CN107674870A - 一种改进的鉴定细胞样品中rna结合蛋白的靶标rna序列的方法 - Google Patents

一种改进的鉴定细胞样品中rna结合蛋白的靶标rna序列的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供了一种改进的对细胞内RNA结合蛋白所结合的靶标RNA序列的鉴定。通过UV交联‑ 免疫共沉淀获得RNA 结合蛋白的靶标RNA，使用微球菌核酸酶对紫外交联后的靶标RNA 作不完全酶解，酶解结束后使用能去除Ca2+ 离子的螯合剂使该酶失活，将上述方法获得的靶标RNA 3’末端磷酸化并连接3’RNA 接头，之后对连接产物磷酸化、分离和回收，之后连接5’RNA 接头，并进行RT‑PCR 扩增，获得靶标RNA 相应的cDNA 文库。本发明简化实验流程，去掉同位素标记步骤，加入IgG抗体阴性对照样品扣除非特异结合和背景对实验结果的影响，达到与Clip‑seq同等质量的数据结果。

Description

一种改进的鉴定细胞样品中RNA结合蛋白的靶标RNA序列的 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及对细胞内RNA结合蛋白所结合的靶标RNA序列的鉴定。
背景技术
RNA是一种不稳定的生物大分子，绝大多数的RNA都需要与特定的RNA结合蛋白质结合形成RNA/蛋白复合物才能稳定存在于细胞中；不仅如此，RNA与RNA结合蛋白之间的动态关联贯穿和伴随了RNA的转录合成、加工和修饰、胞内运输和定位、功能发挥及降解的整个生命循环。
鉴于此，利用RNA结合蛋白分离或发现鉴定功能性RNA分子是RNA研究领域中一个不可或缺的研究方法。过去鉴定这些靶标RNA常用的手段主要是通过体外指数富集配基的系统进化技术(SELEX，Singh R，Valcarcel J，Green MR 1995Distinct bindingspecificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-bindingproteins.Science 268(5214)：1173-1176)；结合体内免疫共沉淀获得RNA-蛋白质复合物偶联基因芯片分析的技术(Buckanovich RJ，Darnell RB 1997The neuronal RNA bindingprotein Nova-1recognizes specific RNA targetsin vitro and invivo.Mol.Cell.Biol.17(6)3194-3201；Darnell JC，Jensen KB，Jin P，Brown V，WarrenST，Darnell RB 2001Fragile X mental retardation protein targets G quartetmRNAs important for neuronal function.Cell 107 489-499；Brown V，Jin P，Ceman S，Darnell JC，O’Donnell WT，Tenenbaum SA，Jin X，Feng Y，Wilkinson KD，Keene JD，Darnell RB，Warren ST 2001Microarray identification of FMRP-associated brainmRNAs and altered mRNA translational profiles in fragile X syndrome Cell.107(4)477-487)。但这些手段存在很大的缺陷，无法区分RNA和蛋白质是直接相互作用还是间接相互作用，以及无法知道蛋白质所结合的RNA的具体区域等。
RIP技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀)，是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具。2010年霍华德·休斯医学研究所采用RIP技术结合高通量测序技术，即RIP-seq技术捕获了Polycomb复合物蛋白在全基因水平上结合的RNAs，鉴定出PRC2与9000以上的RNAs有互作关系(Jing Zhao,1,2Toshiro K，Genome-wide Identification of Polycomb-AssociatedRNAs by RIP-seq.2010Molecμlar Cell；40,939–953)。
现有的RIP-seq技术研究对象都是细胞体内自然状态下较弱的RNA-蛋白质的互作力，在后续多步骤操作中容易丢失与蛋白质互作的靶RNA分子。同时由于捕获的靶RNA分子片段较长(与mRNA-seq测序得到插入片段大小一致)，后续分析时不能精确鉴定RBP与RNA的结合位点，会获得许多假的阳性结果，导致信噪比高(Zambelli&Pavesi,2015)。
紫外交联-免疫共沉淀技术(ΜV Crosslinking-Immunopricipitation，CLIP)是一种自2003年起兴起的实验技术，由美国洛克菲勒大学的Darnell教授实验室首先发明(Μle J，Jensen KB，Ruggiu M，Mele A，Μle A，Darnell RB 2003CLIP identifies NOVA-regulated RNA networks in the brain.Science 302(5648)1212-1215)。该实验技术结合最近兴起的第二代高通量测序技术(The Second-Generation DNA Sequencing)，成功鉴定了多种RNA结合蛋白体内结合的靶标RNA的基序以及在基因组中的分布(Yeo GW，CoufalNG，Liang TY，Peng GE，Fu XD，Gage FH 2009An RNA code for the FOX2splicingregulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stemcells.Nat.Struct.Mol.)
现有的Clip-seq技术流程复杂，步骤繁琐，需要特殊的仪器设备。同时需要使用放射性元素32P标记的方法指示蛋白质-RNA复合物的位置，同位素对人体会有危害，国家对同位素使用管理严格，普通的实验室没有资质去申请同位素。(Zambelli&Pavesi,2015)
发明内容
本发明针对上述不足提供一种改进的鉴定细胞样品中RNA结合蛋白的靶标RNA序列的方法，其包括以下步骤：
一、紫外交联-免疫共沉淀获得RNA结合蛋白的靶标RNA
1)紫外交联及细胞裂解液的制备：
采用254m波长的紫外光，400mj/cm2的能量照射细胞，使细胞中的直接相互作用的蛋白质和RNA之间形成共价键，得到蛋白-RNA复合物；向收集的细胞沉淀中加入Washbuffer，获得细胞裂解液；向细胞裂解液中加入RQ1DNA酶，TaKaRa RNA酶抑制剂，Thermomixer混仪上1000rpm，37℃，两分钟；放冰上5分钟。然后放入预冷4℃的冷冻离心机中10,000rpm离心20分钟，再用移液器吸出上清。
Wash buffer：50ml 10X PBS，0.5g SDS，2.5g脱氧胆酸钠，2.5ml NP-40，加超纯水定容至500ml。
2)RNA分子的片段化：
使用微球菌核酸酶MNase对紫外交联后的靶标RNA作不完全酶解，使RNA tag至少在20个核苷酸以上，在酶解结束后，使用能去除Ca2+离子的螯合剂使该酶失活，获得MNase片段化后的细胞裂解液
3)免疫共沉淀：
将蛋白A或G磁珠分别与研究蛋白X蛋白的抗体和阴性对照IgG抗体分别进行偶联，放4℃混合一个小时，偶联完毕后，将离心管置于磁分离架上，待磁珠沉淀后吸出上清；加入1)中的洗脱缓冲液重悬磁珠，放至磁分离架上至磁珠沉淀，如此重复三次；取2)中MNase片段化后的细胞裂解液各2管，分别加入到X蛋白抗体偶联磁珠和阴性对照IgG抗体偶联磁珠中，重悬磁珠直至全部悬浮于细胞裂解液中，置于旋转混合仪上，放4℃混合一个小时；用移液器取出上清；在结合了研究蛋白和阴性对照IgG抗体的磁珠中加入1)中的Wash buffer，如前所述洗剂磁珠两次，再加入High-salt wash buffer洗剂磁珠两次，最后用1×PNK缓冲液洗剂磁珠两次。
High-salt wash buffer：250ml10X PBS，0.5g SDS，2.5g脱氧胆酸钠，2.5ml NP-40，加超纯水定容至500ml；
1×多核苷酸激酶缓冲液(1×PNK bμffer)：25ml 1M Tris-HCl PH 7.4，1.0165gMgCl2，2.5ml NP-40，加超纯水定容至500ml；
Elution buffer：5ml1M NaHCO3，0.5g SDS，加超纯水定容至50ml；
4)去磷酸化：
用FAST AP反应混合体系分别重悬X蛋白抗体磁珠和阴性对照IgG抗体磁珠，置于热混仪上37℃1000rpm每3分钟震荡15秒保温10分钟；用1ml 1×PNK+EGTA缓冲液洗涤磁珠2次；用1ml 1×PNK缓冲液洗涤磁珠2次；Elution buffer分别重悬X蛋白和IgG磁珠，置于热混仪上70℃1000rpm处理10分钟，再置于磁分离架上，1分钟后取上清转移至新的EP管中；
去磷酸化混合体系(FAST AP反应)：8μl 10X FAST AP缓冲液，4μl FAST AP，68μlDEPC-H2O；
1×PNK+EGTA缓冲液：25ml1M Tris-HCl PH 7.4，3.8035g EGTA，2.5ml NP-40，加超纯水定容至500ml；
5)提取RNA：
洗脱溶液加入蛋白酶K，置热混仪上55℃,1000rpm，15s/3min处理2小时；Trizol法提取RNA，DEPE-H2O回溶；X蛋白和IgG样品提取的RNA均进行文库构建；
6)连接3’linker：
向3’linker连接混合体系中加入接头混合体系，置PCR仪中22℃反应2小时；
接头混合体系：5μl RNA，1μl 3’linker(Seq ID NO:1)，70℃反应2min，立即置冰上；
3’linker连接混合体系：2μl 10X T4RNA连接酶缓冲液，1μl T4RNA Ligase 1(NEB)，1μl RRI，3μl PEG8000，2μl 10mM ATP，5μl DEPC-H2O；
7)15％尿素PAGE胶分离3’linker连接产物：
将3’linker连接产物与等体积RNA loading bμffer混合，65℃加热10min，然后置于冰上，离心后准备上样；15％尿素PAGE胶180V电泳60min(溴酚蓝跑到胶块底端)；电泳结束，在紫外灯下，于干净的PE手套上切割39-54nt的胶块。
15％尿素PAGE胶配方：0.9ml 10xTBE，3ml 45％丙烯酰胺，5ml 7M尿素溶液，60μl10％AP，6μl TEMED；
8)电洗脱回收RNA：
9)磷酸化：
配置PNK磷酸化体系：5μl 3’linker连接产物，1μl10X PNK Bμffer，1μl PNK，1μl10mM ATP，0.5μl RRI，1.5μl DEPC-H2O；磷酸化反应混合溶液在PCR仪中37℃,30min，70℃，5min；
10)连接5’linker：
取1.0μl 5’linker(Seq ID NO:2)，70℃,2min，立即置于冰上；配置5’linker连接反应体系：10μl PNK磷酸化产物，1.5μl10X T4RNA ligase Bμffer，1μl5’linker,0.15μl100mM ATP，1.3μl PEG8000，0.5μl RRI，1μl T4RNA ligase 1(NEB)；反应混合液在PCR仪中22℃,2小时；
二、紫外交联-免疫共沉淀获取的RNA结合蛋白的靶标RNA进行cDNA合成
1)RT-PCR扩增靶标RNA的DNA序列：
向15.45μl连接有5’linker和3’linker的靶标RNA中加入逆转录引物1μl(10μM)(Seq ID NO:3)，65℃热击5分钟，立即置于冰上，瞬间快速离心；将10μl逆转录反应混合体系和15.45μl靶标RNA和逆转录引物混匀，50℃反应30min，90℃反应5分钟，4℃保温cDNA；取5μlcDNA当作模板进行PCR扩增，反应体系如下:15.7μl DEPC-H2O,6μl5×HF Bμffer,1μl10mM dNTP,5μl cDNA,1μl 10μM PCR正向引物(Seq ID NO:4),1μl 10μMPCR反向引物(SeqID NO:3),0.3μl phusion hot start II DNA polymerase；反应条件为：98℃变性30秒，98℃变性10秒，60℃褪火30秒，72℃延伸30秒，反应25-30个循环，最后72℃延伸5分钟。靶标RNA逆转录PCR为DNA后，其大小(包含两端linker的长度)介于100-200bp之间，所以胶上在此区间内的DNA可能为靶标序列；
2)cDNA文库回收:
12％的PAGE胶电泳，切取140—200bp之间的胶块；电洗脱回收，10μl回溶；illμmina Nex500仪器高通量测序；高通量测序结果分析得到插入片段大小集中在15-50bp，以IgG样本为背景，对X蛋白样本进行Peak Calling，得到实验样本特异的结合峰(peak)并进行统计结合峰在参考基因组上各个区域的分布情况，得到X蛋白的RNA标签在基因组不同区域的分布；用HOMER(Hypergeometric Optimization of Motif EnRichment)对实验样本特异的结合峰进行motif分析。
针对Clip-seq流程复杂，需要特殊仪器，需要使用放射性的元素32P危害身体的问题，本发明简化实验流程，去掉同位素标记步骤，加入IgG抗体阴性对照样品扣除非特异结合和背景对实验结果的影响，达到与Clip-seq同等质量的数据结果。
附图说明
图1为现有CLIP-seq方案流程图；
图2为本发明方案流程图；
图3为某蛋白ΜV交联后的IP效果图；
图4为文库测序后，RNA片段长度统计图；
4A为专利流程文库插入片段大小；4B是普通RIP-seq文库插入片段大小；
图5为文库测序后reads在参考基因组上的分布图；
5A代表专利方法测序peaks在基因组上分布；5B代表普通RIP-seq测序peaks在基因组上分布；
图6为文库测序后蛋白结合基序展示图；
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】RNA linker的设计与合成
使用的linker序列与illμmina的Nex-500测序仪匹配：
3’linker：5‘-PO4ATC TGG AAT TCT CGG GTG CCA AGG-Puromycin 3’(Seq IDNO:1)；
5’linker：5‘Biotin-TGG AAT TCT CGG GTG CCA AGG 3’(Seq ID NO:2)；
3’linker 3’端的嘌呤霉素与5’linker的5’端生物素起封闭linker末端防止首尾自连的作用。
逆转录引物为3’linker的反向互补DNA序列即：
5’CCT TGG CAC CCG AGA ATT C(Seq ID NO:3)，
PCR所用的正向引物：
5’AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC AGG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA(Seq IDNO:4)；
反向引物即逆转录引物。
【实施例2】紫外交联及细胞裂解液的制备
1)使用150mm细胞培养皿培养HeLa细胞，培养基用DMEM(Invitrogen)，待细胞丰度达到80％以上时弃去培养基，用1xPBS缓冲液漂洗2次后，再加入适量PBS缓冲液覆盖过细胞表面；
2)将培养皿置于冰上，放入HL-2000交联仪(ΜVP)下部的抽屉中，使400mj/cm2能量的254nm紫外线照射1次。而后取出培养皿，倒去PBS，加入15ml PBS，用细胞刮将细胞刮下；
3)用移液器将所有细胞的PBS悬液吸入15ml离心管，4℃4000rpm离心5分钟，去上清。加入1.5ml PBS，用移液器吹起沉淀，转入干净的1.5ml离心管中(DEPC处理或者使用进口RNase free的离心管)，再次4000rpm离心5分钟，去上清，放入-80℃保存备用或者直接使用；
4)向收集的细胞沉淀中加入600μl Wash buffer，吹打数下直至细胞沉淀全部重悬，置于冰上15-20分钟，每隔5分钟将细胞颠倒混匀；
5)向细胞裂解液中加入30μl RQ1DNA酶(Promega)，30μl RNA酶抑制剂(TaKaRa)混仪(Thermomixer，Eppendorf)上两分钟(1000rpm，37℃)；
6)将离心管放冰上5分钟。然后放入预冷4℃的冷冻离心机中10,000rpm离心20分钟，再用移液器吸出上清，保留50μl用以Western检测。
Wash buffer：
【实施例3】RNA分子的片段化
在第一次对一个蛋白进行RIP实验时，需要摸索最适的微球菌核酸酶MicrococalNμclease酶(MNase)(Fermentas公司)浓度，使RNA tag至少在20个核苷酸(20个核苷酸是ΜCSC Genome Browser进行基因组比对最短长度)以上，平均长度在30-60个核苷酸为宜。
1)根据摸索的浓度加入Micrococal Nμclease酶，10X MNase缓冲液，放于热混仪上10分钟，1000rpm，每3分钟混15秒；
2)加入EDTA+EGTA溶液螯合体系中的Ca2+，终止反应。
【实施例4】免疫共沉淀
1)将蛋白A或G磁珠(Protein A beads，Dynal beads，Invitrogen 100.02)分别取300μl与X蛋白的抗体和阴性对照IgG抗体分别进行偶联，放4℃混合一个小时，偶联完毕后，将离心管置于磁分离架上，待磁珠沉淀后吸出上清；
2)加入900μl Wash buffer(同实施例2)重悬磁珠，放至磁分离架上至磁珠沉淀，如此重复三次；
3)取实施例3中MNase片段化后的细胞裂解液700μl各2管，分别加入到2)中的X蛋白抗体偶联磁珠和阴性对照IgG抗体偶联磁珠中，重悬磁珠直至全部悬浮于细胞裂解液中，置于旋转混合仪上，放4℃混合一个小时；
4)用移液器取出上清，保留50μl用以Western检测IP效率，其余上清丢弃；
5)在结合了研究蛋白和阴性对照IgG抗体的磁珠中加入900μl Wash buffer，如前所述洗剂磁珠两次，再加入High-salt wash buffer洗剂磁珠两次，最后用1×PNK缓冲液洗剂磁珠两次。(X抗体及阴性对照IgG抗体的IP效率检测见图3)
High-salt wash buffer：
1×多核苷酸激酶缓冲液(1×PNK bμffer)：
【实施例5】去磷酸化
1)配置去磷酸化混合体系：
2)用FAST AP反应混合体系分别重悬X蛋白抗体磁珠和阴性对照IgG抗体磁珠，置于热混仪上37℃1000rpm每3分钟震荡15秒保温10分钟；
3)用1ml 1×PNK+EGTA缓冲液洗涤磁珠2次；
4)用1ml 1×PNK缓冲液洗涤磁珠2次；
5)100μl Elution buffer分别重悬X蛋白和IgG磁珠，置于热混仪上70℃1000rpm处理10分钟，再置于磁分离架上，1分钟后取上清转移至新的EP管中。
1×PNK+EGTA bμffer：
Elution buffer：
【实施例6】提取RNA
1)100μl的洗脱溶液加入蛋白酶K，置热混仪上55℃,1000rpm，15s/3min处理2小时；
2)Trizol法提取RNA，5μl DEPE-H2O回溶。
【实施例7】连接3’linker
X蛋白抗体捕获RNA和阴性对照IgG抗体捕获RNA同时建库。
1)制备接头混合体系：
70℃反应2min，立即置冰上。
2)配制3’linker连接混合体系：
3)向3’linker连接混合体系中加入接头混合体系，置PCR仪中22℃反应2小时。
【实施例8】15％尿素PAGE胶分离3’linker连接产物
1)15％尿素PAGE胶配方：
2)将3’linker连接产物与等体积RNA loading buffer混合，65℃加热10min，然后置于冰上，离心后准备上样；
3)取5μl的10bp DNA Ladder、5μl的oligo DNA(30bp，40pmol/μl)与等体积含EB的RNA loading buffer混合，准备上样；
4)电泳条件：1xTBE，180V预电泳20min，上样(由左至右上样顺序：10bp DNALadder，oligo DNA，样品RNA，每个样品之间至少间隔两个孔)，180V电泳60min(溴酚蓝跑到胶块底端)；
5)电泳结束，在紫外灯下，于干净的PE手套上切割39-54nt的胶块。
【实施例9】电洗脱回收RNA
1)封闭电泳槽的出水口，倒入0.5xTBE至置胶凹槽上边缘(不能没及，约550ml)；
2)将胶块放入置胶凹槽内，记下每个样品的放置位置，向V型槽中小心缓慢加入200μl 3M醋酸钠(pH5.2)，100V恒压洗脱1h；
3)从电泳槽的出水口缓慢放出电泳槽中的缓冲液至置胶凹槽缺口以下，小心吸出V型槽中的洗脱液至1.5ml RNase-free EP管中；
4)洗脱后沉淀浓缩小RNA：向洗脱液中加入3倍体积乙醇，-70℃1-2h；
5)13,200rpm，4℃离心30min，弃上清，1m 75％乙醇洗涤，13,200rpm，4℃离心10min，弃上清，再瞬时离心，用200μl的移液枪尽量吸尽乙醇(小心操作，防止RNA被吸走)，适度干燥，加5μl DEPC-treated水溶解。
【实施例10】磷酸化
1)配置PNK磷酸化体系：
2)磷酸化反应混合溶液在PCR仪中37℃,30min，70℃，5min。
【实施例11】连接5’linker
1)取1.0μl 5’linker，70℃,2min，立即置于冰上；
2)配置5’linker连接反应体系：
3)反应混合仪在PCR仪中22℃,2小时。
【实施例12】RT-PCR扩增靶标RNA的DNA序列
1)向15.45μl连接有5’linker和3’linker的靶标RNA中加入如实施例1中所述之逆转录引物1μl(10μM)，65℃热击5分钟，立即置于冰上，瞬间快速离心；
2)配制逆转录反应混合体系(逆转录酶SuperscriptIII及其缓冲液购自Invitrogen公司)：
3)将10μl逆转录反应混合体系和15.45μl靶标RNA和逆转录引物混匀，50℃反应30min，90℃反应5分钟，4℃保温cDNA；
4)取5μlcDNA当作模板进行PCR扩增，反应体系如下:
反应条件为：98℃变性30秒，98℃变性10秒，60℃褪火30秒，72℃延伸30秒，反应25-30个循环，最后72℃延伸5分钟。靶标RNA逆转录PCR为DNA后，其大小(包含两端linker的长度)介于100-200bp之间，所以胶上在此区间内的DNA可能为靶标序列。
【实施例13】cDNA文库回收
1)12％的PAGE胶电泳，切取140—200bp之间的胶块；
2)参照实施例9的方法电洗脱回收，10μl回溶；
3)公司的illumina Nex500仪器高通量测序。
4)高通量测序结果分析得到插入片段大小集中在15-50bp(图4A)，而普通RIP-seq却集中在140bp以上了(图4B)。IgG样本为背景，对X蛋白样本进行Peak Calling，得到实验样本特异的结合峰(peak)并进行统计结合峰在参考基因组上各个区域的分布情况，得到X蛋白的RNA标签在基因组不同区域的分布，如图5中所示5'UTR分布5.75％，3'UTR分布12.03％，CDS分布54.85％，Introns分布11.94％，Intergenic分布0.36％。用HOMER(Hypergeometric Optimization of Motif EnRichment)对实验样本特异的结合峰进行motif分析，得到如图6所示排名前3的Motif。

Claims (1)

1.一种改进的鉴定细胞样品中RNA结合蛋白的靶标RNA序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
一、紫外交联-免疫共沉淀获得RNA结合蛋白的靶标RNA
1)紫外交联及细胞裂解液的制备：
采用254m波长的紫外光，400mj/cm2的能量照射细胞，使细胞中的直接相互作用的蛋白质和RNA之间形成共价键，得到蛋白-RNA复合物；向收集的细胞沉淀中加入Wash buffer，获得细胞裂解液；向细胞裂解液中加入RQ1 DNA酶，TaKaRa RNA酶抑制剂，Thermomixer混仪上1000rpm，37℃，两分钟；放冰上5分钟；然后放入预冷4℃的冷冻离心机中10,000rpm离心20分钟，再用移液器吸出上清；
Wash buffer：50ml 10X PBS，0.5g SDS，2.5g脱氧胆酸钠，2.5ml NP-40，加超纯水定容至500ml；
2)RNA分子的片段化：
使用微球菌核酸酶MNase对紫外交联后的靶标RNA作不完全酶解，使RNA tag至少在20个核苷酸以上，在酶解结束后，使用能去除Ca2+离子的螯合剂使该酶失活，获得MNase片段化后的细胞裂解液；
3)免疫共沉淀：
将蛋白A或G磁珠分别与研究蛋白X蛋白的抗体和阴性对照IgG抗体分别进行偶联，放4℃混合一个小时，偶联完毕后，将离心管置于磁分离架上，待磁珠沉淀后吸出上清；加入1)中的Wash buffer重悬磁珠，放至磁分离架上至磁珠沉淀，如此重复三次；取2)中MNase片段化后的细胞裂解液各2管，分别加入到X蛋白抗体偶联磁珠和阴性对照IgG抗体偶联磁珠中，重悬磁珠直至全部悬浮于细胞裂解液中，置于旋转混合仪上，放4℃混合一个小时；用移液器取出上清；在结合了研究蛋白和阴性对照IgG抗体的磁珠中加入1)中的Wash buffer，如前所述洗剂磁珠两次，再加入高盐缓冲液洗剂磁珠两次，最后用1×PNK缓冲液洗剂磁珠两次；
High-salt wash buffer：250ml 10X PBS，0.5g SDS，2.5g脱氧胆酸钠，2.5mlNP-40，加超纯水定容至500ml；
1×多核苷酸激酶缓冲液(1×PNK bμffer)：25ml 1M Tris-HCl PH 7.4，1.0165gMgCl2，2.5ml NP-40，加超纯水定容至500ml；
Elution buffer：5ml 1M NaHCO3，0.5g SDS，加超纯水定容至50ml；
4)去磷酸化：
用FAST AP反应混合体系分别重悬X蛋白抗体磁珠和阴性对照IgG抗体磁珠，置于热混仪上37℃1000rpm每3分钟震荡15秒保温10分钟；用1ml 1×PNK+EGTA缓冲液洗涤磁珠2次；用1ml 1×PNK缓冲液洗涤磁珠2次；Elution buffer分别重悬X蛋白和IgG磁珠，置于热混仪上70℃1000rpm处理10分钟，再置于磁分离架上，1分钟后取上清转移至新的EP管中；
去磷酸化混合体系(FAST AP反应)：8μl 10X FAST AP缓冲液，4μl FASTAP，68μl DEPC-H2O；
1×PNK+EGTA缓冲液：25ml1M Tris-HCl PH 7.4，3.8035g EGTA，2.5mlNP-40，加超纯水定容至500ml；
5)提取RNA：
洗脱溶液加入蛋白酶K，置热混仪上55℃,1000rpm，15s/3min处理2小时；Trizol法提取RNA，DEPE-H2O回溶；X蛋白和IgG样品提取的RNA均进行文库构建；
6)连接3’linker：
向3’linker连接混合体系中加入接头混合体系，置PCR仪中22℃反应2小时；
接头混合体系：5μl RNA，1μl 3’linker(Seq ID NO:1)，70℃反应2min，立即置冰上；
3’linker连接混合体系：2μl 10X T4RNA连接酶缓冲液，1μl T4RNA Ligase1(NEB)，1μlRRI，3μl PEG8000，2μl 10mM ATP，5μl DEPC-H2O；
7)15％尿素PAGE胶分离3’linker连接产物：
将3’linker连接产物与等体积RNA loading bμffer混合，65℃加热10min，然后置于冰上，离心后准备上样；15％尿素PAGE胶180V电泳60min(溴酚蓝跑到胶块底端)；电泳结束，在紫外灯下，于干净的PE手套上切割39-54nt的胶块；
15％尿素PAGE胶配方：0.9ml 10xTBE，3ml 45％丙烯酰胺，5ml 7M尿素溶液，60μl 10％AP，6μl TEMED；
8)电洗脱回收RNA：
9)磷酸化：
配置PNK磷酸化体系：5μl 3’linker连接产物，1μl10X PNK Bμffer，1μl PNK，1μl 10mMATP，0.5μl RRI，1.5μl DEPC-H2O；磷酸化反应混合溶液在PCR仪中37℃,30min，70℃，5min；
10)连接5’linker：
取1.0μl 5’linker(Seq ID NO:2)，70℃,2min，立即置于冰上；配置5’linker连接反应体系：10μl PNK磷酸化产物，1.5μl10X T4RNA ligase Bμffer，1μl5’linker,0.15μl 100mMATP，1.3μl PEG8000，0.5μl RRI，1μl T4RNA ligase 1(NEB)；反应混合液在PCR仪中22℃,2小时；
二、紫外交联-免疫共沉淀获取的RNA结合蛋白的靶标RNA进行cDNA合成
1)RT-PCR扩增靶标RNA的DNA序列：
向15.45μl连接有5’linker和3’linker的靶标RNA中加入逆转录引物1μl(10μM)(SeqID NO:3)，65℃热击5分钟，立即置于冰上，瞬间快速离心；将10μl逆转录反应混合体系和15.45μl靶标RNA和逆转录引物混匀，50℃反应30min，90℃反应5分钟，4℃保温cDNA；取5μlcDNA当作模板进行PCR扩增，反应体系如下:15.7μl DEPC-H2O,6μl5×HF Bμffer,1μl10mMdNTP,5μl cDNA,1μl10μM PCR正向引物(Seq ID NO:4),1μl 10μMPCR反向引物(Seq ID NO:3),0.3μl phusion hot start II DNA polymerase；反应条件为：98℃变性30秒，98℃变性10秒，60℃褪火30秒，72℃延伸30秒，反应25-30个循环，最后72℃延伸5分钟。靶标RNA逆转录PCR为DNA后，其大小(包含两端linker的长度)介于100-200bp之间，所以胶上在此区间内的DNA可能为靶标序列；
2)cDNA文库回收:
12％的PAGE胶电泳，切取140—200bp之间的胶块；电洗脱回收，10μl回溶；illμminaNex500仪器高通量测序；高通量测序结果分析得到插入片段大小集中在15-50bp，以IgG样本为背景，对X蛋白样本进行Peak Calling，得到实验样本特异的结合峰(peak)并进行统计结合峰在参考基因组上各个区域的分布情况，得到X蛋白的RNA标签在基因组不同区域的分布；用HOMER(Hypergeometric Optimization of Motif EnRichment)对实验样本特异的结合峰进行motif分析。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019153851A1 (zh) * 2018-02-11 2019-08-15 北京大学 一种融合蛋白、试剂盒以及CHIP-seq检测方法
CN110205365A (zh) * 2019-07-02 2019-09-06 中山大学孙逸仙纪念医院 一种高效研究rna相互作用组的高通量测序方法及其应用
CN111020018A (zh) * 2019-11-28 2020-04-17 天津金匙医学科技有限公司 一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒
CN111458518A (zh) * 2020-04-03 2020-07-28 中国医科大学 一种简便rna结合蛋白免疫沉淀试剂盒开发及应用
CN111560423A (zh) * 2020-06-05 2020-08-21 中山大学孙逸仙纪念医院 一种高通量高灵敏度单碱基分辨率检测RNA m6A的方法及其应用
CN111909991A (zh) * 2019-05-09 2020-11-10 中国科学院生物物理研究所 一种捕获rna原位高级结构及相互作用的方法
EP4079813A1 (en) * 2021-04-23 2022-10-26 Omya International AG Buffer composition comprising a first and a second buffer component

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102628038A (zh) * 2012-04-09 2012-08-08 武汉生命之美科技有限公司 一种改进的clip法鉴定rna结合蛋白的靶标rna的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102628038A (zh) * 2012-04-09 2012-08-08 武汉生命之美科技有限公司 一种改进的clip法鉴定rna结合蛋白的靶标rna的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEROME E LEE ET AL.: "Highly efficient ligation of small RNA molecules for microRNA quantitation by high-throughput sequencing", 《JOURNAL OF VISUALIZED EXPERIMENTS》 *
YOICHIRO SUGIMOTO ET AL.: "hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1", 《NATURE》 *
杨薇 等: "染色质免疫共沉淀-测序(ChIP-Seq)技术及数据分析方法介绍", 《河南科学》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019153851A1 (zh) * 2018-02-11 2019-08-15 北京大学 一种融合蛋白、试剂盒以及CHIP-seq检测方法
CN111909991A (zh) * 2019-05-09 2020-11-10 中国科学院生物物理研究所 一种捕获rna原位高级结构及相互作用的方法
CN111909991B (zh) * 2019-05-09 2021-08-03 中国科学院生物物理研究所 一种捕获rna原位高级结构及相互作用的方法
CN110205365A (zh) * 2019-07-02 2019-09-06 中山大学孙逸仙纪念医院 一种高效研究rna相互作用组的高通量测序方法及其应用
CN111020018A (zh) * 2019-11-28 2020-04-17 天津金匙医学科技有限公司 一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒
CN111458518A (zh) * 2020-04-03 2020-07-28 中国医科大学 一种简便rna结合蛋白免疫沉淀试剂盒开发及应用
CN111458518B (zh) * 2020-04-03 2023-10-27 中国医科大学 一种简便rna结合蛋白免疫沉淀试剂盒开发及应用
CN111560423A (zh) * 2020-06-05 2020-08-21 中山大学孙逸仙纪念医院 一种高通量高灵敏度单碱基分辨率检测RNA m6A的方法及其应用
CN111560423B (zh) * 2020-06-05 2023-11-24 中山大学孙逸仙纪念医院 一种高通量高灵敏度单碱基分辨率检测RNA m6A的方法及其应用
EP4079813A1 (en) * 2021-04-23 2022-10-26 Omya International AG Buffer composition comprising a first and a second buffer component
WO2022223804A1 (en) * 2021-04-23 2022-10-27 Omya International Ag Buffer composition comprising a first and a second buffer component

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