CN105463090A - 应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序实验方法 - Google Patents

应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序实验方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序(iChIP-seq)实验方法，首先斑马鱼胚胎样本进行甲醛交联，然后通过MNase酶切获取单核小体，H3抗体将染色质固定在磁珠上，从而在磁珠上对各种不同的样品加上不同的标签接头，再将染色质从磁珠上释放出来浓缩后将样品混合在一起进行各种抗体的染色质免疫共沉淀反应，获得DNA样品纯化后建库测序。本发明iChIP是在传统的ChiP上进行的改良，这种方法是通过在染色质免疫共沉淀前先将每个样本进行标记后再将所有样品混合在一起进行实验，能观察到在发育过程中染色质修饰的一个动态变化，减少早期细胞量少可能造成的实验偏差，且可以通过细胞数数量对整个发育过程中的染色质修饰动态变化进行定量观察。

Description

应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序实验方法
技术领域
本发明属于分子生物学高通量实验技术领域，主要用于研究斑马鱼早期胚胎发育过程中全基因组染色质修饰动态变化及相关基因转录机制研究。
背景技术
胚胎发育一直是生命科学研究的主题之一。从一个单细胞发育成一个多细胞的个体，是许多基因和蛋白质在时间和空间上顺序表达的结果。其中染色质修饰在胚胎发育过程中扮演着重要的角色，但是关于其在发育过程中的动态变化研究比较少，斑马鱼为生物体的发育研究提供好很好的模型，但是实验技术限制阻碍了很好的研究发育各个阶段染色质修饰的动态变化。传统的染色质免疫共沉淀(ChIP)虽然也能观察每个时期的染色质修饰的水平，间接观察其动态变化，但是由于早期胚胎发育过程中，细胞数量少，很难达到实验要求。index-firstchromatinimmunoprecipitation(iChIP)是在传统的ChiP上进行的改良，这种方法是通过在染色质免疫共沉淀前先将每个样本进行标记后再将所有样品混合在一起进行实验，这样可以在一次实验中完成所有时期的实验，比较好的能观察到在发育过程中染色质修饰的一个动态变化，减少了早期细胞量少可能造成的实验偏差，且可以通过细胞数的量实验对整个发育过程中的染色质修饰的动态变化进行定论观察。
斑马鱼由于养殖容易，繁殖周期短，产卵量大，胚胎透明等诸多优点，近年来已成为研究脊椎动物发育与人类疾病的新兴模式动物。研究发现斑马鱼共享了人类70％的蛋白编码基因，而且人类相关基因中有84％可以在斑马鱼中找到对应基因，另外在斑马鱼系统中开发除了阻断基因功能的工具－morpholino，而且随着CRISPR/Cas9技术的日益成熟，可快速逆向遗传学手法来验证基因的功能，为我们揭开人类发育的生物学奥秘提供依据。
目前iChIP-seq技术只是用于细胞样本中，对于染色质修饰的动态变化及与基因表达的关系研究也只限于细胞水平，还未有报道在斑马鱼的胚胎细胞中应用。
发明内容
本发明的目的为了研究斑马鱼早期胚胎发育过程中的染色质各种修饰的动态变化及与基因表达调控的关系所建立的应用于斑马鱼胚胎的一种先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序(iChIP-seq)实验方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
应用于斑马鱼胚胎的一种先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序(iChIP-seq)实验方法，该方法包括以下步骤：
(1)斑马鱼胚胎样本前处理：
取200个胚胎于2ml离心管中，用预冷的PBS洗三次后加入1％甲醛1750ul(1％甲醛为270ul37％甲醛加4.73mlPBS稀释配置)摇床轻摇交联3min，加200ul1.25M甘氨酸摇床轻摇5min终止交联。
(2)斑马鱼胚胎细胞核裂解：
经过前处理的斑马鱼胚胎样品再用PBS加蛋白抑制剂洗涤3次，最后一次尽量将液体吸干净。加入1ml预冷的裂解缓冲液10mMTris-HClpH7.5，10mMNaCl，0.5％NP-40(加蛋白抑制剂)，用1ml广口的移液器枪头冰上反复吹打胚胎，直至胚胎裂解，冰上放置3-4min，直至裂解液变清，离心收集细胞核，用1mlPBS(加蛋白抑制剂)重悬细胞核于新的1.5ml的离心管中，4度，3500rpm离心5min去上清。
(3)微球菌酶(MNase)酶切反应：
用200ul消化缓冲液50mMTris-ClpH7.6，1mMCaCl2，0.2％TritonX-100或NP-40(加蛋白抑制剂)重悬细胞核，25度预热2min，加稀释好的MNase于离心管中轻轻混匀，25度反应5-10分钟。MNase酶稀释：取2ul0.4U/ulMNase酶于8ulMNase稀释缓冲液(50mMTris-ClpH8，10mMNaCl，126mMCaCl2，5％甘油)混匀后，再取4ul于28ulMNase稀释缓冲液中共稀释40倍。
(4)终止反应及超声片段化DNA
反应结束后立即加入200ulMNase终止缓冲液10mMTrispH7.6，20mMEDTA，轻轻混匀后，biorupt超声4*30sec，超声条件为最大功率H，30sec开，30sec关。13000rpm，4度，离心10min，取50ul上清加50ulGilchrist终止缓冲液1％SDS，100mMNaHCO3，25mMEDTA，65度90分钟解交联，加1ml无水乙醇，40ul3MpH5.2NaAc，-80度沉淀后Qiagen试剂盒纯化得inputDNA。
(5)透析及磁珠平衡：
将剩下的上清液转至透析卡中，于透析缓冲液ChIPbuffer(10mMTris-HCl，140mMNaCl，0.1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1％Tx-100，1mMEDTA)中轻摇2h，4度。每个样品取15ulDynabeadsProteinG，用PBS加5mg/mlBSA洗涤平衡3次备用。
(6)染色质固定：
透析结束吸出透析卡中的染色质离心取上清，转至低吸附的离心管中，加入提前准备好的磁珠，加1.3ugH3抗体，4度轻摇孵育20h，然后用150ul10mMTrisCl(加蛋白抑制剂)洗涤3次，每次于4度轻摇5min。
(7)染色质标记：
20ul上述液体重悬磁珠，加25ul2*ER混合缓冲液(50mMTris-HClpH7.5，20mMMgCl2，20mMDTT，2mMATP，1mMdNTPs)，2ulT4PNK酶，2ulT4聚合酶，低吸附枪头混匀，于热循环仪器中12度25min，25度25min，4度。末端修复完成后用150ulTrisCl(加蛋白抑制剂)洗涤一次，然后用上述液体42ul重悬磁珠，加5ul10*NE缓冲液，2ulKlenow，1uldATP，低吸附枪头混匀，37度反应30min，再次用150ulTrisCl(加蛋白抑制剂)洗涤一次，用18ul上述液体重悬磁珠，加25ul2*快速连接缓冲液，5ul快速连接酶，5ul0.75uMY-型indexed接头，低吸附枪头混匀，25度反应40min，再用150ulTrisCl(加蛋白抑制剂)洗涤一次。
(8)染色质释放及磁珠平衡：
每个样品中加12.5ul100mMDTT，室温孵育5min，然后再加12.5ul染色质释放缓冲液500mMNaCl，2％SDS，2％脱氧胆酸钠(加蛋白抑制剂)，然后将所有样品混合在一起，37度孵育震荡30min，磁力架上取上清，转至30KD蛋白浓缩管中，用TE缓冲液补至体积为500ul，14000g，4度，离心20min，然后将蛋白浓缩管倒放至新的离心管中，1000g，4度，离心2min，收集浓缩后的染色质。每个样品取50ulProteinG磁珠，用PBS加5mg/mlBSA洗涤平衡三次备用。
(9)染色质免疫共沉淀：
将上述浓缩后的染色质转至低吸附离心管中，加440ul水，150mMNaCl，0.5％Tx-100，加上述平衡后的磁珠，加组蛋白修饰抗体，4度孵育3h。各种组蛋白修饰抗体：1.5ugH3K4me1(ab8895)，2.5ugH3K4me3(Millipore，07-473)，2.5ugH3K27ac(ab4729)，2.5ugH3K27me3，(Millipore，07-449)。
(10)洗涤及iChIPedDNA洗脱
用磁力架去除上清，用200UL预冷的RIPA缓冲液(25mMTris-HClpH7.6，150mMNaCl，1％NP-40，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)洗涤5次，RIPA缓冲液加350mMNaCl洗涤两次，LiCl缓冲液(10mMTE，250mMLiCl，0.5％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠)洗涤两次，TE缓冲液(0mMTris-HClpH8，1mMEDTA)洗涤1次，以上洗涤每次8min。然后加50ul洗脱缓冲液(0.5％SDS，300mMNaCl，1mMEDTA，10mMTris-HClpH8)加2ulRNaseA，37度洗脱30分钟，转上清至新的离心管中加2.5ul蛋白酶K，65度解交联过夜，磁珠重复洗脱一次，体积共100ul。
(11)纯化及建库测序
解交联过夜DNA用AMPure磁珠纯化，24ul无核酶水洗脱。Qubit对iChIP下来的样品进行定量，然后进行PCR扩增建库，iChIPedDNA，2.5ul10mM上游引物，2.5ul10mM下游引物，25ulNEBNextHigh-Fidelity2*PCRMasterMix。总体系50ul。反应条件：98℃30sec，98℃10sec，60℃30sec，72℃30sec，Repeatsteps2-4，xcycles，保持在4℃。再用AMPure磁珠去除引物二聚体，bioanalyzer检查文库质量，Hiseq2500的125PE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。
步骤(1)所述的1％甲醛为：270ul37％甲醛加4.73mlPBS稀释配置。
本发明iChIP是在传统的ChiP上进行的改良，这种方法是通过在染色质免疫共沉淀前先将每个样本进行标记后再将所有样品混合在一起进行实验，这样可以在一次实验中完成所有时期的实验，比较好的能观察到在发育过程中染色质修饰的一个动态变化，减少了早期细胞量少可能造成的实验偏差，且可以通过细胞数的数量对整个发育过程中的染色质修饰的动态变化进行定量观察。
具体实施方式
本发明实验方法，首先进行斑马鱼胚胎样本进行甲醛交联，然后通过MNase酶切获取单核小体，通过H3抗体将染色质固定在磁珠上，从而可以在磁珠上对各种不同的样品加上不同的标签接头，再将染色质从磁珠上释放出来浓缩后将样品混合在一起进行各种抗体的染色质免疫共沉淀反应，获得的DNA样品纯化后建库测序。
本发明iChIP是在传统的ChiP上进行的改良，这种方法是通过在染色质免疫共沉淀前先将每个样本进行标记后再将所有样品混合在一起进行实验，这样可以在一次实验中完成所有时期的实验，比较好的能观察到在发育过程中染色质修饰的一个动态变化，减少了早期细胞量少可能造成的实验偏差，且可以通过细胞数的数量对整个发育过程中的染色质修饰的动态变化进行定量观察。
下面结合具体实施例对本发明技术方案进行详细说明。
实施例
收取成功受精的斑马鱼早期胚胎样品。具体方法如下：
(1)斑马鱼胚胎样本前处理：
取64细胞期，256细胞期，1k细胞期，Oblong细胞期，Dome/30％epiboly各200个胚胎于2ml离心管中，用预冷的PBS洗三次后加入1％甲醛1750ul(此处1％甲醛为：270ul37％甲醛加4.73mlPBS稀释配置)摇床轻摇交联3min，加200ul1.25M甘氨酸摇床轻摇5min终止交联。
(2)斑马鱼胚胎细胞核裂解：
经过前处理的斑马鱼胚胎样品再用PBS加蛋白抑制剂洗涤3次，最后一次尽量将液体吸干净。加入1ml预冷的裂解缓冲液10mMTris-HClpH7.5，10mMNaCl，0.5％NP-40(加蛋白抑制剂)，用1ml广口的移液器枪头冰上反复吹打胚胎，直至胚胎裂解，冰上放置3-4min，直至裂解液变清，离心收集细胞核，用1mlPBS(加蛋白抑制剂)重悬细胞核于新的1.5ml的离心管中，4度，3500rpm离心5min去上清。
(3)微球菌酶(MNase)酶切反应：
用200ul消化缓冲液50mMTris-ClpH7.6，1mMCaCl2，0.2％TritonX-100或NP-40(加蛋白抑制剂)重悬细胞核，25度预热2min，加稀释好的MNase于离心管中轻轻混匀，25度反应5-10分钟；MNase酶稀释：取2ul0.4U/ulMNase酶于8ulMNase稀释缓冲液(50mMTris-ClpH8，10mMNaCl，126mMCaCl2，5％甘油)混匀后，再取4ul于28ulMNase稀释缓冲液中共稀释40倍。64细胞期MNase酶浓度为0.001U，反应9分钟，256细胞期MNase酶浓度为0.002U，反应9min，1k细胞期MNase酶浓度为0.01U，反应5min，Oblong细胞期MNase酶浓度为0.01U，反应5min，Dome/30％epibolyMNase酶浓度为0.02U，反应5min。
步骤(3)所述的酶切消化缓冲液具体包括：50mMTris-ClpH7.6，1mMCaCl2，0.2％TritonX-100或NP-40。
MNase酶稀释：取2ul0.4U/ulMNase酶于8ulMNase稀释缓冲液(50mMTris-ClpH8，10mMNaCl，126mMCaCl2，5％甘油)混匀后，再取4ul于28ulMNase稀释缓冲液中共稀释40倍。
(4)终止反应及超声片段化DNA
反应结束后立即加入200ulMNase终止缓冲液10mMTrispH7.6，20mMEDTA，轻轻混匀后，biorupt超声4*30sec，超声条件为最大功率H，30sec开，30sec关。13000rpm，4度，离心10min，取50ul上清加50ulGilchrist终止缓冲液1％SDS，100mMNaHCO3，25mMEDTA，65度90分钟解交联，加1ml无水乙醇，40ul3MpH5.2NaAc，-80度沉淀后Qiagen试剂盒纯化得inputDNA。
(5)透析及磁珠平衡：
将剩下的上清液转至透析卡中，于透析缓冲液ChIPbuffer(10mMTris-HCl，140mMNaCl，0.1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1％Tx-100，1mMEDTA)中2h，4度。每个样品取15ulDynabeadsProteinG，用PBS加BSA5mg/ml洗涤平衡3次备用。
(6)染色质固定：
透析结束吸出透析卡中的染色质离心取上清，转至低吸附的离心管中，加入提前准备好的磁珠，加1.3ugH3抗体，4度轻摇孵育20h，然后用150ul10mMTrisCl(加蛋白抑制剂)洗涤3次，每次于4度轻摇5min。
(7)染色质标记：
20ul上述液体重悬磁珠，加25ul2*ER混合缓冲液(50mMTris-HClpH7.5，20mMMgCl2，20mMDTT，2mMATP，1mMdNTPs)，2ulT4PNK酶，2ulT4聚合酶，低吸附枪头混匀，于热循环仪器中12度25min，25度25min，4度。末端修复完成后用150ulTrisCl(加蛋白抑制剂)洗涤一次，然后用上述液体42ul重悬磁珠，加5ul10*NE缓冲液，2ulKlenow，1uldATP，低吸附枪头混匀，37度反应30min，再次用150ulTrisCl(加蛋白抑制剂)洗涤一次，用18ul上述液体重悬磁珠，加25ul2*快速连接缓冲液，5ul快速连接酶，5ul0.75uMY-型indexed接头，低吸附枪头混匀，25度反应40min，五组样品加入不同的indexed接头。再用150ulTrisCl(加蛋白抑制剂)洗涤一次。
(8)染色质释放及磁珠平衡：
每个样品中加12.5ul100mMDTT，室温孵育5min，然后再加12.5ul染色质释放缓冲液500mMNaCl，2％SDS，2％脱氧胆酸钠(加蛋白抑制剂)，然后将五组样品混合在一起，37度孵育震荡30min，磁力架上取上清，转至30KD蛋白浓缩管中，用TE缓冲液补至体积为500ul，14000g，4度，离心20min，然后将蛋白浓缩管倒放至新的离心管中，1000g，4度，离心2min，收集浓缩后的染色质。每个样品取50ulProteinG磁珠，用PBS加BSA洗涤平衡三次备用。
(9)染色质免疫共沉淀：
将上述浓缩后的染色质转至低吸附离心管中，加440ul水，150mMNaCl，0.5％Tx-100，加上述平衡后的磁珠，加组蛋白修饰抗体，4度孵育3h。各种组蛋白修饰抗体：1.5ugH3K4me1(ab8895)，2.5ugH3K4me3(Millipore，07-473)，2.5ugH3K27ac(ab4729)，2.5ugH3K27me3，(Millipore，07-449)。
(10)洗涤及iChIPedDNA洗脱
用磁力架去除上清，用200ul预冷的RIPA缓冲液(25mMTris-HClpH7.6，150mMNaCl，1％NP-40，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)洗涤5次，RIPA缓冲液加350mMNaCl洗涤两次，LiCl缓冲液(10mMTE，250mMLiCl，0.5％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠)洗涤两次，TE缓冲液(0mMTris-HClpH8，1mMEDTA)洗涤1次，以上洗涤每次8min。然后加50ul洗脱缓冲液(0.5％SDS，300mMNaCl，1mMEDTA，10mMTris-HClpH8)加2ulRNaseA，37度洗脱30分钟，转上清至新的离心管中加2.5ul蛋白酶K，65度解交联过夜，磁珠重复洗脱一次，体积共100ul。
(11)纯化及建库测序
解交联过夜DNA用AMPure磁珠纯化，24ul无核酶水洗脱。Qubit对iChIP下来的样品进行定量，取总量1-2ng进行PCR扩增建库，iChIPedDNA，2.5ul10mM上游引物，2.5ul10mM下游引物，25ulNEBNextHigh-Fidelity2*PCRMasterMix。总体系50ul。反应条件：98℃30sec，98℃10sec，60℃30sec，72℃30sec，Repeatsteps2-4，12cycles，保持在4℃。再用AMPure磁珠去除引物二聚体，bioanalyzer检查文库质量，Hiseq2500的125PE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。
实施例中，用到的蛋白抑制剂为蛋白抑制剂cocktail，其含量为1X，所述的蛋白抑制剂cocktail是由AEBSF、EDTA、Leupeptin及PepstatinA组成。已为现有技术。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序(iChIP-seq)实验方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)斑马鱼胚胎样本前处理：
取200个胚胎于2ml离心管中，用预冷的PBS洗三次后加入1％甲醛1750ul摇床轻摇交联3min，加200ul1.25M甘氨酸摇床轻摇5min终止交联；
(2)斑马鱼胚胎细胞核裂解：
经过前处理的斑马鱼胚胎样品再用PBS加蛋白抑制剂洗涤3次，最后一次尽量将液体吸干净。加入1ml预冷的裂解缓冲液(加蛋白抑制剂)，用1ml广口的移液器枪头冰上反复吹打胚胎，直至胚胎裂解，冰上放置3-4min，直至裂解液变清，离心收集细胞核，用1mlPBS(加蛋白抑制剂)重悬细胞核于新的1.5ml的离心管中，离心去上清；
(3)微球菌酶(MNase)酶切反应：
用200ul酶切消化缓冲液(加蛋白抑制剂)重悬细胞核，25度预热2min，加稀释好的MNase于离心管中轻轻混匀，25度反应5-10分钟；
(4)终止反应及超声片段化DNA
反应结束后立即加入200ulMNase终止缓冲液，轻轻混匀后，biorupt超声4*30sec，离心10min，取50ul上清加50ulGilchrist终止缓冲液，65度90分钟解交联，加1ml无水乙醇，40ul3MpH5.3NaAc，-80度沉淀后Qiagen试剂盒纯化得inputDNA；
(5)透析及磁珠平衡：
将剩下的上清液转至透析卡中，于透析缓冲液ChIPbuffer中轻摇2h，4度。每个样品取15ulDynabeadsProteinG，用PBS加BSA5mg/ml洗涤平衡3次备用；
(6)染色质固定：
透析结束吸出透析卡中的染色质离心取上清，转至低吸附的离心管中，加入提前准备好的磁珠，加1.3ugH3抗体，4度轻摇孵育20h，然后用150ul10mMTrisCl(加蛋白抑制剂)洗涤3次，每次于4度轻摇5min；
(7)染色质标记：
20ul上述液体重悬磁珠，加25ul2*ER混合缓冲液，2ulT4PNK酶，2ulT4聚合酶，低吸附枪头混匀，于热循环仪器中12度25min，25度25min，4度；末端修复完成后用150ulTrisCl(加蛋白抑制剂)洗涤一次，然后用上述液体42ul重悬磁珠，加5ul10*NE缓冲液，2ulKlenow，1uldATP，低吸附枪头混匀，37度反应30min，再次用150ulTrisCl(加蛋白抑制剂)洗涤一次，用18ul上述液体重悬磁珠，加25ul2*快速连接缓冲液，5ul快速连接酶，5ul0.75uMY-型indexed接头，低吸附枪头混匀，25度反应40min，再用150ulTrisCl(加蛋白抑制剂)洗涤一次；
(8)染色质释放及磁珠平衡：
每个样品中加12.5ul100mMDTT，振荡混匀，室温孵育5min，然后再加12.5ul染色质释放缓冲液(加蛋白抑制剂)，然后将所有样品混合在一起，37度孵育震荡30min，磁力架上取上清，转至30KD蛋白浓缩管中，用TE缓冲液补至体积为500ul，离心20min，然后将蛋白浓缩管倒放至新的离心管中收集浓缩后的染色质；每个样品取50ulProteinG磁珠，用PBS加5mg/mlBSA洗涤平衡三次备用；
(9)染色质免疫共沉淀：
将上述浓缩后的染色质转至低吸附离心管中，加440ul水，150mMNaCl，0.5％Tx-100，加上述平衡后的磁珠，加组蛋白修饰抗体，4度孵育3h；
(10)洗涤及iChIPedDNA洗脱
用磁力架去除上清，用200ul预冷的RIPA缓冲液洗涤5次，RIPA缓冲液加350mMNaCl洗涤两次，LiCl缓冲液洗涤两次，TE缓冲液洗涤1次，以上洗涤每次8min；然后加50ul洗脱缓冲液加2ulRNaseA，37度洗脱30分钟，转上清至新的离心管中加2.5ul蛋白酶K，65度解交联过夜，磁珠重复洗脱一次，体积共100ul；
(11)纯化及建库测序
解交联过夜DNA用AMPure磁珠纯化，24ul无核酶水洗脱；Qubit对iChIP下来的样品进行定量，然后加上下游引物及PCR混合液扩增建库，再用AMPure磁珠去除引物二聚体，bioanalyzer检查文库质量，Hiseq2500的125PE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。
2.根据权利要求1所述的应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序(iChIP-seq)实验方法，其特征在于，步骤(2)所述的裂解液具体包含：10mMTris-HClpH7.5，10mMNaCl，0.5％NP-40。离心转速为3500rpm，5min，4度。
3.根据权利要求1所述的应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序(iChIP-seq)实验方法，其特征在于，步骤(3)所述的酶切消化缓冲液具体包括：50mMTris-ClpH7.6，1mMCaCl2，0.2％TritonX-100或NP-40；MNase酶稀释：取2ul0.4U/ulMNase酶于8ulMNase稀释缓冲液(50mMTris-ClpH8，10mMNaCl，126mMCaCl2，5％甘油)混匀后，再取4ul于28ulMNase稀释缓冲液中共稀释40倍。
4.根据权利要求1所述的应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序(iChIP-seq)实验方法，其特征在于，步骤(4)所述的酶切终止液含有10mMTrispH7.6，20mMEDTA；超声条件为最大功率H，30sec开，30sec关；所述的Gilchrist终止缓冲液包含：1％SDS，100mMNaHCO3，25mMEDTA；离心转速为13000rpm，10min，4度。
5.根据权利要求1所述的应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序(iChIP-seq)实验方法，其特征在于，步骤(5)所述的ChIP缓冲液包含：10mMTris-HCl，140mMNaCl，0.1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1％Tx-100，1mMEDTA。
6.根据权利要求1所述的应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序(iChIP-seq)实验方法，其特征在于，步骤(7)所述的2*ER缓冲液包含：50mMTris-HClpH7.5，20mMMgCl2，20mMDTT，2mMATP，1mMdNTPs；10*NE缓冲液及快速连接试剂盒为NEB产品。
7.根据权利要求1所述的应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序(iChIP-seq)实验方法，其特征在于，步骤(8)所述的染色质释放缓冲液具体包含：500mMNaCl，2％SDS，2％脱氧胆酸钠；浓缩离心转速为14000g，20min，收集浓缩染色质离心转速为1000g，2min，4度。
8.根据权利要求1所述的应用于斑马鱼胚胎的一种先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序(iChIP-seq)实验方法，其特征在于，步骤(9)所述的组蛋白修饰抗体包含：1.5ugH3K4me1(ab8895)，2.5ugH3K4me3(Millipore，07-473)，2.5ugH3K27ac(ab4729)，2.5ugH3K27me3，(Millipore，07-449)。
9.根据权利要求1所述的应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序(iChIP-seq)实验方法，其特征在于，步骤(10)所述的RIPA缓冲液包含：25mMTris-HClpH7.6，150mMNaCl，1％NP-40，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS；LiCl缓冲液具体包含：10mMTE，250mMLiCl，0.5％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠；TE缓冲液为10mMTris-HClpH8，1mMEDTA；洗脱缓冲液包括：0.5％SDS，300mMNaCl，1mMEDTA，10mMTris-HClpH8。
10.根据权利要求1所述的应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序(iChIP-seq)实验方法，其特征在于，步骤(11)所述的扩增反应体系包括：iChIPedDNA，2.5ul10mM上游引物，2.5ul10mM下游引物，25ulNEBNextHigh-Fidelity2*PCRMasterMix；总体系50ul；反应条件：98℃30sec，98℃10sec，60℃30sec，72℃30sec，Repeatsteps2-4，xcycles，保持在4℃。
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