CN104237524B - 一种酶催化的n端标记的定量蛋白质组学方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于胰蛋白酶催化的N端稳定同位素编码的氨基酸标记的相对定量蛋白质组学方法。蛋白质在水相缓冲溶液中经过胰蛋白酶酶解冻干后，转移到含微量水的乙醇体系中，又在胰蛋白酶的催化下将稳定同位素编码的精氨酸连接到这些肽段的N末端。该酶促标记温和的反应条件以及高度区域专一性大大减少了肽段降解和副反应的发生。由于新的肽键也能在串联质谱中解离，所以新形成的其他碎片离子能大大提高的肽鉴定的准确度。通过应用于标准蛋白质以及复杂的蛋白质组学样品的标记，证明这种定量方法的可靠性和准确度。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质组学研究方向定量蛋白质组学技术领域，具体涉及一种酶促催化N端标记的相对定量蛋白组学技术和方法。
背景技术
蛋白质组学研究的核心内容是蛋白质的动态变化和动态行为，即蛋白质的动态表达、动态定位、动态修饰和动态相互作用等，最终的研究目的是以大规模的尺度研究细胞内蛋白质的功能，这种研究要走向成熟必然要脱离对蛋白质的简单鉴定，实现对蛋白质的表达水平及其存在形式变化的检测。因此，定量技术应该说是整个蛋白质组学的精华部分。而这种定量通常不必是检测蛋白质在细胞内的绝对含量，而只需对其相对含量进行定量即可。
蛋白质组学研究的最终目标不仅是为了鉴定一个完整的细胞，组织或生物系统的蛋白质，同时也要定量这些蛋白质以及他们的翻译后修饰（PTM）。稳定同位素标记定量蛋白质组学是一个最重要的方法，已经有许多巧妙的标记策略被介绍（文献1.Ong,S.E.&Mann,M.Massspectrometry-basedproteomicsturnsquantitative.Nat.Chem.Biol.1,252-262(2005).文献2.Yao,X.Derivatizationornot:achoiceinquantitativeproteomics.Anal.Chem.83,4427-4439(2011).）。稳定同位素标签可以通过化学修饰的方法引入到蛋白质或肽段的末端或侧链。例如，巯基反应的标签，ICATs（同位素编码的亲和标签，文献3.Gygi,S.P.etal.Quantitativeanalysisofcomplexproteinmixturesusingisotope-codedaffinitytags.Nat.Biotechnol.17,994-999(1999).），只标记含有半胱氨酸残基的蛋白质；氨基反应活性试剂，稳定同位素二甲基（文献4.Hsu,J.L.,Huang,S.Y.,Chow,N.H.&Chen,S.H.Stable-isotopedimethyllabelingforquantitativeproteomics.Anal.Chem.75,6843-6852(2003).文献5.Song,C.etal.Improvementofthequantificationaccuracyandthroughputforphosphoproteomeanalysisbyapseudotriplexstableisotopedimethyllabelingapproach.Anal.Chem.83,7755-7762(2011).）和iTRAQ（文献6.Ross,P.L.etal.Multiplexedproteinquantitationinsaccharomycescerevisiaeusingamine-reactiveisobarictaggingreagents.Mol.Cell.Proteomics3,1154-1169(2004).）用来标记多肽N末端和赖氨酸残基。化学标记方法经济，使用广泛，但化学标签的引入会改变肽段的性质及其质谱碎裂行为，从而干扰肽段的鉴定和蛋白质的定量。另外这些标记反应大多不是在生理条件下进行，副反应的发生将大大增加蛋白质组分析的复杂性。此外，这些方法可能不完全兼容一些翻译后修饰蛋白质的定量。例如，氨基反应活性试剂的使用可能会使它难以识别和量化赖氨酸残基的翻译后修饰，因为这些标记试剂也标记的赖氨酸侧链。因此，发展低副反应和高特异性的稳定同位素标记策略是非常有必要的。
体内标记的方法，例如SILAC（文献7.Ong,S.E.etal.Stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture,SILAC,asasimpleandaccurateapproachtoexpressionproteomics.Mol.Cell.Proteomics1,376-386(2002).），它将含有稳定同位素的氨基酸引入到活细胞中。稳定同位素标记是发生在样品制备，消化和分析之前，从而定量的准确性不会被这些步骤影响。此外，避免了化学反应处理的情况下对肽段和蛋白质的定量的影响。这种方法的另一个显着优点是，由于是活细胞的酶催化反应，特异性高，没有副反应的发生。这些提示我们，酶促催化的方法可以克服化学标记方法遇到的问题。但到目前为止，只有一种此类的酶的方法，称为蛋白质水解标记。在该方法中，稳定同位素的引入是通过蛋白质在H2 18O中水解实现的，将一个或两个氧原子引入肽段的C-末端羧基上，从而形成2Da或4Da的质量的差别（文献8.Mirgorodskaya,O.A.etal.Quantitationofpeptidesandproteinsbymatrix-assistedlaserdesorption/ionizationmassspectrometryusing18O-labeledinternalstandards.RapidCommun.MassSpectrom.14,1226-1232(2000).文献9.Yao,X.,Freas,A.,Ramirez,J.,Demirev,P.A.&Fenselau,C.Proteolytic18Olabelingforcomparativeproteomics:modelstudieswithtwoserotypesofadenovirus.Anal.Chem.73,2836-2842(2001).）。该反应具有高度的特异性，而且不引入其他化学标签，但以下缺点阻碍了它在定量蛋白质组学的广泛应用：有一个或两个羧基氧原子可以被交换，导致定量的差异；较小的质量偏差可能会导致定量的误差，特别是在使用低分辨率质谱仪时。更糟的是，18O标签会随时间延长产生回交现象，从而导致定量误差（文献10.Sevinsky,J.R.,Brown,K.J.,Cargile,B.J.,Bundy,J.L.&Stephenson,J.L.Minimizingbackexchangein18O/16Oquantitativeproteomicsexperimentsbyincorporationofimmobilizedtrypsinintotheinitialdigestionstep.Anal.Chem.79,2158-2162(2007).）。
发明内容
本发明目的在于提供一种准确，可靠，操作简单，特异性只标记肽段N端并能适用于复杂蛋白质组学样品的胰蛋白酶催化N端标记的相对定量蛋白质组学方法。
本发明提出的胰蛋白酶催化N端标记的定量蛋白质组学方法，在生物体外，利用胰蛋白酶的催化作用，将轻重稳定同位素标记的氨基酸标签连接到肽段的N端，应用于相对定量蛋白质组学。
所述的酶催化的N端标记的定量蛋白质组学方法中所用的胰蛋白酶为固定化的胰蛋白酶。
所述的酶催化的N端标记的定量蛋白质组学方法中所用的稳定同位素标记的氨基酸标签分别为12C6-L-arginine和13C6-L-arginine的衍生物Bz-R-OEt和Bz-(13C6)R-OEt，化学式如下，
所述的酶促催化的反应体系是含有4%（v/v）0.1MTris-HCl缓冲溶液（pH8.0）的乙醇溶液。
所述的酶催化的N端标记的定量蛋白质组学方法可按如下步骤进行，轻重稳定同位素标签Bz-R-OEt和Bz-(13C6)R-OEt（终浓度为32mM）和胰蛋白酶酶解肽段（200μg）溶解分散在50μl含有4%（v/v）0.1MTris-HCl缓冲溶液（pH8.0）的乙醇溶液中，然后加入1mg的磁性纳米材料固定化的胰蛋白酶（含有50μg胰蛋白酶），接着将此混合物在30℃下振荡孵育10小时，通过磁力除去固定化胰蛋白酶后，将轻重不同标记的肽段1:1混合然后冻干，复溶在0.1%（v/v）甲酸中进行RPLC-MS/MS分析，最后经过数据库搜索得到定量结果。
所述的酶催化的N端标记的定量蛋白质组学方法所用的被标记的反应物是经胰蛋白酶酶解后的肽段。
所述的酶催化的N端标记的定量蛋白质组学，所采用的数据库是以肽为中心的数据库（即Peptide-Centricdatabase，PC-DB），它是由InternationalProteinIndexdatabase（IPI-DB）数据库生成的，首先将IPI-DB中所有蛋白质序列用胰蛋白酶进行理论酶切，生成一类理论酶解肽段，然后在这些肽段的N端都连接上一个精氨酸，形成新的一类标记后的肽段，最后，将这两类的每一个肽段作为一个单独的FASTA条目生成新的PC-DB数据库。
所述的酶催化的N端标记的定量蛋白质组学方法，其特征在于：所述的酶催化的N端标记方法可以用于蛋白质组差异分析（如肝癌和正常肝组织的蛋白质组）以及肽段的从头测序分析。
本发明的优点：
该酶促标记反应条件温和，具有高度区域专一性，大大减少了肽段降解和副反应的发生；胰蛋白酶作为水解酶通常用来酶解蛋白质，但在本发明中被用来作为连接酶，催化稳定同位素编码的精氨酸连接到胰蛋白酶酶解后的肽段的N末端，由于标记反应只发生在肽段的N末端，所以不会对翻译后修饰的定量产生影响；与一般的标记方法不同的是本标记反应后形成新的肽键，而且每个肽段只在N端标记上一个含同位素的氨基酸，由于新的肽键也能在串联质谱中解离，所以新形成的其他碎片离子能大大提高的肽鉴定的准确度；利用本发明进行从头测序分析时，可以提取并形成b和y两类系列的离子，可以分别并相互补充的对肽序列进行分析和鉴定。
附图说明
下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1为所述酶促稳定同位素标记的定量方法流程图。两组相同或不同蛋白质组样品首先在水相缓冲液里，经过胰蛋白酶酶解后，得到一系列胰蛋白酶酶解肽段。然后将这些肽段转移到含微量水的乙醇缓冲溶液里，同样在胰蛋白酶的催化下，分别将Bz-R（轻标）和Bz-(13C6)R（重标）引入到肽段的N-端。然后轻重标记的肽段以1:1的比例混合，最后经过质谱扫描，用定量软件搜库得到蛋白质的定量信息。
图2为标准肽段在胰蛋白酶的催化下的标记情况，首先在有底物但没有加入酶的情况下，我们没有发现有任何标记后的肽段，然后在有轻重标签底物存在，而且又加入胰蛋白酶后，可以很明显看到标记后的肽段峰，反应比较完全，没有其他杂峰。相比没有标记之前，轻重标记后肽段质荷比分别增加260Da和266Da。
图3为对复杂样品进行酶促轻重标记后，等量混合定量结果。鼠肝蛋白经胰蛋白酶酶解，然后将得到的肽段分成等量的两份后，经过胰蛋白酶催化进行轻重标记，最后进行质谱定量分析。图3a，b是两个平行实验定量到的蛋白的log2ratio(H/L)分布图，图3c是两次实验共同定量到的蛋白的且ratio值变化<50%的log2ratio(H/L)分布图。虚线分别表示log2ratio(H/L)的值为-1和1。
图4为人类肝癌组织（HCC）与正常肝组织差异蛋白的定量结果，图4a为两次平行实验的定量结果的重复性，图4b为两次实验共同定量到的蛋白的且ratio值变化<50%的log2ratio(H/L)分布图。
图5为利用此酶促催化标记方法分别获取一系列离子，从而有利于denovo分析。图5a为其中一个肽段，通过选取6Da的离子提取窗口，用HCD碎裂得到的MS/MS谱图，图5b和5c分别是从图5a提取出来的b和y-系列离子组成的图谱，可以直接用来做肽段的从头测序分析。
具体实施方式
磁性纳米材料固定化的胰蛋白酶的具体制备过程如下：350mgFe3O4磁性纳米粒子用乙醇洗涤两次，然后分散在160ml乙醇中并用超声处理30分钟，接着加入1ml25%（v/v）的浓氨水，40ml水和1ml正硅酸乙酯，此混合物在室温下搅拌6h。所得到的磁性Fe3O4SiO2核-壳纳米颗粒，在超声辅助的情况下用50ml乙醇冲洗三次，然后分散在60ml异丙醇里，并加入1ml氨基丙基三乙氧基硅烷（APTEOS），此混合溶液经过24小时的机械搅拌后得到氨基修饰的Fe3O4SiO2纳米颗粒，分别用异丙醇（3×50ml）和二氯甲烷（3×50ml）洗涤，然后再分散在50ml无水二氯甲烷中。
将上述混合液和0.711ml重蒸的三乙胺在烧瓶中混合，然后在氩气气氛保护下用冰浴冷却。待溶液冷却到0℃后，滴加0.528ml2-溴异丁酰溴，将得到的溶液在0℃搅拌2小时，然后在室温下搅拌16小时，得到的材料（记为Fe3O4SiO2-Br）依次用二氯甲烷（3×20ml），乙醇（3×50ml）和水（3×50ml）洗涤，最后在50℃真空烘箱中过夜。
126mgFe3O4SiO2-Br纳米颗粒，3.26ml甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA），5.39ml甲醇和1.34ml水依次添加到一个装有机械搅拌棒的真空管里。将真空管浸入到冰盐浴中，然后反复通氩气抽真空三次。最后把瓶子充满氩气。接着快速加入99mg氯化亚铜，11.2mg氯化铜和312mg2,2’-联吡啶，紧接着反复通氩气抽真空两次，然后在室温下搅拌8小时，最后通过通入空气和加入水来终止聚合反应。所得到的材料（记为Fe3O4SiO2PGMA纳米粒子）用水，甲醇和乙腈进行彻底冲洗。将50mgFe3O4SiO2PGMA纳米粒子和10ml己二胺在60℃下反应过夜，得到氨基修饰的纳米粒子（Fe3O4SiO2PGMA-NH2），并用清水彻底洗净。
把15mgFe3O4SiO2PGMA-NH2纳米粒子加入到2ml含5%（v/v）戊二醛的PBS缓冲液中，室温下振荡2小时。将活化好的纳米粒子加入到1ml含5mg胰蛋白酶和1%（wt/v）氰基硼氢化钠（NaBH3CN）的PBS缓冲液中，混合溶液在4℃下轻轻振荡孵育12小时。然后除去未反应的胰蛋白酶溶液，将纳米粒子在4℃下和1ml含有0.75%（wt/v）甘氨酸和1%（wt/v）NaBH3CN的PBS缓冲液孵育1小时，最终产品用PBS缓冲液洗涤三次后储存在含有0.02%（wt/wt）叠氮化钠的PBS缓冲液中。
实施例1
标准肽段的标记:各取200μg标准肽段VIFIEHAKRKG分别与终浓度为32mM轻重标签Bz-R-OEt和Bz-(13C6)R-OEt溶解在50μl含有4%（v/v）的0.1MTris-HCl（pH8.0）缓冲液的乙醇溶液中。然后分别加入1mg的磁性纳米材料固定化的胰蛋白酶（含有50μg胰蛋白酶），接着将此混合物在30℃下振荡孵育6小时左右。用磁铁除去固定化胰蛋白酶后，将标记后的肽段冻干，最后将1μg冻干后的肽段复溶在65μl0.1%（v/v）甲酸中，取0.5μl进行MALDI-TOFMS分析。
如图2所示，在没有胰蛋白酶加入的条件下，只检测到原始的肽段，没有检测到有标记的肽段。但当加入固定化胰蛋白酶后，可以看到质荷比分别增加260和266Da的轻重不同标记后的肽段。通过分析比较可以发现一个肽段只引入一个精氨酸标签，而又由于标准肽段的两个赖氨酸残基上的伯胺基团具有相同的化学活性，所以精氨酸标签必然是只是被引入到肽段的N末端，这与其他的氨基反应的标记方法明显不同。胰蛋白酶通常是作为一种蛋白水解酶，虽然标肽含有三个胰蛋白酶的酶切位点，但通过比较图谱发现，并没有检测到肽段的酶解产物，这表明，在此条件下，胰蛋白酶的水解活性很低。这种酶标记方法，标记后的产物中除了目标肽段外并没有其它副产物，这对改善定量的准确性是有一定益处。
实施例2
复杂样品鼠肝蛋白定量标记：两份各100μg胰蛋白酶酶解后的鼠肝肽段分别和轻重稳定同位素标签Bz-R-OEt和Bz-(13C6)R-OEt（32mM）溶解在50μl含有4%（v/v）0.1MTris/HCl缓冲液（pH8.0）的乙醇溶液中，然后加入1mg的磁性纳米材料固定化的胰蛋白酶（含有50μg胰蛋白酶），接着将此混合物在30℃下振荡孵育10小时左右。通过磁力除去固定化胰蛋白酶后，将轻重不同标记的肽段1:1（重量比）混合然后冻干，最后将1μg冻干后的肽段复溶在20μl0.1%（v/v）甲酸中。采用在线的SCX-RP二维LC-MS/MSLTQOrbitrap系统进行质谱分析。经过100，200，400，500和1000mM共5个醋酸铵盐梯度洗脱，并用上述系统分析，最后使用一种以肽为中心的数据库（Peptide-Centricdatabase，即PC-DB）搜索得到定量结果。我们在两个平行的实验中分别定量到823和850个蛋白质，定量结果（ratio=H/L）平均值分别为1.04±0.25和0.93±0.19，这和理论值非常接近（图3a，b），其中有740个（约90%）蛋白在两次标记实验中都能被定量到。
在定量蛋白质组学研究中，通常把定量结果变化在两倍以上的（即log2ratio＞1和＜–1）当作显著的变化，所以当等量相同样品轻重标记后得到的log2ratio值在–1到1之间的比例越高，这个定量方法的精密度就越高，目前对于无标定量（label-free），代谢标记（metabolicLabeling）和两种等重标签标记（iTRAQ和TMT）来说，这个比例分别为85.5%，93.5%，98.5%和99.5%，而在本发明的这两次实验中这个比例分别为97%和98%，因此可以说明本发明可以和其他的化学标记相比，而且优于无标定量和代谢标记定量。另外一方面，本发明的两次重复标记实验中共同定量到的蛋白的定量结果变化小于50%和30%的比例分别是97%和92%，这也高于iTRAQ定量结果（两次定量结果变化小于50%的比例是89%）。通常可以利用两次定量结果变化50%这个阈值来滤掉不可靠的定量数据，在本发明的两次重复实验的定量结果中各有28和14个蛋白的log2ratio值在–1到1之外（图3a，b），但是取定量结果变化阈值<50%后，只有一个蛋白的log2ratio值在–1到1之外（图3c）。
实施例3
人类肝癌组织（HCC）和正常肝组织差异蛋白的定量分析：人类肝癌组织和正常肝组织经过相同方法提取蛋白后，再经过相同的酶解手段得到胰蛋白酶酶解的肽段，分别取等量的肽段（各100μg）并分别进行轻重酶促标记，即两份各100μg肝癌和正常肝组织胰蛋白酶酶解肽段分别和轻重稳定同位素标签Bz-R-OEt和Bz-(13C6)R-OEt（32mM）溶解在50μl含有4%（v/v）0.1MTris/HCl缓冲液（pH8.0）的乙醇溶液中，然后各加入1mg的磁性纳米材料固定化的胰蛋白酶（含有50μg胰蛋白酶），接着将此混合物在30℃下振荡孵育10小时左右。通过磁力除去固定化胰蛋白酶后，将轻重不同标记的肽段1:1（重量比）混合然后冻干，最后复溶在0.1%（v/v）甲酸中。然后取2μg样品经在线的LC-MS/MSLTQOrbitrap系统进行质谱分析。经过100，200，400，500和1000mM共5个醋酸铵盐梯度洗脱，并用反相色谱-质谱联用分析，最后使用一种以肽为中心的数据库（Peptide-Centricdatabase，即PC-DB）搜索得到定量结果。我们在两个平行的实验中分别定量到1246和1248个蛋白质，其中两次实验共同定量到828个蛋白质，两次实验的定量结果有较高的相关性，表明本发明的定量方法有比较好的重现性（图4a）。其中两次定量结果变化<50%的共有699个蛋白质（图4b），共有250个蛋白质表现出下调，91个蛋白表现出上调，而且许多蛋白的定量结果和以前的研究一致。在尿素代谢途径中，与之相关的四类酶，即鸟氨酸氨甲酰转移酶（0.4倍），精氨琥珀酸合成酶（0.6倍），精氨琥珀酸裂解酶（0.8倍）和精氨酸酶（0.3倍）被发现具有显着的下调趋势，而在其它的定量蛋白质组学也观察到同样的趋势。表明本发明的定量结果具有较高的可信性。
实施例4
酶促N端标记应用于肽段的从头测序（denovo）分析：200μg鼠肝蛋白经胰蛋白酶酶解后，分成相同的两份，然后分别在胰蛋白酶催化下用轻重精氨酸标记，标记后1:1（重量比）混合。取1μg混合后的样品，用LC-MS/MS联用进行分析，质谱采用LTQOrbitrap的HCD碎裂模式。为了确保轻重标记后的肽段能同时在HCD碎裂，母离子的提取窗口选为8m/z。由于本发明的酶促标记方法只在肽段的N末端进行标记，所以只有含有N端的碎片离子（b-ions）能形成成对的峰，从而将肽段碎裂产生的两种系列离子（b-和y-ions）得以区分。图5a是一个典型的轻重标记后的肽段一起碎裂的MS/MS图谱，可以发现相差6.0201Da的成对的峰。把这些成对的离子提取出来，并只保留轻标的离子，然后就得到一系列b-ions的简单易读的图谱（图5b），然后剩下的y-ions谱图也比较简单易读（图5c），从而b和y离子都可以用来做denovo分析。y和b-ions图谱相互补充，可以得到更多更全的肽段序列信息。其他方法也可以直接产生类似的一系列同类型的离子，然而这些方法只产生单一的一种类型离子系列。而本发明的酶促的N端同位素标记法可以同时生成两种类型的单离子系列的图谱，可用于一起从头序列，和其他方法相比这是的一个明显的优势。
本发明为一种基于胰蛋白酶催化的N端稳定同位素编码的氨基酸标记的相对定量蛋白质组学方法。蛋白质在水相缓冲溶液中经过胰蛋白酶酶解冻干后，转移到含微量水溶液的乙醇体系中，又在胰蛋白酶的催化下将稳定同位素编码的精氨酸连接到这些肽段的N末端。该酶促标记温和的反应条件以及高度区域专一性大大减少了肽段降解和副反应的发生。与一般的标记方法不同的是酶促标记后，标记分子和肽段之间形成的是新的肽键，而且只在每个肽段的N端标记上一个含同位素的氨基酸。由于新的肽键也能在串联质谱中解离，所以新形成的其他碎片离子能大大提高的肽鉴定的准确度。通过应用于标准蛋白质以及复杂的蛋白质组学样品的标记，证明这种定量方法的可靠性和准确度，将这种酶促标记的方法应用于肝癌和正常的肝组织中的蛋白质差异分析，高度可靠的定量到726种有显著差异的蛋白质，另外一方面，通过酶催化的N端稳定同位素标记，可以实现并简化肽段的从头测序分析。这种酶促标记反应为蛋白质组学的研究和发展，提供了一个新的方法和技术平台。
Claims (7)
1.一种酶催化的N端标记的定量蛋白质组学方法，其特征在于：利用胰蛋白酶的催化作用，将轻重稳定同位素标记的氨基酸标签分别连接到胰蛋白酶酶解后的肽段的N端，经液质联用分析后，进行蛋白质组学相对定量研究。
2.根据权利要求1所述的酶催化的N端标记的定量蛋白质组学方法，其特征在于：所述胰蛋白酶的催化作用为固定化的胰蛋白酶的催化作用。
3.根据权利要求1所述的酶催化的N端标记的定量蛋白质组学方法，其特征在于：所用的轻重稳定同位素标记的氨基酸标签分别为12C6-L-arginine和13C6-L-arginine的衍生物Bz-R-OEt和Bz-(13C6)R-OEt，化学式如下，
4.根据权利要求1所述的酶催化的N端标记的定量蛋白质组学方法，其特征在于：胰蛋白酶的酶促催化的反应体系是含有4％(v/v)0.1MpH8.0Tris-HCl缓冲溶液的乙醇溶液。
5.根据权利要求1-4任一所述的酶催化的N端标记的定量蛋白质组学方法，其特征在于：按如下步骤进行，终浓度32-64mM的轻重稳定同位素标签Bz-Arg-OEt和Bz-(13C6)Arg-OEt分别和100-200μg胰蛋白酶酶解肽段溶解分散在50-100μl含有4％(v/v)0.1MpH8.0Tris-HCl缓冲溶液的乙醇溶液中，然后加入1-2mg的含有50-100μg胰蛋白酶的磁性纳米材料固定化的胰蛋白酶，接着将此混合物在30℃下振荡孵育8-10小时，通过磁力除去固定化胰蛋白酶后，将轻重不同标记的肽段按质量比1:1混合然后冻干，将1μg冻干后的肽段复溶在20μl0.1％(v/v)甲酸中进行RPLC-MS/MS分析，最后使用一个以肽为中心的数据库Peptide-Centricdatabase进行搜索得到定量结果。
6.根据权利要求1所述的酶催化的N端标记的定量蛋白质组学方法，其特征在于：获取的相对定量结果可以用于蛋白质组差异分析或肽段的从头测序分析。
7.根据权利要求1所述的酶催化的N端标记的定量蛋白质组学方法，其特征在于：
所述胰蛋白酶酶解后的肽段是指蛋白质在含有1-2M尿素和50-100mMpH8.0的Tris-HCl的水相缓冲溶液中经过胰蛋白酶酶解后的产物。
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