特异性信号肽,HPV18 L1有20条候选型别特异性信号肽。
表2:HPV16 L1的候选型别特异性信号肽
Figure BDA0001445784590000201
Figure BDA0001445784590000211
表3:HPV18 L1的候选型别特异性信号肽
Figure BDA0001445784590000212
1.2HPV16 L1及HPV18 L1特征肽的确定
本发明人分别将HPV16及HPV18 L1单价吸附前原液酶解,而后通过液相色谱串联质谱对实施例1.1中所述的各个候选型别特异性信号肽进行肽段分析。具体步骤如下所示:
(1)取30μL(约10μg)HPV16 L1或HPV18 L1吸附前原液,根据制造商说明书使用Rapigest SF和胰蛋白酶进行样品酶解。用0.22μM微孔滤膜过滤,而后进行液相色谱串联质谱分析。
(2)液相色谱参数:Ultimate 3000 RSLC nano(美国赛默飞公司);预柱(ThermoPepMap,2cm×75μm inner diameter,C18,3μm,100A)(美国赛默飞公司);流速:5μl/min;A相(含0.05%甲酸的2%乙腈溶液);色谱柱:Thermo PepMap RSLC,15cm×75μm innerdiameter,C18,2μm,100A)(美国赛默飞公司);A相(含0.1%甲酸的水溶液),B相(含0.1%甲酸的80%乙腈溶液);流速:300nL/min;梯度洗脱条件:3分钟内,将流动相B相由5%升至10%,60分钟内,再升至30%,30分钟内,升至90%,90%B相清洗柱子5分钟,5%B相平衡15分钟。进样体积:15μL。
(3)质谱参数:质谱仪:Q-Exactive质谱仪(美国赛默飞公司);针:12cm length,360μm diameter,20μm inner diameter,10μm tip inner diameter(美国赛默飞公司);液接电位:2500V;毛细管温度:250℃;数据处理:Proteome Discoverer软件。
结果显示,HPV16 L1的21条候选型别特异性信号肽中仅有AGAVGENVPDDLYIK(SEQID NO:1)能够用于质谱分析,其MS/MS谱图如图1所示;HPV18 L1的20条候选型别特异性信号肽中仅有FSLDLDQYPLGR(SEQ ID NO:2)能够用于质谱分析,其MS/MS谱图如图2所示。同时,本发明人经过反复验证发现实施例1.1中所述的其余候选信号肽均无法提供有效的可用于定量的质谱信号。
实施例2.单一型别HPV L1的质谱定量检测方法
在本实施例中,通过同位素稀释法测定实施例1所获得的HPV16特征肽及HPV18特征肽的含量,从而实现对HPV16 L1蛋白及HPV18 L1蛋白的定量。
2.1特征肽及内标肽
HPV16 L1蛋白和HPV18 L1蛋白的特征肽及相应同位素标记肽(内标肽)的序列如表4所示。上述多肽均由中国GL Biochem LTD公司合成,并且被包装成1mg/瓶。
表4:HPV16 L1和HPV18 L1的型别特征肽及内标肽
Figure BDA0001445784590000231
2.2标准曲线
配制HPV16特征肽和HPV18特征肽的混合溶液作为外标,两者浓度均为100μmol/L,待用。另外,配制HPV16内标肽和HPV18内标肽的混合溶液作为内标,两者浓度均为100μmol/L,待用。外标的工作浓度是400、200、100、50、20nmol/L。内标的工作浓度是500nmol/L。通过LC/MS/MS分别测定上述各浓度下的特征峰面积比值(外标/内标),并以外标/内标的峰面积比值和对应的外标浓度进行线性回归分析,从而获得特征肽的浓度相对于特征峰面积比值(外标/内标)的标准曲线。
2.3LC/MS/MS定量方法
取适量待测样品(例如,单价吸附前原液、单价吸附原液或商业化HPV疫苗),并加入适量内标至工作浓度,混合均匀。然后根据制造商说明书使用Rapigest SF和胰蛋白酶进行样品酶解。将样品定容至1mL,并用0.22μM微孔滤膜过滤,待测。
将上述酶解后样品通过液相色谱柱及质谱仪以进行定量分析,以获得HPV16特征肽或HPV18特征肽的特征峰面积与各自内标肽的特征峰面积的比值,将该比值与2.2中获得标准曲线比较,从而获得HPV16 L1或HPV18 L1蛋白含量,其中:
HPV16 L1的标准曲线是y=0.932x-0.000290,R2=0.994;HPV18 L1的标准曲线是y=0.681x-0.00300,R2=0.992。
超高压液相色谱(UPLC)参数:液相色谱仪:Acquity Ultra Performance LC(美国沃特世公司);色谱柱:WATERS ACQUITY UPLC HSS T3(50mm×2.1mm,1.8μm,美国沃特世公司);柱温:40℃;样品室温度:4℃;进样体积:5μL;流动相A:含0.1%甲酸的水溶液,流动相B:乙腈溶液;流速:0.3mL/min;梯度洗脱条件:3分钟内,将流动相B含量从0%提升至70%,0.1分钟内,将其升至90%,之后用100%B清洗1分钟,然后在0.1分钟内返至0%并平衡1分钟。
三重四级杆质谱(MS)参数:质谱仪:TQ-S MS Xevo(美国沃特世公司),带ESI源;毛细管电压:3.2kV;脱溶剂温度:500℃;脱溶剂气流量:1000L/h;锥孔反吹气流量:150L/h;HPV16及HPV18特征肽及内标肽的母离子、子离子及其最佳MRM参数分别参见表5。
表5:HPV16及HPV18特征肽及内标肽的质谱参数
Figure BDA0001445784590000241
实施例3.商业化产品中HPV16 L1及HPV18 L1蛋白含量的测定
本发明人采用实施例2所描述的同位素稀释质谱法(简写为IDMS)对四份HPV16 L1单价吸附前原液(Y1-16、Y2-16、E1-16和I1-16)、四份HPV18 L1单价吸附前原液(Y1-18、Y2-18、E1-18和I1-18)、一份HPV16 L1单价吸附后原液(E1-16-Al)以及商业化疫苗卉妍康(Cervarix)(购自葛兰素史克(GSK))、加德西(Gardasil)和加德西9(Gardasil 9)(购自默克(Merck&Co))中的HPV16 L1和HPV18 L1蛋白含量进行了检测;并且,同时采用本领域常规的BCA法和Bradford法对上述样品的蛋白含量进行了测定。HPV16 L1蛋白含量的检测结果分别如图3、表6所示,HPV18 L1蛋白含量的检测结果分别如图4、表6所示。同时,以信噪比(S/N)为3时对应的标准溶液浓度为方法检出限,测得HPV16 L1和HPV18 L1的最低检出限(LOD)分别是1.0nmol/L和0.3nmol/L。以信噪比(S/N)为10时对应的标准溶液浓度为方法定量限,测得HPV16 L1和HPV18 L1的最低定量限(LOQ)分别是2.5nmol/L和1.0nmol/L。
以上结果表明,基于本发明的特征肽的质谱检测方法能够准确测定样品中HPV16及HPV18 L1蛋白含量,具有显著有利的技术效果。
Figure BDA0001445784590000261
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公布的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国食品药品检定研究院
<120> HPV的L1蛋白的定量检测方法
<130> IDC170082
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 1
Ala Gly Ala Val Gly Glu Asn Val Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 2
Phe Ser Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 3
Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val
1 5 10 15
Pro Val Ser Lys
20
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 4
Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His
1 5 10 15
Trp Gly Lys
<210> 5
<211> 46
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 5
Gly Ser Pro Cys Thr Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro
1 5 10 15
Leu Glu Leu Ile Asn Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr
20 25 30
Gly Phe Gly Ala Met Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys
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<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 6
Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Thr Ser Ile Cys Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 7
Met Val Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg
1 5 10 15
<210> 8
<211> 37
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 8
Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser Ser Asn Tyr Phe Pro Thr
1 5 10 15
Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro
20 25 30
Tyr Trp Leu Gln Arg
35
<210> 9
<211> 18
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 9
Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu Thr Thr
1 5 10 15
Tyr Lys
<210> 10
<211> 39
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 10
Ile Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser
1 5 10 15
Thr Ile Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly
20 25 30
Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg
35
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 11
Phe Thr Leu Gly Lys
1 5
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 12
Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Thr Ala Lys
1 5 10
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 13
Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 14
Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg
1 5 10
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 15
Thr Asn Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg
1 5 10
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 16
Asn Thr Asn Phe Lys
1 5
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 17
Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Pro Ile Lys
1 5 10
<210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 18
Leu Asp Asp Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val
1 5 10 15
Asp Asn Arg
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 19
Lys Pro Asn Asn Asn Lys
1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 20
Ile Leu Val Pro Lys
1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 21
Ile His Leu Pro Asp Pro Asn Lys
1 5
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 22
His Thr Pro Pro Ala Pro Lys
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 23
Asp Ala Ala Pro Ala Glu Asn Lys
1 5
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 24
Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys
1 5 10 15
<210> 25
<211> 19
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 25
Leu Asp Asp Thr Glu Ser Ser His Ala Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu
1 5 10 15
Asp Val Arg
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 26
Val Pro Ala Gly Gly Gly Asn Lys
1 5
<210> 27
<211> 14
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 27
Ser Asp Asn Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro Ser Val Ala Arg
1 5 10
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 28
Phe Gly Leu Pro Asp Asn Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg
1 5 10 15
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 29
Leu Val Trp Ala Cys Ala Gly Val Glu Ile Gly Arg
1 5 10
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 30
Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly Cys Ala Pro Ala Ile Gly Glu His
1 5 10 15
Trp Ala Lys
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 31
Ser Arg Pro Leu Ser Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys
1 5 10 15
<210> 32
<211> 26
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 32
Asn Thr Val Leu Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala
1 5 10 15
Met Asp Phe Ser Thr Leu Gln Asp Thr Lys
20 25
<210> 33
<211> 13
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 33
Cys Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Gln Ser Ile Cys Lys
1 5 10
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 34
Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro Gln Ser Leu Tyr Ile Lys
1 5 10 15
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 35
Gly Thr Gly Met Arg
1 5
<210> 36
<211> 32
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 36
Ala Ser Pro Gly Ser Cys Val Tyr Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile
1 5 10 15
Val Thr Ser Asp Ser Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys
20 25 30
<210> 37
<211> 23
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 37
Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Val Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val
1 5 10 15
Thr Val Val Asp Thr Thr Arg
20
<210> 38
<211> 22
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 38
Ser Thr Asn Leu Thr Ile Cys Ala Ser Thr Gln Ser Pro Val Pro Gly
1 5 10 15
Gln Tyr Asp Ala Thr Lys
20
<210> 39
<211> 54
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 39
His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile
1 5 10 15
Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser
20 25 30
Ile Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr Ser
35 40 45
Leu Val Asp Thr Tyr Arg
50
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 40
Phe Val Gln Ser Val Ala Ile Thr Cys Gln Lys
1 5 10
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 41
Phe Trp Asn Val Asp Leu Lys
1 5

Claims (76)

1.一种多肽,其氨基酸序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
2.权利要求1的多肽,其中,所述多肽由如下所示的序列组成:AGAVGENVPDDLYIK(SEQID NO:1),其用于测定样品中HPV16 L1蛋白的量;所述多肽未经标记或带有可检测的标记。
3.权利要求2的多肽,其中,所述多肽带有同位素标记。
4.权利要求3的多肽,其中,所述多肽中的一个或多个氨基酸残基带有稳定同位素标记。
5.权利要求4的多肽,其中,所述稳定同位素标记选自2H、13C、15N、17O、18O及其任意组合。
6.权利要求4的多肽,其中,所述多肽由如下所示的序列组成:AGAVGENVPDD[L]YIK(SEQID NO:1),其中,[L]表示该亮氨酸中的一个或多个原子被其对应的稳定同位素替换。
7.权利要求6的多肽,其中,所述亮氨酸中的全部碳原子被13C替换。
8.权利要求1的多肽,其中,所述多肽由如下所示的序列组成:FSLDLDQYPLGR(SEQ IDNO:2),其用于测定样品中HPV18 L1蛋白的量;所述多肽未经标记或带有可检测的标记。
9.权利要求8的多肽,其中,所述多肽带有同位素标记。
10.权利要求9的多肽,其中,所述多肽中的一个或多个氨基酸残基带有稳定同位素标记。
11.权利要求10的多肽,其中,所述稳定同位素标记选自2H、13C、15N、17O、18O及其任意组合。
12.权利要求10的多肽,其中,所述多肽由如下所示的序列组成:FS[L]DLDQYPLGR(SEQID NO:2),其中,[L]表示该亮氨酸中的一个或多个原子被其对应的稳定同位素替换。
13.权利要求12的多肽,其中,所述亮氨酸中的全部碳原子及氮原子分别被13C和15N替换。
14.一种试剂盒,其包含:
第一多肽,其氨基酸序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2,并且所述第一多肽未经标记;和/或
第二多肽,其由与所述第一多肽相同的氨基酸序列组成,并且带有同位素标记。
15.权利要求14的试剂盒,其中,所述试剂盒用于测定样品中HPV16 L1蛋白的量,其包含:
(1)不同已知量的所述第一多肽,其由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成;和/或
(2)已知量的所述第二多肽。
16.权利要求15的试剂盒,其中,所述第二多肽中的一个或多个氨基酸残基带有稳定同位素标记。
17.权利要求16的试剂盒,其中,所述稳定同位素标记选自2H、13C、15N、17O、18O及其任意组合。
18.权利要求16的试剂盒,其中,所述第二多肽由如下所示的序列组成:AGAVGENVPDD[L]YIK(SEQ ID NO:1),其中,[L]表示该亮氨酸中的一个或多个原子被其对应的稳定同位素替换。
19.权利要求18的试剂盒,其中,所述亮氨酸中的全部碳原子被13C替换。
20.权利要求14的试剂盒,其中,所述试剂盒用于测定样品中HPV18 L1蛋白的量,其包含:
(1)不同已知量的所述第一多肽,其由如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成;和/或
(2)已知量的所述第二多肽。
21.权利要求20的试剂盒,其中,所述第二多肽中的一个或多个氨基酸残基带有稳定同位素标记。
22.权利要求21的试剂盒,其中,所述稳定同位素标记选自2H、13C、15N、17O、18O及其任意组合。
23.权利要求21的试剂盒,其中,所述第二多肽由如下所示的序列组成:FS[L]DLDQYPLGR(SEQ ID NO:2),其中,[L]表示该亮氨酸中的一个或多个原子被其对应的稳定同位素替换。
24.权利要求23的试剂盒,其中,所述亮氨酸中的全部碳原子及氮原子分别被13C和15N替换。
25.权利要求14-24任一项的试剂盒,其中,所述试剂盒还包含一种或多种选自1)-5)的试剂:
1)变性剂;
2)还原剂;
3)烷基化试剂;
4)蛋白酶;
5)水。
26.权利要求25的试剂盒,其具备以下特征中的一项或多项:
(1)所述变性剂选自尿素、盐酸胍或离子型表面活性剂;
(2)所述还原剂选自二硫苏糖醇、巯基乙醇或TECP;
(3)所述烷基化试剂选自碘乙酰胺;
(4)所述蛋白酶选自胰蛋白酶、LysC蛋白酶、GluC蛋白酶、AspN蛋白酶或胰凝乳蛋白酶;
(5)所述水选自纯水、超纯水、去离子水或蒸馏水。
27.一种用于非诊断目的的测定样品中HPV16 L1蛋白的量的方法,其包括使用质谱测定所述样品的酶消化产物中第一多肽的量的步骤,其中,所述第一多肽由如下所示的序列组成:AGAVGENVPDDLYIK(SEQ ID NO:1),并且未经标记。
28.权利要求27的方法,其中,使用同位素稀释质谱法测定所述样品的酶消化产物中所述第一多肽的量。
29.权利要求27的方法,其中,所述酶消化产物为胰蛋白酶消化产物。
30.权利要求27的方法,其中,在使用质谱测定所述样品的酶消化产物中第一多肽的量之前,还包括对所述酶消化产物进行纯化的步骤。
31.权利要求30的方法,其中,所述纯化为层析。
32.权利要求30的方法,其中,所述纯化为高效液相色谱或超高效液相色谱。
33.权利要求27的方法,其中,所述质谱选自四极杆质谱、离子阱质谱、飞行时间质谱或串联质谱。
34.权利要求27的方法,其中,所述质谱为三重四极杆质谱(QqQ)或四极杆飞行时间串联质谱(QTOF)。
35.权利要求27的方法,其中,所述质谱的检测模式为单离子监测(SIM)、选择反应监测(SRM)、多反应监测(MRM)或多选择反应监测(mSRM)。
36.权利要求27的方法,其中,所述样品为包含HPV16 L1蛋白的单价或多价HPV疫苗。
37.权利要求27的方法,其中,所述方法包括以下步骤:
(1)使用蛋白酶将所述样品消化,并获得酶消化产物;
(2)对步骤(1)所获得的酶消化产物进行质谱分析,并获得所述第一多肽的信号强度;
(3)将步骤(2)所获得的信号强度与标准曲线比较,并获得所述第一多肽的含量,该含量为所述样品中HPV16 L1蛋白的量;其中,所述标准曲线是所述第一多肽的已知量与所述信号强度之间的数学关系。
38.权利要求37的方法,其具备以下特征中的一项或多项:
(i)在步骤(1)中,所述蛋白酶为胰蛋白酶;
(ii)在步骤(2)和(3)中,所述信号强度为峰高或峰面积;
(iii)在步骤(2)之前,还包括对所述酶消化产物进行纯化的步骤;
(iv)在步骤(2)中,所述质谱为三重四极杆质谱(QqQ)或四极杆飞行时间串联质谱(QTOF);
(v)所述质谱中的质谱模式为MRM;
39.权利要求37的方法,其中,在步骤(2)中,所述质谱分析包括以下步骤:
(2a)对步骤(1)所获得的酶消化产物进行离子化,获得所述第一多肽的母离子和子离子;
(2b)测定步骤(2a)中获得的所述子离子的信号强度,该信号强度为所述第一多肽的信号强度。
40.权利要求39的方法,其中,所述离子化的方法为ESI。
41.权利要求39的方法,其中,所述母离子是质荷比为781±1m/z的离子碎片,所述子离子是质荷比分别为1263±1m/z和864±1m/z的离子碎片。
42.权利要求27的方法,其中,所述方法还包括使用质谱测定所述酶消化产物中第二多肽的量的步骤,其中,所述第二多肽由与所述第一多肽相同的氨基酸序列组成,并且带有同位素标记。
43.权利要求42的方法,其中,所述第二多肽中的一个或多个氨基酸残基带有稳定同位素标记。
44.权利要求43的方法,其中,所述稳定同位素标记选自2H、13C、15N、17O、18O及其任意组合。
45.权利要求43的方法,其中,所述第二多肽由如下所示的序列组成:AGAVGENVPDD[L]YIK(SEQ ID NO:1),其中,[L]表示该亮氨酸中的一个或多个原子被其对应的稳定同位素替换。
46.权利要求45的方法,其中,所述亮氨酸([L])中的全部碳原子被13C替换。
47.权利要求42的方法,其中,所述方法包括以下步骤:
(1)使用蛋白酶将所述样品消化,并获得酶消化产物;
(2)将已知量的所述第二多肽加入步骤(1)所获得的酶消化产物中,并获得混合物;
(3)对步骤(2)所获得的混合物进行质谱分析,并获得所述第一多肽和所述第二多肽的信号强度;
(4)计算所述所述第一多肽与所述第二多肽的信号强度的比值;
(5)将所述比值与标准曲线比较,并获得所述第一多肽的含量,该含量为所述样品中HPV16 L1蛋白的量;其中,所述标准曲线是所述第一多肽的已知量与所述比值之间的数学关系。
48.权利要求47的方法,其具备以下特征中的一项或多项:
(i)在步骤(1)中,所述蛋白酶为胰蛋白酶;
(ii)在步骤(2)~(4)中,所述信号强度为峰高或峰面积;
(iii)在步骤(3)之前,还包括对所述混合物进行纯化的步骤;
(iv)在步骤(3)中,所述质谱分析为三重四极杆质谱;
(v)在步骤(3)中,所述质谱分析的检测模式为MRM。
49.权利要求47的方法,其中,在步骤(3)中,所述质谱分析包括以下步骤:
(3a)对步骤(2)所获得的混合物进行离子化,获得所述第一多肽的母离子和子离子和所述第二多肽的母离子和子离子;
(3b)测定步骤(3a)中获得的所述第一多肽的子离子和所述第二多肽的子离子的信号强度,其中所述第一多肽的子离子的信号强度为所述第一多肽的信号强度,所述第二多肽的子离子的信号强度为所述第二多肽的信号强度。
50.权利要求49的方法,其中,所述离子化的方法为ESI。
51.权利要求49的方法,其中,所述第一多肽的母离子是质荷比为781±1m/z的离子碎片,所述子离子是质荷比分别为1263±1m/z和864±1m/z的离子碎片;和,
所述第二多肽由如下所示的序列组成:AGAVGENVPDD[L]YIK(SEQ ID NO:1),其中,[L]所示的亮氨酸中的全部碳原子被13C替换,并且所述第二多肽的母离子是质荷比为784±1m/z的离子碎片,所述子离子是质荷比分别为1269±1m/z和869±1m/z的离子碎片。
52.一种用于非诊断目的的测定样品中HPV18 L1蛋白的量的方法,其包括使用质谱测定所述样品的酶消化产物中第一多肽的量的步骤,其中,所述第一多肽由如下所示的序列组成:FSLDLDQYPLGR(SEQ ID NO:2),并且未经标记。
53.权利要求52的方法,其中,使用同位素稀释质谱法测定所述样品的酶消化产物中所述第一多肽的量。
54.权利要求52的方法,其中,所述酶消化产物为胰蛋白酶消化产物。
55.权利要求52的方法,其中,在使用质谱测定所述样品的酶消化产物中第一多肽的量之前,还包括对所述酶消化产物进行纯化的步骤。
56.权利要求55的方法,其中,所述纯化为层析。
57.权利要求55的方法,其中,所述纯化为高效液相色谱或超高效液相色谱。
58.权利要求52的方法,其中,所述质谱选自四极杆质谱、离子阱质谱、飞行时间质谱或串联质谱。
59.权利要求52的方法,其中,所述质谱为三重四极杆质谱(QqQ)或四极杆飞行时间串联质谱(QTOF)。
60.权利要求52的方法,其中,所述质谱的检测模式为单离子监测(SIM)、选择反应监测(SRM)、多反应监测(MRM)或多选择反应监测(mSRM)。
61.权利要求52的方法,其中,所述样品为包含HPV18 L1蛋白的单价或多价HPV疫苗。
62.权利要求52的方法,其中,所述方法包括以下步骤:
(1)使用蛋白酶将所述样品消化,并获得酶消化产物;
(2)对步骤(1)所获得的酶消化产物进行质谱分析,并获得所述第一多肽的信号强度;
(3)将步骤(2)所获得的信号强度与标准曲线比较,并获得所述第一多肽的含量,该含量为所述样品中HPV18 L1蛋白的量;其中,所述标准曲线是所述第一多肽的已知量与所述信号强度之间的数学关系。
63.权利要求62的方法,其具备以下特征中的一项或多项:
(i)在步骤(1)中,所述蛋白酶为胰蛋白酶;
(ii)在步骤(2)和(3)中,所述信号强度为峰高或峰面积;
(iii)在步骤(2)之前,还包括对所述酶消化产物进行纯化的步骤;
(iv)在步骤(2)中,所述质谱为三重四极杆质谱(QqQ)或四极杆飞行时间串联质谱(QTOF);
(v)所述质谱中的质谱模式为MRM。
64.权利要求62的方法,其中,在步骤(2)中,所述质谱分析包括以下步骤:
(2a)对步骤(1)所获得的酶消化产物进行离子化,获得所述第一多肽的母离子和子离子;
(2b)测定步骤(2a)中获得的所述子离子的信号强度,该信号强度为所述第一多肽的信号强度。
65.权利要求64的方法,其中,所述离子化的方法为ESI。
66.权利要求64的方法,其中,所述母离子是质荷比为712±1m/z的离子碎片,所述子离子是质荷比分别为442±1m/z和605±1m/z的离子碎片。
67.权利要求52的方法,其中,所述方法还包括使用质谱测定所述酶消化产物中第二多肽的量的步骤,其中,所述第二多肽由与所述第一多肽相同的氨基酸序列组成,并且带有同位素标记。
68.权利要求67的方法,其中,所述第二多肽中的一个或多个氨基酸残基带有稳定同位素标记。
69.权利要求68的方法,其中,所述稳定同位素标记选自2H、13C、15N、17O、18O及其任意组合。
70.权利要求68的方法,其中,所述第二多肽由如下所示的序列组成:FS[L]DLDQYPLGR(SEQ ID NO:2),其中,[L]表示该亮氨酸中的一个或多个原子被其对应的稳定同位素替换。
71.权利要求70的方法,其中,所述亮氨酸([L])中的全部碳原子及氮原子分别被13C和15N替换。
72.权利要求67的方法,其中,所述方法包括以下步骤:
(1)使用蛋白酶将所述样品消化,并获得酶消化产物;
(2)将已知量的所述第二多肽加入步骤(1)所获得的酶消化产物中,并获得混合物;
(3)对步骤(2)所获得的混合物进行质谱分析,并获得所述第一多肽和所述第二多肽的信号强度;
(4)计算所述所述第一多肽与所述第二多肽的信号强度的比值;
(5)将所述比值与标准曲线比较,并获得所述第一多肽的含量,该含量为所述样品中HPV18 L1蛋白的量;其中,所述标准曲线是所述第一多肽的已知量与所述比值之间的数学关系。
73.权利要求72的方法,其具备以下特征中的一项或多项:
(i)在步骤(1)中,所述蛋白酶为胰蛋白酶;
(ii)在步骤(2)~(4)中,所述信号强度为峰高或峰面积;
(iii)在步骤(3)之前,还包括对所述混合物进行纯化的步骤;
(iv)在步骤(3)中,所述质谱分析为三重四极杆质谱;
(v)在步骤(3)中,所述质谱分析的检测模式为MRM。
74.权利要求72的方法,其中,在步骤(3)中,所述质谱分析包括以下步骤:
(3a)对步骤(2)所获得的混合物进行离子化,获得所述第一多肽的母离子和子离子和所述第二多肽的母离子和子离子;
(3b)测定步骤(3a)中获得的所述第一多肽的子离子和所述第二多肽的子离子的信号强度,其中所述第一多肽的子离子的信号强度为所述第一多肽的信号强度,所述第二多肽的子离子的信号强度为所述第二多肽的信号强度。
75.权利要求74的方法,其中,所述离子化的方法为ESI。
76.权利要求74的方法,其中,所述第一多肽的母离子是质荷比为712±1m/z的离子碎片,所述子离子是质荷比分别为442±1m/z和605±1m/z的离子碎片;和,
所述第二多肽由如下所示的序列组成:FS[L]DLDQYPLGR(SEQ ID NO:2),其中,[L]所示的亮氨酸中的全部碳原子及氮原子分别被13C和15N替换,并且所述第二多肽的母离子是质荷比为716±1m/z的离子碎片,所述子离子是质荷比分别为442±1m/z和232±1m/z的离子碎片。
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