CN108957008B - 检测大鼠cyp2e1酶的特征肽段及其筛选方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段及其筛选方法与应用，属于生物检测和蛋白质技术领域。本发明提供的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，时效性高，能特异性的针对CYP2E1酶进行检测，专属性较强；能较好的避免被干扰，将特征肽段应用到检测大鼠CYP2E1酶中，效果明显；检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段的筛选方法，通过本筛选方法，能获得特异性的片段。

Description

检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段及其筛选方法与应用
技术领域
本发明涉及生物检测和蛋白质技术领域，具体而言，涉及检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段及其筛选方法与应用。
背景技术
肝脏中细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)是许多内源性和外源性物质进行Ⅰ相代谢的主要酶类，其中CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2E和CYP3A五大类参与了临床70～80％常用药物的代谢。CYP2E1是CYP2E家族中报道对药物影响最大的代谢酶。
对于CYP2E1酶作用的药物，不同个体对同一药物剂量反应不同，甚至导致不可预见的药物不良反应及毒性，主要表现在酶基因多态性和含量差异性两个方面。其基因多态性已被广泛任何，但由于现有蛋白定量方法的缺陷，含量差异在药物对人体的作用研究相对较少。
不同的研究机构对代谢酶的定量方法不全相同，主要包括定量RT-PCR、半定量RT-PCR从转录水平对mRNA定量分析，或以免疫组织化学技术(IHC)、免疫印迹法(WesternBlot)从翻译水平对相应蛋白质表达水平定量。但是由于m RNA的翻译水平调控以及蛋白质的翻译后转移和修饰受多种因素的影响，因此测得的m RNA的量不能准确代表药物代谢酶的表达水平。同时，由于外排蛋白具有高度的序列同源性，因此现有免疫印迹法缺乏专属性，伴有一定的抗原-抗体交叉反应，有可能形成非特异性的抗原抗体复合物，其掺杂在待测物与抗体形成的复合物间，从而导致错误结果的产生。探针底物法是测定酶的活性(从功能上分析)的方法，目前在评价细胞色素P450酶活性时采用最多的是“Cocktail”探针底物法，该方法选用主要经该酶代谢的药物作用底物，通过测试底物的减少量或代谢产物的生成量测试酶的活性。通过这种方法获得的结果具有间接性，并且往往涉及到大量样本的采集和测试，时效性差。难以重复。同时，同一个探针底物可被多个酶催化，同一个酶可催化众多化合物，因此，探针底物法的交叉反应使得方法准确性较差。
已有少量国内外文献报道使用质谱技术绝对定量CYP450酶，但关于对CYP2E1酶的定量研究较少，现有的方法选出3-5条目标蛋白的肽段，将特征肽段串联，通过质粒转化、蛋白表达与纯化，用纯化后的蛋白作为标准品定量。但是该方法在筛选肽段时未用实际样本进行验证，仅借用软件筛选出特异性肽段，是否满足唯一性并能在仪器中有足够高的响应是在前期筛选无法确认的，同时，现有方法开发后未进行方法验证，仅用标曲完成样本定量，定量下限较高，灵敏度不够。
发明内容
本发明的第一目的在于提供检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，该特征肽段能用于精确检测CYP2E1酶的含量，检测结果可靠。
本发明的第二目的在于提供上述的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段在大鼠CYP2E1酶定量检测的应用。
本发明的第三目的在于提供检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段的筛选方法，通过该筛选方法，能筛选得到特异性的肽段。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，特征肽段包括定量肽段、标记肽段和延长肽段；定量肽段包括第一定量肽段和第二定量肽段，第一定量肽段和第二定量肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；标记肽段包括第一标记肽段和第二标记肽段，第一标记肽段和第二标记肽段为同位素标记；延长肽段包括第一延长肽段和第二延长肽段，第一延长肽段和第二延长肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。
上述的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段在CYP2E1酶定量检测的应用。
检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段的筛选方法，筛选方法包括以下步骤：
取大鼠CYP2E1酶液待测样本进行SDS-PAGE凝胶电泳；电泳结束后用水漂洗SDS-PAGE凝胶，再用固定液处理，得到固定液凝胶；
用考马斯亮蓝染色固定液凝胶得到染色凝胶，用水清洗染色凝胶并用脱色液处理；
将染色的蛋白条带切下，并切碎成胶粒，再加入脱色液处理后用乙腈脱水，用还原液水浴处理后，加入蛋白保护液处理后，再次加入250μL还原液室温处理，得到还原胶粒；
干燥还原胶粒。并加入酶处理18h，并通过ZipTipC18柱脱盐处理，得到脱盐样本；
将脱盐样本干燥浓缩并加入0.1％甲酸溶液混悬，得到样本混悬液；将样本混悬液通过液相色谱系统和质谱系统分析，获得肽段信息，分析并获得目标肽段信息，合成得到特征肽段。
本发明的有益效果为：本发明提供的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，时效性高，能特异性的针对CYP2E1酶进行检测，专属性较强；能较好的避免被干扰，将特征肽段应用到检测大鼠CYP2E1酶中，经方法学验证显示，定量肽段1与定量肽段2在2～320ng/mL的范围内均线性良好，定量下限可达2ng/mL，灵敏度高，满足样本测试要求。质控浓度样本测量值偏差在±15％以内，RSD值不大于6.7％。肽段经酶解后于进样器条件下存放24h，-20℃保存20d，-20℃冻融三次均稳定；检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段的筛选方法，通过本筛选方法，能获得特异性的片段，并将建立的方法成功用于定量大鼠肝微粒体CYP2E1酶的表达量。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段及其筛选方法与应用进行具体说明。
同一蛋白，选用不同的特征肽段，可能导致定量结果不同。这是由于不同肽段的酶解效率是存在差异的，为了验证肽段的选择对测试结果的影响，本研究筛选了大鼠CYP2E1酶的2条特征肽段进行方法开发。
检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，特征肽段包括定量肽段、标记肽段和延长肽段；定量肽段包括第一定量肽段和第二定量肽段，第一定量肽段和第二定量肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；标记肽段包括第一标记肽段和第二标记肽段，第一标记肽段和第二标记肽段为同位素标记；延长肽段包括第一延长肽段和第二延长肽段，第一延长肽段和第二延长肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。进一步地，在本发明较佳的实施例中，第一标记肽段的同位素标记方式为：FINL(13C6 15N1)VPSNLPHEATR；第二标记肽段的同位素标记方式为GII(13C6 15N1)FNNGPTWK。
实际上，本方案中，肽段的标记还可以是其他类的标记，也可以是其他位置的氨基酸的标记。
上述的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段在大鼠CYP2E1酶定量检测的应用。
检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段的筛选方法，筛选方法包括以下步骤：
取大鼠CYP2E1酶液待测样本进行SDS-PAGE凝胶电泳；电泳结束后用水漂洗SDS-PAGE凝胶，再用固定液处理，得到固定液凝胶；
用考马斯亮蓝染色固定液凝胶得到染色凝胶，用水清洗染色凝胶并用脱色液处理；
将染色的蛋白条带切下，并切碎成胶粒，再加入脱色液处理后用乙腈脱水，用还原液水浴处理后，加入蛋白保护液处理后，再次加入250μL还原液室温处理，得到还原胶粒；
干燥还原胶粒，并加入酶处理18h，并通过ZipTipC18柱脱盐处理，得到脱盐样本；
将脱盐样本干燥浓缩并加入0.1％甲酸溶液混悬，得到样本混悬液；将样本混悬液通过液相色谱系统和质谱系统分析，获得肽段信息，分析并获得目标肽段信息，合成得到特征肽段。
当然，在前期的准备阶段，可以通过软件进行模拟处理，筛选目标片段，控制肽段长度为7-22个氨基酸，肽段的两端应该至少有一端含有赖氨酸或者精氨酸；尽量避免含有易于氧化的半胱氨酸(C)和甲硫氨酸(M)；特征性肽段要避免跨膜区域和翻译后修饰区域，因为构成跨膜区域蛋白质的氨基酸序列绝大部分都是疏水性氨基酸以及转录后翻译可能会造成一个肽段分子量的改变。含有连续的赖氨酸(K)和精氨酸(R)的特征性肽段也要排除。序列中疏水性氨基酸应尽量占50％以下，最多不要超过75％。同时，针对两条定量肽段，分别设计对应的延长肽段；当两条定量肽段的检测数据不一致的时候，通过延长肽段检验检测数据的可靠性。
加入适量的考马斯亮蓝超快染色液(每块大小约7×8cm的凝胶需使用约20mL)，使染色液能盖住凝胶，且液面至少高出三个胶的厚度为宜。
凝胶染色时间根据凝胶的厚度确定，1mm凝胶推荐的染色时间为30min，1.5mm凝胶推荐的染色时间为60min。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，按体积份计，固定液由190-205份无水乙醇、95-105份乙酸和190-215份水制成；脱色液由230-260份乙醇、75-85份冰醋酸和655-695份水制；还原液有25mM的DTT和25mM的NH4HCO3配制而成，蛋白保护液有25mM的IAA和25mM的NH4HCO3配制而成。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，水浴的温度为55-59℃，水浴的时间为55-65min。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，酶为胰酶，用胰酶处理的温度为35-38℃。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，甲酸溶液的体积为18-24μL。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，液相色谱系统的进样量为6mL，柱温20℃，流速为0.2μL/min；流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为0.1％的甲酸溶液，流动相B为0.1％的甲酸-乙腈溶液；流动相的梯度为(体积百分数)：
0-49min，A:100％、B:0；
49-50min，A：70％、B：30％；
50-60min，A：3％、B：97％。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，质谱系统的条件为：电喷雾(ESI)离子源，离子源喷雾电压2kV，加热毛细管温度350℃；一级质谱Orbitrap扫描范围280～1500，二级质谱LTQ为CID碰撞，正离子模式，标准化碰撞能量35％，活化q值0.1，活化时间10ms以0.2-0.3℃/s的速度升温，收集74-85℃的荧光信号。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，特征肽段包括定量肽段、标记肽段和延长肽段；定量肽段包括第一定量肽段和第二定量肽段，第一定量肽段和第二定量肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；标记肽段包括第一标记肽段和第二标记肽段，第一标记肽段和第二标记肽段为同位素标记；延长肽段包括第一延长肽段和第二延长肽段，第一延长肽段和第二延长肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。
第一标记肽段的同位素标记方式为：FINL(13C6 15N1)VPSNLPHEATR；第二标记肽段的同位素标记方式为GII(13C6 15N1)FNNGPTWK。
因此，可以将上述的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段应用于CYP2E1酶含量的定量检测中。
实施例2
本实施例提供检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段的筛选方法，包括以下步骤：
首先，根据CYP2E1酶的氨基酸序列通过Skyline软件模拟酶切，模拟酶切的肽段长度设置为7-22个氨基酸长度。得到模拟酶切肽段，并得到每一条肽段的离子信息；再通过Uniprot软件排除不符合特征性肽段的区域，如金属结合位点，冲突序列，翻译后修饰位点。NCBI数据库的Protein BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)可以对候选肽段进行特异性鉴定。输入蛋白或肽段序列，种族选择Rattusnorvegicus，分析两条肽段是否均满足特异性要求。
其次，取的小鼠肝微粒体样本，用BCA法测定样本的蛋白浓度，并根据需要调整样本的浓度，通过SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后用蒸馏水漂洗，再加入50mL的固定液，(固定液由190mL的无水乙醇、95mL的乙酸加水定容至500mL制得)，室温慢摇固定30min，回收固定液，得到固定液凝胶。
将固定液凝胶加入适量ddH2O漂洗两次，每次室温漂洗15min；漂洗后加入适量的考马斯亮蓝超快染色液(每块大小约7×8cm的凝胶需使用约20mL)，使染色液能盖住凝胶，室温(20-25℃)在侧摆摇床或水平摇床上染色60min，实际染色时间可以根据染色效果自行调整，染色至能看到清晰的目标蛋白条带后，弃染色液，得到染色凝胶。
染色凝胶加入适量的去离子水，洗去残留的染色液，停止染色反应，然后记录实验结果。最后用蒸馏水洗掉凝胶浮色，即可看到条带清晰明亮。
凝胶脱色、还原剂烷基化：经染色的凝胶加入脱色液(脱色液由260mL乙醇、85mL的冰醋酸和655mL的水制成)，摇床摇动脱色，更换脱色液脱色3-4次；将SDS-PAGE染色的蛋白条带切下，切成1mm3的胶粒，再次加入脱色液，直至胶粒成透明，然后加入25mM的NH4HCO3进行清洗后，用乙腈脱水处理；加入250μL的还原液(还原液由25mM的DTT和25mM的NH4HCO3配制而成)55℃水浴处理55min，冷却至室温后，加入250μL的蛋白保护液(蛋白保护液由25mM的IAA和25mM的NH4HCO3配制而成)室温避光反应30min，再次加入250μL的还原液室温反应30min，以除去多余的IAA，得到还原胶粒。
干燥、酶解并脱盐样品：将还原胶粒清洗脱色，并真空干燥后，加入胰酶在35℃处理18h，向ZipTip管内加入0.2mL100％ACN，2000rpm离心2-3min，重复3次，活化ZipTipC18柱；加入0.2mL0.1％FA水溶液，4000rpm离心4min，重复3次，平衡ZipTipC18柱；酶解液加入平衡后的ZipTip管，4000rpm离心6min，再将离心后EP管内的液体重新加入ZipTip管，离心，充分吸附裂解液里的肽段；吸附后加入0.2mL0.1％FA水溶液，4000rpm离心4min，充分洗涤ZipTip中所含的盐类成分；将0.2mL洗脱液(80％ACN/01％FA)加入ZipTip管，4000rpm离心4min将肽段洗脱液至ZipTip管内，离心即得。得到脱盐样本；
质谱分析：将脱盐样本进行干燥和浓缩，得到3-10μL样品，加入18μL的0.1％的甲酸溶液混悬，得到样本混悬液。
将样本混悬液进行液相色谱仪分析：液相色谱系统的进样量为6mL，柱温20℃，流速为0.2μL/min；流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为0.1％的甲酸溶液，流动相B为0.1％的甲酸-乙腈溶液；流动相的梯度为(体积百分数)：
0-49min，A:100％、B:0；
49-50min，A：70％、B：30％；
50-60min，A：3％、B：97％。
经色谱分离的肽段直接进入高分辨LTQ-Orbitrap质谱仪，质谱条件如下：电喷雾(ESI)离子源，离子源喷雾电压2kV，加热毛细管温度350℃。一级质谱Orbitrap扫描范围280～1500，二级质谱LTQ为CID碰撞，正离子模式，标准化碰撞能量35％，活化q值0.1，活化时间10ms；获得目标肽段信息。
根据目标肽段与数据库比对，筛选得到如实施例1所示的定量肽段，定量肽段包括第一定量肽段和第二定量肽段，第一定量肽段和第二定量肽段的氨基酸序列如SEQ IDNO.1-2所示。
根据定量肽段可以合成得到标记肽段和延长肽段。
实施例3
本实施例提供检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段的筛选方法，包括以下步骤：
首先，根据CYP2E1酶的氨基酸序列通过Skyline软件模拟酶切，模拟酶切的肽段长度设置为7-22个氨基酸长度。得到模拟酶切肽段，并得到每一条肽段的离子信息；再通过Uniprot软件排除不符合特征性肽段的区域，如金属结合位点，冲突序列，翻译后修饰位点。NCBI数据库的Protein BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)可以对候选肽段进行特异性鉴定。输入蛋白或肽段序列，种族选择Rattusnorvegicus，分析两条肽段是否均满足特异性要求。
其次，取的小鼠肝微粒体样本，用BCA法测定样本的蛋白浓度，并根据需要调整样本的浓度，通过SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后用蒸馏水漂洗，再加入50mL的固定液，(固定液由205mL的无水乙醇、105mL的乙酸加190mL水定容至500mL制得)，室温慢摇固定30min，回收固定液，得到固定液凝胶。
将固定液凝胶加入适量ddH2O漂洗两次，每次室温漂洗15min；漂洗后加入适量的考马斯亮蓝超快染色液(每块大小约7×8cm的凝胶需使用约20mL)，使染色液能盖住凝胶，室温(20-25℃)在侧摆摇床或水平摇床上染色60min，实际染色时间可以根据染色效果自行调整，染色至能看到清晰的目标蛋白条带后，弃染色液，得到染色凝胶。
染色凝胶加入适量的去离子水，洗去残留的染色液，停止染色反应，然后记录实验结果。最后用蒸馏水洗掉凝胶浮色，即可看到条带清晰明亮。
凝胶脱色、还原剂烷基化：经染色的凝胶加入脱色液(脱色液由230mL乙醇、75mL的冰醋酸和695mL的水制成)，摇床摇动脱色，更换脱色液脱色3-4次；将SDS-PAGE染色的蛋白条带切下，切成1mm3的胶粒，再次加入脱色液，直至胶粒成透明，然后加入25mM的NH4HCO3进行清洗后，用乙腈脱水处理；加入250μL的还原液(还原液由25mM的DTT和25mM的NH4HCO3配制而成)55℃水浴处理55min，冷却至室温后，加入250μL的蛋白保护液(蛋白保护液由25mM的IAA和25mM的NH4HCO3配制而成)室温避光反应30min，再次加入250μL的还原液室温反应30min，以除去多余的IAA，得到还原胶粒。
干燥并酶解并脱盐样品：将还原胶粒清洗脱色，并真空干燥后，加入胰酶在35℃处理18h，向ZipTip管内加入0.2mL100％ACN，2000rpm离心2-3in，重复3次，活化ZipTipC18柱；加入0.2mL0.1％FA水溶液，4000rpm离心4min，重复3次，平衡ZipTipC18柱；酶解液加入平衡后的ZipTip管，4000rpm离心6min，再将离心后EP管内的液体重新加入ZipTip管，离心，充分吸附裂解液里的肽段；吸附后加入0.2mL0.1％FA水溶液，4000rpm离心4min，充分洗涤ZipTip中所含的盐类成分；将0.2mL洗脱液(80％ACN/01％FA)加入ZipTip管，4000rpm离心4min将肽段洗脱液至ZipTip管内，离心即得。得到脱盐样本；
质谱分析：将脱盐样本进行干燥和浓缩，得到3-10μL样品，加入24μL的0.1％的甲酸溶液混悬，得到样本混悬液。
将样本混悬液进行液相色谱仪分析：液相色谱系统的进样量为6mL，柱温20℃，流速为0.2μL/min；流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为0.1％的甲酸溶液，流动相B为0.1％的甲酸-乙腈溶液；流动相的梯度为(体积百分数)：
0-49min，A:100％、B:0；
49-50min，A：70％、B：30％；
50-60min，A：3％、B：97％。
经色谱分离的肽段直接进入高分辨LTQ-Orbitrap质谱仪，质谱条件如下：电喷雾(ESI)离子源，离子源喷雾电压2kV，加热毛细管温度350℃。一级质谱Orbitrap扫描范围280～1500，二级质谱LTQ为CID碰撞，正离子模式，标准化碰撞能量35％，活化q值0.1，活化时间10ms；获得目标肽段信息。
根据目标肽段与数据库比对，筛选得到如实施例1所示的定量肽段，定量肽段包括第一定量肽段和第二定量肽段，第一定量肽段和第二定量肽段的氨基酸序列如SEQ IDNO.1-2所示。
根据定量肽段可以合成得到标记肽段和延长肽段。
实施例4
本实施例提供检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段的筛选方法，包括以下步骤：
首先，根据CYP2E1酶的氨基酸序列通过Skyline软件模拟酶切，模拟酶切的肽段长度设置为7-22个氨基酸长度。得到模拟酶切肽段，并得到每一条肽段的离子信息；再通过Uniprot软件排除不符合特征性肽段的区域，如金属结合位点，冲突序列，翻译后修饰位点。NCBI数据库的Protein BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)可以对候选肽段进行特异性鉴定。输入蛋白或肽段序列，种族选择Rattusnorvegicus，分析两条肽段是否均满足特异性要求。
其次，取的小鼠肝微粒体样本，用BCA法测定样本的蛋白浓度，并根据需要调整样本的浓度，通过SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后用蒸馏水漂洗，再加入50mL的固定液，(固定液由200mL的无水乙醇、100mL的乙酸加200mL水定容至500mL制得)，室温慢摇固定30min，回收固定液，得到固定液凝胶。
将固定液凝胶加入适量ddH2O漂洗两次，每次室温漂洗15min；漂洗后加入适量的考马斯亮蓝超快染色液(每块大小约7×8cm的凝胶需使用约20mL)，使染色液能盖住凝胶，室温(20-25℃)在侧摆摇床或水平摇床上染色60min，实际染色时间可以根据染色效果自行调整，染色至能看到清晰的目标蛋白条带后，弃染色液，得到染色凝胶。
染色凝胶加入适量的去离子水，洗去残留的染色液，停止染色反应，然后记录实验结果。最后用蒸馏水洗掉凝胶浮色，即可看到条带清晰明亮。
凝胶脱色、还原剂烷基化：经染色的凝胶加入脱色液(脱色液由250mL乙醇、80mL的冰醋酸和675mL的水制成)，摇床摇动脱色，更换脱色液脱色3-4次；将SDS-PAGE染色的蛋白条带切下，切成1mm3的胶粒，再次加入脱色液，直至胶粒成透明，然后加入25mM的NH4HCO3进行清洗后，用乙腈脱水处理；加入250μL的还原液(还原液由25mM的DTT和25mM的NH4HCO3配制而成)55℃水浴处理55min，冷却至室温后，加入250μL的蛋白保护液(蛋白保护液由25mM的IAA和25mM的NH4HCO3配制而成)室温避光反应30min，再次加入250μL的还原液室温反应30min，以除去多余的IAA，得到还原胶粒。
干燥并酶解并脱盐样品：将还原胶粒清洗脱色，并真空干燥后，加入胰酶在35℃处理18h，向ZipTip管内加入0.2mL100％ACN，2000rpm离心2-3in，重复3次，活化ZipTipC18柱；加入0.2mL0.1％FA水溶液，4000rpm离心4min，重复3次，平衡ZipTipC18柱；酶解液加入平衡后的ZipTip管，4000rpm离心6min，再将离心后EP管内的液体重新加入ZipTip管，离心，充分吸附裂解液里的肽段；吸附后加入0.2mL0.1％FA水溶液，4000rpm离心4min，充分洗涤ZipTip中所含的盐类成分；将0.2mL洗脱液(80％ACN/01％FA)加入ZipTip管，4000rpm离心4min将肽段洗脱液至ZipTip管内，离心即得。得到脱盐样本；
质谱分析：将脱盐样本进行干燥和浓缩，得到3-10μL样品，加入20μL的0.1％的甲酸溶液混悬，得到样本混悬液。
将样本混悬液进行液相色谱仪分析：液相色谱系统的进样量为6mL，柱温20℃，流速为0.2μL/min；流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为0.1％的甲酸溶液，流动相B为0.1％的甲酸-乙腈溶液；流动相的梯度为(体积百分数)：
0-49min，A:100％、B:0；
49-50min，A：70％、B：30％；
50-60min，A：3％、B：97％。
经色谱分离的肽段直接进入高分辨LTQ-Orbitrap质谱仪，质谱条件如下：电喷雾(ESI)离子源，离子源喷雾电压2kV，加热毛细管温度350℃。一级质谱Orbitrap扫描范围280～1500，二级质谱LTQ为CID碰撞，正离子模式，标准化碰撞能量35％，活化q值0.1，活化时间10ms；获得目标肽段信息。
根据目标肽段与数据库比对，筛选得到如实施例1所示的定量肽段，定量肽段包括第一定量肽段和第二定量肽段，第一定量肽段和第二定量肽段的氨基酸序列如SEQ IDNO.1-2所示。
根据定量肽段可以合成得到标记肽段和延长肽段。
综上所述，本发明实施例提供的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，特异性好，针对性强；能用于检测CYP2E1酶，使检测结果精确可靠；筛选检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段的方法，能获得较为特异的片段，操作检测，易于实施。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 余鹏
<120> 检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段及其筛选方法与应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Phe Ile Asn Leu Val Pro Ser Asn Leu Pro His Glu Ala Thr Arg
1 5 10 15
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Gly Ile Ile Phe Asn Asn Gly Pro Thr Trp Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Ile Gln Arg Phe Ile Asn Leu Val Pro Ser Asn Leu Pro His Glu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Asp Thr Val
20
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Lys Asn Lys Gly Ile Ile Phe Asn Asn Gly Pro Thr Trp Lys Asp Val
1 5 10 15
Arg

Claims (3)

1.检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，其特征在于，所述特征肽段是 由定量肽段、标记肽段和延长肽段组成的肽段组合；所述定量肽段为第一定量肽段和第二定量肽段，所述第一定量肽段和所述第二定量肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；所述标记肽段包括第一标记肽段和第二标记肽段，所述第一标记肽段和所述第二标记肽段为同位素标记；所述延长肽段包括第一延长肽段和第二延长肽段，所述第一延长肽段和所述第二延长肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。
2.根据权利要求1所述的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，其特征在于，所述第一标记肽段的同位素标记方式为：FINL(13C6 15N1)VPSNLPHEATR；所述第二标记肽段的同位素标记方式为GII(13C6 15N1)FNNGPTWK。
3.如权利要求1或2所述的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段在CYP2E1酶定量检测的应用。
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药物代谢的生物质谱绝对定量方法发展及其应用研究;刘喜东;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20141015(第10期);正文第19-36页第三章 *

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