CN106282314A

CN106282314A - 一种在植物中鉴定与蛋白结合的rna种类和rna位点的方法

Info

Publication number: CN106282314A
Application number: CN201510233649.2A
Authority: CN
Inventors: 曹晓风; 刘春艳; 宋显伟; 邓娴; 张勇; 赵庆华
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2015-05-11
Filing date: 2015-05-11
Publication date: 2017-01-04

Abstract

本发明涉及一种在植物中鉴定与蛋白结合的RNA种类和RNA位点的方法。该方法主要就是通过紫外交联将蛋白与核酸的体内结合状态固定下来，免疫沉淀下来的RNA用核酸酶进行酶切成小片段，然后通过SDS-PAGE和转膜去除非特异性结合的RNA，并利用连接在RNA两端的adaptor进行反转录PCR扩增和大规模测序。该技术有以下几个优点：1)紫外交联是在活体的情况下进行的，因此更能反映体内的真实结合情况；2)由于紫外交联形成的共价键是不可逆的，因此可以用核酸酶消化来缩短与蛋白结合的核酸的长度。随后进行的多步纯化极大地提高了信噪比；3)沉淀后的样品经过SDS-PAGE的分离去除了绝大多数非特异性结合的RNA，而后续的转膜过程去除了游离的RNA；4)RNA的两端分别连上了adaptor，允许后续的PCR扩增和大规模测序。

Description

一种在植物中鉴定与蛋白结合的RNA种类和RNA位点的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域的蛋白质和核酸互作方法研究，尤其涉及在全基因组范围内鉴定与某一特定RNA结合蛋白所结合的RNA种类和位点的方法。

背景技术

在人类的注释基因中，有23％的蛋白为核酸结合蛋白，这暗示这些蛋白在调控基因表达过程中发挥了重要的作用。为了研究这些蛋白的调控网络，科学家们已经尝试建立了多个实验系统来研究蛋白与核酸互作的方法。SELEX(Selected evolution of ligands through exponential enrichment)是一种比较常用的体外验证蛋白与RNA互作的方法，这个实验成功的关键依赖于从随机的RNA序列库中选择亲和力强的特异性RNA结构域(motif)。但有时这些结构域非常小，只有几个核苷酸，这样的序列在基因组上出现的频率非常高，因此很难预测它们体内真正的结合位点。另外，由于体内蛋白与RNA的结合可能依赖于蛋白的亚细胞定位、离子强度和精确的浓度，还可能需要多蛋白的复合体，因此有时体外验证的RNA结构域并不能反映体内真正的结合。

一种较常用的体内研究蛋白与RNA结合的方法是RIP(ribonucleoprotein immunoprecipitation)，这种方法用蛋白的抗体进行免疫沉淀后，与其结合的RNA会一起被沉淀下来，随后用反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)、文库筛选和微阵列芯片(microarray)杂交等手段来验证与该蛋白结合的RNA。但是这种方法的缺点在于很低的信噪比，而且很难区分是直接亦或是间接的蛋白与RNA的相互作用。另外，利用这种方法也不能验证RNA是通过哪个结构域与蛋白相互作用的。

近几年刚刚发展起来的验证体内蛋白与RNA相互作用的新方法为CLIP(cross-linking and immunoprecipitation)以及在此基础之上的HITS-CLIP(high-throughput sequencing of RNAs isolated by crosslinking immunoprecipitation)或CLIP-seq。该技术是将紫外交联免疫沉淀技术(CLIP)与高通量测序技术相结合的研究体系，可在全基因组水平鉴定与特定RNA结合蛋白互作的RNA分子及其结构特征。该技术主要是利用紫外交联将蛋白与核酸的相互作用固定下来，然后通过特定的RNA结合蛋白的抗体进行免疫沉淀将RNA结合蛋白-RNA复合物进行富集，利用核酸酶降解不被蛋白保护的RNA片段，然后通过放射自显影标记和SDS-PAGE分离，回收目的蛋白-RNA复合物，再利用蛋白酶和尿素去除复合物中的RNA结合蛋白，将RNA富集进行后续的高通量文库的构建和大规模测序。该方法加入了放射自显影标记和多步分离纯化步骤极大地降低了假阳性，另外，由于紫外交联是在活体情况进行的，因此更能反映体内真实的蛋白与RNA的相互作用。

CLIP-seq可以在单个核苷酸分辨率上识别蛋白质和RNA的结合位点，因此在动物领域主要用于检测RNA结合蛋白的全基因组结合位点。目前HITS-CLIP方法已经在动物体内有了非常好的应用，但在植物体系中还没有相应的报道，这极大地限制了植物体内RNA结合蛋白功能的研究。CLIP技术在动物系统中得到了广泛的应用，但迄今为止在植物体系中还没有相应的报道，这极大地限制了植物体内RNA结合蛋白功能的研究。因此在植物体内建立CLIP技术并应用其分析RNA结合蛋白的功能是十分必要的。该方法的建立将极大推进植物中RNA结合蛋白功能的研究，有助于阐明RNA结合蛋白在RNA代谢过程中的调控网络和分子机制。

发明内容

针对上述存在的不足和影响因素，本发明的目的在于在植物体内建立高通量的蛋白质与RNA互作的鉴定方法。为了实现这一目标，本发明采用如下的技术解决方案：

为了获得稳定、可重复的实验结果，紫外交联的效率非常关键。和动物贴壁生长的单层细胞不同，植物的幼苗细胞层数多，所以需要正反两面进行两次紫外交联。但是翻转的过程中叶片容易交叠，很难保证很短的时间内所有的而且也不容易操作。本发明利用150mm的细胞培养皿，剪取合适大小的滤纸两张，一张铺在培养皿内，在其中倒入150ml冰冷的PBS。收集拟南芥幼苗置于PBS中，苗和苗之间尽可能不要重叠。然后将此培养皿放在冰上，置于紫外交联仪(Hoefer UVC 500Crosslinker，Amersham)中，400-1000mJ/cm²进行交联(由于不同蛋白的交联效率可能是不同的，因此需要对交联的强度进行优化)。交联结束后取出培养皿，在其上覆盖另一张滤纸，然后小心地用镊子将两张滤纸夹起并翻转，从而对植物的另一面进行同样的交联。这一步对于保证实验的重复性非常重要，使用两张滤纸可以非常有效的将植物幼苗翻转，增加了实验的可重复性。本发明提供了植物幼苗的交联条件处于400-1000mJ/cm²之间，这可以保证绝大多数RNA结合蛋白与RNA的结合被固定。

另外，本发明还提供了一种降低接头自连的方法。由于在目的RNA片段的两端分别添加接头，而两个接头自连的情况比较多，因此在我们的实验方法中添加了一步利用TBE-Urea的PAGE胶回收RNA片段的步骤，有效地降低了接头自连的现象，保证了构建文库的质量，以利于后续的高通量测序。具体步骤如下：

配置7.5％TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶(TBE-Urea PAGE凝胶)(10ml，2板胶的用量)

1)首先配制400ml 0.5X TBE(40ML 5X TBE加超纯水至400ml)，搅拌混匀。

2)180V，预电泳30min。

3)将连有3’RNA linker的RNA 70度加热2min，置于冰上5min，同时RiboRuler RNA ladder 70度10min，冰上5min。

4)在样品中加入3ul 6X DNA loading。

5)上样前用10ml注射器将加样孔中的Urea吹走，然后上样，有一道跑4ul RiboRuler RNA ladder，电泳180V，35min(此时第一道loading即将到达底部)。

6)卸胶，在TBE buffer中加入10ul EB染胶5-10min。

7)照胶，切取80-300nt的片段，置于底部钻孔的0.5ml dorf管中，下面用2ml的收集管。

8)12000rpm，5min，抛弃上面的dorf管。

9)在碎胶中加入2-3倍体积的0.3M NaCL，4度rotation过夜。

10)第二天，将过夜溶的胶倒入Costa的Spin-XcentrifugeTube Filter 0.45uM Cellulase Acetate 8163中，10000rpm，2min。

11)弃胶，在流穿管中加入3倍体积乙醇和3.5ul Glycoblue，-20度沉淀至少30min，沉淀时间最好能长一些，保证沉淀的效果好一些！

12)12000rpm离心15min，75％乙醇洗一次，干燥后加入11ul DEPC水溶解RNA。

附图说明

图 1为CLIP-seq实验示意图。

图 2为HLP1 CLIP放射自显影结果，其中ΔRRM是指缺失了RNA结合结构域RRM的HLP1互补植株，此处作为阴性对照；而HLP1-CLIP是指HLP1的互补植株，为实验组。其中白色虚线框为回收的蛋白-RNA复合物。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解的是本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案，还应当理解的是本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下面以拟南芥中新鉴定的hnRNP A1的同源蛋白hnRNP A1-like protein 1(HLP1)为例具体描述拟南芥中CLIP-seq文库构建的过程。

1.紫外交联

取150mm的细胞培养皿，剪取合适大小的滤纸两张，一张铺在培养皿内，在其中倒入150ml冰冷的PBS。收集MS培养基上生长8-14天的幼苗(具体的生长时期需要根据特定蛋白的表达时期而定)，培养皿中尽可能苗和苗之间不要重叠。然后将此培养皿放在冰上，置于紫外交联仪(Hoefer UVC 500Crosslinker，Amersham)中，400-1000mJ/cm²进行交联(由于不同蛋白的交联效率可能是不同的，因此需要对交联的强度进行优化)，HLP1材料所用的交联强度是400mJ/cm²。交联结束后取出培养皿，在其上覆盖另一张滤纸，然后小心地用镊子将两张滤纸夹起并翻转，从而对植物的另一面进行同样的交联。这一步对于保证实验的重复性非常重要，使用两张滤纸可以非常有效的将植物幼苗翻转，增加了实验的可重复性。

交联结束后用冷的PBS清洗幼苗，然后用滤纸吸干PBS，并将交联的材料用液氮速冻，如果不立即进行下游的实验，可将其置于-80℃冰箱中储存。

2.抗体与protein A/G磁珠结合

1)通常每ml交联的细胞裂解液用20-50μl protein A/G磁珠(Invitrogen，Dynal，100-02或100-04)，吸取所需的磁珠到无RNase的1.5ml Eppendorf管中(本实验由于要分离RNA，因此在最后一步PCR之前均需要严格按照RNA的操作进行)。并将dorf管放在磁分离架上，静置0.5-1分钟，吸弃液体。

2)用1ml PBS缓冲液(pH7.4)+0.02％Tween 20重悬磁珠。

3)加入适量的抗体(此处HLP1抗体免疫沉淀的稀释度是1∶200)进行孵育，此步需要在旋转混合仪上进行，室温1个小时或者4度2小时至过夜。

4)免疫沉淀结束后，用Lysis buffer清洗磁珠3次。

3.裂解细胞

在抗体与磁珠的孵育过程中可以进行细胞的裂解。

1)将紫外交联的拟南芥幼苗在液氮中研磨成非常细的粉末。

2)每克植物材料中加入0.75-1ml lysis buffer(包含蛋白酶抑制剂和RNA酶抑制剂)。

3)4℃，12000rpm离心15分钟，取上清

4)DNasel处理：每ml细胞裂解液中加入30μl DNase I(Promega，M6101)，置于可调温的混合仪(Theromixture comfort，Eppendorf，22331)上，37℃，每3分钟震荡15秒，1000rpm，5分钟。

5)立即将样品放在冰上至少5分钟。

6)4℃，12000rpm离心15分钟，取上清。

4.免疫沉淀

1)加适量的上清到第二步准备好的磁珠中进行免疫沉淀，免疫沉淀时需要在旋转混合仪上进行，4度2小时至过夜。

2)磁分离架上移走上清。

3)用如下的冰冷缓冲液清洗磁珠：

Lysis buffer 2次

高盐buffer(high-salt buffer)2次

PNK buffer 2次

4)最后一次清洗磁珠的时候将磁珠分为几等份，每份对应于下面的一个微球菌核酸酶的梯度。

5.微球菌核酸酶处理部分消化RNA

1)首先用1X MN reaction buffer稀释微球菌核酸酶。1∶1000倍稀释是过量消化的稀释比例，这个稀释倍数在每次试验过程中都需要有，用以作为对照。同时不同的RNA结合蛋白可能需要摸索一系列的稀释倍数进行消化，最终选择最适的浓度进行处理。

2)加500ul稀释的微球菌核酸酶到各个样品中。

3)置于可变温混合仪上，37℃，每3分钟震荡15秒，1000rpm，10分钟。

4)用如下的冰冷缓冲液清洗磁珠：

PNK+EGTA buffer 2次(EGTA可以终止微球菌核酸酶的反应)

Lysis buffer 2次

PNK buffer 2次

6. CIP脱磷处理

1)配置CIP处理反应体系：

2)置于可变温混合仪上，37℃，每3分钟震荡15秒，1000rpm，10-20分钟。

3)用如下的冰冷缓冲液清洗磁珠：

PNK+EGTA buffer 2次(EGTA可以终止脱磷酶的反应)

PNK buffer 2次

0.2μg/μl BSA溶液(DEPC水配置)2次

7. 3’RNA Linker连接

1)Linker混合液：

2)每管磁珠中加入40μl linker混合液。

3)配制连接反应混合液：

4)每管磁珠中加入40μl连接反应混合液。

5)置于可变温混合仪上，16℃，每3分钟震荡15秒，1000rpm，孵育过夜。

6)用PNK buffer洗磁珠3次。

8. 5’末端加磷处理

从这步开始需要在同位素室进行

1)配置加磷反应混合液

2)每管磁珠中加入80μl连接反应混合液。

3)置于可变温混合仪上，37℃，每3分钟震荡15秒，1000rpm，孵育10-30分钟。

4)每管磁珠中加入1μl 10mM ATP，再反应10-20分钟。

5)用PNK+EGTA buffer洗磁珠3次。

6)用计数器测量磁珠上的同位素信号。

7)每管磁珠中加入20μl-60μl 1X上样缓冲液。

8)置于可变温混合仪上，70℃，每3分钟震荡15秒，1000rpm，孵育10分钟。

9. SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分离蛋白和RNA复合体

1)Invitrogen公司的Novex NuPage预制胶和buffer的pH值为中性，可以有效地防止RNA水解。因此建议用Novex NuPage 10％Bis-Tris胶去分离蛋白和RNA的复合体。

2)跑完胶后，冰上转膜，使用硝酸纤维素膜，以利于后续RNA的洗脱。

3)转完膜后，用保鲜膜将硝酸纤维素膜包裹起来，用计数器测量同位素信号。

4)将膜固定在暗夹中，压光片或者磷屏进行发射自显影。发射自显影的时间根据信号的强度而定，比较强的信号压几个小时即可，而弱的信号就需要压过夜或1-2天。

5)在光片或磷屏上，合适的微球菌核酸酶浓度消化的样品将呈现一个弥散的放射性信号，比未结合任何RNA的游离蛋白大10-20kD。

6)切下比游离蛋白大10-20kD的带(这步切的范围宽的话也可以，这样信号会强一些，后续还有几个进行大小选择的步骤)(图 2)，将切下来的硝纤膜放在低亲和力的dorf管中。

7)用计数器记录放射性信号。

10.降解蛋白、分离纯化RNA

1)用1X蛋白酶K buffer稀释蛋白酶K到终浓度为4mg/ml，将此溶液首先置于37℃孵育20分钟。

2)蛋白酶K处理：每个样品中加入200μl蛋白酶K溶液，37℃，每3分钟震荡15秒，1000rpm，孵育20分钟。

3)尿素处理：加入200μl 7M尿素溶液(用1X蛋白酶K buffer配置，此尿素溶液需要先用现配)，37℃，每3分钟震荡15秒，1000rpm，孵育20分钟。

4)酚仿抽提：加入400μl水饱和酚和130μl氯仿，37℃，每3分钟震荡15秒，1000rpm，孵育20分钟。

5)4℃，12000rpm，离心20分钟。

6)醇沉：取水相加入新管中，加50μl 3M乙酸钠(pH 5.2)、0.5μl糖原、500μl乙醇和500μl异丙醇，颠倒混匀。

7)在-20℃冰箱中过夜沉淀RNA。

11. 5’RNA Linker连接

1)4℃，12000rpm，离心20分钟，弃上清，用计数器测放射性信号强度，以此评估RNA沉淀是否完全。

2)75％乙醇洗沉淀两次，每次离心10分钟。

3)加4.5μl水重悬沉淀。

4)RNA连接酶反应液：

5)将上述反应液加入纯化的RNA中。

6)16℃连接1小时至过夜。

12.去除污染的DNA并纯化RNA

1)DNase l处理去除DNA

2)37℃孵育30分钟。

3)加5.5ul DNase Inactivation Reagent失活DNase，充分混匀。

4)室温放置5分钟，偶尔混匀。

5)10000g离心1.5分钟，转移RNA到一个新管中。

6)酚仿抽提：

350μl水

300μl水饱和酚

100μl氯仿

7)4℃，12000rpm，离心10分钟，取上层水相。

8)醇沉：加50μl 3M乙酸钠(pH 5.2)、5μl糖原(Glycoblue，AM9515，终浓度为15ug/ml)、500μl乙醇和500μl异丙醇，颠倒混匀。在-20℃冰箱中过夜沉淀RNA。

9)4℃，12000rpm，离心20分钟，弃上清，用计数器测放射性信号强度，以此评估RNA沉淀是否完全。

10)75％乙醇洗沉淀两次，每次离心10分钟。

11)用7ul去离子甲酰胺重悬沉淀。

13.回收RNA片段

配置7.5％ TBE-Urea PAGE胶(10ml，2板胶的用量)

在此基础之上，进行RNA片段回收，具体步骤如下：

1)首先配制400ml 0.5X TBE(40ML 5X TBE加超纯水至400ml)，搅拌混匀。

2)180V，预电泳30min

3)将连有3’RNA linker的RNA 70度加热2min，置于冰上5min，同时RiboRuler RNA ladder 70度10min，冰上5min

4)在样品中加入3ul 6X DNA loading

5)上样前用10ml注射器将加样孔中的Urea吹走，然后上样，有一道跑4ul RiboRuler RNA ladder，电泳180V，35min(此时第一道loading即将到达底部)

6)卸胶，在TBE buffer中加入10ul EB染胶5-10min

8)12000rpm，5min，抛弃上面的dorf管

9)在碎胶中加入2-3倍体积的0.3M NaCL，4度rotation过夜

10)第二天，将过夜溶的胶倒入Costa的Spin-XcentrifugeTube Filter 0.45uM Cellulase Acetate 8163中，10000rpm，2min

14. RT-PCR扩增两端连有Iinker的目的片段

1)加入1μl 10μM的RT primer，65℃加热5分钟，立刻放在冰上2分钟，然后短暂离心将液体甩到管底。

2)然后在管中加入下列试剂：

1μl 10mM dNTPs

1μl 0.1M DTT

4μl 5X SuperScript RT buffer

1μl RNase OUT

1μl SuperScript III(Invitrogen，18080-044)

3)50℃孵育30分钟至1.5小时，90℃5分钟灭活反转录酶的活性，转移至冰上。

4)PCR反应体系：

5)PCR反应程序：

①98℃30秒

②98℃10秒

③60℃30秒

④72℃15秒

⑤72℃5分钟

②-④步重复20-35个循环，根据RNA的量来确定循环数。

6)在3％琼脂糖胶上分离目的片段，用新刀片切取150-250bp的条带。用凝胶DNA回收试剂盒回收，重溶于15-20μl水中，即为CLIP-seq的高通量测序文库。此样品经过质检，如果片段大小mapping比例符合要求就可以直接用于高通量测序。

因此，已描述了在植物中鉴定与蛋白结合的RNA种类和RNA位点的方法。虽然已参考特定示例性实施例描述了实施例，但将显而易见的是在不脱离发明主题的更宽泛范围的情况下可对这些示例进行各种修改和变更。因此，应在说明性而不是限制性意义上考虑本说明书和附图。

此实验中涉及的Iinker和primer信息(与Illumina测序平台兼容)如下：

实验所需的缓冲液：

10XPBS

Lysis buffer

High-salt buffer

PNK buffer

50mM Tris-CI pH 7

10mM MgCl2

0.5％ NP-40

PNK+EGTA buffer

50mM Tris-CI pH 7

20mM EGTA

0.5％ NP-40

MNase buffer

10mM Tris-CI pH 8.0

1mM CaCl2

20X MOPS SDS电泳缓冲液(250ml)

20X转膜缓冲液(125ml)

Bicine 10.2g

Bis-Tris 13.1g

EDTA.Na₂ 0.95g

1X转膜缓冲液

2X Ioading buffer(10ml)

1X蛋白酶K BUFFER

100mM Tris-CI pH 7.5

50mM NaCI

10mM EDTA

1X蛋白酶K buffer/7M urea(现用现配)

。

此实验中涉及的Iinker信息：

Small RNA PCR Primer 2

5′AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA

RNA RT Primer(RTP)

5’GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA

5′RNA Linker

5′GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCNNNN

3′RNA Linker

5′P-UGGAAUUCUCGGGUGCCAAGGUidT

RNA PCR Primer，Index 1(RPI1)

5’

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA

RNA PCR Primer，Index 2(RPI2)

5’

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA

RNA PCR Primer，Index 3(RPI3)

5’

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA

RNA PCR Primer，Index 4(RPI4)

5’

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA ATTCCA

RNA PCR Primer，Index 5(RPI5)

5’

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA

RNA PCR Primer，Index 6(RPI6)

5’

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA

RNA PCR Primer，Index 7(RPI7)

5’

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA

RNA PCR Primer，Index 8(RPI8)

5’

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA

Solexa Sequencing Primer

5′CGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC

。

Claims

1.一种在植物中鉴定与蛋白结合的RNA种类和RNA位点的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)紫外交联植物中蛋白质和核酸的相互作用；

2)裂解植物细胞和免疫沉淀；

3)核酸酶消化；

4)3’接头连接和放射性同位素³²P标记；

5)用SDS-PAGE分离蛋白-RNA复合物，并回收相应的片段；

6)降解蛋白、分离纯化RNA；

7)5’接头连接，TBE-Urea PAGE凝胶回收RNA片段；

8)在RT-PCR之后，用PAGE凝胶或琼脂糖凝胶电泳回收相应大小条带，该条带为高通量测序文库。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)用400-1000mJ/cm²对植物材料进行紫外交联。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤7)用TBE-Urea PAGE凝胶回收80-300ntRNA片段。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤3)中的核酸酶包括微球菌核酸酶和RNasel。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中免疫沉淀所用抗体包括HLP1抗体。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤8)中高通量测序文库的长度为150-250bp。