CN108285494B - 一种融合蛋白、试剂盒以及CHIP-seq检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种融合蛋白、试剂盒以及CHIP‑seq检测方法,其中,所述融合蛋白包括Tn5转座酶和Fc结合蛋白,所述试剂盒包括前述融合蛋白以及其他辅助检测试剂,所述方法使用前述融合蛋白或试剂盒进行CHIP‑seq检测方法。本发明所述融合蛋白、试剂盒和方法在CHIP‑seq检测过程中能够提高建库效率,降低文库背景,从而提高CHIP‑seq检测方法的准确性并简化CHIP‑seq的实验流程。
Description
技术领域
本发明涉及表观遗传学领域,具体而言,涉及一种融合蛋白、试剂盒以及CHIP-seq检测方法。
背景技术
随着基因测序的完成以及后基因组时代的到来,表观遗传学已经成为生物领域的研究热点。表观遗传学(epigenetics)主要研究在基因核苷酸序列不发生改变的情况下,DNA及有关蛋白分子发生的可遗传修饰,这些修饰可被细胞“记忆”并在随后的细胞分裂过程中保留下来,其研究方向包括:一是基因转录水平选择性表达的调控,二是基因转录后的调控。目前,表观遗传学的热点主要集中在基因转录水平选择性表达调控上,特别是转录因子与DNA的相互作用、DNA的甲基化和组蛋白修饰等[1]。
染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)也称结合位点分析法,其一般流程主要包括:(1)用甲醛将DNA和结合在所述DNA上的蛋白交联,染色体分离并打碎成一定大小的片段;(2)用特异性抗体免疫沉淀并富集目标蛋白与DNA交联的复合物;(3)采用低pH值条件反交联,释放DNA片段;(4)通过对DNA片段的纯化与检测,获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。由于CHIP技术能够研究蛋白质与DNA的相互作用,其被广泛应用表观遗传学领域,用于研究转录因子与DNA的相互作用、DNA甲基化和组蛋白修饰等。
随着新一代测序技术的发展,在CHIP技术的基础上发展出一种可在全基因组范围内研究蛋白质与DNA相互作用的技术——染色质免疫共沉淀-测序(即,CHIP-seq)。CHIP-seq技术包括染色质免疫共沉淀和高通量测序两部分,其中,先通过染色质免疫共沉淀技术特异性地富集目的蛋白结合的DNA,然后构建测序文库,采用新一代测序技术对富集得到的DNA片段进行高通量测序,最后通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上,从而获得全基因组范围内与目标蛋白相互作用的DNA区段信息[2]。
目前,一种优化的并于本技术相关的一种ChIP-seq技术叫做“CUT&RUN(CleavageUnder Targets&Release Using Nuclease)”。所述CUT&RUN将Protein A与核酸酶MNase(Micrococcal Nuclease)融合,通过Protein A能特异与免疫球蛋白G结合的特性,ProteinA将MNase引入抗体(识别特异转录因子或者组蛋白修饰的抗体)结合的位点,通过MNase的核酸内切和外切酶活性,Protein A-MNase能特异将抗体结合的DNA两端切开,被切开的DNA片段从细胞核中释放出来,对这些DNA片段进行建库和测序分析,能在全基因组水平绘制特定蛋白与DNA相互作用图谱。
其具体技术方案如图1所示:Con A beads和细胞结合,加入识别特异转录因子的抗体,孵育一定时间,让抗体与转录因子充分结合,加入ProteinA-MNase融合蛋白,ProteinA-MNase能特异结合抗体结合的位点,然后加入Ca2+离子激活MNase核酸酶的活性,ProteinA-MNase能特异将抗体结合的DNA的两端切开,终止MNase的反应之后,这些被切开的DNA片段从细胞核中释放出来,之后对这些DNA片段进行建库和二代测序分析,根据测序结果可以在全基因组水平绘制特定转录因子的结合图谱。
然而,目前通用的CHIP-seq技术存在以下缺陷:
1、建库效率低,导致做少量细胞时文库信息丢失严重
对Protein A-MNase切割后释放出来的DNA片段建库时,需要采用传统的TruSeq的建库策略,建库时Adaptor和DNA片段连接效率低。尤其以少量细胞为起始材料时,DNA片段在建库过程中丢失太多,最终导致文库主要信息丢失,实验失败几率高,也无法得到全基因组水平上的蛋白与DNA相互作用图谱。
2、文库背景较高
Protein A-MNase切割反应被终止后,所有小的DNA片段将从细胞核中释放出来,它们没有与转录因子或蛋白质结合。这些小片段,在建库过程中会被Adaptor连接,最后通过PCR扩增,形成高背景,降低了文库复杂度(complexity),导致实验失败。
3、现有的CHIP-seq技术无法对组织切片等进行原位检测,破坏其空间分辨率。
有鉴于此,本领域亟待提出一种能够有效提高文库建立的效率、降低文库背景以及能够实现原位检测的CHIP-seq技术。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种融合蛋白,所述融合蛋白包括Tn5转座酶和Fc结合蛋白,所述融合蛋白在CHIP-seq检测过程中能够提高建库效率,降低文库背景,从而提高CHIP-seq检测方法的准确性并简化CHIP-seq的实验流程。
本发明的第二目的在于提供一种用于CHIP-seq的试剂盒,所述试剂盒包括前述融合蛋白和其他辅助检测试剂,能够方便、快捷地实施CHIP-seq方法,获得准确的检测结果。
本发明的第三目的在于提供一种使用前述融合蛋白或前述试剂盒的CHIP-seq检测方法,所述方法能够提高建库效率,降低文库背景,从而提高所述检测方法的准确率和简化实验流程;
进一步地,本发明所述方法对抗体、融合蛋白的孵育条件以及切割反应的条件进行优化,提高抗体、融合蛋白的结合效率以及DNA切割的效率和准确性,从而降低文库的背景,提高分辨率;
更进一步地,本发明所述方法能够对组织切片、细胞涂片和细胞爬片进行原位检测,不需要裂解细胞核以及超声打断染色质,保留原样本的空间分辨率。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
一种融合蛋白,所述融合蛋白包括Tn5转座酶和Fc结合蛋白。
本发明所述融合蛋白包括Tn5转座酶和Fc结合蛋白。与常规CHIP-seq方法所使用的融合蛋白protein A-MNase相比,本发明所述融合蛋白不但能够准确地定位到目标蛋白与DNA相互作用的位置区域并对定位区域附近的DNA片段进行切割,而且所述Tn5转座酶在切割DNA的同时还能在被切割DNA片段的两端添加特定的Adaptors。因此,被释放的阳性DNA片段不需要额外地添加Adaptor,可以直接用于PCR扩增从而高效率地实现文库的制备,简化了CHIP-seq的实验流程。同时,由于融合蛋白本身的特性,只有被它识别并结合切割的DNA片段才能特异的带上Adaptor,而其他原因导致的释放出细胞核的背景DNA片段不能连接上Adaptor,所以在建库过程中,这些背景DNA片段将会丢失,这样被降低背景的文库具有更高的质量。
总而言之,本发明所述融合蛋白能够提高建库效率,降低文库背景,简化实验流程,从而在整体上提高CHIP-seq检测结果的准确性,缩短实验时间。
在一些具体的实施方式中,所述Fc结合蛋白选自蛋白A或蛋白G。
本发明还涉及一种用于CHIP-seq的试剂盒,所述试剂盒包括前述的融合蛋白以及其他辅助检测试剂。本发明所述试剂盒能够能够方便、快捷地实施CHIP-seq方法,获得准确的检测结果。
在一些具体的实施方式中,所述试剂盒包括前述的融合蛋白以及其他辅助检测试剂。
在一些具体的实施方式中,所述其他辅助检测试剂包括下组中的一种或多种:洗涤缓冲液、结合缓冲液、反应缓冲液、终止缓冲液或测序用试剂。
在一些具体的实施方式中,优选地,所述洗涤缓冲液包括洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2,其中,所述洗涤缓冲液1包括1~100mM HEPES、50~500mM NaCl和100~1000mM亚精胺,所述洗涤缓冲液2包括10~100mM HEPES、50~500mM NaCl、100~1000mM亚精胺和0.01~2%w.t.毛地黄皂苷。
在一些具体的实施方式中,优选地,所述结合缓冲液包括10~100mM Hepes、50~500mM NaCl、100~1000mM亚精胺,0.01~1%w.t.毛地黄皂苷和1~10mM EDTA。
在一些具体的实施方式中,优选地,所述反应缓冲液包括10~100mM Mg2+和10~100mM三羟甲基甲胺基丙磺酸。
在一些具体的实施方式中,优选地,所述终止缓冲液包括10~500mM EDTA和0.1-10%w.t.SDS。
在一些具体的实施方式中,优选地,所述测序用试剂包括测序用引物,更优选地,所述测序用引物为Nextera index引物。
本发明还涉及一种使用前述融合蛋白或前述试剂盒的CHIP-seq检测方法,所述方法包括以下步骤:将样品先后分别与抗体和融合蛋白孵育,激活所述融合蛋白进行切割反应,切割反应终止后提取DNA,进行测序。
本发明所述方法在检测过程中使用前述融合蛋白或试剂盒,能够提高建库效率,降低文库背景,从而提高所述检测方法的准确率和简化实验流程。
在一些具体的实施方式中,所述样品在与抗体孵育前进行交联反应或者不进行交联反应。
在一些具体的实施方式中,所述样品为组织切片、细胞爬片、细胞涂片或其他生物样品。
在一些具体的实施方式中,当所述样品为组织切片、细胞爬片或细胞涂片时,所述CHIP-Seq为原位CHIP-seq。
在一些具体的实施方式中,所述原位CHIP-seq是指从抗体孵育到切割反应终止均在所述组织切片、细胞爬片或细胞涂片上完成。
在一些具体的实施方式中,所述原位CHIP-seq还包括在切割反应终止后,在所述组织切片、细胞爬片或细胞涂片上对切割得到的目的片段进行PCR扩增。
在一些具体的实施方式中,优选地,所述引物为Nextera index引物,所述聚合酶为等温DNA聚合酶,如Phi29DNA聚合酶,扩增结束后,洗脱并纯化扩增所得DNA,用于建库和测序。
本发明前述方法进一步限定可以在组织切片、细胞爬片或细胞涂片上进行原位CHIP-seq,不需要裂解细胞核以及超声打断染色质,保留原样本的空间分辨率。
在一些具体的实施方式中,所述样品与所述抗体的孵育条件为:在2~10℃下孵育30min~12h;优选地,在4℃下孵育30min-4h。
在一些具体的实施方式中,所述样品与所述融合蛋白的孵育条件为:在2~10℃下孵育30min~12h;优选地,在4℃下孵育30min~4h。
在一些具体的实施方式中,所述切割反应的具体条件为:在2~10℃下反应30min~12h,优选地,在4℃下孵育30min~4h;或者在25~37℃下反应5min~12h,优选地,在30℃下反应15min~2h。
本发明前述方法对抗体、融合蛋白的孵育条件以及切割反应的条件进行优化,提高抗体、融合蛋白的结合效率以及DNA切割的效率和准确性,从而降低文库的背景和分辨率。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明所述融合蛋白、试剂盒和方法在CHIP-seq检测过程中能够提高建库效率,降低文库背景,从而提高CHIP-seq检测方法的准确性并简化CHIP-seq的实验流程。
(2)本发明所述方法对抗体、融合蛋白的孵育条件以及切割反应的条件进行优化,提高抗体、融合蛋白的结合效率以及DNA切割的效率和准确性,从而降低文库的背景和分辨率;
(3)本发明所述方法能够对组织切片、细胞涂片和细胞爬片进行原位检测,不需要裂解细胞核以及超声打断染色质,保留原样本的空间分辨率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为ProteinA-MNase在CHIP-seq中的作用原理;
图2为在原位CHIP-seq(In situ-CHIP)和超声CHIP-seq方法下,H3K4me3在pou5f1基因启动子区域的信号分布(IGV track显示图);
图3为在原位CHIP-seq(In situ-CHIP)和超声CHIP-seq方法下,H3K4me3在启动子区域的信号分布(热图),其中TSS表示转录起始位点。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购买获得的常规产品。
下述实施例1~3融合蛋白为Protein A-Tn5,对比例1中所用融合蛋白为ProteinA-MNase,所用洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2、结合缓冲液、反应缓冲液和终止缓冲液的配方如下所示:
洗涤缓冲液1:50mM HEPES、100mM NaCl和500mM亚精胺;
洗涤缓冲液2:50mM HEPES、100mM NaCl、500mM亚精胺和0.1%w.t.毛地黄皂苷;
结合缓冲液:50mM Hepes、100mM NaCl、500mM亚精胺,0.05%w.t.毛地黄皂苷和5mM EDTA;
反应缓冲液:50mM Mg2+和50mM三羟甲基甲胺基丙磺酸;
终止缓冲液:100mM EDTA和1%w.t.SDS。
实施例1
本实施例提供一种CHIP-seq检测方法(细胞不交联,处于自然状态),所述方法包括以下步骤:
1)收集约1,000,000个体外培养的胚胎干细胞,用PBS洗2次,离心收集细胞后用洗涤缓冲液1洗3次;
2)用结合缓冲液重悬细胞,加入适量的抗体,所述抗体为H3K4Me3抗体,在4℃孵育30min,使抗体与蛋白充分结合;
3)用洗涤缓冲液2洗涤细胞3次,除去多余没有结合的抗体;
4)用洗涤缓冲液2重悬细胞,之后加入融合蛋白,在4℃孵育30min,使得融合蛋白与抗体充分结合;
5)用洗涤缓冲液2洗涤细胞3次以除去多余的融合蛋白;
6)加入反应缓冲液,激活融合蛋白的活性,为降低反应背景,在4℃下进行反应,反应30min;
7)加入终止缓冲液终止反应,反应终止后,用QIAGEN DNA纯化试剂盒进行纯化;
8)纯化好的DNA直接用NEB Nextera index引物进行PCR扩增完成建库;
9)将完成建库的文库用于二代测序。
实施例2
本实施例提供一种CHIP-seq检测方法(细胞交联),所述方法包括以下步骤:
1)收集1,000,000个胚胎干细胞,1%FA室温交联3-10min,甘氨酸中和后用PBS洗3次;
2)用含0.3%SDS的低渗溶液重悬细胞,37℃孵育30min使染色质充分打开;
3)离心去掉上清;
4)用结合缓冲液洗涤细胞1次,然后用结合缓冲液重悬细胞并加入抗体,所述抗体为H3K4Me3抗体,在4℃孵育30min使抗体与蛋白充分结合;
5)洗涤缓冲液2洗涤细胞3次,除去多余没有结合的抗体;
6)用洗涤缓冲液2重悬细胞,之后加入融合蛋白,4℃孵育30min,使得融合蛋白与抗体充分结合;
7)洗涤缓冲液2洗涤细胞3次以除去多余的没有结合的融合蛋白;
8)加入反应缓冲液,激活融合蛋白的活性,为降低反应背景,在4℃下进行反应,反应30min;
9)加入终止缓冲液终止反应,反应终止后,用QIAGEN DNA纯化试剂盒进行纯化;
10)纯化好的DNA直接用NEB Nextera index引物进行PCR扩增完成建库;
11)将完成建库的文库用于二代测序。
实施例3
本实施例提供一种原位CHIP-seq检测方法,所述方法包括以下步骤:
1)PBS洗涤组织切片3次,然后用洗涤缓冲液1洗涤切片3次;
2)用结合缓冲液洗涤切片一次,用结合缓冲液覆盖组织切片,加入抗体,所述抗体为H3K4Me3抗体,在4℃孵育1h使抗体与蛋白充分结合;
3)洗涤缓冲液2洗涤切片3次,除去多余没有结合的抗体;
4)用洗涤缓冲液2覆盖组织切片,之后加入融合蛋白,4℃孵育30min,使得融合蛋白与抗体充分结合;
5)洗涤缓冲液2洗涤切片3次以除去多余的融合蛋白;
6)加入反应缓冲液,激活融合蛋白的活性,为降低反应背景,在4℃下进行反应,反应30min;
7)加入终止缓冲液终止反应,反应终止后直接加入NEB Nextera index引物和等温DNA聚合酶(如Phi29DNA聚合酶)在一定温度下进行PCR扩增建库;
8)PCR完成后,将DNA洗脱下来,用AMP beads进行纯化完成建库;
9)建库完成的文库直接用于二代测序。
对比例1“CUT&RUN”ProteinA-MNase based ChIP-seq
1)收集1,000,000个体外培养的细胞,用PBS洗2次,离心收集细胞后用洗涤缓冲液1洗3次;
2)用结合缓冲液重悬细胞,加入适量的抗体,所述抗体为H3K4Me3抗体,在4℃孵育2h,使抗体与蛋白充分结合;
3)用洗涤缓冲液2洗涤细胞3次,除去多余没有结合的抗体,将ProteinA-MNase融合蛋白与抗体结合;
4)用洗涤缓冲液2重悬细胞,之后加入融合蛋白,在4℃孵育1h,使得融合蛋白与抗体充分结合;
5)离心,用洗涤缓冲液2洗涤细胞3次以除去多余的融合蛋白;
6)用洗涤缓冲液2重悬细胞,加入2μl 100mM CaCl2,轻轻混匀以激活MNase的活性,将反应体系至于0℃反应30min;
7)加入100μl MNase终止反应液,轻轻混匀;
8)37℃孵育10min使核中的被切割的片段充分释放;
9)4℃,16000g离心5min,转移上清至一新EP管;
10)用QIAGEN DNA纯化试剂盒纯化上清中DNA;
11)加入终止缓冲液终止反应,反应终止后,用QIAGEN DNA纯化试剂盒进行纯化;
12)纯化完的DNA用“NEBNext Ultra DNA library Prep Kit for Illumina”试剂盒进行常规建库,常规建库过程需要1天;
13)将建库好的文库进行二代测序。
对比例2基于普通超声的ChIP-seq
1)收集1,000,000个体外培养的细胞,用FA室温交联10min,用甘氨酸中和后用PBS洗涤细胞3次,然后用液氮速冻;
2)用1ml低渗溶液(加蛋白酶抑制剂)将细胞悬起,在冰上孵育15min;
3)用玻璃Dounce pestle B将细胞混10-20次使细胞进一步分散,并将细胞破碎;
4)4℃,3000rpm离心5min以收集细胞核;
5)用100μl细胞核裂解液(含1%SDS)重悬细胞核,轻轻混匀,4℃孵育30min以充分裂解细胞核;
6)孵育后,简单离心,然后加ChIP稀释缓冲液稀释SDS浓度到0.3%,轻轻混匀;
7)超声(Q800R2):时间:6min;程序:15s on,45s off;能量:80%power;
8)超声后,加入ChIP稀释缓冲液,混匀后4℃,20,000离心20min,将上清转移至新的EP管中;
9)准备70μl Protein G,用1%BSA/PBS洗3次,然后分20μl protein G磁珠加入到步骤8)的上清中,4℃孵育1个小时,以去除非一些特异结合的蛋白。加入1ml 1%BSA/PBS到剩余的50μl protein G磁珠中,4℃封闭过夜;
10)1h后,用磁力架收集protein G磁珠,转移上清到一个新的EP管中,加入抗体,4℃孵育过夜;
11)第二天,将封闭过夜的protein G磁珠转移到染色质-抗体的混合液中,4℃孵育4h;
12)洗protein G磁珠;
13)用磁力架收集磁珠,然后进行如下洗涤过程;
a.4℃,用高盐洗涤缓冲液洗涤protein G磁珠1次,5min/次;
b.4℃,用低盐洗涤缓冲液溶液洗涤protein G磁珠3次,5min/次;
c.4℃,用1ml 1×TE溶液简单洗涤磁珠1次;
d.4℃,用800μl 1×TE溶液简单洗涤磁珠1次,然后转移到一个新的EP管中;
14)去除残留的液体,然后加入110μl ChIP洗脱缓冲液洗脱磁珠上的DNA,将ChIP洗脱缓冲液和磁珠在70℃孵育过夜;
15)第三天,用磁力架将上清转移到一个新的EP管中,然后加入100μl TE溶液再次洗脱磁珠上的DNA,将第二次洗脱的TE溶液和第一次的洗脱ChIP elution buffer结合在一起,加入3μl 10mg/ml蛋白酶K,55℃孵育6-8h;
16)第四天,用QIAGEN DNA纯化试剂盒纯化ChIPed DNA;
17)纯化完的DNA用“NEBNext Ultra DNA library Prep Kit for Illumina”试剂盒进行常规建库,常规建库过程需要1天;
18)将建库好的文库进行二代测序。
试剂配方:
ChIP洗脱缓冲液:50mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA,1%SDS;
ChIP稀释缓冲液:0.01%SDS,1%Triton X-100,2mM EDTA,20mM Tris-HCl(pH7.5),150mM NaCl;
低盐洗涤缓冲液:0.1%脱氧胆酸钠,1%Triton X-100,2mM EDTA,50mM HEPES(pH7.5),150mM NaCl;
高盐洗涤缓冲液:0.1%脱氧胆酸钠,1%TritonX-100,2mM EDTA,50mM HEPES(pH7.5),500mM NaCl;
核裂解缓冲液:1%SDS,10mM EDTA,50mM Tris-HCl(pH8.0)。
实验例1
检测实施例3所述方法和对比例2所述方法的文库背景,具体检测结果详见图2~3。根据图2的实验结果可知,本发明实施例3所述原位CHIP-seq能够获得与对比例2所述超声CHIP-Seq基本相同的阳性信号,同时,其背景信号(如图2所示的阴影部分)要明显低于对比例2。根据图3所示结果可知,与对比例2相比,实施例3所述原位CHIP-seq获得的H3K4me3信号在TSS附近更为集中,表现出更高的信噪比,而对比例2的信号在启动子区域比较分散。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,但本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
参考文献:
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Claims (10)
1.一种CHIP-seq检测方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
将样品先后分别与抗体和融合蛋白孵育,激活所述融合蛋白进行切割反应,切割反应终止后提取DNA,进行测序;
所述融合蛋白包括Tn5转座酶和Fc结合蛋白,所述Fc结合蛋白选自蛋白A或蛋白G;
所述样品为组织切片、细胞爬片或细胞涂片,所述CHIP-Seq为原位CHIP-seq;
所述样品与所述融合蛋白的孵育条件为:在2~10℃下孵育30min~12h;
所述切割反应的具体条件为:在2~10℃下反应30min~12h;或者在25~37℃下反应5min~12h。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述样品在与抗体孵育前进行交联反应或者不进行交联反应。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述原位CHIP-seq是指从抗体孵育到切割反应终止均在所述组织切片、细胞爬片或细胞涂片上完成。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述原位CHIP-seq还包括在切割反应终止后,在所述组织切片、细胞爬片或细胞涂片上对切割得到的目的片段进行PCR扩增。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,用于扩增的引物为Nextera index引物,聚合酶为等温DNA聚合酶,扩增结束后,洗脱并纯化扩增所得DNA,用于建库和测序。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,聚合酶为Phi29 DNA聚合酶。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述样品与所述抗体的孵育条件为:在2~10℃下孵育30min~12h。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述样品与所述抗体的孵育条件为:在4℃下孵育30min~4h。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述样品与所述融合蛋白的孵育条件为:在4℃下孵育30min~4h。
10.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述切割反应的具体条件为:在4℃下反应30min~4h;或者在30℃下反应15min-2h。
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