CN102998361A - C反应蛋白标准物质定值的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种C反应蛋白标准物质定值的方法，C反应蛋白（C-reactionprotein，CRP）在1930年由Tillet和Francis发现。CRP是机体受到微生物入侵或组织损伤等炎症性刺激时肝细胞合成的急性相蛋白。在实际检测工作中，主要是采用C反应蛋白分析仪对C反应蛋白进行测定，其均需要使用C反应蛋白标准物质，但是对于其标准物质定值是否准确的研究现在还很少。本发明所解决的技术问题是填补上述技术空白，提供一种C反应蛋白标准物质定值的方法，具有良好的准确性、可靠性和溯源性。
Description
技术领域
本发明涉及一种标准物质的定值方法，尤其是涉及一种C反应蛋白标准物质定值的方法。
背景技术
对通过均匀性、稳定性检验合格样料的特性值进行测量，在标准物质技术领域称为表征化(原文为characterize，即对材料特性进行测量)；由计量权威部门对表征化获得的样料特性的量值进行计量学溯源性(以下简称溯源性)确认和相应测量不确定度评定合理性确认，在标准物质技术领域称为定值(原文为certify，即对测量获得的结果进行认证确认，在其它技术领域一般称为认证)。因此，对有证标准物质的定值，实际上应分为两步：首先是对经过均匀性、稳定性检验合格的样料特性值进行测量，也就是表征化；然后是对测量结果的溯源性和测量不确定度评定的合理性进行有效性确认。
C反应蛋白（C-reactionprotein，CRP）在1930年由Tillet和Francis发现。最初他们观察到一些急性病人的血清可与肺炎链球菌的荚膜C-多糖发生反应，随后证实能与C-多糖反应的物质是一种蛋白质，因而将这种蛋白质命名为C反应蛋白（C-reaction protein，CRP）。CRP是机体受到微生物入侵或组织损伤等炎症性刺激时肝细胞合成的急性相蛋白。CRP的测定，可用来对下列情况治疗监测：
（1）在许多急性感染时，作为最有效使用抗生素治疗的依据。
（2）在高危病人缺少微生物学诊断时，进行抗生素治疗。
（3）在CRP下降至正常时，中断抗生素治疗。
（4）根据CRP的水平变化来决定抗炎药物的剂量。
（5）在有些难以进行临床评估的风湿性疾病中，快速选择合适的抗治疗。
（6）估计并发症的开始。如在风湿性多肌痛患者中巨细胞动脉炎的发展。
在实际检测工作中，主要是采用C反应蛋白分析仪对C反应蛋白进行测定，其均需要使用C反应蛋白标准物质，但是对于其标准物质定值是否准确的研究现在还很少。
发明内容
本发明所解决的技术问题是填补上述技术空白，提供一种C反应蛋白标准物质定值的方法，具有良好的准确性、可靠性和溯源性。
上述定值方法，包括以下步骤：
(1)合成三条特异性肽段：ESDTSYVSLK、APLTKPLK、ALKYEVQGEVFTK用于进行C反应蛋白定量；
(2)同时使用全氘标记的亮氨基合成对应的三条同位素标记肽段；
(3)以亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸标准物质为标准，以同位素标记亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对合成的三条标准肽段进行准确定量；
(4)按400μL溶液中所含C反应蛋白质量，根据三条肽段的纯度计算酶切后所得三条目标肽段的质量，配制相应浓度标准肽段及同位素内标肽段；
(5)准确称量400μL C反应蛋白溶液，加入并称量相应体积的同位素内标溶液；使酶切后所得目标肽段与内标肽段摩尔比为1:1；
(6)离心干燥上述已加入内标的蛋白溶液，加入100μL的8M尿素溶液对蛋白进行变性处理；10min后加入2μL 1M的二硫苏糖醇溶液在60摄氏度水浴中加热60min；然后加入2μL 1M的碘乙酰胺，在暗处反应40min；加入6μL 1M的二硫苏糖醇还原多余的碘乙酰胺；用100mM的碳酸氢胺溶液稀释尿素至1M以下，加入2μL 0.5mg/mL的胰蛋白酶溶液进行酶切，每24小时补充2μL的胰蛋白酶；酶切96小时后采用同位素稀释质谱法对三条肽段进行准确定量；
(7)根据质谱所得酶切后肽段与同位素肽段的比例配制标准肽段与内标肽段比例的标准曲线；计算溶液中肽段含量，根据蛋白的分子量计算每400μL溶液中C反应蛋白的浓度作为标准物质的定值结果。
其中本发明中使用的C反应标准物质制备过程：
(1)配制浓度为20mmol/L的Tris-HCl（pH7.5）,0.35moL/NaCl,2mmol/L CaCl2溶液，0.5%NaN3用于溶解经过纯化的CRP。
(2)配制浓度为50μg／g CRP溶液。
(3)将CRP溶液分装至500μL冻存管中，每只冻存管中分装400μL溶液，分装好的标准物质在－80摄氏度冰箱中冷冻保存。
采用上述技术方案，本发明可以达到的技术效果是：
(1)采用Tris-HCl,NaCl,CaCl2，NaN3溶解制备CRP标准物质，提高了CRP溶解度，保证了标准物质的均匀性；
(2)采用同位素稀释质谱基准方法对标准肽段和CRP蛋白质含量进行测定，保证了定值结果的准确；
(3)在采用同位素稀释质谱法对标准肽段定量时同时选用多个氨基酸定量结果的平均值；在采用同位素稀释质谱法对CRP定量时同时选用三条酶切肽段定量结果的平均值，提高了定值结果的可靠性。
(4)标准物质定值结果可最终溯源到SI单位。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：
实施例1：
（一）C反应标准物质制备过程：
(1)配制浓度为20mmol/L的Tris-HCl（pH7.5）,0.35moL/NaCl,2mmol/L CaCl2溶液，0.5%NaN3用于溶解经过纯化的CRP。
(2)配制浓度为50μg／g CRP溶液。
(3)将CRP溶液分装至500μL冻存管中，每只冻存管中分装400μL溶液，分装好的标准物质在－80摄氏度冰箱中冷冻保存。
（二）标准物质定值：
(1)选择检测ESDTSYVSLK,APLTKPLK,ALKYEVQGEVFTK三条特异性肽段进行CRP蛋白定量。
(2)合成上述三条肽段，同时使用全氘标记的亮氨基合成对应的三条同位素标记肽段。
(3)以国家亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸标准物质为标准，以同位素标记亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对合成的三条标准肽段进行准确定量。
(3)按400μL溶液中所含CRP蛋白质量，根据三条肽段的纯度计算酶切后所得三条目标肽段的质量，配制相应浓度标准肽段及同位素内标肽段。
(4)准确称量400μL蛋白溶液，加入并称量相应体积的同位素内标溶液。使酶切后所得目标肽段与内标肽段摩尔比尽量为1:1。
(5)离心干燥加入内标的蛋白溶液，加入100μL的8M尿素溶液对蛋白进行变性处理。10min后加入2μL 1M的二硫苏糖醇(DTT)溶液在60摄氏度水浴中加热60min。然后加入2μL 1M的碘乙酰胺(IAA)，在暗处反应40min。加入6μL 1M的DTT还原多余的IAA。用100mM的碳酸氢胺溶液稀释尿素至1M以下，加入2μL 0.5mg/mL的Trypsin溶液进行酶切，每24小时补充2μL的Trypsin。酶切84小时后采用同位素稀释质谱法对三条肽段进行准确定量。
(6)根据质谱所得酶切后肽段与同位素肽段的比例配制标准肽段与内标肽段比例的标准曲线。计算溶液中肽段含量，根据蛋白的分子量计算每400μL溶液中CRP蛋白的浓度作为标准物质的定值结果。
（三）实施例中使用的仪器
(1)分析天平
（Sartorius BS323S型，最大称量为320g，精度为0.001g，德国）
（Sartorius ME235S型，最大称量为230g，精度为0.01mg，德国）
（METTLER TOLEDO XP26型，最大称量为22g，精度为0.001mg，瑞士）
（METTLER TOLEDO UMX2型，最大称量为2.1g，精度为0.1μg，瑞士）
(2)超低温冰箱（Deep Freezer VXE570型，Thermo Electron Corporation，法国）
(3)恒温摇床（S16R-2型，SHEL LAC，美国）
(4)冷冻干燥器（日立，日本）
(5)烘箱（UFE500型，MEMMERT，美国）
(6)液相色谱-质谱联用仪（Agilent 6410 Triple Quard LC/MS，Agilent，美国）
(7)超纯水系统（Milli-Q型，MILLIPORE，美国）
(8)pH计（3STAR型，Thermo Electron Corporation，法国）
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (1)
1.一种C反应蛋白标准物质定值的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)合成三条特异性肽段：ESDTSYVSLK、APLTKPLK、ALKYEVQGEVFTK用于进行C反应蛋白定量；
(2)同时使用全氘标记的亮氨基合成对应的三条同位素标记肽段；
(3)以亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸标准物质为标准，以同位素标记亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对合成的三条标准肽段进行准确定量；
(4)按400μL溶液中所含C反应蛋白质量，根据三条肽段的纯度计算酶切后所得三条目标肽段的质量，配制相应浓度标准肽段及同位素内标肽段；
(5)准确称量400μL C反应蛋白溶液，加入并称量相应体积的同位素内标溶液；使酶切后所得目标肽段与内标肽段摩尔比为1:1；
(6)离心干燥上述已加入内标的蛋白溶液，加入100μL的8M尿素溶液对蛋白进行变性处理；10min后加入2μL 1M的二硫苏糖醇溶液在60摄氏度水浴中加热60min；然后加入2μL 1M的碘乙酰胺，在暗处反应40min；加入6μL 1M的二硫苏糖醇还原多余的碘乙酰胺；用100mM的碳酸氢胺溶液稀释尿素至1M以下，加入2μL 0.5mg/mL的胰蛋白酶溶液进行酶切，每24小时补充2μL的胰蛋白酶；酶切96小时后采用同位素稀释质谱法对三条肽段进行准确定量；
(7)根据质谱所得酶切后肽段与同位素肽段的比例配制标准肽段与内标肽段比例的标准曲线；计算溶液中肽段含量，根据蛋白的分子量计算每400μL溶液中C反应蛋白的浓度作为标准物质的定值结果。
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