CN104655710A - 一种蛋白质变化程度检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的一种蛋白质变化程度检测方法,包括以下步骤:利用三重四级杆质谱仪质谱定量检测生理、病理不同期间的同一目标蛋白质的肽片段;根据质谱结果,将同一目标蛋白质的肽片段归类;根据同一目标蛋白质的不同类别的肽片段之间的比例关系,确定蛋白质变化程度。该方法是一种全新的方法,属于开拓性的发明,其能够定量的检测蛋白质内部各个肽片段变化程度,从而在肽片段水平上反应生物体细胞内的病理、生理过程。

Description

一种蛋白质变化程度检测方法及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域,特别涉及一种对蛋白质变化程度的分析方法,还涉及该方法在发现新的病理、生理过程标志物中的应用,还涉及该方法在评估生物样品腐败程度中的应用。
背景技术
液相色谱仪与串联质谱仪联用(LC-MS/MS)技术发展迅速,是当今世界上最为先进的灵敏、准确的蛋白质分析平台。其中,近年来发展起来的三重四级杆质谱仪是将三组四级杆质谱仪串联使用,组与组之间是递进的质谱选择关系,通过选择性反应监测模式(SRM)与多反应监测模式(MRM),可以对蛋白质内具有代表性的肽片段的质量与带电荷比值(m/z值)特性进行选择,从而从复杂的蛋白混合物中滤过众多本底干扰,专一地检测选定的蛋白质,这使得此蛋白质检测平台更具专一性和灵敏性。另外,在选定有代表性的肽片段以后,可以人工合成与该肽片段序列完全一致但标记有同位素的标准品,与待测样品以一定比例混合同时注入质谱仪中,由于标准品进样量已知,因而可以将待测样品中所检测到的代表性肽片段丰度与标准品丰度作比较,以反映待测样品中选定蛋白的绝对摩尔含量。
如上所述的蛋白定量质谱技术被自然杂志的技术分刊(Nature Methods)评为2012年最佳技术。然而,短暂的技术发展史使该技术仍有很多不完善之处。目前国内、外对该技术的应用,主要是用来测量在各个领域已经被证明有重要价值的蛋白在样品中的摩尔含量。除此以外,该技术还被利用于检测蛋白质在某些位点的修饰等。
但是,以上所述的蛋白定量质谱技术无一例外地将检测对象局限于“蛋白水平”,而忽略了该技术本质上是提供了丰富的“亚蛋白水平”(肽片段)的数据,也就是说,该技术在一般情况下只是选择出能够代表相应蛋白的某个(些)肽片段,而忽略了其他肽片段的应用价值。而事实上,这些“亚蛋白水平”的数据在常规质谱分析时已经存在,这些数据为研究蛋白内部各个肽区段的独立特征提供了完美的资料。
血、病理标本等生物样本离体后失去养氧供给不可避免地发生组织腐败、生物分子降解,在医学临床工作中,这些腐败降解可直接引发误诊、误治。然而目前尚没有任何技术手段可以反映生物样品发生的腐败降解程度。
发明内容
发明目的:本发明的目的在于提供一种蛋白质变化程度检测方法及其应用。
技术方案:本发明提供的一种蛋白质变化程度检测方法,包括以下步骤:
(1)利用三重四级杆质谱仪质谱定量检测生理、病理不同期间的同一目标蛋白质的肽片段;
(2)根据质谱结果,将同一目标蛋白质的肽片段归类,见图1:
I型肽片段:随生理、病理期间变化,肽片段丰度减少或增多;肽片段丰度减少主要由于蛋白被降解为肽片段后,该肽片段对次级蛋白酶易感,继而被分解为氨基酸,从而从质谱结果中消失所致;而肽片段丰度增多主要由于该蛋白表达增加而致;
II型肽片段:随生理、病理期间变化,肽片段丰度相对恒定;肽片段丰度相对恒定主要因为该蛋白随生理、病理期间变化不敏感,或由于该肽片段对次级蛋白酶不敏感所致;
III型肽片段:随生理、病理期间变化,肽片段丰度减少,同时具有氨基酸修饰的质谱特征的新肽片段丰度增加;变化主要由于该肽片段上氨基酸修饰(如磷酸化、去磷酸化等)的变化所致;
IV型肽片段:随生理、病理期间变化,肽片段丰度减少,同时具有切割质谱特征的新肽片段丰度增加;变化主要由于蛋白酶切割原肽片段所致;
(3)根据同一目标蛋白质的不同类别的肽片段之间的比例关系,确定蛋白质变化程度。
本发明提供的蛋白质变化程度检测方法,是一种以质谱为手段分析肽片段与生物体细胞内的病理、生理过程相关关系的“亚蛋白水平”的研究方法。
申请人的研究发现,生物样本中的某些蛋白质随着生物样本整体腐败程度的加重,自身降解加剧,因而这些蛋白质可以作为样本腐败的指示剂和标志物。值得重视的是,在对这些腐败标志物的“亚蛋白水平”的质谱分析时发现,在标本腐败、标志物蛋白降解的过程中,这些标志物蛋白内部的肽片段之间并非同时、同速地在质谱分析中消失,而是某些肽片段被蛋白酶识别,渐进性地降解成氨基酸而逐渐从质谱检测中消失,而另一些肽片段却能够抵抗次级降解,继续在质谱检测结果中长时间存在。在这种情况下,“亚蛋白水平”的质谱分析不但可以利用那些渐进性降解的肽片段作为样本腐败的标志物,而且由于有其他“恒量”肽片段作为内参,“亚蛋白水平”的质谱分析甚至可以在不使用标准品的情况下,直接以“渐进性降解肽片段”与“恒量肽片段”的比值作为指标对标本腐败程度作出定量评价。“亚蛋白水平”的定量研究在生物、医学领域具有独特的应用价值。
该方法的原理为:
首先,按照研究者所关心的病理、生理过程设立生物模型,生物模型的特征表现为一系列强度逐渐加剧的病理、生理条件,因此可特征性的体现肽片段与生物体细胞内的病理、生理过程相关关系;例如,对于生物样品腐败模型,需要包括从无腐败、早期腐败、到晚期腐败、完全腐败等一系列观察组别。
其次,对生物模型的各个观察组别所产生的蛋白混合物进行全面分析,筛选出典型蛋白模型,典型蛋白模型应当与模型相关的具有肽片段失衡现象,从而能够特征性的体现其肽片段与生物体细胞内的病理、生理过程相关关系。
再次,对各观察组的典型蛋白模型中所有肽片段的丰度平衡进行分析,推测肽片段降解或者修饰所产生具有新质谱特征的新片段的可能性,并由质谱数据中搜寻所推测的新片段的质谱特征,从而对肽片段进行正确分类,找出丰度平衡不均、并且丰度失衡程度随模型条件强度改变而有序改变的蛋白质。典型蛋白模型内部的所有肽片段在病理、生理模型中的变化,可以表现为四型肽片段的变化中的一种,也可以几种变化同时存在;当几种形式的肽片段变化同时存在于某一蛋白时,肽片段之间的平衡在不同观察组别中必然被打破,使研究“亚蛋白水平”肽片段与生物体病理、生理过程关系成为可能。
最后,不同肽片段相互之间可以形成客观的内部参照物,如I型肽片段与II型肽片段之间、III和IV型肽片段新片段与原始片段之间的丰度比例,可以直接被用于作为指示病理、生理过程的指标;内参是在“亚蛋白水平”研究生物体病理、生理过程的特有优势。
此外,对于重点肽片段还可进行标准化定量质谱分析:在选定重点肽片段以后,将合成与该肽片段序列完全一致但标记有同位素的标准品,定量的标准品将与待测样品混合同时注入质谱仪中,在选择性反应监测模式(SRM)与多反应监测模式(MRM)下按照其质谱特征对重点肽片段及其标准品进行选择性的定量质谱分析,由于标准品进样量已知,因而可以将待测样品中所检测到的代表性肽片段丰度与标准品丰度作比较,可以换算出待测样品中重点肽片段的绝对摩尔含量。
本发明还提供了上述蛋白质变化程度检测方法在生理过程检测中的应用。
本发明还提供了上述蛋白质变化程度检测方法在细胞腐败程度检测中的应用。
本发明还提供了一种细胞腐败程度检测方法,以胞衬蛋白1153至1181号氨基酸组成的肽片段以及其1153至1176号氨基酸组成的肽片段之间的丰度比例,作为指示细胞腐败程度的指标。
本发明还提供了一种细胞腐败程度定量检测方法,包括以下步骤:制备标记的与胞衬蛋白1153至1181号氨基酸组成的肽片段以及其1153至1176号氨基酸组成的肽片段序列完全一致的两段肽片段作为标准品,将定量的标准品与腐败程度待测样品混合在三重四级杆质谱仪中,在选择性反应监测模式与多反应监测模式下按照其质谱特征对胞衬蛋白1153至1181号氨基酸组成的肽片段以及其1153至1176号氨基酸组成的肽片段及其标准品进行定量质谱分析,以胞衬蛋白1153至1181号氨基酸组成的肽片段以及其1153至1176号氨基酸组成的肽片段之间的丰度之比作为定量指示细胞腐败程度的参数。
其中,质谱定量后胞衬蛋白1153至1181号氨基酸组成的肽片段以及其1153至1176号氨基酸组成的肽片段之间的丰度之比值是介于1和0之间的数值。数值愈高,胞衬蛋白愈完整,细胞愈健康,腐败程度愈小;根据所检样品的下游应用不同,可以在1和0之间划定不同区间,作为样品可用性的判断标准。
本发明还提供了上述蛋白质变化程度检测方法在药物靶标筛选中的应用。
有益效果:本发明提供的蛋白质变化程度检测方法是一种全新的方法,属于开拓性的发明,其能够定量的检测蛋白质变化程度,从而反应生物体细胞内的病理、生理过程。
本发明相对于现有技术具有以下突出的优势:
1.开拓性发明:亚蛋白水平研究肽片段与病理、生理过程的关系,是较将蛋白质作为整体进行研究的深化,目前属于一个崭新的研究领域。
2.准确、客观:由于不同类型肽片段之间可以作为同一蛋白质自身的内部参照物,使其在应用过程中更加准确而客观。
3.经济:获得所有肽片段数据是以质谱分析整体蛋白的必经步骤,属于质谱分析的副产品,因而,本发明所涉及的方法并不需要额外检测步骤,所以具有经济实用的特质。
4.具备三重四级杆质谱仪质谱的其他优点:由于本发明所涉及的方法依靠于目前蛋白质定量检测中最为灵敏、精确、专一的三重四级杆质谱仪质谱技术,因而同样附有该技术的全部优点。
5.应用范围广。以该方法可用于寻找以肽片段为基础的分子标志物,从而用以指示生物体的病理、生理过程。具体而言,有标志物功能的肽片段在生物体病理、生理过程中的变化表现为包括增加氨基酸修饰、去氨基酸修饰、被蛋白酶切割、较同一蛋白质内其他肽片段降解程度快、较其他肽片段降解程度慢等变化形式;此类变化将导致该标志物肽片段的数量、绝对质量、以及所带电荷发生改变,与作为内参的同一蛋白质的其他肽片段一起,可以被三重四极杆质谱仪系统识别,用以指示生物体的病理、生理过程。利用该方法可检测人体或动物体生理过程,还可应用于针对蛋白质不同区域的药物靶标筛选以及药物药效评价。该方法还可应用于检测食用肉类样品腐败程度的评估、法医领域指示尸体的腐败程度、器官移植领域对供体器官的质量评估、临床化验室检查对患者样本的质量评估。
附图说明
图1为不同类型的肽片段的变化过程。其中,三行依次代表:(1)在生物体正常细胞内,以完整的形式存在的不同肽片段,各列表示肽片段以同等摩尔数存在。(2)病理、生理早期阶段,蛋白质的肽片段变化有4种可能性,第一列表示I型肽片段随病理、生理变化质谱丰度减少;第二列表示II型肽片段的质谱丰度不随病理、生理变化改变而改变;第三列表示III型肽片段的质谱丰度减少,而由于原始肽段上氨基酸修饰增加(或减少)而产生的新肽片段丰度增加;第四列表示IV型肽片段:随生理、病理期间变化,肽片段丰度减少,同时具有切割质谱特征的新肽片段丰度增加。(3)病理、生理晚期阶段,四种类型的肽片段继续深度变化。
图2为能够指示生物样品腐败程度的标志物蛋白(非红细胞型胞衬蛋白)在质谱分析过程中表现出的肽片段失衡的现象。其中,第一行代表胞衬蛋白自1141号到1196号氨基酸的一段示例性序列(字母代表相应的氨基酸符号)。第二行代表,质谱分析前胰蛋白酶将该部分切割为6段肽片段。以其中的1153至1181号氨基酸为例,在质谱分析细胞腐败模型中,该肽片段表现IV型肽片段;后续研究发现,该肽片段包含的第1176号酪氨酸后方(*所注位置)为钙蛋白酶的切割位点,而在细胞腐败模型中,钙蛋白酶负责在该处打断、降解胞衬蛋白。
图3为细胞腐败模型中针对胞衬蛋白的原始质谱数据的分析图。其中,图3(A)为IV型肽片段(胰蛋白酶水解的胞衬蛋白第1153至1181号氨基酸的肽片段)的质谱图。图3(B)为该肽片段在细胞腐败晚期(左)与腐败早期(右)的质谱丰度,腐败晚期该片段的质谱丰度减少了约500倍。图3(C)为由于钙蛋白酶切割该肽片段使之断裂所产生的新片段在腐败晚期(右)的质谱丰度高于腐败早期(左)6倍。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做出进一步说明。
实施例1利用本发明方法检测细胞腐败
利用本发明方法在细胞腐败模型里发现肽片段丰度失衡,继而找到重点肽片段成为指示细胞腐败程度标志物的过程。
1.细胞腐败模型:
人肾293T细胞大批量培养后达到6x107,蛋白酶消化使贴壁细胞悬浮到消化液,离心、收集,磷酸盐溶液(PBS)洗涤细胞,分装于6个1.7毫升微量离心管中,离心,移除PBS,随机分成6个观察组,暴露于室温使之腐败。
2.蛋白提取、酶切、去盐:
将6个观察组的离心管的腐败模型中的细胞分别在0、2、4、8、24、48小时的时间点收获,分别悬浮于RIPA蛋白提取液中,震荡,冰上放置30分钟;离心17000g15分钟,取上清,即为提取的蛋白混合样品。蛋白混合样品经还原剂、碱化剂处理后,以1微克胰蛋白酶:50微克蛋白的比例混合,过夜消化。
以C18反相柱去盐纯化,再经真空抽干离心机除去有机溶剂后,用含有乙腈和三氟醋酸的溶液稀释到最终0.5~1微克/微升浓度溶液,即为蛋白混合液。
3.质谱分析
将每各观察组样品中取12微升蛋白混合液,上样于与三重四级杆质谱仪(美国Thermo公司的Q-Exactive)的超高压液相色谱仪(美国Waters公司的nanoACQUITY),按照质谱厂家提供的程序在LC/MS/MS常规模式下进行质谱分析。
质谱原始数据在MASCOT数据库搜索以检出混合物中所有蛋白,高于1%错误发现率(FDR)的肽片段被用以做肽片段之间的丰度平衡。
对所检出的每一个蛋白的所有肽片段之间所形成的丰度平衡,在各个观察组别中作比较,找出丰度平衡不均、并且丰度失衡程度随模型条件强度改变而有序改变的蛋白质,本发明发现了胞衬蛋白。
4.“亚蛋白水平”细胞腐败质谱分析
在获取质谱数据、找到与模型相关的具有肽片段失衡现象的蛋白质后,对于重点失衡的肽片段作针对性分析,推测由该片段降解或者修饰所产生具有新质谱特征的新片段的可能性,并由质谱数据中搜寻所推测的新片段的质谱特征以验证推断。
5.胞衬蛋白IV型肽片段的发现
经过“亚蛋白水平”细胞腐败质谱分析,发现了非红细胞型胞衬蛋白在质谱分析过程中表现出的肽片段失衡的现象,见图2。
以其中的1153至1181号氨基酸组成的肽片段为例,在质谱分析中,该肽片段表现为IV型肽片段,即其原始肽片段丰度随细胞腐败加重后而减小,其断裂片段的质谱丰度却相应增加,质谱参数、丰度等见图3。
因而,我们选择了1153至1181号氨基酸组成的肽片段,以及其1153至1176号氨基酸组成的断裂片段之间的丰度比例,作为指示细胞腐败程度的“亚蛋白水平”指标。
6.应用
为建立以上述2肽片段为指标的腐败定量评估体系,合成与2肽片段序列完全一致但标记有同位素C13的标准品,定量的标准品将与腐败程度待测样品混合同时注入Q-Exactive三重四级杆质谱仪中,在选择性反应监测模式(SRM)与多反应监测模式(MRM)下按照其质谱特征对上述2肽片段及其标准品进行选择性的定量质谱分析,换算出待测样品中2肽片段的绝对摩尔含量。
综上所述,实施例1详述了在细胞腐败模型里发现肽片段丰度失衡,继而找到重点肽片段成为指示细胞腐败程度标志物的过程。
实施例2利用实施例1的细胞腐败评估方法对罪犯抛尸次数进行分析
案例:夏日某城市近郊连续几天在不同地点发现尸块5起。为了辨别罪犯是本地人多次抛尸还是外地人路过一次性抛尸,需要对5例尸块进行腐败检验。外地人一次性抛尸的情况下,尸体腐败程度类似;由于气候炎热,如为本地人在几天内多次抛尸的情况,罪犯为防止尸体散发异味而引起注意,多应冷藏尸块,而后期所抛尸块较先期所抛尸块腐败程度低。
蛋白提取、酶切、去盐:将5例尸块分别放置于RIPA蛋白提取液中,匀浆,冰上放置30分钟;离心17000g15分钟,取上清,即为提取的蛋白混合样品。蛋白混合样品经还原剂、碱化剂处理后,以1微克胰蛋白酶:50微克蛋白的比例混合,过夜消化。以C18反相柱去盐纯化,再经真空抽干离心机除去有机溶剂后,用含有乙腈和三氟醋酸的溶液稀释到最终0.5~1微克/微升浓度溶液,即为蛋白混合液。
质谱分析:将每各观察组样品中取12微升蛋白混合液与标准品混合(标准品1为同位素标记的胞衬蛋白1153至1181号氨基酸组成的肽片段,标准品2为同位素标记的胞衬蛋白1153至1176号氨基酸组成的肽片段),混合后同时注入于三重四级杆质谱仪(美国Thermo公司的Q-Exactive)的超高压液相色谱仪(美国Waters公司的nanoACQUITY),在多反应监测模式(MRM)下按照其质谱特征对各例尸块组织中上述2肽片段及其标准品进行选择性的定量质谱分析,换算出待测样品中2肽片段的绝对摩尔含量并利用2肽片段的含量比值作为各个尸块组织的腐败指数。
结果:5例尸块的腐败指数分别为2.04、2.10、0.23、0.24、0.27。因而,从腐败角度分析,5例尸块的腐败程度可以明确地分为两组:腐败指数在2.0以上的2例尸块;和腐败指数在0.2左右的3例尸块。因而判断罪犯在不同时间进行了2次抛尸,流窜作案可能性不大。

Claims (6)

1.一种蛋白质变化程度检测方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)利用三重四级杆质谱仪质谱定量检测生理、病理不同期间的同一目标蛋白质的肽片段;
(2)根据质谱结果,将同一目标蛋白质的肽片段归类:
I型肽片段:随生理、病理期间变化,肽片段丰度减少或增多;
II型肽片段:随生理、病理期间变化,肽片段丰度相对恒定;
III型肽片段:随生理、病理期间变化,肽片段丰度减少,同时具有氨基酸修饰的质谱特征的新肽片段丰度增加;
IV型肽片段:随生理、病理期间变化,肽片段丰度减少,同时具有被蛋白酶切割质谱特征的新肽片段丰度增加;
(3)根据同一目标蛋白质的不同类别的肽片段之间的比例关系,确定蛋白质变化程度。
2.权利要求1所述的蛋白质变化程度检测方法在生理过程检测中的应用。
3.权利要求1所述的蛋白质变化程度检测方法在细胞腐败程度检测中的应用。
4.一种细胞腐败程度检测方法,其特征在于:以胞衬蛋白1153至1181号氨基酸组成的肽片段以及其1153至1176号氨基酸组成的肽片段之间的丰度比例,作为指示细胞腐败程度的指标。
5.一种细胞腐败程度定量检测方法,其特征在于:包括以下步骤:制备标记的与胞衬蛋白1153至1181号氨基酸组成的肽片段以及其1153至1176号氨基酸组成的肽片段序列完全一致的两段肽片段作为标准品,将定量的标准品与腐败程度待测样品混合在三重四级杆质谱仪中,在选择性反应监测模式与多反应监测模式下按照其质谱特征对胞衬蛋白1153至1181号氨基酸组成的肽片段以及其1153至1176号氨基酸组成的肽片段及其标准品进行定量质谱分析,以胞衬蛋白1153至1181号氨基酸组成的肽片段以及其1153至1176号氨基酸组成的肽片段之间的丰度之比作为定量指示细胞腐败程度的参数。
6.权利要求1所述的蛋白质变化程度检测方法在药物靶标筛选中的应用。
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