CN1714145A

CN1714145A - 用质谱法高灵敏度定量肽

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Publication number: CN1714145A
Application number: CN200380103688.6A
Authority: CN
Inventors: 诺曼·利·安德森
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-10-03
Filing date: 2003-10-02
Publication date: 2005-12-28
Anticipated expiration: 2023-10-02
Also published as: EP2186879B1; EP1556478A4; EP1556478B1; EP2186879A2; CN100558879C; WO2004031730A3; CA2501000A1; EP1556478A2; EP2186879A3; AU2003287017B2; CN101782581A; WO2004031730A2; CA2501000C; AU2003287017A1

Abstract

本发明提供了一种用于测定样品中靶蛋白数量的经济的流通型方法。用一种抗体制剂(不论是多克隆、单克隆或任何等价的特定结合剂)来捕获并从而富集特定的监测肽(在复杂蛋白样品的蛋白水解液中要定量的蛋白质的特定肽片段)及内标肽(具有同样的化学结构但包括稳定的同位素标记)。当洗脱到适宜的质谱仪中时，对天然的(源于样品的)和内标(同位素标记)肽进行定量，其所测定的丰度比较用计算起始样品中监控肽及其母体蛋白的数量。

Description

用质谱法高灵敏度定量肽

发明技术领域及背景

本发明涉及用于对如人血浆等的复杂样品中的蛋白进行评价的定量分析。本发明可用于分析来自单一个体来源的样品，也可用于评价群体中特定蛋白质的水平，并可用于分析来自目标人群的集合样品。

需要对各种复杂蛋白质样品中(例如人血浆中)的蛋白质进行定量分析。通常，这些分析以免疫试验的方式进行，利用了相对于靶蛋白的特定抗体作为特异性试剂和检测试剂。新的方法，特别是涉及用同位素标记的肽进行内部标准化的方法，使得质谱法(MS)提供了这样的定量肽和蛋白质的分析(如现在MS用于测定低分子量药物代谢产物)。然而，当应用于非常复杂的混合物时，如那些自全血浆蛋白消化到肽的的复杂混合物时，存在着MS动态范围和试验敏感性的问题。本发明通过以下方式处理了这一问题：提供对敏感性的改进，及有效平衡了含有高量及低量蛋白质样品的消化液中监控肽的丰度，从而使得可同时测定复杂样品中的低量和高量蛋白。

能帮助扩增诊断学上有用的蛋白质组的一个重要的进展是同时将许多蛋白测定一起用作一个组，以便于将模式的改变与疾病或治疗关联，而不是依赖于单独解释的单个蛋白标记物。几种科研工作对该方法提供了数据支持。(参见Jellum、Bjornson、Nesbakken、Johansson和Wold，J Chromatogr 217：231-7，1981。)人们努力使用后一种方法在后标准化20种分析物的血清化学组中检测疾病标志物，但可能是由于该分析物的间接特性及其较少的数量，该努力收效甚微。

一段时间以来已建立了多变的蛋白质标记物的概念和使用方法。需要说明的是为什么该方法未曾有效进入到临床实践中去。

虽然蛋白质组学可显示并有时测定许多种蛋白质，现有技术(例如2D凝胶)已难于应用于大量足够大的样品来在研究水平上证明临床相关性。使用现有测验的另一方法对于确定检测组的疾病相关性通常太昂贵。在血浆的单个样品中全部可测得七十种蛋白，但使用单个试验的商业成本是$10896.30。这样最终，多分析物诊断的成功与科学工作的成本相同。

质谱法(MS)已解决了通过2D凝胶和其他方法溶解析的蛋白的鉴别问题，并也为复杂蛋白混合物的分析提供了显得稳定的通用方法。在以后的分类中，可区别两种通常的方法：第一，对样品中的蛋白质和肽经其检测或识别而获得“无偏见的”发现，及第二，对蛋白质或肽进行定量测定，通常需要某种额外的标准化物。

质谱技术发现复杂样品中蛋白质的能力依赖于存在通常源于DNA测序工作的大的蛋白质序列数据库，除了下述一种值得注意的例外。由于这些数据库越来越全面，至少在理论上该方法为蛋白质发现提供了一种通常的解决方案。到目前为止，MS工作已为蛋白质组问题审查了三种基本的窗口(window)：全蛋白质、通过体外消化蛋白(例如，用胰蛋白酶)获得的肽片段、及天然存在的肽(低分子量蛋白组或肽组)。

可用称为SELDI-TOF(为表面强化的激光解吸电离飞行时间)质谱的方法分析全蛋白质，该质谱法是MALDI-TOF(基质强化的激光解吸电离飞行时间质谱)的变体，在该方法中用基于对派生的MS靶的蛋白质亲和力的化学分级来将样品的复杂性降低至全蛋白MS可解析一系列单个峰的水平。该方法的严重缺点在于全蛋白MS分析不直接提供基于序列的识别(有许多蛋白质接近给定的质量)，因此没有其他有效的工作，严格意义上说未识别作为标志发现的蛋白质峰。尤其是，没有离散的识别，一般不可能说明一种峰是一个蛋白质分析物或将测定值转换为典型的免疫分析形式。然而，由于这已通过基于某些单克隆抗体的成功分析(其中靶蛋白质未识别)清楚显示，如果该技术允许该分析在任何目标实验室中重复(现在显示正在进行的工作)，此点不对临床使用造成重大限制。

更通用的方法包括将蛋白质消化(例如用胰蛋白酶)为可进一步在质谱仪中断裂(MS/MS)的肽，从而产生基于序列的识别。该方法可与电喷雾(ESI)或MALDI电离一同使用，并通常在一维或多维色谱分级后应用该方法从而在任意给定的瞬间降低导入MS中的肽的复杂性。多维色谱、离子化、质谱及数据分析的优化系统(例如，多维蛋白质识别技术，或Yates的“MudPIT”方法也称为猎枪蛋白质组学)已显示在一次分析中可检测并识别～1500个酵母蛋白(Washburn、Wolters和Yates，Nat Biotechnol 19：242-7，2001)，而结合傅里叶变换离子回旋加速器共振(FTICR)MS极高分辨率的一维LC分离可识别细菌中多于1900种的不同开放阅读框(即，预测的蛋白)的蛋白质产物。在人的尿液中，一种比上述微生物样品更像血浆的样品，Patterson在ESI-MS/MS之前使用一维LC分离来检测源于124种不同基因产物的751种序列。最近，Adkins等人已使用结合MS的两种色谱分离法来识别人血清中的总共490种不同的蛋白质(Adkins等人，Molec CellProteomics 1：947-955(22002))，因而实质扩增了该蛋白质组。这样的方法应具有能力来处理血浆中的许多蛋白的大量转译后修饰特性，如能显示表征在老化的人晶状体中发生的非常复杂的转译后修饰所说明的。

通常在肾过滤截点之下并因而通常收集于尿液或血透析液的天然肽，提供了在血浆蛋白质组低质量端的许多情况的补充写照。可从患有晚期肾病并进行透析治疗的患者中收集上千升人血透析液(Schepky、Bensch、Schulz-Knappe和Forssmann，Biomed Chromatogr 8：90-4，1994)，尽管它只含有50μg/ml蛋白质/肽材料，它提供了低于45kd的蛋白质和肽的大量来源。通过将色谱和MS方法结合已分析了这样的材料，从而分辨了大约5000种不同的肽，包括75种不同蛋白质的片段。55％的片段源自血浆蛋白和整体的7％代表肽激素、生长因子和细胞生长因子。

上述蛋白质发现方法集中于识别复杂样品中的肽和蛋白质，但它们一般都显示了低质量的精确度和再现性。肽离子化的这种公知特异性质很大一部分是由于一种肽的存在可影响离子化并由此影响其他的信号强度的强度。这已成为用质谱法进行精确定量的主要障碍。然而，通过使用稳定的同位素标记的内标物可克服该问题。以适当高浓缩的形式(＞98原子％)在商业上至少可获得四种适合的同位素(²H、¹³C、¹⁵N、¹⁸O)。通常，最终应获得如同用内标物在药物代谢物MS测定中所获得的丰度同样精确的丰度数据(变异系数＜1％)。在二十世纪八十年代，制备¹⁸O标记的脑啡肽并用于ppb水平上测定组织中的这些肽。在二十世纪九十年代，开发了GC/MS方法来准确定量稳定的同位素标记的氨基酸，以及由此的体内标记的人肌肉及血浆的蛋白质的蛋白质代谢。如果有适当的蛋白质或肽标记方案，这些方法的极度敏感和准确性表明稳定的同位素方法可用于定量的蛋白组学研究。

在过去的三年，已研究了许多这样的标记策略。最直接的方法(在生物合成过程中，标记的结合达到了高取代水平)已成功应用于微生物(Lahm和Langen，Electrophoresis 21：2105-14，2000；Oda，Huang，Cross，Cowburn和Chait，Proc Natl Acad Sci USA 96：6591-6，1999)和培养的哺乳动物细胞，但由于成本和伦理道德的原因不可能直接用于人类。一种相关的方法(可应用于人蛋白质)是现在通用的化学合成在特定位置含有重同位素的监测肽。也已研制了合成后的方法来标记肽，从而用后来混合并通过MS一起分析的标记/未标记对来区分源于“内部对照”样品的肽与那些源于试验样品的肽。这些方法包括Aebersold的同位素亲和标签(ICAT)方法及用氘化丙烯酰胺和N标记肽硫氢化物、用氘化乙酸标记伯氨基、n端特异性试剂、肽羧基的全甲基化酯化及断裂过程中在胰蛋白酶处理的肽c端加入一对18O标记物。

因为通过测定释放进入血浆中的高丰度组织蛋白可在少量组织中检测严重病理，所以少量蛋白质，如组织泄漏蛋白，是重要的。正常个体血浆中存在的心脏肌球素(Mb)为1-85ng/ml，而心肌梗塞却使之提高到200-1100ng/ml，而用溶血纤维蛋白治疗梗塞却使之上升至3000ng/ml。一般局部作用(在感染或发炎部位)的细胞因子可能在它们正常的血浆浓度(或甚至相关于大量局部释放后达到较高的水平)无活性，因为它们从μl或ml组织体积稀释为17L组织间隙液。因此，虽然它们在血浆中存在并不显示细胞破裂，但它们也在感测泄漏的标志物之列。用于进行这种测定的商业上有用的方法是本发明的目的。

将稳定的同位素标记的肽内标物结合抗肽抗体富集步骤从而进行基于MS定量肽分析的这种原始思想于1989年由Jardine等人发表(Lisek、Bailey、Benson、Yaksh和Jardine，Rapid Commun MassSpectrom 3：43-6，1989)。该参考文件披露了使用单一合成的稳定的同位素标记的肽(物质P序列)插入神经组织，然后(在从组织中提取后)结合到固定化抗物质P特异性抗体上，从而富集神经肽物质P并最终用MS定量。通过天然肽离子流与同样序列的内部标记标准肽之比计算底物P的量：即，显示单一分析物肽标准/抗体富集过程的全部元素。Jardine等人使用了10倍分子过量的标记形式的物质P作为内标和载体，并用快原子轰击(FAB)选择的离子监测(SIM)MS测定质量。如所报道的，Jardine的方法仅用于内源肽而不用于体外所制备的蛋白质片段(例如，一种或多种较大蛋白质的胰蛋白酶消化产物)。离线进行抗体捕获，浓缩洗脱液，然后加到C18毛细管柱上，从该毛细管柱将其洗脱到ESI源。

Nelson等人(Intrinsic Bioprobes公司)虽然没有提到应用于来自靶蛋白消化的肽，但他们已开发了相似的方法，通过使用抗体来富集特定蛋白，然后用MS进行检测(用或不用外加的同位素标记标准)。他们用抗体从血浆中富集蛋白，并用马b2M(来自加入的马血清)作为内标物从而分析了人β-2小球蛋白(Kiernan、Tubbs、Nedelkov、Niederkofler和Nelson，Biochem Biophys Res.Commun 297：401，2002；Niederkofler、Tubbs、Gruber、Nedelkov、Kiernan、Williams和Nelson，Anal.Chem.73：3294-9，2001a)。Nelson(美国专利5955729)已用内标肽加入到亲和纯化的天然肽样品中，但在这种情况下，标准肽具有与分析物不同的序列并且不结合在同一抗体上。稳定的同位素标记肽和抗肽抗体现在都是常用的试剂，可从多种商业来源获得。

自1995年以来，单一肽已用作复杂蛋白质混合物中母体蛋白(通过蛋白水解消化作用该肽来自该蛋白)存在的代表，基于例如MALDI-PSD(Griffin、MacCoss、Eng、Blevins、Aaronson及Yates，Rapid CommunMass Spectrom 9：1546-51，1995)或离子陷阱(Yates、Eng、McCormack和Schieltz，Anal Chem.67：1426-36，1995)，MS/MS谱。

Regnier等人已从事“鲜明特征肽”定量方法(Chakraborty和Regnier，J.Chromatogr A949：173-84，2002a；Chakraborty和Regnier，J.Chromatogr A.949：173-84，2002a；Zhang、Sioma、Wang和Regnier，Anal.Chem.73：5142-9，2001a)，及已公开的专利申请的主题(Regnier，F.E.、X.Zhang等人，US2002/0037532)，其中蛋白质样品由酶消化为肽，用蛋白质活性试剂的不同同位素形式进行差异标记，通过选择性富集柱进行纯化，并使用MALDI或ESI-MS结合进行MS分析。该方法包括了本发明的一些特征，但特别选择使用了消化物中肽的合成后标记来产生内标(使得未知肽可进行分析)，并且描述了应用抗体作为富集特异性特征组肽而不是单一肽的一种方式：“限定为抗原的蛋白质或肽氨基酸序列部分也可作为内生亲和配体，如果该内生氨基酸序列为原始混合物中的多于一种蛋白质所共有，该配体特别有用。在那种情况下，为含有内生抗原序列的多肽的家族选择的多克隆抗体或单克隆抗体可用作为捕获物质”(Regnier、F.E.、X.Zhang等人，US2002/0037532)。

Scrivener、Barry等人(Scrivener、Barry、Platt、Calvert、Masih、Hextall、Soloviev和Terrett，Proteomics 3：122-128，2003；Barry等人，美国专利申请2002/0055186)已用固定于阵列的抗体从消化物中富集肽来通过MALDI MS进行检测。该方法需要将抗体以特定的空间形式固定以便于进行MALDI MS分析(通常是在平面基质表面上的阵列)，并且该方法不包括靶肽的标记型式作为定量分析内标。

Gygi使用稳定同位素标记的合成的肽来定量在1-D凝胶上分离的蛋白质消化物中的磷酸化与非磷酸化肽的水平(Stemmann、Zou、Gerber、Gygi和Kirschner，Cell 107：715-26，2001)，并且已描述了用于肽定量的方法(WO03016861)，该方法使用Jardine途径并外加更高的质谱分辨率(选择的反应监测方法[SRM]，其中通过第一质量分析仪分离所需的肽，肽在飞行中断裂并且用第二质量分析仪检测特定的片段)。在MS之前，用通常的分离法(例如，反向LC)而不是特异性的捕获试剂(如抗体)来分离肽。

通过化学合成可制成标准品。Crowther在1994年公开了一种类似的方法(Anal.Chem.66：2356-61，1994)使用氘化的合成内标来检测血浆中的肽药物。Rose使用合成的稳定同位素标记的胰岛素来标准化MS法而用于定量胰岛素(小蛋白或大肽)，在该过程中通过反相色谱来分离受阻的样品从而使样品分级。现在通过完全化学合成法可制成甚至较大的蛋白。

用抗体来亲和捕获蛋白质和肽的几种方式是本领域技术人员已知的。已将抗体结合蛋白消化从而消除非抗原决定簇肽，然后用MS法洗脱并识别抗原决定簇肽(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：9848-52，1990)。已使用DNA(而不是Ab)结合婴儿尿中的乳铁蛋白用于进行MS分析(Pediatr.Res.29：243-50，1991)。

以前用捕获在抗体上的抗原决定簇肽及随后的MS法已对蛋白质间的相互作用绘制了图谱(Methods Mol.Biol.146：439-52，2000)。已开发了方法通过在进行MS前使固定化Ab从消化液中除去结合(抗原决定簇)肽用于识别肽抗原决定簇(J.Am.Soc.Mass Spectrom 11：746-50，2000)。

已使用在磁珠上的抗体来结合所选择的蛋白质，然后消化该蛋白质并用MS分析肽(J.Am.Soc.Mass Spectrom 9：208-15，1998)。Hurst研制了一种用固相抗体亲和捕获蛋白质配体(αTNF)然后用MS进行分析的方法(Anal.Chem.71：4727-33，1999)。Wehland通过结合抗体和其他蛋白质来浓缩肽，从而识别线性结合的抗原决定簇(Anal.Biochem.275：162-70，1999)。

Naylor研究了一种类似的方法用于在MS前分离转铁蛋白从而测定糖基化变体(Anal.Biochem.296：122-9，2001)。Clarke和Naylor公开了(Clarke、Crow、Younkin和Naylor，Anal.Biochem.298：32-9，2001)一种方法，其中通过抗体将40个氨基酸的β淀粉样肽捕获到16个氨基酸上，吸脱并用MS进行定量分析。该方法不包括使用稳定同位素标记的内标物。

Thibault在进行MS前使用微液流装置来将c-myc肽捕捉在抗体上，检测受阻肽达到20ng/ml(Mol.Cell Proteomics 1：157-68，2002)。

自1975年起使用固定化多克隆抗体柱的再循环免疫亲和就已知。使用固定在CNBr活化的琼脂糖或商业可获得的POROS支持物(AppliedBiosystems公司)上的抗体、多克隆抗体已显示可再循环几百次而不会丧失底物特异性结合能力。

本发明将几种现有技术所引的方法用于一个完全不同的组合中。在后面的说明中，本发明针对通常意义上的蛋白质、肽或其他生物分子的定量，因此所披露的本发明决不限于血清和其他体液的分析。

发明概述

本发明提供了一种经济的流通型方法来检测靶蛋白在样品中的量。用抗体制剂(不论是多克隆或是单克隆，或其他等价的特定结合剂)来进行捕获从而富集特定的监测肽(在复杂蛋白质样品的水解蛋白消化物中要进行定量的蛋白质的一种特定肽片段)和内标肽(同样的化学结构但包括稳定的同位素标记物)。当吸脱入适宜的质谱仪中时，对天然(来源于样品)和内标(同位素标记)肽进行定量，并且对它们所测得的丰度比例用于计算监控肽和其母体蛋白在起始样品中的量。这不同于使用较小特异性的亲和方法来捕获共有某特性(如糖基化、含有半胱氨酸或赖氨酸残基、磷酸化)的一类监测肽；也不同于使用选择存在于特定细胞部分中的、具有相似的天然分子量(例如大小排阻层析)、电荷等等的分析物的另一种分级形式。这种特异性种类分级方法已由包括Regnier的其他人开发，其目的和实践将稍减小提供给MS的混合物的复杂度，因而使得不超出其分辨率和敏感度，而不是对于每种亲和结合剂(通常是抗体)的单一肽。在本发明中，目的是用给定的抗体或其他结合剂选择源自复杂蛋白样品消化物的单个靶蛋白(或其他分析物)的单一肽。本发明提供了进行多路肽测定的方法，用于有效选择监测肽的序列，并进而增加测定的有效性。

本发明的公开也教导了具有结合剂的支持物，该结合剂可自样品收集各种浓度的靶肽和蛋白质。通过选择性使用结合剂和一定数量的这样的试剂，可能获得样品中很少量的靶肽/蛋白质的大部分，而仅仅结合了一小部分以高浓度存在于样品中的靶肽/蛋白质。这种改进的方法通过限制导入分光计的洗脱液中的靶蛋白或肽的浓度范围促进了MS读数的有效性和准确性。

附图简述

图1.每个抗体结合表面包括盘(此处为圆盘)中孔的内腔，通过刻凹槽使内腔表面积增大。图1说明了在含抗体的孔或管中作出凹槽以增加表面积。

图2显示了盘8中孔内结合表面的设置，该盘含有齿缘9使其受控旋转。显示了16个含抗体的孔10，4个空孔11，绕轴12排列。

图3显示了一组盘8如何排列为堆叠17，其具有空的对齐的端帽16和18。所结合的抗体示为19。

图4.图4显示了排列并加载盘的设置，其中用在经31计算机控制下驱动的装置30交替挤压并扩张球管28中的抗体溶液29，从而将该液体往复挤过管32、33、34，向上通过管35进入球管36中。由于存在孔38，挤过37的溶液未在球管36中建立起压力。因而可将抗体施加到一系列盘中的每一个上的单孔中，重复该过程将抗体(通常是不同特异性的)施加到其他孔中。对刻了凹槽的内腔表面进行化学修饰以便于结合抗体。一旦将抗体加入了孔中，可洗涤这些孔并且抗体在适当的位置干燥。然后拆开堆叠的盘产生一系列相同的载有抗体的肽捕获盘。

图5.在使用中，如图5所示，盘39在空盘41和42之间持为40，含有对齐的孔。该设置使盘41和42固定而盘40可通过使用具有齿缘9的外部装置转动。

图6.图6显示了该系统在一个分析循环中的操作，其中具有齿缘64的盘63包括16个含抗体的孔65和4个空孔70-73。

图7显示了整合的整个系统，具有结合到盘分析仪75上的质谱仪74，然后通过76制成并控制供给的盘，全部过程在计算机77的控制下。

图8描述了在样品消化液(A)中具有宽范围浓度的一系列肽分析物的丰度，加入内标肽，该内标肽浓度类似于所期望的分析物浓度(B)，在从抗体结合介质捕获并洗脱后平均这些浓度。

图9描述了以相似浓度存在的肽分析物的组如何一起进行处理以便于节约使用内标物。

图10显示了如何从组中选择监测肽组(天然肽为实条，标记的标准物为阴影线的条)，这些组在质量上不重叠，因而可以分别定量。

图11描述了以不同浓度使用不同质量的多个内标肽来提供用于定量样品肽分析物的工作曲线。

发明详述

本发明提供了一种流通型方法用于识别并定量样品中的肽和/或蛋白质。虽然将上述披露的许多方法结合到本发明的方法中去，但以前未披露过这样有商业化用途的方法。

本发明通过使用监控蛋白和抗肽抗体来检测蛋白分析物的方法来进行说明，虽然其他试剂组可类似地用于检测其他种分析物分子。本公开自始至终，术语“分析物”和“配体”可以是任何各种的不同的分子，或人们需要在样品中测定或定量的组分、部分、片段或不同分子的区域。术语“监测片段”可以指分析物的任何部分，上至并包括全部分析物，该片段可通过可重复的断裂过程产生(或者如果监控片段是整个分析物则不需要片段化)，该片段的量或浓度可用作分析物量或浓度的代表。术语“监测肽”是指选作蛋白质或肽的监测片段的肽。

术语“结合剂”和“受体”可以是大量不同分子、生物细胞或聚合体中的任何种，这些词可以互换使用。关于这一点，结合剂结合要检测的分析物以便于在检测前将其富集，且以特定性的方式进行使得只结合并富集一种分析物。蛋白质、多肽、肽、核酸(寡聚核苷酸和多核苷酸)、抗体、配体、多糖、微生物、受体、抗生素、试验化合物(特别是那些通过组合化学产生的)，每一种都可以是结合剂。

术语“抗体”可以是任何物种的任何类免疫球蛋白分子、或任何其衍生的分子、或任何其他由保守分子构架的变异构成以便特异性结合分析物或监测片段的特异性结合剂。术语“抗肽抗体”可以是任何种抗体(在前述一般意义上)，该抗体结合特定的肽、监测肽、或用于从样品或已处理的样品进行富集的其他监测片段。通常，此处对抗体的任何利用理解为也可通过上述限定的结合剂而实现的目的。

术语“结合”包括任何物理连接或密切关联，其可以是永久的或暂时的。通常，可逆结合包括以下方面：电荷相互作用、氢键、疏水力、范德华力等等，其促进目标分子和待测分析物之间进行物理连接。在结合引起化学反应发生的状况下，“结合”反应是短暂的。如果反应可以随后返向释放监测片段，则由结合剂和分析物之间的接触引起的反应也在用于本发明目的结合的定义中。

术语“内标物”、“同位素标记的监测片段”、或“同位素标记的监测肽”可以是任何相应监测片段或监测肽的下述变化形式：1)作为监控片段或监测肽的等价物被适当的结合剂进行识别和2)通过直接分子量检测或通过片段质量检测(例如，通过MS/MS分析)，或是通过其他同等的方式，以某种可通过质谱法区分的方式与之进行区分。

术语“特异性监测肽”指在抗体(或其他结合剂)接触区具有独特序列的肽，它源自单基因的蛋白质产物。具有该序列非实质性改变的肽，如单一氨基酸取代(可发生在自然产生的多态性中)、接触区域外的取代或不会实质性影响结合的肽的化学修饰(包括糖基化、磷酸化和其他已知的翻译后修饰)，都包括在该术语中。每一种抗体制剂(或其他结合剂)用于富集单一的监测肽作为单一蛋白质分析物的代表物。为了检测并定量测定蛋白质分析物，本发明使用抗肽抗体(或任何其他可逆结合大约5-20个残基的特异性肽序列的结合性实体)来从肽混合物中捕获特异性肽，例如从通过水解蛋白酶(如胰蛋白酶)或化学试剂(如溴化氢)由蛋白质混合物(如人血清)的特异性断裂产生的肽混合物中。通过将特异性肽结合到抗体上(抗体通常连接到固相支持物上)，然后洗涤抗体：肽复合物，最后将结合的肽洗脱成为小体积(通常通过酸性溶液，如10％醋酸获得)，本发明有可能富集在整个消化物中以小浓度存在的且因此相对于存在于混合物中更大量的肽背景而不可用简单质谱法(MS)或液相色谱-MS(LC-MS)系统检测的特异性肽。这种富集步骤用于捕获高、中或低丰度的肽，并将它们提供给MS进行分析：因而它舍弃了关于起始混合物中肽的相对丰度的信息以便于增加检测的敏感性。然而这种在蛋白质组学领域具有很大价值的丰度信息可以通过使用同位素稀释方法而得到再现：本发明用这样的方法(优选使用稳定的同位素)结合特异性肽的富集，从而提供了一种用于定量分析肽的方法，包括分析低丰度肽。

本方法将产生将进行测定的肽的结合了一或多种质量不同于主要的自然同位素的同位素的一种形式，从而形成标记的肽变体，该标记肽变体与存在于混合物中的天然肽化学性质相同(或近似相同)，但却由于它变化的肽质量(同位素的标记)仍可通过质谱仪进行区分。产生标记肽的优选方法是化学合成，其中通过结合含有氢、碳、氧或氮的重同位素的氨基酸前体引入同位素标记物而制成与天然肽相同的肽。该同位素肽变体用作内标物，在用抗体捕获进行富集之前以一种已知浓度加到样品肽混合物中。从而抗体根据它们在样品中的相对量一起捕获并富集天然和标记的肽(由于它们的化学性质相同而具有彼此之间无差异的亲和性)。由于标记的肽以已知浓度加入，通过最终MS分析测得的天然形式和标记形式的量之间的比率使得可以计算在样品混合物中的天然肽浓度。这样，本发明可以测定复杂混合物中低丰度肽的量，并且由于肽通常通过蛋白质混合物的定量(完全)断裂而产生，可以推导出蛋白质混合物中的母体蛋白质的丰度。本发明可延伸为包括平行测定多个肽，并且通过计算机控制而自动化从而为蛋白质测定提供通用系统。因此产生新的特异性蛋白分析仅需要生成肽特异性抗体和标记的肽类似物。本发明的关键特征是：本发明旨在建立对于先以选择的特定蛋白的定量分析，而不是解决两或多种样品的所有未知成分之间的比较问题。这种对特异性分析的关注使产生相对于每个监测肽的特异性抗体(原则上一个抗体对每个分析结合一种肽)具有了吸引力：现在产生成千上万的可能抗肽抗体是不具有吸引力的，例如，这些抗体需要包括可能的人蛋白质的所有范围。由于此原因，前面所述方法还未集中于抗肽抗体，而却替代地使用了通常的亲和概念，其通过识别配体、标记物或该类物质所共有的特征而结合并富集所有的这类肽，例如，用固定化的金属亲和层析(IMAC)选择磷酸肽作为一组、用抗磷酸酪氨酸抗体选择含抗磷酸酪氨酸肽作为一组、或者用凝集素选择糖肽作为一组。本发明的目的是提供特意使用不同抗体(或其他等价的选择性结合剂)富集每一种肽序列的方法。

另一目的是以非常接近的相同丰度并不含其他无关肽的方式传送一系列不同的监测肽(通过相应系列的特异性抗体来选择的)到质谱仪上。通过对一系列肽的丰度进行平衡，该方法确保所有的肽都在质谱仪动态范围内并且可将该动态范围在跨越肽分析物的真实动态范围内优化使用。如果MS系统的动态范围为1000(根据MS的类型100到10000的范围是典型的)，该方法确保所有提供给MS的肽在该范围的中间水平，从而使得最优化其检测天然和同位素标记的形态相对丰度增加或减小的能力。如果提供给MS的肽是不同的丰度(例如相对浓度为1，0.001和1000)，那么MS将很难检测这三种肽的天然及同位素标记形式之间的等价的数量差异。通过“拉平”肽的丰度分布，充分加强了质谱仪定量分析的分辨率。

虽然在选择最优肽来监控每种蛋白质的过程中一些技术是有用的，但是相对于产生高亲合抗体和进行通常夹心型定量免疫分析所需的其他要素所需的大量成本，本方法通用并且不昂贵。它可与低容量免疫分析技术竞争，作为一种测定混合物(如人血清或血浆)中十到上百种特异性蛋白质的手段。

优选的实施例结合：1)已有的用于产生及亲和纯化抗体的方法，该抗体紧密但可逆地结合短肽序列；2)用于将复杂蛋白质混合物消化产生短肽的已有方法；3)用于合成含同位素标记的限定肽的已有方法；4)用于有效循环亲和色谱而重复捕获及传递肽的已有方法；和5)用于Ms测定标记和未标记(源自样品的)肽的比率的已有方法，来产生定量测定。此处，用血浆蛋白质作为示例来描述该结合的方法。除了以新的方式结合单独的步骤，我们还描述了多路传输并自动化这种试验的新方法，及优化选择监测肽序列的方式。对其它蛋白质或肽混合物的应用对本领域技术人员将是显而易见的。使用除了抗体以外的肽结合剂(例如，RNA适体、肽体等等)对本领域技术人员也是显而易见的。同样将显而易见的是该概念推广到其他生物分子的定量检测，如核苷酸和低聚糖，或推广到到任何分子实体，该分子实体可以是：1)以同位素标记形式产生，并且2)可产生与之可逆结合的结合剂。

单一分析物实施例(1：)

在最简单的实施方案中，对每个人们希望在血浆中测定的蛋白质进行下面的步骤以便于产生特定的定量分析系统。出发点是蛋白质鉴定，通常表示为序列数据库(如SwissProt或Genbank)中的登录号。该步骤是：

选择监控蛋白(步骤a)

使用蛋白质的已知序列，人们在其中选择一种或多种肽片段作为“监测肽”。虽然用所需的酶通过切割产生的任何肽都是一种可能的选择，但通过一组设计为选择肽的标准来定义良好的监测肽，该肽可以高产量化学合成，可在适宜的质谱仪中进行定量检测，并且当用作抗原时可引发抗体。一组有用的标准如下所示：

1：该肽具有由所需蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)切割蛋白质而产生的序列。应用通常可获得的软件可以容易地从蛋白质序列计算所有可能的胰蛋白酶肽。

2：该肽应是完全亲水性的，在通常用于酶消化和亲和层析的溶剂中是可溶的。基于从通常可获得的软件程序对每种肽所得到的计算结果选择亲水性肽。一般，亲水性肽是那些含有较多极性氨基酸(组氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸)和较少疏水性氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)的肽。

3：由于可加入c-末端半胱氨酸以方便缀合免疫原并且在肽中存在两个半胱氨酸可能导致不利的二聚作用和交联，因此该肽应优选不含半胱氨酸。

4：肽应通过电喷雾(ESI)或矩阵辅助的激光解吸(MALDI)离子化作用很好地进行离子化。该特性可用软件程序估计或通过目的蛋白消化物的MS分析而试验确定以了解哪种肽以最高相对量被检测。

5：该肽在抗体产生的物种中是具有免疫原性的。对下面的肽具有通常更好的免疫原性，即：那些亲水性的肽(与上述第(2)点一致)；该肽包括由第二结构预测软件预测的弯曲；该肽不包括糖化位点；并且该肽在长度上为10-20个氨基酸。

6：在该肽中不应包括任何在靶蛋白质中普遍存在的序列多态性(也就是遗传变异体)位点(由于如果变异体肽未以期望的质量出现，这可能影响对各蛋白质量的估计)。

7：该肽不应与靶生物体的任何其他肽具有显著的同源性(例如通过BLAST序列比较程序确定的)。该特性应可减小抗体捕获步骤中的任何来自非靶蛋白质的肽的干扰。

根据这些标准可容易地评估来自靶蛋白质的所有可能的肽并且选择最优平衡本方法的需要的一种或多种肽。尤其是，对有限组分析物(如在血浆中的抑制蛋白质)直接产生所有肽及其衍生特性的数据库，并使用该数据库作为选择监测肽的基础。以蛋白质分析物的已知氨基酸序列开始，有效的算法可构建所有可能的胰蛋白肽，这些肽通过蛋白质的胰蛋白酶消化作用产生。这些胰蛋白酶肽序列作为记录存储于数据库中，并对其他可能的切割酶和试剂产生的相似记录进行存储。可用另外的算法计算每种肽的各种不同的物理及生物特性，包括长度、质量、在中性pH下的静电荷、采取二级结构的趋势、亲水性等等。对每种肽可将这些衍生数据制成表格，并且额外进行集合计算以产生与作为监控蛋白成功可能性有关的优先分值。将这些优先分值分类来为每种蛋白质选择优选的待选监测肽。

也可能将实验数据加到优先化中。例如，可能通过合成所有来自蛋白质的各胰蛋白酶肽序列产生并将这些肽固定在膜上的阵列中。然后用全蛋白质的抗体或用抗蛋白质混合物(包括靶蛋白)的抗体混合物探测这样的阵列，通过用第二标记抗体二次染色对抗体与各种肽的结合进行显示与定量，从而可用发光、荧光或比色染色法检测(PEPSCAN方法{Carter Methods Mol.Biol.36：207-223(1994)。然后那些定位于检测到抗体结合的地方的肽因此显示可以引发抗体应答。这样使用PEPSCAn的主要限制是需要存在对于所选蛋白质的抗体，或对于含所选蛋白质的混合物的抗体。当蛋白质是一种以前研究过的蛋白质时，这样的抗体可以获得或者它可在选择最优监控蛋白时产生。

产生同位素监测肽(步骤b)

然后制作所选择肽的同位素标记的形式，其中保留了化学结构，但用同位素代替一个或多个原子，以使得MS可将标记的肽与普通肽(含有各元素同位素的天然丰度)相区分。例如，氮-15可替代天然的氮-14导入合成肽的一个或多个位点。该合成肽超出的重量等于替代的氮数量的原子量单位。应仔细制备该肽，以使得加入的质量单位数是已知的并已确定(即，以一种标准产生的所有材料具有尽可能相同范围的质量—例如，通过使用高富集的氨基酸同位素变异体)。在优选实施方案中，由氮-15标记的氨基酸前体(取代＞98％)用于肽合成过程的一个或多个位置从而与天然肽相比导入4-10个额外的质量单位。这样的氮-15标记的氨基酸前体(或其碳-13标记的等价物)作为FMOC衍生物可商业获得，适于直接用于通常的商业肽合成工具。用通常的LC法纯化最终产生的标记的监测肽(通常达到＞90％纯度)，并用MS对其进行表征以确保正确的序列和质量。

产生抗肽抗体(步骤c)

免疫动物以生产抗肽抗体，将同样的肽(标记或未标记，如果这是所盼望的，更加经济)偶联到载体蛋白(例如钥孔血蓝蛋白(KLH)；不与人蛋白质同源)上，并用于通过已知方案免疫动物(如兔、鸡、山羊或绵羊)，该免疫方案有效产生抗肽抗体。为了方便，用于免疫及抗体纯化的肽优选含有加到监控蛋白序列上的额外的c-端残基(此处简化为MONITOR)，例如：n端-MONITOR-lys-gly-ser-gly-cys-c端。所产生的延伸的监测肽可方便地偶联载体KLH，该载体KLH在先已与异双功能试剂反应，以使得多个SH-活性基团结合到载体上。在用肽进行典型的免疫时(该肽现作为载体蛋白上的半抗原)，产生的多克隆抗血清含有针对该肽、针对载体及针对其他非特异性抗原决定簇的抗体。或者，在本领域中有许多已知方法来偶联肽，用于抗体产生的载体有或无任何扩充或修饰，且可使用任何这样的方法。同样，存在已知的方法通过用载体上的肽免疫动物以外的方式来产生抗肽抗体。只要对于监测肽产生适宜的特异性可逆结合剂，可使用任何变化的方法。

然后，通过在含紧密结合的肽的柱上进行亲和纯化而从该抗血清中制备特异性的抗肽抗体。通过将一等分量的延伸的监测肽与硫醇活化固相支持物(例如，商业可获得的丙基硫氧嘧啶琼脂糖)反应可容易地制备这样的柱。将粗提抗血清加到该柱上，然后洗涤该柱并最终暴露于10％醋酸(或其他低pH、高pH、或高促溶剂浓度的洗脱缓冲液)来特异性洗脱抗肽抗体。中和或从洗脱缓冲液分离这些抗体(为防止变性)，并且再生该柱达到生理条件以便于需要时对更多抗血清进行应用。

将肽特异性抗体最终固定在柱、珠或其他表面上用作肽特异性亲和捕获剂。在优选实施方案中，根据制造者的说明，抗肽抗体固定于商业可获得的蛋白质A-衍生的POROS层析介质(应用生物系统)上并且通过与二甲基庚二亚胺(pimelimidate)共价交联共价固定在该支持物上。所产生的固相介质可特异性从肽混合物(例如，血清或血浆的胰蛋白酶水解液)中结合监测肽，并且洗涤步骤后，在和缓的洗脱条件(例如，10％醋酸)下释放监测肽。然后将该柱恢复至中性pH从而再生该柱用于另一样品的再次使用，本领域公知的方法可使之重复上百次。

抗肽抗体优选的亲和性在100-100,000,000范围内。需要较高的亲和性来富集更低量的肽，也就是说，捕获低浓度肽。

将样品消化为肽(步骤d)

将人们希望测定的血浆样品中的所选蛋白由适宜的蛋白酶(在此为胰蛋白酶)消化完全从而产生肽(包括在步骤1中所选择的监测肽)。对于其序列于靶蛋白序列中只显示一次的监测肽，该消化应产生同指定样品中所存在的靶蛋白分子相同数量的监测肽。通过以下步骤进行消化：首次先使蛋白质样品变性(例如，用尿素或盐酸胍)，减少蛋白质中的二硫键(例如，用二硫苏糖醇或巯基乙醇)，烷基化半胱氨酸(例如，通过加入碘乙酰胺)，通过加入更多二硫苏糖醇或巯基乙醇淬灭过剩的碘乙酰胺，最后(在除去或稀释变性物后)加入所选择的蛋白质水解酶(例如，胰蛋白酶)，然后进行孵育使得消化进行。在孵育后，通过加入化学抑制剂(例如，DFP或PMSF)，或通过使胰蛋白酶变性(加热或加入变性剂，或使用两者)或除去(如果胰蛋白酶在固体支持物上)胰蛋白酶而终止胰蛋白酶的反应。破坏胰蛋白酶的活性是重要的以避免后来由于残留在样品中的蛋白质水解酶活性产生对抗体的破坏。

加入同位素标记的监测肽内标物(步骤e)

然后将量取的等分的同位素标记的合成监测肽以接近或大于(如果标准物作为低丰度肽的载体)等分样品中所期望的相同“天然”肽的量加入到量取的等分消化样品肽混合物中。在加入后，监测肽在样品中以两种形式存在(天然的及同位素标记的)。基于加入的数量和已知的等分体积将准确知道同位素标记形式的浓度。

通过抗体捕获及洗脱富集监测肽(步骤f)

使肽混合物(带有所加入的同位素标记监测肽的消化物)与肽特异性亲和捕获剂接触，该捕获剂优选与监测肽结合但不会区分标记与未标记形式(由于同位素取代物不会影响抗体的结合亲和性)。在洗涤步骤后(例如，磷酸盐缓冲液)，然后洗脱结合的肽(例如，用10％醋酸，或用水和乙腈的混合液)以进行MS分析。如果需要，亲合性支持物可以制备再生以用于另一样品。假设在高通量分析应用中，循环使用固定的抗体结合数百次，如果不是数千次，将是有利的。现在的证据显示，当用5％或10％醋酸洗脱抗原并且对酸的总接触量较短(例如，在用中性pH缓冲液在生前少于一分钟)时，兔多克隆抗体可循环至少200次。在固定抗体床在尺寸上低于微升的毛细管柱的形式中，接触酸的持续时间可更进一步减少，可能会进一步延长固定的抗体吸收剂的寿命。

通过抗体对于肽的亲合常数及通过肽和抗体两者的浓度来控制对肽的捕获效应。我们特别关注结合抗体的肽片段。相关通用方程为：

Ab+Pep＝AbPep，

K_a＝[AbPeb]/([Ab]×[Pep])

K_a×[Ab]＝[AbPep]/[Pep]

[Ab]、[Pep]和[AbPep]分别是Ab、Pep、AbPep的浓度；K_a是在给定的溶液条件下控制结合反应的亲合常数。在本实施方案中，我们特别关注低丰度肽(由于高量肽相对容易捕获)，这样我们令抗体以最大可获得浓度存在于固相支持物上([Ab]＝对于结合到蛋白A衍生POROS树脂的IgG接近10-5M)。由于在该浓度下100fmol的Ab仅占据1nL POROS，并且虽然以通常的标准看所使用的柱非常小，实际上其比这大得多，该抗体的存在相当过量于肽，且我们可以假设任何可获得的[AbPep]水平不会有效减小[Ab]，该[Ab]可假设为常数(10^-5M)。通常抗肽抗体具有10⁶-10⁸范围的亲合常数。因此抗体结合的肽与游离肽的量的比例([AbPep]/[Pep])为K_a×[Ab]＝10⁶-10⁸×10^-5＝10-10³)。这样甚至在相当低的亲合性(K_a＝10⁶)的情况下，肽的主要部分(90％)应结合到抗体上，而高亲合性抗体则给出99.9％抗体结合。该比例不依赖于抗体浓度，因为抗体捕获任何可获得的肽，并且主要通过检测器的敏感性确定该敏感性。

上述计算应用于平衡结合。亲合常数Ka是“结合速率”K_on和“解离速率”K_off的商(K_a＝K_on/K_off)。由于主要由扩散(分子撞到另一分子上)确定，对所有的肽-抗体结合反应，K_on是相似的。通常K_on值为10⁵-10⁶M^-1sec^-1，此处我们假设更守恒的值(10⁶)。从该值和上述所使用的通常K_a值(10⁶-10⁸)，我们可计算K_off值的范围：1-0.01/秒或换句话说为1-100秒。如果在肽离开后，该肽可再连接到另一结合位点上，那么它可在另一相似的时间段保持结合。因此，如果装载和洗涤相对较快并且假设有过量的结合位点(抗体)用于再次结合，在装载和洗涤期间肽可能留在柱上。因为洗脱条件(例如，低pH)改变肽与抗体之间的相互作用并急剧增加解离速度，所以洗脱非常快速。由于这个原因，甚至在快速循环的亲和层析过程中观察到结合到固定化抗体柱上的抗原以尖锐峰带洗脱。这样锋面表现使得捕获肽的洗脱体积很小，特别是如果柱长与柱直径的比例大的情况下。通过例如直径为100微米长度为3mm(长度/直径＝30，体积＝～25nL)的毛细管固定化抗体柱满足后者的需要。在这样的柱中，肽区在1mm区域中洗脱，其具有8nl体积。如果10μL血浆样品的消化液可装载于柱上，那么以上述高效率捕获的监测肽洗脱为8nL，则本发明方法获得1000倍的浓度增加，并同时除去了大量潜在的干扰性肽材料。

由于该步骤使得源于样品中低丰度蛋白质的低丰度肽富集和浓缩，因此富集步骤是本方法的重要步骤。理论上，该富集方法仅将监测肽供给MS，并使它的检测成为纯粹MS敏感性的问题，而不是相对于许多其他潜在的更大丰度存在于整个消化物中的肽背景的检测监测肽问题。该方法有效地扩展了在样品及其消化液中存在其它高丰度蛋白和肽的情况下MS检测器的检测敏感性并有效扩展了动态范围。

通过MS分析所捕获的监测肽(步骤g)

将在上述步骤富集的监测肽(包括天然和同位素标记的形式)优选通过电喷雾离子化供给到质谱仪的入口中去。在优选实施方案中，肽在洗脱缓冲液(例如，10％醋酸)中直接导入质谱仪。或者，将监测肽加到反相(例如，C18)柱上，并梯度(例如，在水中的乙腈/三氟乙酸)洗脱到质谱仪(也就是LC/MS)的电喷雾源。质谱可以是离子阱、三重四极、ESI-TOF、Q-TOF型设备、或适宜质量分辨(＞1000)和灵敏度的任何其他设备。

对于两种形式的监测肽(天然和标记的)MS测定离子电流(离子数量)作为时间的函数。对每种质量类型，离子电流在时间上积分(理论上只要监测肽出现在质谱上)，计算天然和同位素标记形式的积分数。

计算样品内每种监测肽的丰度(步骤h)

计算标记和未标记(天然的)监测肽之间的数量比例。由于加入的标记肽的量是已知的，那么用该测定比例乘标记的监测肽的已知浓度可计算源自样品消化物的天然监测肽的量。通过假设消化液中监测肽的量与该肽源于的母体蛋白的量相同(或近似相关)，可获得样品中该蛋白量的计算。

为检测并补偿样品消化过程完成性的变化，可选择一系列消化监测肽，该监测肽显示消化过程的进展。由于样品消化液在水解蛋白酶对血浆蛋白比率之间的差异、消化时间和温度的差异、样品的内源蛋白酶抑制剂含量的差异、或内源蛋白酶水平或活性的差异，消化的完成性可以有所不同。尤其是，人们可以进行时程实验，在该实验中用胰蛋白酶消化血浆样品(在血浆蛋白还原并烷基化作用后)，一系列释放肽中的每种的数量作为时间的函数测定。一些肽在消化过程初期释放，可能是由于它们位于靶蛋白的表面并由于该肽末端的切割位点与蛋白酶接触并于消化早期达到了它们的最大终浓度。其他肽在消化过程晚一些时候释放，可能是由于它们形成了靶蛋白的核心部分或由于形成该肽末端的切割位点不在完整靶蛋白的表面暴露，因此这些肽在消化过程晚些时候显示并在晚些时候达到它们的最大终浓度。也发生了以下情况：一些水解蛋白肽从后来在溶液中切割的靶蛋白上释放，并由于该肽进一步被切割为其他更短的肽而引起消化液中该肽浓度先增加后减小。通过在这样的时间过程中测定一系列特定肽的时间比浓度性质，人们可选择一起定出血浆消化过程状态精确测定的消化液监测肽。如果这种的肽是一种或一些蛋白质的产物，那么这样肽群体的应用就增加，从而肽之间的丰度比例反映了消化过程而不是亲代蛋白质间的浓度差异。通过在接下来的单一样品消化液中测定所选择的消化监测肽，人们可计算消化过程中在何处捕获各样品，对所涉及的样品种类有效产生消化过程的标准化标度。该信息结合对于每种将用于样品分析的监测肽的释放的时间过程知识(相对于参考消化液中消化监测肽的释放)，当特定的样品不完全消化为同样程度时，这使得可以校正监测肽的丰度。

通过使用多级肽捕获法进一步增强了该方法的特异性和敏感性。在多级方法的一个实施方案中，基于下面的原理可使用两个不同的连续捕获步骤：首先在针对该肽N端部分的抗体上捕获，从该第一抗体洗脱并中和后，在针对该肽C端部分的第二抗体(A2)上捕获。由于用于制造抗肽抗体的免疫原通常由通过附于所需监测肽序列上(通常由一些间隔残基与监测肽序列相隔)的半胱氨酸残基连接在大载体蛋白(例如，钥孔血蓝蛋白或清蛋白)上的肽构成，因此可制成这样的N-端或C-端抗体。如果半胱氨酸包含在免疫肽的N-端，导致N-端连接到载体的表面，那么将使监测肽序列的C-端暴露用于识别和抗体产生。相反的，如果半胱氨酸包含在免疫肽的C-端，导致C-端与载体表面连接，那么将使监测肽序列的N-端暴露用于识别和抗体产生。由于抗体常识别3-6个氨基酸的长度，并由于监测肽常常为8-15个氨基酸长度，出现以下情况是高度可能的：由N-端及C-端抗体识别的抗原决定簇实质上不同，这将对监测肽提供分离的但特异性的识别。任何通过与监测肽序列N-端部分的某些相似性结合到第一(例如N端)抗体上的杂质(其他肽)极不可能也与C-端抗体结合。使用两个不同的富集过程通常会产生与两个分离的富集步骤的积相等的纯化作用：如果N-端抗体结合1/10⁴消化肽(作为杂质，即除了所需的监测肽以外的)，并且C-端抗体也结合1/10⁴消化肽(作为杂质，即除了所需的监测肽以外的)，那么作为两个分离的富集步骤的这些抗体的相继结合可能结合1/10⁸非监测肽。如果N-端和C-端抗体都结合大部分的监测肽(例如，每一步骤为90％)，那么两步捕获的最终结果是81％的监测肽回收，仅0.000001％(1/10⁸)的其他结合肽。

其他多级富集方法也是有利的。第一抗体可以针对表面肽或整个肽，可用于捕获来自血浆的天然蛋白，之后可将蛋白质消化为肽和通过第二抗肽抗体捕获监测肽。

或者，相继的消化方法可用于与两个抗肽抗体相结合。此处，用第一蛋白酶消化血浆样品，产生由第一抗肽抗体结合的监测肽序列的第一种形式。洗脱该肽后，用第二蛋白酶将之切割，产生两个(或可能更多的)新肽，其中每一种具有至少一个新的末端(第一监测肽先前的C-端片段具有新的N-末端，先前的N-端片段具有新的C-末端)。第二抗肽抗体用于捕获一个这样新暴露的末端序列(一个在第二消化步骤之前并未暴露的末端)用于MS检测。作为示例，该方法的一种操作涉及选择通过赖氨酸和/或N-或C-端结合的监测肽序列，在该序列中存在一个精氨酸残基。使用lys-C(其优先在赖氨酸残基处而非精氨酸处切割)作为第一蛋白酶，制成第一抗肽抗体来识别该序列C端赖氨酸部分(例如，经N-端半胱氨酸连接载体而成免疫肽)。用胰蛋白酶(该蛋白在赖氨酸和精氨酸之处都切割)进行的第二消化作用在该肽的内部精氨酸处断裂，产生两个片段，其中一个片段具有新的C-端序列(以精氨酸结束)并且该片段由第二抗肽抗体识别。该方法实际上使用了三个特异性步骤(第一抗体、第二蛋白酶、第二抗体)从而进一步加强了最终检测过程的整体特异性。在使用两个蛋白酶的多级系统时，存在捕获并检测两种(或更多的，如果第二蛋白酶进行多于一次的切断)“子代”肽分别作为相互证实的试验的机会。可使用具有不同特异性的蛋白酶的任何组合。

两种蛋白酶的多级系统的一个特定的有趣事实是：其中第一蛋白酶作用发生在体内，在样品中的部分天然蛋白分子中产生断裂的系统。例如，这样的蛋白酶的作用可以显示一种疾病过程或对于治疗的有益响应。一种所需的测定可能是被断裂分子的一部分。通过用不在体内蛋白酶的位点切割的蛋白酶(体外蛋白酶)消化血浆样品可获得该结果，产生天然蛋白质的片段(肽)，其中一个片段含有该体内切割位点。针对监测肽N端(或者是C-端)的抗肽抗体捕获整个监测肽和来自体内断裂的较短的形式。监测肽在长形式和短形式之间的丰度比例(优选通过相对于同样的稳定同位素标记内标物肽定量每一种)给定亲代蛋白质的未断裂形式与体内断裂形式之比。

上述所有多级方法使用同位素标级肽作为内标物，通过与第一单一分析物实施方案同样的方式应用于定量肽。

基本操作的自动化(2：)

优选结合基本操作步骤d、e、f和g为自动化过程，将计算机控制的液体操作系统应用于步骤d、e和f，并将计算机控制的质谱仪应用于步骤g。在该方法中，计算机化的液体操作系统进行样品的还原和烷基化、加入胰蛋白酶、孵育、淬灭胰蛋白酶活性并加入标记的肽标准物。

在一种形式中，计算机化的液体操作系统然后将准备好的消化样品加到对监测肽特异性的抗体上(优选在固体支持物上)，移走消化物，在它的支持物上洗涤抗体，最后将所捕获的肽直接洗脱入质谱仪进行步骤g。可以非常小的体积(例如10μl)进行该洗脱，且因此将全部洗脱样品逐渐灌输到MS以获得最大的敏感度。

或者可以离线进行步骤f，产生可随后导入质谱仪进行测量的一系列富集的肽样品。由于载有数百样品的MALDI靶盘可离线制备并在此后导入MS中，当MALDI MS用于检测和定量这些肽时，该方法特别适用。

步骤a-h的整个过程可作为统一的分析过程而用于定量样品中蛋白质。

多分析物测定的平行的实施方案：

在第一个平行的实施方案中，在一种装置中用各种抗体一次一个地选择各种监测肽而测定多种蛋白质，该装置使得连续的抗体间断地洗脱入MS(当其抗体在适当的位置进行洗脱时，连续测定每种监测肽)。在该方案中，不是用层析分离法来分离含有一系列监测肽的混合物(在所有情况下连同它们所加入的同位素标记的形式)，人们使用液流或机械方式来将每种抗体放置在其固体支持物上进入洗脱路径(通常10％醋酸的洗脱液流导入到MS中)。可用图1-7所示的设置为旋转腔室的多个小抗体柱来实现这种基本的实施方案。

在该实施例中，最耗费时间并且昂贵的两个过程是制备被消化的微样品以及制备和使用结合要分析的肽的固定化的抗体表面。因而，人们希望仅制备一份或很少的要分析样品的消化液，并将其加到许多免疫吸收支持物或表面上，该数量对测定所需数量监测肽(靶蛋白质)是有效并必须的。由于结合与扩散相关，一个目的是使肽消化样品在相对大的表面扩散，以及有效地进行施加和去除。最初有两个限制是明显的。首先是吸收表面的容量和多特异性，其次是当将进行检测的数量增加导致它们的更大稀释时，质谱对同时定量大量不同分析物的限制。这样，如果使用最大多价吸收性表面，那么它对任意一种分析物的容量就非常小，且每种结合剂只有很少数量存在。并且，由于分析物的数量上升至极大的数量，MS不可能分辨所有存在的物质。在结合自动操作的本实施方案中，目的是让消化样品通过一系列不同的免疫吸收性支持物，每一种支持物含有一个或多个不同的特异性抗体，在封闭系统中以如下方式设置：所有支持物都与样品接触，然后洗脱过量的样品。在该步骤后，分离分立的支持物，每一支持物分别有效洗脱到电喷雾MS系统中。免疫吸收性支持物必须以如下方式设计：将抗体连接到它们的大组上(也就是它们制造的关键步骤)的操作可平行进行并具有高度再生性。

在开始的设计中，使用十六个包含不同表面的不同免疫吸收支持物，且期望十种不同抗体混合物会连接到每一个上，对每种分析组给出总共160种不同的要分析的蛋白质。每一种抗体结合表面包括盘(此处为圆盘)中小孔的内腔，且通过开槽而使内腔表面积增加。图1表明对含抗体的孔或管开槽以增加表面积。

图2显示含有齿缘9的盘8中的孔内的结合表面设置为使它进行受控制的旋转。所显示的是16个含抗体的孔10，4个空孔11，它们绕轴12对齐。

图3显示一组盘8对齐为堆叠17，有空的对齐的端帽16和18。结合的抗体示为19。

图4显示对齐并装载盘的设置，其中通过由31计算机控制驱动的装置30对在球管28中的抗体溶液29进行交替挤压和扩散，从而将液体往复推过管32、33和34，且向上通过管35进入球管36。由于存在孔38，压过37的溶液不会在球管36中建立压力。这样将抗体加到一系列盘中的每一个上的单孔中，并重复该过程将抗体(通常是不同种类的)加到其他孔上。对开槽的内腔表面进行化学修饰以便于结合抗体。一旦将抗体加入，可洗涤该孔并在原位使抗体干燥。然后拆开堆叠的盘产生一系列同样的载有抗体的肽捕获盘。

在使用中，如图5所示，盘39在空盘41和42之间持为40，其含有对齐的孔。该设置保持盘41和42稳定，而盘40可通过具有齿缘9的外部装置的设置而进行旋转。

图6显示了在一个分析循环中操作该系统，其中具有齿缘64的盘63含有十六个含抗体的孔65和四个空孔70-73。含抗体的孔通过上下空盘中的缝隙交替相连，用虚线66表示下面的缝隙而用非虚线67表示上面的连接，连接入口68，通过经上(67)和下(66)连接缝隙的蛇形连接穿过所有含抗体的孔65，通过69流出制成了连续路径。这使得样品消化液往复泵过所有的孔，然后排出，并将孔组进行洗涤。这些部件在图6b中显示为通过盘的圆形截面。在下一操作中，移动可旋转的盘63使得装载抗体的管69与盘41和42的管70对齐，并且将洗液流过。向前指引一步将管69移到位置71，在位置71洗脱液(如10％醋酸)用于分离所结合的肽并将它们传输到质谱仪上或中间的捕获点，如反相柱。下一个指引将试管69带进有位置72的寄存器，其中缓冲液流过以再生抗体并在暴露于洗脱液后使它稳定。如此将每种不同的含抗体管(或孔)引导通过该状态，产生16个顺序的连续洗脱到MS中。

图7显示了整个系统如何整合，质谱仪74与盘分析器75连接，然后通过自动取样器76供给样品，全部处于计算机77的控制下。

可形成含抗体的孔以使得将抗体(或其他结合剂)装载于它们的内表面上(如所示)或它们可以用结合有抗体的多孔单片材料填充，产生较大的表面积从而有较高的抗体分子局部浓度。可通过以下方式形成这样的单片支持物：原位聚合、烧结预制的颗粒、将预形成的多孔杆通过摩擦配合插入每一孔、或通过其他方法。在抗体结合到内表面的情况下，这些表面可以是圆柱形的(如通常的管)或它们可以通过各种方式形成网状以增加内表面积。

在必须使用多种不同分析部件(如盘)的临床化学中，最重要的问题是确定在位置上的部件是正确的部件。成为该系统一部分的注意是能质量控制和阳性识别结合位点的能力。由于标准物的混合物加到每一个肽的消化样品中，其中只有一些结合到每一载有抗体的结合表面上，因此这就实现为该系统的自动化特征。因而通过质谱对从每个表面(孔)洗脱的肽进行分析提供了对表面的抗体及它们的操作条件的阳性识别。该方面确定了该盘含有正确的抗体特异性。外加的任选特征是在制造过程中在每个带有抗体的相应肽的孔装载抗体：在此情况下，在任何样品加载前，盘中的每个孔可洗脱到MS，通过MS识别这些洗脱肽而证实抗体的特异性。

或者，以其他方式执行该多抗体分离洗脱方法，例如使用电磁装置使包被抗体的反磁性颗粒移过所需的位置(取样、洗涤、洗脱到MS中)。可使用如下设置的固定化抗肽抗体阵列：设置在平面上以使得从覆盖的液体体积捕获肽；设置在针状物上以使得从浸渍它们的容器中捕获肽；或设置在微液流装置的分离的微容器中以使得可连通多个液流通道。多个机械及电磁溶液显然存在以下问题：使多个分别固定的抗体与样品接解，洗涤它们，然后通过暴露于其后移入MS的液流单独洗脱它们。

在第二平行实施方案中，该方法应用于一系列不同质量的监测肽(A-L)，用于同时测定一系列蛋白质(a-l)(图8A)。在该情况下，将预定量的标记肽的混合物(基于样品中各蛋白质期望的相对丰度)加到样品消化液中(图8B：实条代表天然肽，虚线条代表加入的稳定同位素标记监测肽)。用一系列捕获抗体来恰好地捕获这些监测肽(天然的及标记的形式)。这些抗体(在适当的固相介质上)优选以相对量组合以使得捕获近似相等量的每种监测肽，而与这些肽在消化液中的量无关，因此在洗脱到MS中时产生了近似等摩尔的监测肽混合物(图8C)。如果抗体亲和性高，那么通过制备柱或近似等量的每种抗体固定在其上的其他亲和性支持物，并使足够量的样品消化液通过该支持物使得所有抗体可结合达到饱和，而实现该目的。如果一种或多种抗体具有较低的亲和性，那么需要更多该抗体以便于获得捕获及释放肽的近似相等的化学计量。高丰度监测肽的大部分将不结合(超过了在支持物上的捕获抗体的量)，而低丰度的肽仅饱和各自的捕获抗体而未有显现于流通(未结合)的部分。通过使监测肽在丰度上更接近相等(相比于与它们在样品中可能具有的非常不相同的丰度)，LC和MS的动态范围限制不再成为主要问题。如果监测肽(天然和标记形式)的质量足够不同以使得MS可解析分辨并定量全部监测肽(以两种形式)，可以通过导入MS直接分析监测肽的该组合。使一系列监测肽更接近相等摩尔是允许多路(多分析物)质谱法检测中主要的进步。

或者，结合的监测肽可施加于LC/MS以使得仅有一种或一些监测肽同时导入到MS，且可对MS进行预编程以接连寻找每一监测肽。这样，为测定一系列监测肽(代表一系列蛋白质分析物)，将全部相应的同位素标记肽标准物加入消化液中(如上所述通过计算机化的液体操作系统制备)，并然后将洗脱的肽(现在由一系列带有它们相应标记的标准物的监测肽)导入层析柱(如C18反相柱，也在计算机控制下形成部分层析系统)并从该反相柱上由梯度(通常含有0.05％三氟乙酸的0-70％乙腈水溶液)洗脱(通常经过5-30分钟)。将输出(柱的洗脱液)导入质谱仪，结果是任意一次只出现一种或一些监测肽，这样使MS可单独测定每一种而不存在其他监测肽的潜在干扰。进行起始操作，在起始操作的过程中，通过扫描所有洗脱肽的质量确定每一监测肽的洗脱时间。在接下来的操作中，可将LC/MS系统编程为查看已知质量的标记和未标记形式的监测肽的正确洗脱时间，因而将更多的测定时间给予目的监测肽而不是扫描所有的肽质量。

以此方式，使用捕获抗体进行富集的该披露方法可平行对许多蛋白质进行测定，在样品中具有非常不同的相对丰度的一系列蛋白质可在单次MS或LC/MS操作中进行定量。监测肽丰度的均衡化(“化学计量平衡”)是关键的思想，且它克服了用MS定量的关键性问题，即现有系统可获得的有限的动态范围。

在第三平行实施例中，测定在样品中具有不同丰度的一系列蛋白质，但我们希望对大量蛋白质节省使用标记监测肽。(图9)。例如，血清白蛋白、补体C2和甲状腺球蛋白在人血清中的丰度不同，相差的级数接近1000倍(在浓度上相对为10⁶∶10³∶1)。如果用酶(如胰蛋白酶)将血浆样品消化为肽，那么来源于这三种蛋白质的监测肽在数量上也以同样的系数而不同(假设全部消化)。现在建议的定量方法的基础是：1)选择适宜化学性质的至少一种肽来代表每一种将进行测定的蛋白质(监测肽)；2)以相同于天然肽(来源于样品)的浓度加入同位素标记形式的每种监测肽，因而提供了一种内部定量标记物，其在质谱仪中可通过质量进行区分但与天然肽化学性质相同；3)通过捕获将每一监测肽(天然和同位素标记的标准物)富集在特异性抗肽抗体上，并在洗涤后洗脱；及4)在质谱仪中分析所富集的监测肽，从而确定测定的天然对同位素标记的肽的比例。该比例给出了原始分析蛋白质相对与加入的同位素标记标准物的数量。

在该实施方案中，注意由于优选以与等价天然肽(实条，图9中的系列1)相同浓度加入标记肽标准物(虚线条，图9中的系列2)；也就是，内标物以相同于所定量的监测肽的浓度而存在，那么白蛋白监测肽必须以1000倍C2监测肽的量及1000000倍甲状腺球蛋白的量加入(由于这三种蛋白质通常以该相对浓度存在)。当甲状腺球蛋白肽可检测时，1000000倍高浓度的白蛋白监测肽无疑是太过量了，并且加入对于甲状腺球蛋白监测肽所需量的1000000倍浪费了标记的白蛋白监测肽(该肽通常通过合成制成)。因此在该实施方案中(图9C)，制备了血浆肽消化液的三种子样品：一种未稀释的(加入其中的是所需量的甲状腺球蛋白标记监测肽，及组3丰度类型中的其他蛋白的监测肽：图9)，第二种稀释了大约1000倍(组2，在其中我们加入了大约同样数量的标记的补体C2监测肽)，第三种稀释了大约1000000倍(组1，在其中加入了白蛋白监测肽)。这样产生了稀释样品，其中检测较高量、中量及低量组蛋白质，从而需要较少的相应标记监测肽。在用抗体捕获和洗脱后，使肽恢复到近似相同的相对丰度回收(图9C)。

在实践中，组的数量(稀释组)依赖于标记肽需要保存的程度，可以大于三。在优选的实施例中，通过将监测肽根据样品中蛋白质的各种丰度的种类分组而实现该原则，将监测肽分为5个丰度组，每一组只含盖100倍范围的蛋白质丰度(其加起来在数量上跨越10,000,000,000倍)。使组中每一蛋白质的标记监测肽混合成其成分在彼此的100倍范围内的混合物(根据样品中蛋白质所期望的相对丰度设定相对丰度)。制备未稀释的等分和样品肽消化液的4个稀释液(每一个相对于后一个100倍)，在富集和分析步骤(上述4和5)之前将5种标记的监测肽混合物加到各稀释液中。这样该方法以操作5个分析物而不是一个分析物的成本而对于高丰度蛋白质只需要更少的监测肽。由于下述给出的原因，其与其他优化因素一致，无论用什么方法那都限制一个步骤中分析的肽的数量。

该实施方案的主要因素是根据样品中各靶蛋白的预期丰度将肽分成几组。使用所披露的发明从探索性研究(扫描一系列这样的稀释液以观察在那一组中可检测给定的监测肽)中，或从包括公开数据的其他定量测定获得所需的丰度信息。将所需的数据组织成数据库，与其他标准一起使用来选择最佳的监测肽组，通过复杂标准使用数据库系统的能力用来筛选、排列并分类硅肽中的成千上万种待测物。

在第四平行实施例中(图10)，基于肽的质量以如下方式将监测肽分成几组：一组中的肽不重叠。这样的一组标准示例如下所示：假设选作蛋白a监测肽的肽具有质量A(以原子质量单位(amu)或道尔顿)并为此示例单独带电(也就是以A的M/Z值检测)，并且相应的同位素标记监测肽A具有A+6的质量，并且可以假设两种肽在它们的谱上具有一系列质量类似物，比亲代质量上升扩展了5个质量单位(由于公知的各种稳定同位素的天然频率的结合)。因此，这些肽的肽峰值相对于天然肽(图10中的实条)在范围{A，A+1，A+2，A+3，A+4，A+5}上扩展，且相对于稳定同位素标准物(图10中的虚线条)在范围{A+6，A+7，A+8，A+9，A+10，A+11}上扩展，或者换句话说在A到A+11amu范围上。那么假设人们从具有质量A+12的另一蛋白质b选择监测肽B：该肽B的质量变化峰值将没有一个与肽A的质量变化峰值重叠。同样，人们选择理想间隔至少12amu的一系列监测肽。这样，50个肽的系列可设置在1000-1600的质量范围内。在实践中，可用于选择的肽将不会理想设置，并因此可能会结合不超过10个来跨越该理论测定范围而不发生重叠。这样，通过MS可一次对这10个蛋白质进行定量，该类是可同时测定的一组蛋白质。由于肽组将一次导入MS，需要MS可有效地以高运行循环扫描所需的质量范围。在所披露的检测方案中，这10个监测肽加到天然样品肽消化液中，且可一起用相应的10个抗体来富集这10个肽以进行分析。

该实施例的关键元素是基于不重叠质量选择相互协调的监测肽的组。

在第五平行实施例中，结合上述第三和第四实施方案。此处，我们选择同时满足下列情况的监测肽组：1)在样品中的亲代蛋白质丰度类中具有相似性，及2)不重叠的质量。这些标准可与披露于基础单一分析物实施方案中的其他标准结合(亲水性、适宜的大小、缺少某些氨基酸，等等)。将如此产生的这些类最优化以用于所披露的测定方法中。它们将可在一个MS操作中定量的蛋白质数量最大化，并使通常昂贵的稳定同位素标记的监测肽的耗费最小化。这些允许多个监测肽一次检测的策略可与自动化方法结合，以允许大量分析物常规检测。

其他实施方案

另外的一系列实施方案在可选择的方法中使用抗肽抗体。

其他实施例利用通过MS/MS技术获得的作为“从头”序列的试验观察的部分肽序列数据代替来源于现存数据库的序列用于监测肽的设计。

另一实施例(图11)对给定的监测肽分析物使用多个同位素标记肽，以一系列水平加入从而生成标准曲线。在该实施方案中，合成每种监测肽的两种或更多形式，其具有不同同位素质量。如果该肽序列含有例如3个组氨酸，该肽(IV1)的一种形式含有单一的同位素标记的HIS残基(6×碳-13；比天然的净重6道尔顿)，而第二种形式(IV2)含有两个，而第三种形式(IV3)含有全部三种重同位素形式的组氨酸。因此这三种修饰的肽比天然形式重6、12、18道尔顿。那么，人们可以在样品中加入的IV1的量等于1/5的天然形式的期望的量，IV2的量等于所期望的天然水平，IV3的量等于2倍的天然水平。这样监测肽的MS谱显示四个分离的解析形式，三个同位素标记形式给出了覆盖所期望值周围10倍范围的内标物曲线。以此方式，在每一样品中可相对于内标物曲线测定监测肽。显然，标记的氨基酸与适宜同位素标记的任何组合可结合以设计标记的在任何质量增加的范围上不同于天然肽并彼此不同的监测肽。

其他实施方案利用了监测肽中改造产生的特异性的特性，其设计为便于用氧-18标记监测肽。在此情况下(假设用胰蛋白酶作为分裂酶)，不用同位素标记的氨基酸合成监测肽的扩展形式，但在此形式中所加入的c-端残基开始于赖氨酸或精氨酸残基(例如，n端-MONITOR-lys-gly-ser-gly-cys-c端，如在第一优选实施方案中)。通过在存在氧-18的水溶液中用胰蛋白酶切割该肽，氧-18的两个原子(比天然的重4道尔顿)将被导入最终的监测肽。该方法的优点是只需要制造单一形式的监测肽：同样的扩展形式可用于免疫、抗体亲和纯化并作为MS内标物(在断裂及氧18导入后)，因而潜在地减少了成本。可构建其他类似的适于其他酶切割的构建体，如果它们断裂的机理适于同位素标记的导入。

另一实施方案利用了由标记天然肽(来源于参考样品的消化液)而不是化学合成(如上述第一优选实施方案所述)而制备的同位素标记监测肽。在该方法中，接下来进行分析的该种参考样品用同样的酶或试剂进行消化，其中该酶或试剂用于随后的样品(例如，胰蛋白酶)而产生肽。然后使这些肽与含同位素标记的化学衍生试剂反应。例如，该肽可与氘化碘乙酰胺反应，从而将一种标记导入所有含半胱氨酸的肽。或者，在用胰蛋白酶断裂前用氘化碘乙酰胺还原并烷基化样品蛋白。用未标记的碘乙酰胺还原并烷基化要分析的样品，以使得样品和标记的监测肽在化学上相同。将标记的监测肽混合物(基本上是参考样品的标记的消化液)通常以相同的比例加到试验样品的消化液中，并使产生的混合物用于对所选择监测肽的抗体富集。在该情况下，从靶蛋白质中的含半胱氨酸的肽中选择监测肽。产生的MS读数显示了监测肽(及从而的靶蛋白)在参考样品和试验样品之间的丰度比例。由于在该实施例中，通过监测肽的化学修饰导入标记物，优选通过用类似修饰的肽进行免疫接种而产生富集抗体：肽免疫原可以是含半胱氨酸的肽，其中用碘乙酰胺烷基化半胱氨酸。可用其他化学方式在各种氨基酸上导入其他标记，或特异性地导入n-端或c-端组。在每一种情况下，对试验样品肽进行同样的修饰(只要适宜，或者在消化前或者在消化后，但不具有同位素标记)并针相对适宜修饰的合成肽产生抗体。

或者，用噬菌体展示或其他体外技术选择针对监测肽的抗体。

进一步的实施方案利用多克隆抗体、噬菌体展示抗体(单链或Fab)，单功能区抗体、亲和体或其他化学一致性的蛋白质作为肽结合剂。

在另一可选择实施方案中，从母体蛋白质消化液而不通过化学合成制备免疫肽。

在另一可选择的实施方案中，免疫肽可在表达体系(如大肠杆菌、杆状病毒、酵母菌)或体外转译体系(如兔网织红细胞、麦芽或大肠杆菌溶菌产物)中作为融合蛋白合成，而不通过化学合成。如果需要，可在融合蛋白中产生所需的肽多个样板，可通过结合的亲和标记物(例如，FLAG肽或多组氨酸标记物)进行分离，并可在后来从融合蛋白上切割(例如，经胰蛋白酶)并通过液体层析或其他方法进行纯化。用类似的方法通过将标记的氨基酸整合到合成系统中而产生同位素标记的监测肽。

在另一可选择的实施方案中，富集监测肽(天然和同位素标记的)加到靶上用于在MALDI质谱仪中进行MS分析。

另一实施方案利用荧光检测代替了MS检测，并使用了共价荧光标记(例如与半胱氨酸反应的Cy3和Cy5染色标记)来标记样品肽和所加入的监测肽。在此情况下，针对连接染料的抗原产生抗肽抗体，并如下述方式选择该抗肽抗体：它们相对相等地结合该两种形式(例如，Cy3和Cy5)。直接对来自抗体的肽的洗脱液进行最终的荧光比例检测(如果该抗体具有足够的特异性来排斥所有的其他肽)，或者紧随另一分离步骤(例如，反相LC或毛细管电泳)，在该分离步骤中，Cy3和Cy5肽表现如果不相同，至少表现为可再生的及可解释的方式(以使得可以可靠预测两种形式的监测肽的洗脱位置用于测定)。

另一实施方案利用荧光检测，其中用标记物(例如，Cy5)标记合成的监测肽标准物，并且使样品消化液保持未标记。在该实施方案中，源于样品的监测肽与荧光标记的标准肽竞争结合相应的抗肽抗体。如此使用标准工作曲线，从结合到抗肽并随后从抗体洗脱的标记的标准肽的数量可推断源于样品的肽的浓度。在亲代蛋白的高样品浓度(在消化液中监测肽的浓度高)下较少的标记标准肽发生结合，并反之亦然。然后分离该荧光标记标准肽，并用毛细管电泳及特别是用于DNA测序的多通道装置(例如，ABI3700，Amersham MegaBACE)非常灵敏地进行检测。

实施例：

通过结合来自教科书、诊断分析目录及收集的科学文献的信息构建了在人血浆中通过各种方式检测的289种蛋白质的数据库。将这些蛋白质的氨基酸序列下载并以文本字段存储于微软Access数据库中。通过产生蛋白质水解酶片段列表的宏程序在Excel电子表格中处理每一个蛋白质序列。对每一肽序列计算一系列参数，包括长度、质量、在中性pH时的预期净电荷、总带电基团、Hopp-Woods亲水性(HWH)和标准化的HWH(HWH/氨基酸数量)，以及Cys、Trp、Pro和Met残基的数量。基于下面由Excel宏估计的要求进行可用的肽的第一次选择：长度＞7并＜14个残基，没有Cys、Met或Trp残基，标准HWH＞-0.5并＜0.5，且质量＞800。将结果(肽序列及所计算的参数)存储在数据库中。这样派生出总共10204种肽，其中751种符合起始的需要。

为证明原理试验，为四种蛋白质分析物中的每一种选择一种监测肽：TNF、IL-6、血红素蛋白和α-1-抗胰凝乳蛋白酶。当来自蛋白质的多种肽都适合起始要求时，对含有脯氨酸(由于期望该氨基酸增加免疫原性)的肽给出优先选择。对每一序列所产生的合成肽具有四个残基的伸长(GSGC或CGSG)，这使得经末端Cys残基与钥孔血蓝蛋白(KLH)载体结合。在TNFα肽的情况下，合成两种形式的监测肽：一种具有N-端延伸，另一种具有C-端延伸(所有其他的肽携带C-端延伸)。该肽序列(下划线为延伸)是：

IL-6 具有C端延伸 GSGC的残基83-94

血红素蛋白具有C端延伸 GSGC的残基92-102

α-1-抗胰凝乳蛋白酶具有C端延伸 GSGC的残基307-314

TNF-αC-端具有C端延伸 GSGC的残基66-78

每一种肽连接到白蛋白载体上，并根据短期免疫方案注射两只兔。通过ELISA试验使用固定在微孔盘上的肽监控抗体的产生。对每种肽，将来自两只兔抗血清中较好的那种的多克隆抗体(基于更高的ELISA信号显示更多或更高亲和性的抗体)在含硫醇的琼脂糖上以适当方向固定肽的柱上进行免疫亲和纯化。

将免疫纯化抗体以定向方式固定在POROS蛋白G树脂上(AppliedBiosystems)。一旦抗体通过蛋白A与抗体分子Fc部分的特异性相互作用而连接，则根据生产者的说明通过与邻苯二甲酸二甲酯(DMP)接触实现共价交联。洗涤该抗肽抗体POROS(APA-POROS)支持物并将其保存在4℃。

用压有1000psig氦的高压瓶将含有该支持物的毛细管微柱(1厘米×100微米)包在预制的装有玻璃料的毛细管(New Objectives)中。携带着针对上述试验的前四个肽的兔多克隆AB的支持物分别与四种各自标记的监测肽的混合物接触。洗涤该支持物并用10微升10％醋酸将结合肽洗脱到毛细管C18反相柱，其后通过在0.05甲酸中的0％-70％CAN梯度洗脱到Qtrap(Applied Biosystem)MS系统的ESI源。平均起来，抗体支持物显示对“正确”监测肽的100倍的富集。

Claims

1.一种用于定量样品中至少一种靶蛋白数量的方法，包括以下步骤：

1)将样品消化以提供肽，

2)制备至少一种经标记的含所述靶蛋白亚序列的监测肽从而提供内标物，

3)将含已知量的标记的合成肽的步骤2)产物的一等份加到步骤1)产物中去，

4)将步骤3)产物装载在至少一种支持物上，该支持物上连接有至少一种结合至少一种监测肽的结合剂，

5)洗涤步骤4)的支持物以除去未结合的肽，

6)从结合到支持物上的结合剂上洗脱监测肽，

7)将存在于步骤6)所得洗脱液中的至少一种监测肽进行质谱检测从而通过与标记的合成标准物比较而确定消化液中监测肽的数量。

2.如权利要求1的方法，其中标记物是稳定的同位素或其混合物。

3.如权利要求2的方法，其中同位素是¹⁵N。

4.如权利要求2的方法，其中同位素是¹³C。

5.如权利要求2的方法，其中同位素是¹⁸O。

6.如权利要求1的方法，其中在步骤4)中，结合剂是抗体。

7.如权利要求6的方法，其中该抗体是单克隆抗体。

8.如权利要求6的方法，其中该抗体是多克隆抗体。

9.如权利要求1的方法，其中在步骤4)中，结合剂是RNA适体。

10.如权利要求1的方法，其中结合剂是可再循环的结合剂。

11.如权利要求1的方法，其中固体支持物由珠子构成。

12.如权利要求1的方法，其中固体支持物是填充柱。

13.如权利要求1的方法，其中固体支持物是单片多孔支持物。

14.如权利要求1的方法，其中支持物具有至少一个开口，所述开口具有将结合剂结合在其上的表面。

15.如权利要求1的方法，其中结合剂结合在其上的支持物具有亲水可塑性。

16.如权利要求1的方法，其中支持物是网孔。

17.如权利要求1的方法，其中支持物是凝胶。

18.如权利要求1的方法，其中结合剂结合在其上的支持物具有疏水可塑性表面。

19.如权利要求1的方法，其中流路是可重构的流路。

20.如权利要求1的方法，其中可在步骤4)的装载和步骤6)的洗脱之间对流路进行调整，以使得每个支持物单独洗脱。

21.如权利要求1的方法，其中在步骤7)中，在导入质谱仪后使肽断裂。

22.如权利要求1的方法，其中在步骤7)中，肽不断裂，而该肽以它们导入质谱仪中的形式检测。

23.如权利要求1的方法，其中用不同的标记原子标记特定的合成的监测肽，以使得具有相同氨基酸序列的标记的监测肽在质量上有所不同。

24.如权利要求1的方法，其中在步骤2)制备至少两种不同的标记的监测肽，将标记的监测肽混合物加到步骤1)产物中，且其后在步骤4)将步骤3)产物装载于带有多种结合剂的支持物系统上，至少一种这样的结合剂优先结合特定的监测肽。

25.如权利要求24的方法，其中选择不同的监测肽以优化质谱仪的差示检测。

26.如权利要求1的方法，其中在步骤2)中制备至少两种不同的标记的监测肽，将标记的监测肽混合物加到步骤1)产物中，且其后在步骤4)将步骤3)产物顺序装载于支持物上，每一支持物具有优选与一种特定序列结合的结合剂，其后将每一支持物进行洗脱，且其后将每一洗脱样品分别导入质谱仪中。

27.一种用于从样品中捕获相似量的两种或更多种不同监测肽的方法，该样品含有宽泛变化浓度的不同监测肽，该方法包括以下步骤：

1)使样品蛋白质片段化，

2)产生标记的监测肽，

3)将步骤1)产物加到含有已知量的标记监测肽的步骤2)产物中，

4)制备至少一种支持物，该支持物具有至少一种结合样品中较丰富的肽的小部分的结合剂及至少一种结合样品中较少量肽的更高比例部分的结合剂，

5)将步骤3)产物装载于步骤4)所制备的支持物上，

6)洗涤步骤5)的支持物，然后

7)从该支持物上洗脱该肽从而获得监测肽，及

8)使步骤7)的洗脱物进行质谱检测。

28.一种用于从肽样品中收集一种以上监测肽的支持物系统，其中样品中的至少一种监测肽以比至少另一种监测肽大许多的浓度存在，所述支持物具有连接在其上的第一结合剂和第二结合剂，该第一结合剂施加到所述支持物上以只结合高浓度监测肽的小部分，而第二结合剂施加到所述支持物上以结合样品中低浓度的监测肽的较高比例部分。

29.如权利要求28的支持物，其中每种结合的监测肽比例量依赖于每种结合剂的量。

30.如权利要求28的支持物，其中每种结合的监测肽比例量依赖于每种结合剂的亲和性。

31.一种含有至少一种标记监测肽的试剂盒，其中该试剂盒进一步含有至少一种结合剂用于捕获至少一种监测肽。

32.一种测定样品蛋白水解消化过程的方法，包括以下步骤：

1)选择来源于样品中一种已知蛋白序列的至少两种监测肽，其中已知至少一种所述的监测肽相对于至少一种其他的监测肽在参考消化的时间过程中较早释放。

2)在消化过程中的一个或多个时间点测定所述监测肽的数量，及

3)用数学方法比较所述监测肽的相对量从而计算反映消化相对于所述参考消化的时间过程已进行程度的指数。

33.如权利要求32的方法，进一步包括使用所述指数来确定为推断样品中至少一种蛋白质的量的目的的样品消化的可接受性，其中所述推断基于对源自所述蛋白质序列的至少一种监测肽的测定。

34.如权利要求32的方法，进一步包括使用所述指数来校正所述消化液中至少一种监测肽的测定，从而估计如果该消化已进行至与在所述参考消化时间过程中的特定的点参考消化液的相同程度时所获得的测定。

35.一种确定样品中至少一种靶蛋白数量的方法，包括以下步骤：

1)将样品消化以提供肽，

2)制备至少一种经标记的含所述靶蛋白序列的合成监测肽从而提供内标物，

3)将含已知量的标记的监测肽的步骤2)产物的一等份加到步骤1)产物中，

4)将步骤3)产物装载在至少一种支持物上，该支持物在其上连接有至少一种结合至少一种监测肽的结合剂，

5)洗涤步骤4)的支持物以除去未结合的肽，

6)从结合于步骤4)的支持物上的结合剂上洗脱监测肽，

7)将步骤6)洗脱的监测肽装载于其上连接有至少一种结合剂的第二支持物上，该结合剂不同于步骤4)的结合剂并与至少一种监测肽结合，

8)洗涤步骤7)的支持物从而除去未结合的肽，

9)从结合于步骤7)中的支持物上的结合剂上洗脱监测肽，及

10)使步骤9)获得的洗脱液进行质谱检测从而通过与标记的合成标准物比较而确定在洗脱液中监测肽的数量。

36.一种表征样品中靶蛋白结构的方法，所述方法包括如下步骤：

1)使所述样品的一等份进行变性操作，

2)消化步骤1)产物，

3)消化所述样品的未经变性的第二等份，

4)制备至少一种经标记的含所述靶蛋白序列的合成监测肽从而提供内标物，

5)对步骤2)产物加入已知量的步骤4)产物，

6)对步骤3)产物加入相同的已知量的步骤4)产物，

7)将步骤5)和6)的每一种产物装载到分离的支持物上，所述支持物在其上连接有至少一种结合所述监测肽的结合剂，

8)洗涤步骤7)中制备的各种支持物，

9)从每种支持物上洗脱所述肽，

10)使步骤9)获得的每种洗脱液进行质谱检测，及

11)比较每种洗脱液中监测肽的数量。

37.如权利要求1的方法，其中在步骤2)中，监测肽是合成肽。

38.如权利要求1的方法，其中通过天然肽的化学修饰导入该标记物。

39.如权利要求38的方法，其中化学修饰将额外的原子结合到监测肽上。

40.如权利要求39的方法，其中选择结合剂来结合监测肽经化学修饰的结构。

41.如权利要求40的方法，其中将样品肽进行同样的化学修饰但不导入标记物。

42.如权利要求31的试剂盒，其另外含有支持物。

43.如权利要求42的试剂盒，其中结合剂连接于支持物上。