CN102628038A - 一种改进的clip法鉴定rna结合蛋白的靶标rna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫外交联-免疫共沉淀法鉴定RNA结合蛋白的靶标RNA方法，该方法采用微球菌核酸酶（micrococcalnuclease）来替代RNaseA和RNaseT1来做不完全酶解，通过酶解结束后通过去除溶液中的钙离子（Ca²⁺）即使该核酸酶完全失活。此外在酶解结束后采用先连接5’RNAlinker再连接3’RNAlinker的方式来给靶标RNA的两端加上接头。本发明使用微球菌核酸酶作部分RNA消解，有效地减少了靶标RNA的降解；采用先连接5’RNAlinker的方案，克服了可能存在的蛋白复合物在3’端形成的空间位阻，提高了CLIP技术的成功率。

Description

一种改进的CLIP法鉴定RNA结合蛋白的靶标RNA的方法

技术领域

本发明属于分子生物学及细胞生物学领域，涉及对细胞内RNA结合蛋白所结合的靶标RNA基序的鉴定。更准确地说，本发明是对一项已发表的紫外交联-免疫共沉淀偶联实验技术的改良与优化。

背景技术

RNA结合蛋白是生物体内一大类十分重要的蛋白，具有广泛的生物学功能。许多RNA结合蛋白被发现与众多人类的疾病有关，例如自身免疫疾病和神经性疾病。要理解这些RNA结合蛋白在正常和非正常细胞中所发挥的作用就需要首先鉴定出它们在体内所结合的靶标RNA所处的位置以及这些靶标RNA的基序。过去鉴定这些靶标RNA常用的手段主要是通过体外指数富集配基的系统进化技术(SELEX，Singh R，Valcarcel J，Green MR 1995 Distinct binding specificities andfunctions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.Science 268(5214)：1173-1176)；结合体内免疫共沉淀获得RNA-蛋白质复合物偶联基因芯片分析的技术(Buckanovich RJ，Darnell RB 1997 The neuronal RNA binding protein Nova-1recognizes specific RNA targets in vitro and in vivo.Mol.Cell.Biol.17(6)3194-3201；Tenenbaum SA，Carson CC，Lager PJ，Keene JD 2000 Identifying mRNA subsets inmessenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.PNAS 97(26)14085-14090；Jensen KB，Dredge BK，Stefani G，Zhong R，Buckanovich RJ，OkanoHJ，Yang Yolanda YL，Darnell RB 2000 Nova-1 regulates neuron-specific alternativesplicing and is essential for neuronal viability.Neuron 25 359-371；Darnell JC，Jensen KB，Jin P，Brown V，Warren ST，Darnell RB 2001 Fragile X mental retardationprotein targets G quartet mRNAs important for neuronal function.Cell 107 489-499；Brown V，Jin P，Ceman S，Darnell JC，O’Donnell WT，Tenenbaum SA，Jin X，Feng Y，Wilkinson KD，Keene JD，Darnell RB，Warren ST 2001 Microarray identification ofFMRP-associated brain mRNAs and altered mRNA translational profiles in fragile Xsyndrome Cell.107(4)477-487)。但这些手段存在很重要的缺陷，例如信噪比很低，无法区分RNA和蛋白质是直接相互作用还是间接相互作用，以及无法知道蛋白质所结合的RNA的具体区域等。

紫外交联-免疫共沉淀技术(UV Crosslinking-Immunopricipitation，CLIP)是一种自2003年起兴起的实验技术，由美国洛克菲勒大学的Darnell教授实验室首先发明(Ule J，Jensen KB，Ruggiu M，Mele A，Ule A，Darnell RB 2003 CLIPidentifies NOVA-regulated RNA networks in the brain.Science 302(5648)1212-1215)。该方法首先用365nm波长的紫外光照射组织或细胞，使组织或细胞中的直接相互作用的蛋白质和RNA之间形成共价键(得到蛋白-RNA复合物)，而RNA与RNA之间此时则不会形成共价键。因为只有直接相互作用的蛋白质与RNA(距离在

以内)在这种条件下才能交联形成共价键，所以排除了间接相互作用。另外由于形成了共价键，蛋白-RNA复合物可以承受后续步骤中更严格的处理，如在SDS-PAGE电泳中的分离，转膜等。而且由于蛋白交联结合的保护，还可以对样品作部分的核酸酶降解处理进而得到被RNA结合蛋白保护的核心片段，这些片段通常为30-100个碱基的RNA标签序列(RNA tag)。该实验技术结合最近兴起的第二代高通量测序技术(The Second-Generation DNA Sequencing)，成功鉴定了多种RNA结合蛋白体内结合的靶标RNA的基序以及在基因组中的分布(Yeo GW，Coufal NG，Liang TY，Peng GE，Fu XD，Gage FH 2009 An RNA code forthe FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stemcells.Nat.Struct.Mol.Biol.16(2)130-137；Xue YC，Zhou Y，Wu TB，Zhu T，Ji X，Kwon YS，Zhang C，Yeo G，Black DL，Sun H，Fu XD，Zhang Y 2009 Genome-wideanalysis of PTB-RNA interactions reveals a strategy used by the general splicingrepressor to modulate exon inclusion or skipping.Mol.Cell.36(6)996-1006；iCLIP，Koenig J，Zarnack K，Rot G，Curk T，Kayikci M，Zupan B，Turner DJ，Luscombe NM，Ule J 2010 iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individualnucleotide resolution.Nat.Struct.Mol.Biol.17(7)909-915；Licatalosi DD，Mele A，FakJJ，Ule J，Kayikci M，Chi SW，Clark TA，Schweitzer AC，Blume JE，Wang X，DarnellJC，Darnell RB 2008 HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternativeRNA processing Nature.456(7221)464-469)。

鉴于CLIP技术的强大功能，在最初基础之上作出改进的CLIP方法近两年也开始陆续被报道，例如光可激活核苷酸增强紫外交联-免疫共沉淀技术(PAR-CLIP，Hafner M，Landthaler M，Burger L，Khorshild M，Hausser J，BerningerP，Rothballer A，Ascano Jr.M，Jungkamp AC，Munschauer M，Ulrich A，Wardle GS，Dewell S，Zavolan M，Tuschl T 2010 Transcriptome-wide identification of RNAbinding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP Cell.141(1)129-141)和单碱基分辨率紫外交联-免疫共沉淀技术(iCLIP，Koenig J，Zarnack K，Rot G，Curk T，Kayikci M，Zupan B，Turner DJ，Luscombe NM，Ule J 2010 iCLIP reveals thefunction of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.Nat.Struct.Mol.Biol.17(7)909-915)，这些改进的CLIP技术有效地提高了该方法捕获靶标RNA的效率，或提高了鉴定靶标RNA序列的分辨率。

目前对于蛋白-RNA复合物进行处理都是用RNase T1或RNase A做RNA的部分酶，然而本发明发现RNase A和RNase T1会很大程度影响下游实验，使得目标RNA降解。此外，已发表的CLIP实验方案中在部分降解RNA后都是先给靶标RNA 3’端连接RNA linker，而当RNA结合蛋白本身在3’RNA附近与其他蛋白形成复合物时，此时形成的空间位阻会使3’linker难以被连接上(图1)。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种改进的紫外交联-免疫共沉淀方法，用于靶标RNA的鉴定。

针对现有技术中CLIP都是用RNase T1或RNase A做RNA的部分酶解，造成对下游实验影响的问题，本发明采用微球菌核酸酶(micrococcal nuclease)来替代RNase A和RNaseT1，因为微球菌核酸酶的酶切活性依赖于Ca²⁺，酶切反应后加入含有EGTA缓冲液螯合掉溶液中的Ca²⁺，就可以让微球菌核酸酶完全失活，不影响下游实验。故，本发明首先提供微球菌核酸酶在紫外交联-免疫共沉淀中的用途。

针对现有技术中CLIP在部分降解RNA后都是先给靶标RNA 3’端连接RNAlinker可能会形成空间位阻致使3’linker难以被连接上的问题，本发明改用先连接5’RNA linker再连接3’RNA linker来解决该问题。

本发明首先提供一种紫外交联-免疫共沉淀获得RNA结合蛋白的靶标RNA方法，其包括使用微球菌核酸酶对紫外交联后的靶标RNA作不完全酶解。在酶解结束后使该核酸酶失活，具体可以使用能去除Ca²⁺离子的螯合剂使该酶失活，这种螯合剂可以是单一型的也可以是组合型的。

进一步本发明提供对紫外交联-免疫共沉淀获取的RNA结合蛋白的靶标RNA进行cDNA合成的方法：包括将上述方法获得的靶标RNA 5’末端磷酸化并连接5’RNA接头，之后对连接产物去磷酸化、分离和回收，之后连接3’RNA接头，并进行RT-PCR扩增，获得靶标RNA相应的cDNA文库。具体地，将样品经紫外交联后用微球菌核酸酶对靶标RNA作不完全酶解，酶解后使用能去除Ca2+离子的螯合剂使该酶失活，使靶标RNA 5’末端磷酸化并连接5’RNA接头，去磷酸化后进行SDS-PAGE分离，转膜，回收连接有5’RNA接头的游离靶标RNA，连接3’RNA接头，并进行RT-PCR，获得靶标RNA相应的cDNA文库。

上述5’RNA接头的5’端具有保护基团，以避免接头分子相互之间的连接，例如连接生物素进行封闭保护。类似的，3’RNA接头的3’端也具有保护基团，例如连接嘌呤霉素进行封闭保护。

上述5’RNA接头及3’RNA接头在设计时应考虑到后续的RT-PCR扩增，符合测序引物的相关设计要求即可。

本发明提供的一种改进的CLIP法法鉴定RNA结合蛋白的靶标RNA的方法，其包括按照上述方法进行cDNA合成，获得靶标RNA相应的cDNA文库，并对cDNA文库进行高通量测序，并根据测序结果进行基因定位。

更具体地，本发明采用如下技术方案：

1)收集组织或对数生长期的细胞，在紫外交联仪内置冰上以400mj/cm²的能量照射；

2)对收集到的细胞用裂解缓冲液在冰上裂解，加入无RNAase的DNA酶消解染色质DNA，然后用偶联有特异性单抗的磁珠纯化出蛋白-RNA复合物；

3)利用微球菌核酶(micrococal nuclease)对蛋白-RNA复合物进行片断化，通过控制酶的浓度及反应时间使得靶标mRNA大小在30-60nt之间；

4)以α-³²P-ATP标记靶标RNA 5’端，之后进行5’端的linker连接；

5)靶标RNA连接5’端linker之后，对靶标RNA去磷酸化，以SDS-PAGE胶分离，转膜后，从膜上切下对应大小的目标蛋白-RNA复合物条带后，用蛋白酶K进行消解、酚：氯仿抽提而后酒精沉淀得到连接有5’linker的自由的靶标RNA；

6)再连接3’linker，然后进行RT-PCR、连T载体、克隆，少量样品作低通量的常规测序检测；

7)低通量测序检测样品序列和分布正确后，再进行高通量测序(如采用Solexa1G genome analyzer测序)；

8)对得到的RNA标签(tag)进行基因组定位、分析。

本发明使用微球菌核酸酶作部分RNA消解，有效地减少了靶标RNA的降解；采用先连接5’RNA linker的方案，克服了可能存在的蛋白复合物在3’端形成的空间位阻，提高了CLIP技术的成功率。

附图说明

图1为蛋白质复合物可能对靶标RNA 3’末端造成空间位阻的原理图；

图2为本发明改进的紫外交联-免疫共沉淀(CLIP)流程图；

图3为免疫共沉淀效率的检测结果，图中INPUT为细胞裂解液，Beads为偶联抗体的A蛋白磁珠，SUP为免疫共沉淀后的上清，αU2AF65-IP表示磁珠偶联的抗体为U2AF65的抗体，Ctrl-IP表示磁珠偶联的抗体是鼠源IgG；αACTB是作为western杂交内参的β肌动蛋白；

图4为微球菌核酸酶对RNA的酶切结果；

图5为CLIP-PCR的结果；

图6为高通量测序结果。

具体实施方式

以下结合实施例进一步具体说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1：RNA linker的设计与合成

使用的linker序列与UCSD的Solexa测序仪匹配，序列为5’linker：5’Biotin-AAU GAU ACG GCG ACC ACC GA 3’；3’linker：5’PO4-UCG UAU GCCGUC UUC UGC UUG-Puromycin。5’linker的5’端生物素与3’linker 3’端的嘌呤霉素如前文所述起封闭linker末端防止首尾自连的作用。逆转录引物为3’linker的反向互补DNA序列即：5’CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA，PCR所用的正向引物为5’AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA，反向引物即逆转录引物。

实施例2：紫外交联及细胞裂解液的制备

1)使用150mm细胞培养皿培养HeLa细胞，培养基用DMEM(Invitrogen)，待细胞丰度达到80％以上时弃去培养基，用1xPBS缓冲液漂洗2次后，再加入适量PBS缓冲液覆盖过细胞表面；

2)将培养皿置于冰上，放入HL-2000交联仪(UVP)下部的抽屉中，使用400mj/cm²能量的254nm紫外线照射1到1.5分钟。而后取出培养皿，倒去PBS，加入15ml PBS，用细胞刮将细胞刮下；

3)用移液器将所有细胞的PBS悬液吸入15ml离心管，4℃ 4000rpm离心5分钟，去上清。加入1.5ml PBS，用移液器吹起沉淀，转入干净的1.5ml离心管中(DEPC处理或者使用进口RNase free的离心管)，再次4000rpm离心5分钟，去上清，放入-80℃保存备用或者直接使用；

4)向收集的细胞沉淀中加入600μl洗脱缓冲液，吹打数下直至细胞沉淀全部重悬，置于冰上15-20分钟，每隔5分钟将细胞颠倒混匀；

5)向细胞裂解液中加入30μl RQ1 DNA酶(Promega)，30μl RNA酶抑制剂(TaKaRa)混仪(Thermomixer，Eppendorf)上两分钟(1000rpm，37℃)；

6)将离心管放冰上5分钟。然后放入预冷4℃的冷冻离心机中10,000rpm离心20分钟，再用移液器吸出上清，保留50μl用以Western检测。

洗脱缓冲液：

实施例3：免疫共沉淀

1)将蛋白A磁珠(Protein A beads，Dynal beads，Invitrogen 100.02)300μl与U2AF65的单抗(MC3，Abcam公司)偶联，偶联完毕后，将离心管置于磁分离架上，待磁珠沉淀后吸出上清；

2)加入900μl洗脱缓冲液(同实施例2)重悬磁珠，放至磁分离架上至磁珠沉淀，如此重复三次；

3)取实施例1中细胞裂解液700μl加入到2)中的磁珠中，重悬磁珠直至全部悬浮于细胞裂解液中，置于旋转混合仪上，放4℃混合一个小时；

4)用移液器取出上清，保留50μl用以Western检测IP效率(图3)，其余上清丢弃；

5)在结合了U2AF65蛋白的磁珠中加入900μl洗脱缓冲液，如前所述洗脱两次，再加入高盐洗脱缓冲液(High-salt wash buffer)洗脱两次，最后用1×PNK缓冲液清洗两次；

高盐洗脱缓冲液

1×多核苷酸激酶缓冲液(1×PNK buffer)

1×PNK+EGTA缓冲液

实施例4：RNA标签的片段化

在第一次对一个蛋白进行CLIP实验时，需要摸索最适的微球菌核酸酶Micrococal Nuclease酶(MNase)(Fermentas公司)浓度，使RNA tag至少在20个核苷酸(20个核苷酸是UCSC Genome Browser进行基因组比对最短长度)以上，平均长度在30-60个核苷酸为宜。

取0.5μl的MNase，加入499.5μl的1×MNase缓冲液中，混匀(1∶1000稀释，终浓度为0.3U/μl)，再按1∶50,000，1∶100,000，1∶1,000,000几个倍数稀释；稀释后终浓度分3x10^-6，6x10^-6，6x10^-7U/μl。

将磁珠分成3份，每份用一个浓度的MNase重悬洗脱后的磁珠，放于热混仪上10分钟，1000rpm，每3分钟混15秒使磁珠悬浮。10分钟后置于磁分离架上，去上清，加入1×PNK+EGTA缓冲液，洗脱两次。接着用洗脱缓冲液和1×PNK缓冲液先后洗脱两次，完全洗去MNase及残留反应缓冲液；

1)用α-³²P-ATP标记靶标RNA的5’末端，制备标记反应体系如下(PNK及其缓冲液为Fermentas-MBI公司产品，α-³²P-ATP购自北京福瑞公司)：

标记反应混合体系

用80μl标记混合液重悬磁珠，置于热混仪以上30分钟，期间每隔3分钟震动混合15秒；

2)分别用1×PNK+EGTA缓冲液、洗脱缓冲液和0.2μg/μl牛血清白蛋白(BSA)各洗脱磁珠2次以洗去游离的α-³²P-ATP；

3)取20μl 2×PNK+EGTA缓冲液，加入20μl 2×蛋白上样缓冲液后重悬每份磁珠，置于热混仪上70℃ 1000rpm处理10分钟，再置于磁分离架上，1分钟后取上清；

2×蛋白上样缓冲液

4)配制NuPAGE(10％，10well，Invitrogen)预制胶所用1×MOPS runningbuffer 400ml，将NuPAGE预制胶放入电泳槽(Surelock，Invitrogen)中，

倒入1×MOPS running buffer，每孔点入样品20μl，120V电泳1个半小时；

20×MOPS SDS电泳缓冲液配制

5)取下NuPAGE胶，转NC膜，200mA恒流转膜1小时40分钟。

20×Transfer buffer(转膜缓冲液)

1×转膜缓冲液

6)取出NC膜，在1×PBS中漂洗一次后用滤纸吸干，包上保鲜膜，贴在暗盒中压X光片或者压磷屏以观察蛋白质-RNA复合体的迁移情况。最适合的MNase浓度通过显影后的样品条带的弥散程度确定，如果预期位置条带比较清晰则标明MNase浓度偏高。而预期位置的条带附近呈现出明显弥散状时则说明酶浓度合适。研究表明，1∶1000,000稀释对U2AF65蛋白的靶标RNA比较合适(图4)。

实施例5：5’末端标记和5’linker连接

1)重新取同样量的-80℃保存的细胞，按1∶1000,000稀释的MNase重复从实施例2的4)至实施例4的3)；

2)向磁珠中加入1μl 10mM ATP，置于热混仪上1000rpm 37℃ 5分钟；

3)分别用1×PNK+EGTA缓冲液、洗脱缓冲液和0.2μg/μl牛血清白蛋白(BSA)各洗脱磁珠2次以洗去游离的α-³²P-ATP；

4)连接5’linker

制备连接反应混合体系如下(T4 RNA连接酶及缓冲液购自Fermentas-MBI)：

制备linker混合体系如下

将连接反应混合体系与linker混合体系混合，置于热混仪上16℃ 1000rpm每3分钟震荡15秒连接过夜；

5)配制新连接反应体系如下：

将新连接反应体系补加到过夜连接反应体系中，再继续反应3个小时；

6)反应体系置于磁分离架上，待磁珠沉淀后弃去上清，分别用以冰预冷的1×PNK+EGTA缓冲液、洗脱缓冲液和1×PNK缓冲液各洗涤磁珠2遍。

实施例6：去磷酸化、SDS-PAGE胶分离和转膜

1)配制FAST AP反应混合体系(碱性磷酸酶FAST AP及其缓冲液购自Fermentas-MBI公司)

2)用FAST AP反应混合体系重悬磁珠，置于热混仪上37℃ 1000rpm每3分钟震荡15秒保温10分钟；

3)用1ml 1×PNK+EGTA缓冲液洗涤磁珠2次；

4)取64μl 2×PNK+EGTA缓冲液，加入64μl 2×蛋白上样缓冲液后重悬磁珠，置于热混仪上70℃ 1000rpm处理10分钟，再置于磁分离架上，1分钟后取上清；；

5)重复实施例4的6)-8)。

由于U2AF65-U2AF35在细胞内是以一个稳定的复合物形式存在，所以用U2AF65的单抗可以捕获该复合物(实施例3)。在实施例4中，使用MNase处理该蛋白质复合物所结合的RNA，处于这两个复合物之间不被该复合物保护的RNA被成功切断。在实施例6的SDS-PAGE胶分离中，这两个复合物及其各自结合的RNA被成功分开。

实施例7：从膜上回收靶标RNA

1)用200℃高温处理1小时的刀片切下靶标RNA位置的NC膜，进一步切碎后置于1.5ml EP管内；

2)用200μl 1×PK缓冲液配制4mg/ml蛋白酶K溶液(蛋白酶K购自TaKaRa)，37℃预保温20分钟以去除RNase；

1×PK缓冲液(1×蛋白酶K缓冲液)

Tris-HCl pH 7.5    100mM

NaCl               50mM

EDTA               10mM

3)向装有膜碎片的EP管内加入处理好的蛋白酶K溶液，热混仪上37℃ 1000rpm每3分钟震荡15秒处理20分钟；

4)再向EP管内加入200μl 1×PK/7M尿素缓冲液，热混仪上37℃ 1000rpm每3分钟震荡15秒处理20分钟，其中1×PK缓冲液/7M尿素缓冲液为1×PK缓冲液中增加终浓度为7M的尿素

5)向EP管中加入400μl水饱和酚和130μl氯仿，热混仪上37℃ 1000rpm每3分钟震荡15秒处理20分钟；

6)4℃ 12,000离心20分钟，取上层水相，加入50μl 3M NaAc，0.5ml无水乙醇，0.5ml异丙醇和1μl肝糖，-20℃沉淀过夜或-80℃沉淀2小时；

7)4℃ 12,000离心20分钟，弃上清。沉淀以200μl 75％乙醇洗涤2次(注意洗涤时不可触动管底的沉淀)；

8)4℃ 12,000离心20分钟，弃上清，室温晾干RNA沉淀；

9)用6μl DEPC H₂O重悬RNA沉淀。

实施例8：连接3’RNA linker

1)配制3’linker连接混合体系：

2)向3’linker连接混合体系中加入回收得到的靶标RNA 5.9μl，轻混匀，16℃保温2小时；

3)配制RQI DNase反应混合体系：

4)向10μl连接体系里加入RQI DNase反应混合体系，混匀，37℃保温20分钟；

5)向4)中的反应体系中加入300μl DEPC H₂O，300μl无RNase水饱和酚及100μl氯仿，涡旋震荡混匀，分层后4℃ 12,000离心20分钟；

6)取上层水相，加入50μl 3M NaAc pH 5.2，0.5ml无水乙醇，0.5ml异丙醇和2μl肝糖，涡旋震荡混匀后-20℃沉淀过夜；

7)4℃ 12,000离心20分钟，用600μl 75％乙醇洗涤沉淀2次；

8)4℃ 12,000离心20分钟，弃上清，室温晾干RNA沉淀，溶于9μl DEPC H₂O。

实施例9：RT-PCR扩增靶标RNA的DNA序列，

1)向9μl连接有5’linker和3’linker的靶标RNA中加入如实施例1中所述之逆转录引物1μl(10μM)，65℃热击5分钟，立即置于冰上，瞬间快速离心；

2)配制逆转录反应混合体系(逆转录酶SuperscriptIII及其缓冲液购自Invitrogen公司)：

3)将10μl逆转录反应混合体系和10μl靶标RNA和逆转录引物混匀，50℃反应30分钟，90℃反应5分钟，4℃保温cDNA；

4)取3μlcDNA当作模板进行PCR扩增，反应体系如下(Ex-Taq酶及其缓冲液购自TaKaRa)：

反应条件为：94℃变性5分钟，94℃变性30秒，56℃褪火30秒，72℃延伸30秒，反应25-30个循环，最后72℃延伸5分钟。

靶标RNA逆转录PCR为DNA后，其大小(包含两端linker的长度)介于100-200bp之间，所以胶上在此区间内的DNA可能为靶标序列。

实施例10：cDNA文库质量的检测

1)用Qiagen公司的MiniElute Gel Extraction Kit试剂盒回收实施例9中的PCR产物，连T载体(TaKaRa)后转化大肠杆菌DH5α感受态，涂平板；

2)待平板上长出单菌落后，挑选单菌落若干，以T载体上的引物T7和SP6做菌落PCR鉴定，PCR程序为：95℃ 10分钟，95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，从第二步开始30个循环，72℃ 5分钟。大小为250bp以上的克隆合格(靶标RNA片段长度、两段RNA linker的长度再加上T载体上的部分序列长度之和在250bp以上)；

3)挑选50个左右的合格的阳性克隆送测序，将测序结果同人类基因组的序列进行匹配，初步鉴定整个CLIP流程所获得的cDNA文库的质量；

4)如果绝大部分测序结果在人类基因组上比对的结果合理，说明所获得的cDNA文库质量合格。此后将剩下的cDNA 7μl全部PCR扩增为双链DNA，送UCSD Solexa 1G genome analyzer测序仪作高通量测序并对后续的测序结果作分析(图6)。

高通量测序结果的分析得到U2AF65蛋白CLIP的RNA标签在人类基因组中的基本分布情况。如图中所示，在内含子区域分布的占39.54％，分布在基因间区域的占37％，分布在反义序列上的占14％，分布在启动子区域的占2％，分布在外显子区域的占5％，分布在外显子-内含子结合部的占1.75％。

序列表

 

<110>   武汉生命之美科技有限公司

 

<120>  一种改进的CLIP法鉴定RNA结合蛋白的靶标RNA的方法

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  20

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

aaugauacgg cgaccaccga                                                   20

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ucguaugccg ucuucugcuu g                                                 21

 

 

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

caagcagaag acggcatacg a                                                 21

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

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Claims (11)

1.微球菌核酸酶在紫外交联-免疫共沉淀技术中的应用。

2.一种紫外交联-免疫共沉淀获取RNA结合蛋白的靶标RNA方法，其包括使用微球菌核酸酶对紫外交联后的靶标RNA作不完全酶解。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其还包括在酶解后使用能去除Ca²⁺离子的螯合剂使该酶失活。

4.一种对紫外交联-免疫共沉淀获取的RNA结合蛋白的靶标RNA进行cDNA合成的方法，其包括对根据权利要求2或3所获得的靶标RNA 5’末端磷酸化并连接5’RNA接头，之后对连接产物去磷酸化、分离和回收，之后连接3’RNA接头，并进行RT-PCR扩增，获得靶标RNA相应的cDNA文库。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：将样品经紫外交联后用微球菌核酸酶对靶标RNA作不完全酶解，酶解后使用能去除Ca²⁺离子的螯合剂使该酶失活，对靶标RNA 5’末端进行磷酸化并加上5’RNA接头，去磷酸化后进行SDS-PAGE分离，转膜，回收连接有5’ RNA接头的游离靶标RNA，连接3’ RNA接头，并进行RT-PCR扩增获得cDNA文库。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述不完全酶解是将靶标RNA酶解至30－60nt 之间。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述5’ RNA接头的5’端连接有封闭保护基团。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述3’ RNA接头的3’端连接有封闭保护基团。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述5’ RNA接头的5’端连接有生物素封闭保护。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述3’ RNA接头的3’端连接有嘌呤霉素封闭保护。

11.一种鉴定RNA结合蛋白的靶标RNA的方法，其包括按照权利要求5~10任一项所述的方法进行cDNA合成，获得靶标RNA相应的cDNA文库，并对cDNA文库进行高通量测序，并根据测序结果进行基因定位。

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