CN112505328B - 一种同位素标记试剂盒和标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同位素标记试剂盒和标记方法，所述试剂盒包括：iTRAQ标记试剂、TEAB、异丙醇和待标记肽段；所述TEAB和异丙醇的体积比为2：(3.4～3.8)，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/(61～63)uL，所述待标记肽段与所述iTRAQ标记试剂的质量体积比为(50～80)ug：(5～7)uL。所述标记方法为：将所述试剂盒的标记体系于室温下反应2.8～3.2h，获得同位素标记的肽段。本发明标记效率高且iTRAQ标记试剂用量少，减少标记试剂用量节约成本的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种同位素标记试剂盒和标记方法。
背景技术
近年来，蛋白质组学技术发展日新月异。尽管如此，研究蛋白质组学的技术方法却大同小异。大致上可分为label free、TMT/iTRQA体外标记、SILAC体内标记等其他技术方法。相较于label free和SILAC技术的局限性，TMT/iTRQA体外标记技术更被研究者们所青睐。但是由于标记试剂的成本较高，致使标记蛋白质组学价格居高不下，严重制约了蛋白质组学技术的推广和应用。
市场上的iTRAQ标记试剂存在较低用量时标记效率不是很高的问题，若想达到较高的标记效率需要使用较多用量的iTRAQ标记试剂。
因此，如何开发一种标记效率高且iTRAQ标记试剂用量少的同位素标记试剂盒和标记方法，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明目的是提供一种同位素标记试剂盒和标记方法，标记效率高且iTRAQ标记试剂用量少。
为了实现上述目的，本发明提供了一种同位素标记试剂盒，所述试剂盒包括：iTRAQ标记试剂、TEAB、异丙醇和待标记肽段；所述TEAB和异丙醇的体积比为2：(3.4～3.8)，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/(61～63)uL，所述待标记肽段与所述iTRAQ标记试剂的质量体积比为(50～80)ug：(5～7)uL。
进一步地，所述TEAB和异丙醇的体积比为2：3.6。
进一步地，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/62uL。
进一步地，所述待标记肽段与所述iTRAQ标记试剂的质量体积比为70ug：(5～7)uL。
本发明还提供了一种同位素标记方法，所述方法包括：
获得肽段；
将所述肽段溶解于TEAB中，离心取上清，获得复溶肽段，向所述复溶肽段中加入异丙醇、iTRAQ标记试剂混匀，获得标记体系；其中，所述TEAB和所述异丙醇的体积比为2：(3.4～3.8)，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/(61～63)uL，所述待标记肽段与所述iTRAQ标记试剂的质量体积比为(50～80)ug：(5～7)uL；
将所述标记体系于室温下反应2.8～3.2h，获得同位素标记的肽段。
进一步地，所述获得肽段包括：对样本蛋白进行提取，后酶解，用C18除盐后，获得所述肽段。
进一步地，所述离心的转速为11000～13000g，离心时间为3～7min。
进一步地，所述向所述复溶肽段中加入异丙醇、iTRAQ标记试剂混匀中，采用涡旋振荡的方式。
进一步地，所述反应时间为3h。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种同位素标记试剂盒和标记方法，采用合适的标记反应体系：TEAB和异丙醇的体积比为2：(3.4～3.8)，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/(61～63)uL，所述待标记肽段与所述iTRAQ标记试剂的质量体积比为(50～80)ug：(5～7)uL；标记反应时间2.8～3.2h，可使得标记效率高且iTRAQ标记试剂用量少。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例1提供的一种同位素标记方法的流程图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种同位素标记试剂盒，所述试剂盒包括：iTRAQ标记试剂、TEAB、异丙醇和待标记肽段；所述TEAB和异丙醇的体积比为2：(3.4～3.8)，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/(61～63)uL，所述待标记肽段与所述iTRAQ标记试剂的质量体积比为(50～80)ug：(5～7)uL。
iTRAQ标记试剂的标记原理是标记试剂与肽段游离的氨基或者肽段的N末端反应，从而使肽段带上相应的标签。现有技术中采用iTRAQ标记试剂标记存在在较低用量时标记效率不是很高的问题。
本发明人通过创新性实验探索发现采用iTRAQ标记试剂、TEAB、异丙醇和待标记肽段组成的反应体系；且满足如下条件：所述TEAB和异丙醇的体积比为2：(3.4～3.8)，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/(61～63)uL，所述待标记肽段与所述iTRAQ标记试剂的质量体积比为(50～80)ug：(5～7)uL。最终可使得标记效率高且iTRAQ标记试剂用量少。标记(50～80)ug的肽段只需要(5～7)uL的iTRAQ标记试剂即可。
作为本发明的可选方式，可将试剂盒中一份的试剂可做成多个小样，每个小样中iTRAQ标记试剂、TEAB、异丙醇和待标记肽段的条件满足上述条件。
作为优选的实施方式，所述TEAB和异丙醇的体积比为2：3.6。
作为优选的实施方式，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/62uL。
作为优选的实施方式，所述待标记肽段与所述iTRAQ标记试剂的质量体积比为70ug：(5～7)uL。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供一种同位素标记方法，所述方法包括：
S1、获得肽段；
S2、将所述肽段溶解于TEAB中，离心取上清，获得复溶肽段，向所述复溶肽段中加入异丙醇、iTRAQ标记试剂混匀，获得标记体系；其中，所述TEAB和所述异丙醇的体积比为2：(3.4～3.8)，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/(61～63)uL，所述待标记肽段与所述iTRAQ标记试剂的质量体积比为(50～80)ug：(5～7)uL；
S3、将所述标记体系于室温下反应2.8～3.2h，获得同位素标记的肽段。
在该实施方式中，采用iTRAQ标记试剂、TEAB、异丙醇和待标记肽段组成的反应体系，且控制标记反应时间为2.8～3.2h，能够最大限度地提高标记效率高且减少iTRAQ标记试剂用量。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的同位素标记试剂盒和标记方法的制备方法进行详细说明。本发明实施例和对比例涉及到的实验材料iTRAQ标记试剂购于AB SCEIX公司。
实施例1
本发明实施例提供了一种同位素标记试剂盒，所述试剂盒包括：iTRAQ标记试剂、TEAB、异丙醇和待标记肽段；所述TEAB和异丙醇的体积比为2：3.6，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/(61～63)uL，所述待标记肽段与所述iTRAQ标记试剂的质量体积比为70ug：6uL。
本发明实施例还提供了一种同位素标记方法，所述方法包括：
S1、获得肽段；具体为：用293t细胞作为实验样本，采用常规的蛋白提取方法提取样本的总蛋白，并酶解成肽段，用C18除盐；肽段定量：用BCA法进行肽段定量；
S2、将所述肽段溶解于TEAB中，离心取上清，获得复溶肽段，向所述复溶肽段中加入异丙醇、iTRAQ标记试剂混匀，获得标记体系；具体地：
a、标记肽段溶解：按定量结果取70ug酶解后的肽段冻干，后加入20uL 0.5M TEAB(三乙胺硼烷)复溶，12000g离心5min取上清；
b、构建标记体系：向复溶的肽段中加入36uL异丙醇，涡旋振荡，混合均匀；
c、标记试剂溶解：向混合体系中加入6uL标记试剂，涡旋振荡；
S3、将所述标记体系于室温下反应3h，获得同位素标记的肽段。具体可采用旋转摇床孵育；
标记效率检测：取5uL，加入3倍体积水终止标记反应，用Zip-Tip除盐；质谱检测标记效率，待标记效率合格后继续后续实验。
HPLC分级：将标记合格的样本混合，HPLC(液相色谱)分级，合并成15个组份；质谱上机。
实施例2
本发明实施例2中所述TEAB和异丙醇的体积比为2：3.4，所述待标记肽段的使用终浓度为50ug/61uL，所述待标记肽段与所述iTRAQ标记试剂的质量体积比为50ug：7uL。其余均同实施例1。
本发明实施例还提供了一种同位素标记方法，所述方法包括：
S1、获得肽段；具体为：用293t细胞作为实验样本，采用常规的蛋白提取方法提取样本的总蛋白，并酶解成肽段，用C18除盐；肽段定量：用BCA法进行肽段定量；
S2、将所述肽段溶解于TEAB中，离心取上清，获得复溶肽段，向所述复溶肽段中加入异丙醇、iTRAQ标记试剂混匀，获得标记体系；具体地：
b、标记肽段溶解：按定量结果取50ug酶解后的肽段冻干，后加入20uL 0.5M TEAB(三乙胺硼烷)复溶，12000g离心5min取上清；
b、构建标记体系：向复溶的肽段中加入34uL异丙醇，涡旋振荡，混合均匀；
c、标记试剂溶解：向混合体系中加入7uL标记试剂，涡旋振荡；
S3、将所述标记体系于室温下反应3.2h，获得同位素标记的肽段。具体可采用旋转摇床孵育。
标记效率检测：取5uL，加入3倍体积水终止标记反应，用Zip-Tip除盐；质谱检测标记效率，待标记效率合格后继续后续实验。
HPLC分级：将标记合格的样本混合，HPLC(液相色谱)分级，合并成15个组份；质谱上机。
实施例3
本发明实施例3中所述TEAB和异丙醇的体积比为2：3.8，所述待标记肽段的使用终浓度为80ug/63uL，所述待标记肽段与所述iTRAQ标记试剂的质量体积比为80ug：5uL。其余均同实施例1。
本发明实施例还提供了一种同位素标记方法，所述方法包括：
S1、获得肽段；具体为：用293t细胞作为实验样本，采用常规的蛋白提取方法提取样本的总蛋白，并酶解成肽段，用C18除盐；肽段定量：用BCA法进行肽段定量；
S2、将所述肽段溶解于TEAB中，离心取上清，获得复溶肽段，向所述复溶肽段中加入异丙醇、iTRAQ标记试剂混匀，获得标记体系；具体地：
c、标记肽段溶解：按定量结果取80ug酶解后的肽段冻干，后加入20uL 0.5M TEAB(三乙胺硼烷)复溶，12000g离心5min取上清；
b、构建标记体系：向复溶的肽段中加入38uL异丙醇，涡旋振荡，混合均匀；
c、标记试剂溶解：向混合体系中加入5uL标记试剂，涡旋振荡；
S3、将所述标记体系于室温下反应2.8h，获得同位素标记的肽段。具体可采用旋转摇床孵育。
标记效率检测：取5uL，加入3倍体积水终止标记反应，用Zip-Tip除盐；质谱检测标记效率，待标记效率合格后继续后续实验。
HPLC分级：将标记合格的样本混合，HPLC(液相色谱)分级，合并成15个组份；质谱上机。
对比例1
该对比例中，TEAB和异丙醇的体积比改为2：3，其余均同实施例1。
对比例2
该对比例中，TEAB和异丙醇的体积比改为2：5，其余均同实施例1。
对比例3
该对比例中，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/50uL，其余均同实施例1。
对比例4
该对比例中，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/70uL，其余均同实施例1。
对比例5
该对比例中，所述标记反应时间为2h，其余均同实施例1。
对比例6
该对比例中，除所述待标记肽段与所述iTRAQ标记试剂的质量体积比为70ug：20uL外，其他条件均同对比例1。
试验例1
将各实施例和各对比例的质谱上机后计算了标记效率测试结果的均值如表1所示。
表1
| 组别 | 标记效率 | iTRAQ标记试剂用量uL |
| 实施例1 | 99.9％ | 6 |
| 实施例2 | 99.8％ | 7 |
| 实施例3 | 97.7％ | 5 |
| 对比例1 | 93.13％ | 6 |
| 对比例2 | 79.33％ | 6 |
| 对比例3 | 88.12％ | 6 |
| 对比例4 | 80.35％ | 6 |
| 对比例5 | 89.14％ | 6 |
| 对比例6 | 99.9％ | 20 |
由表1数据可知：
对比例1中，TEAB和异丙醇的体积比为2：3，大于本发明2：(3.4～3.8)的范围，标记效率为93.13％，比本发明实施例的标记效率低；
对比例2中，TEAB和异丙醇的体积比为2：5，小于本发明2：(3.4～3.8)的范围，标记效率只有79.33％；
对比例3中，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/50uL，大于本发明70ug/(61～63)uL的范围，标记效率只有88.12％；
对比例4中，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/70uL，小于本发明70ug/(61～63)uL的范围，标记效率只有80.35％；
对比例5中，标记反应时间为2h，小于本发明2.8～3.2h的范围，标记效率只有89.14％；
对比例6中，其他条件均同对比例1，要想与实施例1达到相同的标记效率，所述iTRAQ标记试剂的用量要达到20uL。
本发明实施例1-3中，标记效率达到97.5％以上，标记效率高且iTRAQ标记试剂用量少。
以上数据表明，任何一个条件不在本发明的范围内，都难以提高标记效率，要想达到本发明的标记效率，需要提高所述iTRAQ标记试剂的用量，会造成试剂的浪费，增加成本。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种同位素标记试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：iTRAQ标记试剂、三乙胺硼烷TEAB、异丙醇和待标记肽段；所述三乙胺硼烷TEAB和异丙醇的体积比为2：(3.4～3.8)，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/(61～63)uL，所述待标记肽段与所述iTRAQ标记试剂的质量体积比为(50～80)ug：(5～7)uL。
2.根据权利要求1所述的一种同位素标记试剂盒，其特征在于，所述三乙胺硼烷TEAB和异丙醇的体积比为2：3.6。
3.根据权利要求1所述的一种同位素标记试剂盒，其特征在于，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/62uL。
4.根据权利要求1所述的一种同位素标记试剂盒，其特征在于，所述待标记肽段与所述iTRAQ标记试剂的质量体积比为70ug：(5～7)uL。
5.根据权利要求1所述的一种同位素标记试剂盒，其特征在于，所述三乙胺硼烷TEAB和所述异丙醇均为分析纯级。
6.一种同位素标记方法，其特征在于，所述方法包括：
获得待标记肽段；
将所述肽段溶解于三乙胺硼烷TEAB中，离心取上清，获得复溶肽段，向所述复溶肽段中加入异丙醇和iTRAQ标记试剂混匀，获得标记体系；其中，所述三乙胺硼烷TEAB和所述异丙醇的体积比为2：(3.4～3.8)，所述待标记肽段的使用终浓度为70ug/(61～63)uL，所述待标记肽段与所述iTRAQ标记试剂的质量体积比为(50～80)ug：(5～7)uL；
将所述标记体系于室温下反应2.8～3.2h，获得同位素标记的肽段。
7.根据权利要求6所述的一种同位素标记方法，其特征在于，所述获得肽段包括：对样本蛋白进行提取，后酶解，用C18除盐后，获得所述肽段。
8.根据权利要求6所述的一种同位素标记方法，其特征在于，所述离心的转速为11000～13000g，离心时间为3～7min。
9.根据权利要求6所述的一种同位素标记方法，其特征在于，所述向所述复溶肽段中加入异丙醇和iTRAQ标记试剂混匀中，采用涡旋振荡的方式。
10.根据权利要求6所述的一种同位素标记方法，其特征在于，所述反应时间为3h。
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