CN111521774A - 基于糖代谢标记获得O-GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法 - Google Patents

基于糖代谢标记获得O-GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于糖代谢标记获得O‑GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法，包括利用叠氮标记的糖探针将细胞内所有O‑GlcNAc修饰转录因子标记上叠氮分子。通过甲醛交联，酶解超声获得叠氮标记的O‑GlcNAc修饰转录因子‑染色质片段。然后经过Click反应将生物素连接到叠氮标记的转录因子和染色质上，利用链霉亲和素磁珠与生物素亲和沉淀转录因子染色质复合物。最后解交联获得O‑GlcNAc修饰转录因子结合的染色质DNA。本发明首次开发了获得全基因组范围O‑GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA的方法，该方法特异性高、成本低，且制备得到的O‑GlcNAc糖转录因子结合的DNA样品可直接用于PCR检测或者扩增，构建DNA文库。

Description

基于糖代谢标记获得O-GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA 序列的方法
技术领域
本发明涉及糖生物化学染色质免疫共沉淀技术领域，具体而言，涉及一种获得全基因组范围O-GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法。
背景技术
O-GlcNAc修饰是一种普遍存在于细胞质与细胞核中的蛋白质翻译后修饰，通过糖苷键连接于众多细胞内蛋白的丝氨酸、苏氨酸上。迄今已发现的O-GlcNAc 修饰的蛋白已超过4000种，主要包括转录因子、染色体结合蛋白、核孔蛋白、细胞骨架蛋白等。其中核内蛋白，特别是转录因子的O-GlcNAc修饰在基因转录和应激反应中发挥了重要的作用。已有研究表明很多转录因子都能发生 O-GlcNAc糖基化修饰，经糖基化修饰的转录因子可能影响转录因子的核定位，蛋白稳定性，转录调节活性等等。
对于O-GlcNAc转录因子的富集目前可以通过琥珀酰基化麦芽凝集素(sWGA)或者阱化学法。然而这些方法存在特异性不高，破坏糖链结构且操作繁琐的问题。目前，科学家们开发了一种代谢标记的方法，将具有特殊修饰基团(炔基、叠氮等)的单糖类似物导入到细胞中，这些外源的化学物质能够被细胞识别利用转化为糖供体底物类似物，从而使蛋白质或糖链标记上特殊修饰基团，进一步利用能够与这些标记基团发生化学反应的探针将目标糖基化蛋白富集出来。这是一种非常有效的富集O-GlcNAc蛋白的方法。
染色质免疫共沉淀技术使目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，对目的片断纯化与检测。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。ChIP-Seq的原理是:首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。
而近些年对O-GlcNAc修饰转录因子与DNA相互作用的研究一般是通过对已知的某一种转录因子或某几个转录因子分别使用抗体进行染色质免疫共沉淀，从而获得其结合的染色质DNA。目前已经发现了很多转录因子都能O-GlcNAc 修饰，但是还没有办法实现在全基因组范围一次性富集胞内所有O-GlcNAc修饰转录因子结合的DNA，也就意味着无法在组学层面上研究O-GlcNAc糖转录因子及结合靶基因DNA序列。
发明内容
本发明旨在基于O-GlcNAc糖代谢标记-染色质亲和沉淀获得全基因组范围 O-GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
基于糖代谢标记获得O-GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法，包括步骤如下：
第一步，利用叠氮标记的糖探针将胞内O-GlcNAc修饰的转录因子代谢标记叠氮分子；
第二步，利用甲醛交联将叠氮标记的转录因子和染色质连接固定，然后将叠氮标记的转录因子-染色质裂解提取出来，通过酶解超声将染色质随机打断成小片段；
第三步，将已叠氮标记的转录因子-染色质片段与带有生物素基团的炔烃试剂进行Click反应；形成生物素-叠氮标记的转录因子-染色质片段的复合物；将获得的复合物与带有链霉亲和素标记的磁珠共孵育，通过生物素和链酶亲和素的亲和沉淀，富集O-GlcNAc代谢标记修饰的转录因子与染色质；最后通过蛋白酶 K和RNA酶降解蛋白实现反交联释放结合的DNA片段，富集O-GlcNAc糖转录因子结合的DNA；经定量、建库后用于高通量二代测序分析获取DNA序列。
具体包括如下步骤：
第一步，通过向细胞培养液中加入50μM～2mM的叠氮标记的糖探针培养12h～72h，得到叠氮标记的转录因子；
第二步，将第一步得到的叠氮标记的转录因子和染色质，通过甲醛交联10-20min；106个细胞使用0.5μL～2μL的微球菌核酸酶酶解15-30min，超声将染色质随机切割成100-900bp的片段；得到叠氮标记的转录因子-染色质片段；以上每一步中均需加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。
第三步，将第二步得到的叠氮标记的转录因子-染色质片段进行Click反应，反应缓冲液包含50-200μM炔烃生物素标签，预混合的BTTAA和CuSO4摩尔比为2：1以及新鲜制备的抗坏血酸钠，室温反应1～3h；经过Click炔烃环加成反应使叠氮标记的转录因子-染色质片段连接上生物素标签；向缓冲液中加入7-9倍缓冲液体积的甲醇置于-80℃，1～2h沉淀，离心后的沉淀物用冷甲醇洗涤1-3次，得到生物素标签-叠氮标记的转录因子-染色质片段复合物；将复合物重悬于PBS 中，将复合物与链霉亲和素磁珠室温反应1～3h，再去除非特异性结合，涡旋混合并在50-70℃下孵育0.5h～2h以将染色质从链霉亲和素磁珠上洗脱下来；将洗脱下来的染色质上清液转移至新试管；向试管中添加5M NaCl、2～3μL蛋白酶K 和1～2μLRNA酶，并在65℃下孵育2～15h；最后使用DNA纯化柱纯化溶液，获得DNA。
本发明不仅在目前还没有ChIP级的O-GlcNAc抗体而只有凝集素的情况下在代谢标记的基础上通过改良的染色质免疫共沉淀方法实现全基因范围O-GlcNAc修饰转录因子结合DNA的富集，与染色质免疫共沉淀所用的 proteinA/G磁珠不同，本发明使用的链霉亲和素磁珠与生物素可实现高效捕获、分离，且无需抗体，省去了蛋白与抗体、抗体与磁珠结合时间。获得的DNA片段也可直接用于PCR检测或扩增DNA，构建DNA文库。此方法具有操作简便、化学选择性高、生物稳定性强等特点，而且与下游检测手段具有良好兼容性。
附图说明
图1是基于O-GlcNAc代谢标记-染色质亲和沉淀获得O-GlcNAc糖代谢标记转录因子组结合染色质DNA序列分析方法流程图。
图2是MCF-7细胞染色质亲和沉淀样品DNA片段大小。
图3是已知O-GlcNAc转录因子对应引物鉴定MCF-7细胞的O-GlcNAc糖转录因子结合DNA富集效率。
图4是Hela细胞染色质亲和沉淀样品DNA片段大小。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进一步详细说明。当然，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从化学试剂公司购买。实验流程如图1所示。
以下以具体实施条件为例对本发明方法进行进一步说明。
细胞原料：乳腺癌细胞MCF-7；宫颈癌细胞Hela；叠氮标记代谢物：GalNAz，Ac4GalNAz；含生物素的炔烃Diol Biotin-Alkyne
实施例1：本实施例提供一种获得MCF-7细胞O-GlcNAc糖代谢标记转录因子组结合染色质DNA序列的方法。
实验包括如下步骤：
S1.细胞标记与交联
MCF-7细胞用1mM GalNAz处理48h。取出一板10cm皿细胞加入甲醛进行交联，使甲醛的终浓度为1％，室温孵育10min后加入终浓度为0.125M的甘氨酸终止交联。
S2.胞核制备和染色质消化
将S1中交联后的细胞加入1ml含0.5μM DTT和蛋白酶抑制剂的冰冷裂解液。冰上孵育10min。每3min颠倒试管混匀。然后离心沉淀胞核。将沉淀物重悬于1ml含DTT冰冷的裂解液中。重复离心后重悬于100μL含DTT冰冷的裂解液中。添加0.5μL微球菌核酸酶，通过翻转离心管数次进行混合并且在 37℃下孵育20min，使DNA消化成大约150-900bp的长度。然后添加10μL 0.5M EDTA置于冰上1-2min终止消化。离心使胞核沉淀并移除上清液。随后将胞核沉淀物重悬于100μL含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中。将裂解物进行超声处理，20s，3次，每次间隔时间大于30s以破坏胞核膜。离心后取上清得到交联的染色质制备物。
S3.Click反应，链霉亲和素磁珠亲和沉淀
将S2获得的染色质样品进行Click反应，缓冲液包括：100μM Diol Biotin-Alkyne，预混合的BTTAA与CuSO4摩尔比为2：1，新鲜制备的2.5mM 抗坏血酸钠和蛋白酶抑制剂。室温反应2h。Click反应结束后产物加入8倍体积的甲醇置于-80℃沉淀1h。离心5000rpm，10min沉淀。将沉淀物用冰冷甲醇洗涤两次。将蛋白重悬在含1.2％SDS的1mL PBS中。加入100μL的链霉亲和素磁珠。4℃反应2h。向磁珠中添加1ml PBS，洗涤磁珠3次。然后添加1ml PBS 含5M NaCl洗涤1次，均在4℃洗涤5min。
S8.洗脱解交联
向每份免疫沉淀样品中添加150μL洗脱缓冲液。轻轻涡旋混合(1200 rpm/min)并在65℃下孵育30min以将染色质从链霉亲和素磁珠上洗脱下来。将洗脱下来的染色质上清液转移至新试管。再添加6μL 5M NaCl和2μL蛋白酶K解交联，并在65℃下孵育过夜。最后使用离心柱纯化DNA。
上述结果的验证：
(1)在纯化DNA后，取出3μL样品并将其与100bp DNA标准品置于1％琼脂糖凝胶上进行电泳以确定DNA片段的大小。如图2所示，M1为Trans 2K plus DNA marker，M2为100bp，S为标准品上样5μL(10ng/μL)，图中序列1 和3为MCF-7的亲和沉淀获得的DNA。结果显示，酶解的染色质符合DNA片段要求大小。可进行后续的高通量测序。
(2)将获得的O-GlcNAc糖转录因子结合DNA进行初步的PCR验证。使用SP1、KLF5、JUN和NFKB1几种已报道的O-GlcNAc糖基化转录因子的结合 DNA片段设计引物，进行定量PCR反应。结果如图3所示，可初步证明本发明方法获得的O-GlcNAc糖转录因子结合DNA的可行性。
(3)对MCF-7细胞免疫沉淀样品进行ChIP-seq测序，ChIP-seq测序由华大基因公司完成。报告结果显示，平均产出26331150条原始测序序列(reads)；测序得到的原始测序序列里面含有带接头的、低质量的reads，为了保证信息分析质量，对下机数据进行过滤，包括去污染，去测序接头和低质量碱基比例过高的reads，得到Clean data。表A列出了数据产出的概况。在得到Clean data之后，使用比对软件将reads比对到参考基因组上，比对结果如表B所示；之后根据需要对各个文库的reads进行去重复处理；然后进行质控(表C)来判断测序数据质量。结果表明，MCF-7输入样品和免疫沉淀样品的DNA质量达标。
A.数据基本处理与质控
Figure BDA0002452061920000071
B.比对结果统计
Figure BDA0002452061920000072
C.各样品QC质控表
Figure BDA0002452061920000073
Phred:碱基质量值
实施例2：本实施例提供一种获得Hela细胞O-GlcNAc糖代谢标记转录因子组结合染色质DNA序列的方法。
实验包括如下步骤：
S1.细胞标记与交联
Hela细胞用200μM Ac4GalNAz处理48h。取出一板10cm皿细胞加入甲醛进行交联，使甲醛的终浓度为1％，室温孵育15min后加入终浓度为0.125M的甘氨酸终止交联。
S2.胞核制备和染色质消化
将S1中交联后的细胞加入1ml含0.5μM DTT和蛋白酶抑制剂的冰冷裂解液。冰上孵育10min。每3min颠倒试管混匀。然后离心沉淀胞核。将沉淀物重悬于1ml含DTT冰冷的裂解液中。重复离心后重悬于100μL含DTT冰冷的裂解液中。添加1.5μL微球菌核酸酶，通过翻转离心管数次进行混合并且在37℃下孵育25min，使DNA消化成大约150-900bp的长度。然后添加10μL 0.5M EDTA置于冰上1-2min终止消化。离心使胞核沉淀并移除上清液。随后将胞核沉淀物重悬于100μL含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中。将裂解物进行超声处理，10s，5次，每次间隔时间大于10s。离心后取上清得到交联的染色质制备物。
S3.Click反应，链霉亲和素磁珠亲和沉淀
将S2获得的染色质样品进行Click反应，缓冲液包括：100μM Diol Biotin-Alkyne，预混合的BTTAA与CuSO4摩尔比为2：1，新鲜制备的2.5mM 抗坏血酸钠和蛋白酶抑制剂。室温反应3h。Click反应结束后产物加入8倍体积的甲醇置于-80℃沉淀1h。离心5000rpm，10min沉淀。将沉淀物用冰冷甲醇洗涤两次。将蛋白重悬在含1.2％SDS的1mL PBS中。加入100μL的链霉亲和素磁珠。4℃反应1h。向磁珠中添加1ml PBS，洗涤磁珠3次。然后添加1ml PBS 含5M NaCl洗涤1次，均在4℃洗涤5min。
S8.洗脱解交联
向每份免疫沉淀样品中添加150μL洗脱缓冲液。轻轻涡旋混合1200 rpm/min并在65℃反应2h以将染色质从链霉亲和素磁珠上洗脱下来。将洗脱下来的染色质上清液转移至新试管。再添加6μL 5M NaCl和2μL蛋白酶K解交联，并在65℃下孵育过夜。最后使用离心柱纯化DNA。
上述结果的验证：
(1)在纯化DNA后，取出10μL样品并将其与100bp DNA标准品置于 1％琼脂糖凝胶上进行电泳以确定DNA片段的大小。如图4所示，DNA marker 为100bp，图中序列1和序列2为Hela细胞亲和沉淀获得的DNA。结果显示，酶解的染色质符合DNA片段要求大小。可进行后续的高通量测序。

Claims (4)

1.基于糖代谢标记获得O-GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法，其特征在于，包括步骤如下：
第一步，利用叠氮标记的糖探针将胞内O-GlcNAc修饰的转录因子代谢标记叠氮分子；
第二步，利用甲醛交联将叠氮标记的转录因子和染色质连接固定，然后将叠氮标记的转录因子-染色质裂解提取出来，通过酶解超声将染色质随机打断成小片段；
第三步，将已叠氮标记的转录因子-染色质片段与带有生物素基团的炔烃试剂进行Click反应；形成生物素-叠氮标记的转录因子-染色质片段的复合物；将获得的复合物与带有链霉亲和素标记的磁珠共孵育，通过生物素和链酶亲和素的亲和沉淀，富集O-GlcNAc代谢标记修饰的转录因子与染色质；最后通过蛋白酶K和RNA酶降解蛋白实现反交联释放结合的DNA片段，富集O-GlcNAc糖转录因子结合的DNA；经定量、建库后用于高通量二代测序分析获取DNA序列。
2.根据权利1所述的基于糖代谢标记获得O-GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法，包括如下步骤：
第一步，通过向细胞培养液中加入50μM～2mM的叠氮标记的糖探针培养12h～72h，得到叠氮标记的O-GlcNAc修饰转录因子；
第二步，将第一步得到的叠氮标记的O-GlcNAc修饰转录因子，通过甲醛交联10-20min，使转录因子和染色质连接固定；106个细胞使用0.5μL～2μL的微球菌核酸酶酶解15-30min，超声将染色质随机切割成100-900bp的小片段，冰上操作；得到叠氮标记的O-GlcNAc修饰转录因子-染色质片段；
第三步，将第二步得到的叠氮标记的O-GlcNAc修饰转录因子-染色质片段进行Click反应，反应缓冲液包含50-200μM炔烃生物素标签，预混合的BTTAA和CuSO4摩尔比为2：1以及新鲜制备的抗坏血酸钠，4℃反应1～3h；经过Click炔烃环加成反应使叠氮标记的O-GlcNAc修饰转录因子-染色质片段连接上生物素标签；向缓冲液中加入7-9倍缓冲液体积的甲醇置于-80℃，1～2h沉淀，离心后的沉淀物用冷甲醇洗涤1-3次，得到生物素标签-叠氮标记的O-GlcNAc修饰转录因子-染色质片段复合物；将复合物重悬于PBS中，与链霉亲和素磁珠室温反应1～3h，再去除非特异性结合，向磁珠中加入洗脱缓冲液涡旋混合并在50-70℃下孵育0.5h～2h以将染色质从链霉亲和素磁珠上洗脱下来；将洗脱下来的O-GlcNAc糖转录因子和染色质上清液转移至新离心管；向离心管中添加5M NaCl、2～3μL蛋白酶K和1～2μLRNA酶解交联，并在65℃下孵育2～15h；最后使用DNA纯化柱纯化，获得O-GlcNAc修饰转录因子结合的染色质DNA。
3.根据权利2所述的基于糖代谢标记获得O-GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法，其特征在于，第二步中，所述超声10s，共2-6次，间隔大于30s。
4.根据权利2所述的基于糖代谢标记获得O-GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法，其特征在于，第三步，向缓冲液中加入8倍缓冲液体积的甲醇。
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