CN113005145A - 不依赖于特异性抗体的捕获tf在全基因组上结合位点的方法 - Google Patents

不依赖于特异性抗体的捕获tf在全基因组上结合位点的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因转录调控领域，具体涉及一种不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法。该方法包括以下步骤：S1、构建带有rFC标签的目的转录因子表达质粒，进而向细胞中引入TF‑rFC融合蛋白表达，培养到所需时期后收集细胞，并用磁珠偶联细胞；S2、通透磁珠偶联的细胞，加入pA(G)‑MNase融合蛋白孵育过夜；S3、通过加入CaCl2，活化MNase，终止反应并收集释放出核的TF‑染色质复合物，进行纯化；S4、将上述纯化后的DNA片段进行测序文库构建并进行高通量测序。本发明规避了传统用于富集TF在基因组上结合位点的方法中高质量特异性抗体的需要，且避免了由于抗体效率影响特异性结合位点的富集，进而可以使用少至5000个细胞在全基因组水平上捕获TF的结合位点。

Description

不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法
技术领域
本发明属于基因转录调控领域，具体涉及一种不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法。
技术背景
转录因子(Transcription Factors,TFs)能够以序列特异性方式结合DNA来控制染色质结构和基因转录，对发育、分化、肿瘤发生等生命过程和疾病过程中的细胞命运决定具有至关重要的作用。尽管众多科学家对理解TF如何控制基因表达有着浓厚兴趣，精准定位TF在全基因组上的结合位点仍然具有挑战性。因此全基因组TF结合数据对于了解它们如何参与基因转录调控至关重要。染色质免疫沉淀测序(Chromatin ImmunoprecipitationSequencing，ChIP-seq)被广泛用于分析TF的全基因组结合位点，通常情况下单个TF的ChIP-seq实验需要106甚至更多的细胞，这样的细胞量对于在早期胚胎发育等稀有样品中研究TF的作用几乎是不可能实现的。另一方面TF的ChIP-seq实验需要高质量的特异性抗体，但是目前人和小鼠中的大部分TF都缺乏高质量的特异性抗体，而对于斑马鱼、爪蟾等非哺乳动物物种中，几乎所有的TF都缺乏高质量的特异性抗体。为了避免抗体的限制，可以通过在所研究的TF中添加标签并使用标签抗体来产生TF的全基因组结合数据；然而对于大量细胞的需求仍然是研究TF在早期胚胎发育等稀有样品中参与细胞命运决定的功能和机制的一个障碍。因此，为了揭示关键TF在重要生命活动过程中的作用机制，需要一种新的技术来检测TF在全基因组上的结合位点。
最近，CUT&RUN(Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease)被认为是一种可用于检测TF在全基因组结合位点的替代技术。与ChIP-seq相比，CUT&RUN所需的细胞要少，这使得其在早期胚胎发育等稀有样品中分析TF的结合位点成为可能。然而CUT&RUN仍然依赖于高质量的特异性抗体，这限制了它应用与于抗体效率低的TF或非哺乳动物模式生物中。
发明内容
在本发明方法中，我们提出了一种不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法(Fc fragment of immunoglobulin G tagging followed by CUT&RUN(FitCUT&RUN))。FitCUT&RUN通过pA(G)-MNase中的protein A(G)与rFc区(兔IgG的Fc肽段)的直接相互作用，将MNase核酸酶带入目标染色质区域剪切、释放目标TF在基因组结合位点片段，这使得在早期胚胎发育等稀有样品中检测TF在全基因组上的结合位点及研究TF的作用机制成为可能。
本发明的一个目的是提供一种可应用于细胞系中不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法。
本发明的另一个目的是提供一种可应用于早期胚胎发育等稀有样品中不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法，从而研究关键TF对早期胚胎发育等重要生命活动过程中的调控机制。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明第一个方面公开了一种不依赖于特异性抗体的捕获转录因子在全基因组上结合位点的方法，该方法包括以下步骤：
S1、构建带有rFC标签的目的转录因子表达质粒，进而向细胞中引入TF-rFC融合蛋白表达，培养到所需时期后收集细胞，并用Concanavalin A磁珠偶联细胞；
S2、利用digitonin通透磁珠偶联的细胞，加入pA(G)-MNase融合蛋白，4-5摄氏度条件下轻摇孵育过夜，pA(G)-MNase入核后，protein A(G)识别并结合TF-rFC的rFC区域，同时将MNase核酸酶带入目标染色质邻近区域；
S3、通过加入CaCl2，活化MNase，使MNase在目的TF结合位点周围进行DNA双链切割，加入EDTA螯合钙离子终止反应并收集释放出核的TF-染色质复合物，去除RNA和蛋白质后，酚/氯仿/异戊醇抽提纯化DNA片段；
S4、将上述纯化后的DNA片段进行测序文库构建并进行高通量测序。
优选的，所述细胞为K562细胞系。
应当理解，本发明中的细胞不局限于K562细胞系，本领域技术人员可以根据需要，选择任意合适的细胞来完成本发明的技术方案，且均在本发明的保护范围之内。
更优选的，步骤S1包括：
S11、构建带有rFc标签的转录因子载体，电转进K562细胞系中，培养18-24h后，收集细胞，用洗涤缓冲液洗涤后重悬得到细胞悬液；
S12、将平衡好的Concanavalin A磁珠加入到细胞悬液中，孵育20-30min，得到磁珠偶联细胞。
更优选的，步骤S2包括：
用抗体缓冲液重悬磁珠偶联细胞，冰上放置30分钟，用dig-washing buffer洗涤后，重悬，加入pA(G)-MNase融合蛋白，在4摄氏度条件下，轻摇孵育过夜，pA(G)-MNase入核后，pA(G)去识别并结合TF-rFC的rFC区域，同时将MNase核酸酶带入目标染色质邻近区域。
更优选的，步骤S3包括：
S31、dig-washing buffer洗涤后重悬磁珠偶联细胞，0摄氏度下预冷5分钟，加入CaCl2，轻轻涡旋后立即返回0摄氏度，反应20-35分钟；
S32、加入终止缓冲液，轻轻涡旋后，37摄氏度孵育30-40分钟，终止反应并将切开的TF-染色质复合物释放出核，离心后，将上清转移至新的离心管中，加SDS、蛋白酶K，混匀后，55摄氏度孵育30-40分钟，去除蛋白质；
S33、将样品加酚/氯仿/异戊醇充分混匀，常温离心后，转移至新的容器中，加入糖原，NaAc和异丙醇，混匀后，-20摄氏度沉淀30分钟，离心后用80％乙醇洗涤后，干燥，用EB溶解。
更优选的，所述细胞为斑马鱼胚胎细胞。
应当理解，本发明中的细胞不局限于斑马鱼胚胎细胞，本领域技术人员可以根据需要，选择任意合适的物种来完成本发明的技术方案，且均在本发明的保护范围之内。
更优选的，在S1中，将构建带有rFc标签的Nanog载体，通过体外转录试剂盒获得Nanog-rFc的mRNA，在斑马鱼胚胎一细胞时期将Nanog-rFc mRNA显微注射至胚胎中，培养至所需时期后收集细胞。
优选的，在S4中，利用KAPA建库试剂盒进行文库扩增并通过Xten平台进行高通量测序。
本发明第二个方面公开了根据上述的方法在基因转录调控领域中的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有以下区别技术特征：
相比于现有的ChIP-seq技术，本发明创建了一种不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法，名为FitCUT&RUN。本发明方法一方面规避了传统用于富集TF在基因组上结合位点的方法中高质量特异性抗体的需要，尤其适用于抗体效率低的TF或在无有效抗体的非哺乳动物模式生物中，例如斑马鱼、爪蟾等；另一方面由于省略了抗体孵育步骤，避免由于抗体效率影响特异性结合位点的富集，进而可以使用少至5000个细胞在全基因组水平上捕获TF的结合位点。利用本发明的方法检测的数据具有较好的质量，该方法为在取材困难的条件下检测TF在全基因组上的结合位点提供了一种十分有效的方法，有利于深入研究TF在早期胚胎发育等重要生命活动中的作用机制。
附图说明
图1中A表示FitCUT&RUN的实验原理示意图；B为rFc的氨基酸序列。
图2中A为K562细胞系中转录因子ELF1 FitCUT&RUN(用105个细胞)与ChIP-seq(用107个细胞；ENCODE公共数据)示例图谱；B表示ELF1FitCUT&RUN与ChIP-seq的信号峰(peak)重叠比例分析；C表示ELF1FitCUT&RUN特异性信号峰在ChIP-seq数据中的信号。
图3中A为K562细胞系中分别用105、104和5×103个细胞的ELF1FitCUT&RUN示例图谱；B表示不同细胞量中信号峰周围FitCUT&RUN的信号；C图表示不同细胞量中FitCUT&RUN重叠的信号峰在细胞量为105个细胞的FitCUT&RUN信号。
图4中A表示在斑马鱼dome时期胚胎中转录因子NanogFitCUT&RUN数据(用50枚胚胎)与公共的ChIP-seq数据(用2000枚胚胎)示例图谱；B表示将Nanog敲低和补救后在NanogFitCUT&RUN结合位点上ATAC-seq信号的变化；C表示Nanog敲低后在NanogFitCUT&RUN结合位点上MNase-seq信号的变化。
图5中A表示在斑马鱼dome时期胚胎中NanogFitCUT&RUN数据与公共的ChIP-seq数据中检测到的信号峰数量的比较；B表示NanogFitCUT&RUN数据与公共的ChIP-seq数据中特异性信号峰中包含Nanog结合模体(motif)的比例；C表示Nanog敲低后NanogFitCUT&RUN特异性信号峰上ATAC-seq信号的变化；D表示Nanog敲低后NanogFitCUT&RUN特异性信号峰上MNase-seq信号的变化；E表示每个NanogFitCUT&RUN和ChIP-seq重叠的信号峰及各自特异的信号峰上NanogFitCUT&RUN和ChIP-seq的信号。
图6中A表示在斑马鱼256时期、1k时期和dome时期胚胎中的NanogFitCUT&RUN数据示例图谱；B表示256时期、1K时期和dome时期的NanogFitCUT&RUN信号峰数量的变化；C表示256时期和1K时期Nanog敲低和补救后NanogFitCUT&RUN结合位点上ATAC-seq信号的变化。
具体实施方式
下面通过详细的实施例对本申请进行进一步的阐述，应该理解，下述实施例仅是为了用于说明本申请，并不对发明内容进行限定。
以下实施例中所使用的技术，包括PCR扩增、DNA抽提纯化等分子生物学技术，以及细胞系和胚胎培养、斑马鱼显微注射等，除非特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂和细胞系等，除非是本说明书特别注明，均为一般领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
实施例1在人类K562细胞系中检测ELF1在全基因上的结合位点
一、实验目的：利用本发明方法在K562细胞系中检测ELF1在全基因上的结合位点
二、实验方法：
1.构建带有rFc标签的转录因子载体，并利用lonza电转的方式转染进K562细胞系中，培养18-24h后，收集不同量的细胞(105，104，5×103)，用washing buffer(20mM HEPES，pH7.5，150mM NaCl,0.5mM spermidine，protease inhibitor)洗2次后，用washing buffer重悬，同时Concanavalin A(Bangs laboratories,BP531)磁珠用binding buffer(20mMHEPES pH7.9,10mMKCl,1mM CaCl2,1mM MnCl2)平衡后，加入20μl Concanavalin(刀豆素)A磁珠至细胞悬液中轻摇孵育20分钟，使细胞与Concanavalin A磁珠偶联。
2.磁力架上去上清，用antibody buffer抗体缓冲液(washing buffer加0.02％digitonin,2mM EDTA)50ul重悬磁珠偶联细胞，冰上放置30分钟，磁力架上去上清后，用dig-washing buffer(washing buffer加0.02％digitonin洋地黄皂苷)洗2次后，50uldig-washing buffer重悬并加入pA(G)-MNase融合蛋白(EpiCypher 15-1016,终浓度700ng/ml)，4摄氏度，轻摇孵育过夜，pA(G)-MNase入核后，pA(G)去识别并结合TF-rFC的rFC区域，同时将MNase核酸酶带入目标染色质邻近区域。
3.用dig-washing buffer洗2次后，100μl dig-washing buffer重悬磁珠偶联细胞，0摄氏度预冷5分钟，加入2μl 100mM CaCl2，轻轻涡旋后立即返回0摄氏度，反应30分钟，使MNase在目的TF结合位点周围切割DNA双链。
4.加入100ul stop buffer(200mM NaCl,20mM EDTA,4mM EGTA,50ug/mL RNaseA,40μg/mL glycogen,10pg/mL yeast spike-in DNA)，轻轻涡旋后，37摄氏度孵育30分钟，终止反应并将切开的TF-染色质复合物释放出核，4摄氏度，16,000Xg，5分钟离心，磁力架上取上清转移至新的1.5ml离心管中，加2μl10％SDS(终浓度0.1％)，2.5ul蛋白酶K(20mg/ml)，混匀后，55摄氏度孵育30分钟，去除蛋白质。
5.将样品转移至phase-lock tube(分相离心管)中，加200μl酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)充分混匀后，16,000Xg，常温离心5分钟，转移至新的离心管中，加入2μl glycogen(20mg/ml)，20μl NaAc，200μl异丙醇，混匀后，-20摄氏度沉淀30分钟，16,000Xg，15分钟，4摄氏度离心，1ml 80％乙醇洗两次后，干燥，18μl EB(1mM Tris-HCl,pH8.0)溶解。
6.将上述纯化后的DNA片段利用KAPA Hyper Prep kit(KK8504)进行测序文库构建，并通过Xten平台进行高通量测序。
三、结果及结论
ELF1的FitCUT&RUN(105细胞)数据和ENCODE公共ChIP-seq数据比对分析验证FitCUT&RUN检测的ELF1在基因组上的结合位点具有可靠性(图2)；且FitCUT&RUN检测的ELF1在基因组上的特异性位点在ENCODE ChIP-seq中也具有较高的信号(图2)；当细胞量减少至5x103和104时，FitCUT&RUN也能较好地检测到ELF1在基因组上的结合位点(图3)。
从上述实验结果可以看出，利用本发明方法在少量细胞中产生的ELF1在全基因上的结合位点数据与公共的ELF1ChIP-seq数据具有较好的一致性，说明本发明方法能够很好的捕获TF在全基因组上结合位点。本发明方法使得在少至5000个细胞中检测TF的结合位点成为可能，这样极大地降低了原材料的获取难度，并且在无可用特异性抗体的情况下研究TF的作用机制成为可能。
图1中A表示FitCUT&RUN的实验原理示意图；B为rFc的氨基酸序列。
实施例2在斑马鱼早期胚胎中检测Nanog在全基因组上的结合位点
一、实验目的：利用本发明在斑马鱼胚胎发育早期捕获Nanog在全基因组上的结合位点，探讨Nanog影响早期胚胎发育的机制。
二、实验方法：
1.构建带有rFc标签的Nanog载体，通过体外转录试剂盒(invitrogen，AM1345)获得Nanog-rFc的mRNA，在斑马鱼胚胎一细胞时期将25pg Nanog-rFc mRNA显微注射至胚胎中，培养至所需时期，收集细胞(200枚256细胞期胚胎，100枚1k细胞期胚胎和50枚dome期胚胎)，用washing buffer(20mM HEPES,pH7.5,150mMNaCl,0.5mM spermidine亚精胺,protease inhibitor蛋白酶抑制剂)洗2次后，用washing buffer重悬，同时ConcanavalinA磁珠用binding buffer(20mM HEPES pH7.9,10mMKCl,1mM CaCl2,1mM MnCl2)平衡后，加入20μl Concanavalin A磁珠至细胞悬液中轻摇孵育20分钟，使细胞与Concanavalin A磁珠偶联。
2.磁力架上去上清，用antibody buffer(washing buffer加0.02％digitonin,2mM EDTA)50μl重悬磁珠偶联细胞，冰上放置30分钟，磁力架上去上清后，用dig-washingbuffer(washing buffer加0.02％digitonin)洗2次后，50μl dig-washing buffer重悬加入pA(G)-MNase融合蛋白(终浓度700ng/ml)，4摄氏度，轻摇孵育过夜，pA(G)-MNase入核后，pA(G)去识别并结合TF-rFC的rFC区域，同时将MNase核酸酶带入目标染色质邻近区域。
3.用dig-washing buffer洗2次后，100ul dig-washing buffer重悬磁珠偶联细胞，0摄氏度预冷5分钟，加入2μl 100mM CaCl2，轻轻涡旋后立即返回0摄氏度，反应30分钟，使MNase酶切目的TF结合位点周围区域。
4.加入100μl stop buffer(200mM NaCl,20mM EDTA,4mM EGTA,50μg/mL RNaseA,40μg/mL glycogen,10pg/mL yeast spike-in DNA)，轻轻涡旋后，37摄氏度孵育30分钟，终止反应并释放TF-染色质复合物，4摄氏度，16,000Xg，5分钟离心，磁力架上取上清转移至新的1.5ml离心管中，加2μl 10％SDS(终浓度0.1％)，2.5μl蛋白酶K(20mg/ml)，混匀后，55摄氏度孵育30分钟，去除蛋白质。
5.将样品转移至phase-lock tube中，加200μl酚/氯仿/异戊醇充分混匀后，16,000Xg，常温5分钟离心，转移至新的离心管中，假如2μl glycogen(20mg/ml)，20μl NaAc，200μl异丙醇，混匀后，-20摄氏度沉淀30分钟，16,000Xg，15分钟，4摄氏度离心，1ml 80％乙醇洗两次后，干燥，18μl EB(1mM Tris-HCl,pH8.0)溶解。
6.将上述纯化后的DNA片段利用KAPA Hyper Prep kit(KK8504)进行测序文库构建，并通过Xten平台进行高通量测序。
三、实验结果：
通过样品间的相关性、与dome时期的NanogChIP-seq公共数据的比较以及结合染色质开放数据及核小体定位数据分析显示NanogFitCUT&RUN数据质量可靠(图4)；利用相同的peak富集的方法检测到的NanogFitCUT&RUN信号峰更多，并通过结合模体分析，染色质开放性和核小体定位数据分析对这部分FitCUT&RUN检测到的Nanog特异性信号峰进行验证，显示FitCUT&RUN检测到的Nanog的特异性信号峰在ChIP-seq数据上也有较弱的信号(图5)，提示FitCUT&RUN具有更高的灵敏性。进一步，产生了斑马鱼早期胚胎256细胞期、1k时期的NanogFitCUT&RUN数据，结合染色质开放数据证实数据质量可靠，结果显示Nanog在斑马鱼早期胚胎发育的不同时期具有不同的结合位点(图6)。
从上述实验结果可以看出，利用本发明的实验方法可以在斑马鱼胚胎发育早期仅需少量的材料可以检测TF的动态结合位点，得到的数据具有良好的质量，为进一步揭示了TF在早期胚胎发育等重要生命活动过程中的作用机制成为可能。表明本发明方法能够很好的在材料较少的条件下检测TF在全基因组上的结合位点，进一步拓展了本发明方法的应用领域。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种不依赖于特异性抗体的捕获转录因子在全基因组上结合位点的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、构建带有rFC标签的目的转录因子表达质粒，进而向细胞中引入TF-rFC融合蛋白表达，培养到所需时期后收集细胞，并用Concanavalin A磁珠偶联细胞；
S2、利用digitonin通透磁珠偶联的细胞，加入pA(G)-MNase融合蛋白，4-5摄氏度条件下轻摇孵育过夜，pA(G)-MNase入核后，protein A(G)识别并结合TF-rFC的rFC区域，同时将MNase核酸酶带入目标染色质邻近区域；
S3、通过加入CaCl2，活化MNase，使MNase在目的TF结合位点周围进行DNA双链切割，加入EDTA螯合钙离子终止反应并收集释放出核的TF-染色质复合物，去除RNA和蛋白质后，酚/氯仿/异戊醇抽提纯化DNA片段；
S4、将上述纯化后的DNA片段进行测序文库构建并进行高通量测序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为K562细胞系。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1包括：
S11、构建带有rFc标签的转录因子载体，电转进K562细胞系中，培养18-24h后，收集细胞，用洗涤缓冲液洗涤后重悬得到细胞悬液；
S12、将平衡好的Concanavalin A磁珠加入到细胞悬液中，孵育20-30min，得到磁珠偶联细胞。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2包括：
用抗体缓冲液重悬磁珠偶联细胞，冰上放置30分钟，用dig-washing buffer洗涤后，重悬，加入pA(G)-MNase融合蛋白，在4摄氏度条件下，轻摇孵育过夜，pA(G)-MNase入核后，pA(G)去识别并结合TF-rFC的rFC区域，同时将MNase核酸酶带入目标染色质邻近区域。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S3包括：
S31、dig-washing buffer洗涤后重悬磁珠偶联细胞，0摄氏度下预冷5分钟，加入CaCl2，轻轻涡旋后立即返回0摄氏度，反应20-35分钟；
S32、加入终止缓冲液，轻轻涡旋后，37摄氏度孵育30-40分钟，终止反应并将切开的TF-染色质复合物释放出核，离心后，将上清转移至新的容器中，加SDS、蛋白酶K，混匀后，55摄氏度孵育30-40分钟，去除蛋白质；
S33、将样品加酚/氯仿/异戊醇充分混匀，常温离心后，转移至新的离心管中，加入糖原，NaAc和异丙醇，混匀后，-20摄氏度沉淀30分钟，离心后用80％乙醇洗涤后，干燥，用EB溶解。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为斑马鱼胚胎细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，将构建带有rFc标签的Nanog载体，通过体外转录试剂盒获得Nanog-rFc的mRNA，在斑马鱼胚胎的一细胞时期将Nanog-rFc mRNA显微注射至胚胎中，培养至所需时期后收集细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S4中，利用KAPA建库试剂盒进行文库扩增并通过Xten平台进行高通量测序。
9.根据权利要求1-8所述的方法在基因转录调控领域中的应用。
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