CN104114702A

CN104114702A - 模板转换用于dna合成的用途

Info

Publication number: CN104114702A
Application number: CN201280009594.1A
Authority: CN
Inventors: A.M.拉姆博维茨; S.莫尔; T.B.怀特; S.库尔斯坦
Original assignee: TAXAS SYSTEM, University of, Regents of
Current assignee: TAXAS SYSTEM, University of, Regents of; University of Texas System
Priority date: 2011-02-23
Filing date: 2012-02-23
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2032-02-23
Also published as: KR101911969B1; JP6068365B2; EP2678430A4; KR20140037046A; IL228042B; IL228042A0; AU2012220596A1; SG192870A1; CA2827948C; AU2012220596B2; US9012183B2; EP2678430A1; CA2827948A1; WO2012116146A1; EP2678430B1; US20140004569A1; CN104114702B; HK1203218A1; JP2014506483A

Abstract

描述了使用模板转换制备靶多核苷酸的DNA拷贝的方法。所述方法包括：将双链模板/引物底物（其由与互补寡核苷酸模板链结合的DNA引物寡核苷酸组成）与靶多核苷酸一起在反应介质中混合，并将合适量的非逆转录病毒逆转录酶加入反应介质中，以使DNA引物寡核苷酸从它的3’末端延伸从而提供DNA拷贝多核苷酸。所述DNA拷贝多核苷酸包括使用靶多核苷酸作为模板合成的互补的靶DNA多核苷酸。还描述了向双链模板/引物底物添加核苷酸的方法。所述方法可以用于便利RNA和DNA序列的检测、PCR扩增、克隆和测定。

Description

模板转换用于 DNA 合成的用途

继续申请数据

本申请要求2011年2月23日提交的美国临时申请系列号61/445,761的权益，其通过引用并入本文。

政府资助

本工作至少部分地得到卫生和人类服务部国立卫生研究院（ Department of Health and Human Services, National Institutes of Health ）的资助号 GM37947 和 GM37951 的支持。美国政府享有本发明的某些权利。

序列表

本申请含有已经通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并特此通过引用整体并入。所述ASCII拷贝（创建于2012年2月23日）被命名为31594024.txt，大小为34,166字节。

背景技术

逆转录酶(RT) 在生物技术中被用于合成RNA的cDNA拷贝用于多种应用，包括RT-PCR和qRT-PCR、cDNA文库的构建、微阵列的探针的制备、以及常规的和下一代RNA测序。与长聚腺苷酸化RNA相对应的cDNA的合成可以使用随机六聚体引物或含寡(dT)的引物（其与聚(A)尾巴互补）来实现。但是，与非聚腺苷酸化RNA（诸如miRNA或蛋白结合的RNA片段）相对应的cDNA的链特异性的克隆和测序通常需要将DNA、RNA或含有PCR-引物-结合位点的嵌合RNA/DNA寡核苷酸接头连接至RNA或cDNA链的末端(Lau等人 . 2001; Levin等人 . 2010; Lamm等人 . 2011)。所述接头通常使用RNA连接酶连接至RNA模板，要么顺序地连接至RNA的3’和5’末端(例如，Roch 454 Life Sciences®测序和Illumina®下一代测序)，要么同时地连接至RNA两端(例如，SOLiD™下一代测序) (Linsen等人 . 2009)。就一些应用而言，将第一接头连接至RNA的3’末端进行反转录，并将第二接头连接至得到的cDNA的3’末端(例如，蛋白结合的RNA片段的cDNA的交联和分析 (CRAC)；Granneman等人 . 2009)。在一种变化中，如下防止第二接头的连接：使用逆转录酶的非模板化核苷酸添加反应来将C-残基添加至cDNA的3’末端，从而实现用于第二链合成的含有互补G-残基的第二接头的退火(Zhu等人 . 2001)。在另一种变化中，如下防止第二接头的连接：使cDNA环化，随后线性化，并使用第一接头中的双向引物结合位点进行PCR扩增，例如在单核苷酸分辨率UV-交联和免疫沉淀中(iCLIP, König等人 . 2010)或在使用核糖体图谱的核苷酸分辨率全基因组体内翻译分析中那样(Ingolia等人 . 2009)。

不幸的是，尽管克隆和测序与非聚腺苷酸化RNA和RNA片段相对应的cDNA对于灵巧的PCR扩增需要连接寡核苷酸接头的，但是使用连接酶来连接接头是一个耗时的、昂贵的且低效率的步骤。此外，通常用于接头连接的RNA连接酶对要连接的末端具有独特的核苷酸偏好，从而导致在构建的文库中的cDNA偏倚代表(Linsen等人 . 2009; Levin等人 . 2010)。

逆转录因子（编码RT的遗传元件）被分成2个称作含有LTR的逆转录因子和不含LTR的逆转录因子的主要家族(Xiong和Eickbush 1990)。逆转录病毒（其RT经常用于生物技术中）是含有LTR的逆转录因子的众所周知的例子。无-LTR-逆转录因子是RT-编码元件的一个多样化的家族，其包括逆转录质粒（retroplasmid）、无-LTR-逆转录转座子、逆转录子和可移动的II型内含子(Xiong和Eickbush 1990)。可移动的II型内含子由催化活性的内含子RNA (“核酶”)和内含子编码的RT（它们一起起作用来促进RNA剪接和内含子移动）组成(Lambowitz和Zimmerly 2010)。II型内含子RT通常由4个保守结构域组成：RT，其含有7个存在于逆转录病毒RT的指和掌区域中的保守序列块(RT1-7)；X，至少部分地与逆转录病毒RT的拇指结构域相对应的RNA剪接活性所需的区域；D，在DNA靶位识别中涉及的DNA-结合域；和En，切割DNA靶位以产生反转录引物的DNA内切核酸酶结构域(Blocker等人 . 2005; Lambowitz和Zimmerly 2010)。En结构域在某些II型内含子RT中缺失，它们替代性地在DNA复制叉处使用新生链来引发反转录(Zhong和Lambowitz 2003; Lambowitz和Zimmerly 2010)。所述II型内含子RT的RT和X/拇指结构域大于逆转录病毒RT的那些，这是由于N-端延伸（额外N-端保守序列块(RT-0)）和在RT和X/拇指结构域中保守序列块之间的插入(Lambowitz和Zimmerly 2010)。RT-0和一些在RT结构域的保守序列块之间的插入物也存在于其它无-LTR-逆转录因子RT中(Blocker等人 . 2005)。不同于逆转录病毒RT，II型内含子和无-LTR-逆转录因子RT缺少RNA酶H结构域。

已经发现由逆转录质粒和无-LTR-逆转录转座子编码的RT不同于逆转录病毒RT之处在于，能够从初始RNA模板直接地模板转换至新RNA模板的3’末端，所述3’末端与从初始模板合成的cDNA的3’末端几乎没有或没有互补性(Chen和Lambowitz 1997; Bibillo和Eickbush 2002, 2004; Kennell等人 . 1994)。

发明内容

如本文公开的，由逆转录因子的某些种类（最特别是可移动的II型内含子）编码的逆转录酶(RT) 会提供与接头连接有关的困难的解决方案，并且更一般地，会提供帮助RNA和DNA序列的检测、PCR扩增和克隆的新方法。发明人假定，非逆转录病毒RT可能能够在从初始模板合成的cDNA和新RNA或DNA模板的3’末端之间进行几乎没有或没有互补性的模板转换，并且该反应可能用于合成连续cDNA，所述连续cDNA将接头序列无需连接下直接连接至靶RNA或DNA序列。所述合成的cDNA然后可以在cDNA的3’末端处连接至第二接头分子，或者例如用CircLigase环化，，CircLigase为有效地环化单链DNA的酶(Polidoros等人 . 2006)，从而实现使用双向引物的PCR扩增，所述双向引物与第一接头的不同部分退火。就某些应用而言，这样的引物可以添加条形码(barcode)用于下一代/深测序。

描述了非逆转录病毒逆转录酶(RT) 用于合成cDNA的用途，其中靶多核苷酸链或含有目标序列的链通过从一个或多个接头序列和/或添加至cDNA的3’末端的非模板化核苷酸残基的模板转换而连接，。所述接头序列可以含有PCR引物-结合位点，其连接会帮助接下来的检测、PCR扩增、cDNA文库构建、以及RNA或DNA分子的测序。所述接头序列还可以含有其它有用的序列，诸如用于接下来纯化cDNA的亲和标签序列。非模板化核苷酸向cDNA的3’末端的添加可以帮助它们的后续扩增和克隆，例如，通过实现含有核苷酸残基（其与通过非模板化核苷酸添加所添加的那些互补）的PCR引物的退火，或通过实现cDNA向含有核苷酸残基（其与通过非模板化核苷酸添加所添加的那些互补）的载体中的克隆。还描述了用于将逆转录酶实现的模板转换导向具有特定3’-端核苷酸残基的靶多核苷酸序列的方法，以及用于使逆转录酶实现的具有不同3’-端核苷酸残基的多核苷酸链之间的模板转换中的偏倚最小化的方法。本公开内容也提供了逆转录酶实现的RNA模板至DNA模板的模板转换或在DNA模板之间的模板转换以实现不同DNA和RNA序列的连接的方法。例如，逆转录酶的在DNA模板之间模板跳变的能力，可以用于将接头连接至单链DNA，用于第二链合成或用于从单链基因组DNA制备DNA文库。还描述了使用非逆转录病毒RT将非模板化核苷酸残基添加至并非由所述RT合成的其它DNA以便利它们的检测、PCR扩增、克隆和测序的方法。本公开内容也提供了减少非逆转录病毒RT的非模板化核苷酸添加的方法，用于其中这样的非模板化核苷酸添加是有害的用途–例如，通过毛细管电泳确定准确的cDNA长度、RNA结构绘图和RNA足迹法。

应当理解，前述的一般描述和下面的详细描述都仅仅是示例性的和解释性的，并且不限制要求保护的发明。

附图说明

图1. TeI4c-MRF和Superscript III RT的模板转换活性对比。将5’³²P-标记的引物Pc的IA-P1 RNA/Pc DNA模板/引物底物(50 nM)与等摩尔浓度的miRNAx混合，并用TeI4c-MRF RT (2 μM)或SuperScript III (SSIII) RT (10单位/ μL)逆转录。所述反应在每种酶的最佳条件下进行(对于TeI4c-MRF RT，75 mM KCl、10 mM MgCl₂、20 mM Tris-HCl pH 7.5和1 mM dNTP，60℃；对于SuperScript III RT，75 mM KCl、10 mM MgCl₂、40 mM Tris-HCl、pH 8.3和1 mM dNTP，50℃)。通过加入RT开始反应，温育30 min，并通过加入EDTA/SDS (0.125 M，最终0.05%)来停止，随后用苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1；苯酚-CIA)提取。在变性20% 聚丙烯酰胺凝胶中分析产物，用PhosphorImager™扫描所述凝胶。–RT对照泳道显示了在TeI4c-MRF RT反应条件下在没有RT存在下温育的IA-P1 RNA/Pc DNA模板/引物底物。M，用作大小标志物的³²P-标记的10-bp梯度物(Invitrogen™)。AmMO表示在IA-P1 RNA的3’末端处的氨基修饰剂，* 表示在引物的5’末端处的³²P-标记，N’s表示在miRNAx寡核苷酸的5’和3’末端处的2个随机化的核苷酸残基，所述miRNAx寡核苷酸在以后的实验中用于评估模板转换过程中的偏倚。

图2. 通过II型内含子RT模板转换和CircLigase环化进行的cDNA克隆方法。在第一步中，II型内含子RT模板从IA-P1 RNA/Pc DNA模板/引物转换至miRNAx，以产生连续cDNA，所述连续cDNA将IA-P1接头序列连接至miRNAx的序列。将产物与RNA酶H一起温育以消化RNA模板，进行凝胶纯化，并用CircLigase I或II环化。在用外切核酸酶I消化未掺入的引物以后，用尿嘧啶-DNA切除混合物(UDE; Epicentre®) 在已经掺入引物中的脱氧尿苷(在Pc DNA引物序列中标有下划线的U) 处将cDNA产物重新线性化，然后用引物进行PCR扩增，所述引物引入额外接头序列和条形码用于下一代测序。在底部显示了IA-P1 RNA/Pc DNA模板-引物底物的序列和用于SOLiD测序的PCR引物的序列(按照出现的次序，分别是SEQ ID NO 5、24和8-10)。IA-P1 RNA具有3’氨基修饰剂(表示为AmMO)以阻碍模板转换至该RNA末端。X’s表示条形码(BC)核苷酸残基，* 表示在引物的5’末端处的³²P-标记。

图3. 与miRNA (SEQ ID NO: 26)相对应的cDNA (SEQ ID NO: 28)的克隆和测序，在所述miRNA中，2个5’-核苷酸残基和2个3’-核苷酸残基被随机化。通过TeI4c-MRF RT从IA-P1 RNA/Pc DNA模板/引物底物(公开为SEQ ID NO: 27的“IA-P1 RNA”序列) 至miRNAx模板转换15 min，合成了cDNA。在图1中的酶所用的反应条件下，进行凝胶纯化，用CircLigase II环化，使用Flash Phusion®聚合酶、用SOLiD 5’和3’引物进行PCR扩增，TA克隆进PCR2.1 TOPO (Invitrogen™)中，并用M13(-20)F引物进行Sanger测序。在miRNA的5’-末端和3’-末端处的随机化核苷酸位置分别标有下划线和用灰色阴影突出显示。在产物序列(按照出现的次序，分别为SEQ ID NO 29-53)中，用小写字母显示突变体核苷酸残基，并用粗体小写字母显示非模板化核苷酸残基。在产物序列中的N表示在该序列中没有明确地鉴别出的核苷酸。

图4. 使用与Ll.LtrB内含子RNA的5’末端相对应的RNA模板/DNA引物底物，通过Ll.LtrBII型内含子RT实现的非模板化核苷酸添加和模板转换。(A)凝胶测定。在含有200 μM dNTP、450 mM NaCl、5 mM MgCl₂、20 mM Tris-HCl pH 7.5和1 mM二硫苏糖醇(DTT)的反应介质中，将Ll.LtrB内含子RT (LtrA蛋白; 40 nM) 与小人工底物一起在30℃温育30 min，所述小人工底物图解在凝胶的右侧。所述人工底物是44 nM 5’-³²P-标记的DNA引物c (Pri c; 45 nt)自身，或与40 nM Ll.LtrB RNA (60 nt) + 40 nM外显子1 (E1; 40 nt) DNA或RNA退火。温育后，通过苯酚-CIA提取来终止反应，并在变性15% 聚丙烯酰胺凝胶中分析产物，使用PhosphorImager™扫描所述凝胶。泳道(1)和(2)：分别在没有和有LtrA存在下和³²P-标记的Pri c温育；泳道(3)和(4)：分别与³²P-标记的Pri c和E1 DNA或RNA一起温育的LtrA；泳道(5)和(6)：分别与Ll.LtrB RNA/³²P-标记的Pri c模板/引物底物和E1 DNA或RNA一起温育的LtrA。在图中，Ll.LtrB RT显示为灰色椭圆形，并用在灰色椭圆形内的虚线箭头指示DNA合成的方向。在凝胶中指出了用于DNA测序切下的带(a-n)。在凝胶右侧的数字指示5’-³²P-标记的10-bp梯度物(Invitrogen™)的核苷酸位置。(B)和(C)：DNA产物的序列。图4B按照出现的次序分别公开了SEQ ID NO 54-61、61、61、61、61-62、62-63、61和25。图4C按照出现的次序分别公开了SEQ ID NO 64、55、57、65、58、66、59、67-68、60-61、69、62、70-72、72和72-74。从泳道5和6中的指定凝胶带得到的产物分别源自引物c向Ll.LtrB RNA模板/DNA引物c底物中的Ll.LtrB RNA的5’末端的延伸和随后向外显子1 DNA或RNA的模板转换。用小写字母显示了DNA产物序列中的突变体核苷酸残基，并用粗体小写字母显示了插入在模板转换连接区或cDNA的3’末端处的额外核苷酸残基。在图中未显示的DNA产物序列部分包括1个G至A转变（对于外显子1 DNA产物）和2个A至G转变（对于外显子1 RNA产物）。在右侧的数字指示每个序列的频率。* 表示在引物c的5’末端处的³²P-标记。

图5. 使用与3’Ll.LtrB内含子-外显子2整合连接区相对应的RNA模板/DNA引物底物，由Ll.LtrBII型内含子RT实现的非模板化核苷酸添加和模板转换。(A)凝胶测定。在含有200 μM dNTP、450 mM NaCl、5 mM MgCl₂、20 mM Tris-HCl、pH 7.5、1 mM二硫苏糖醇的反应介质中，将Ll.LtrB RT (LtrA蛋白; 40 nM) 与小人工底物一起在30℃温育30 min，所述小人工底物图解在凝胶的右侧。所述人工底物是44 nM 5’-³²P-标记的引物e2 (Pri e2; 70 nt)自身，或与40 nM E2 RNA或DNA (40 nt)退火。通过苯酚-CIA提取来终止反应，并在变性10% 聚丙烯酰胺凝胶中分析产物，使用PhosphorImager™扫描所述凝胶。泳道(1)和(2)：分别在没有和有LtrA存在下和³²P-标记的Pri e2 DNA温育；泳道(3)和(4)：分别与退火的³²P-标记的Pri e2以及E2 DNA或RNA模板一起温育的LtrA。在图中，Ll.LtrB RT显示为灰色椭圆形，并用虚线箭头指示DNA合成的方向。IS指示内含子-插入位点。在凝胶右侧的数字指示5’-³²P-标记的10-bp梯度物(Invitrogen™)的位置。(B)：cDNA产物的序列。图5B按照出现的次序分别公开了SEQ ID NO 75-76、76-92、87-88和93-116。将在凝胶(a-d)中指出的带切离、克隆和测序。在每组通过实验确定的DNA产物序列的上面显示了模板和预期的DNA产物序列(带框)。用小写字母显示了DNA产物序列中的突变体核苷酸残基，并用粗体小写字母显示了插入在模板转换连接区或cDNA的3’末端处的额外核苷酸残基。在右侧的数字指示每个序列的频率。* 表示在引物的5’末端处的³²P-标记。

图6. 向平端RNA模板/DNA引物底物的非模板化核苷酸添加测定。RNA模板/DNA引物底物具有平端，模仿完全延伸至RNA模板的5’末端的cDNA (40-nt RNA模板5’-GUGCGCCCAGAUAGGGUGUUAAGUCAAGUA-3’(SEQ ID NO: 1)；20-nt DNA引物5’-aacaccctatctgggcgcac-3’(SEQ ID NO: 2))。在反应介质中将TeI4c-MRF RT (2 μM) 与RNA模板/DNA引物底物(100 nM)一起在60℃温育10 min，所述反应介质含有：450 mM NaCl、5 mM MgCl₂、20 mM Tris-HCl、pH 7.5或75 mM KCl、10 mM MgCl₂、20 mM Tris-HCl、pH 7.5、以及1或100 μM dATP、dCTP、dGTP或dTTP (左侧凝胶)或1 μM或1 mM所有4种dNTP和3 mM ATP (右侧凝胶)，如在每个泳道的上面所示。通过加入125 mM EDTA和0.05% SDS来终止反应和随后苯酚-CIA提取以后，在变性20% 聚丙烯酰胺凝胶中分析产物，用PhosphorImager™扫描所述凝胶。10-bp梯度标志物(Invitrogen™) 的位置显示在凝胶的右侧。* 表示在引物的5’末端处的³²P-标记。

图7. 在减少非模板化核苷酸添加的反应条件下，通过II型内含子RT模板转换从miRNAx合成的cDNA的下一代SOLiD测序。如图3所示进行与miRNAx模板(SEQ ID NO: 7)相对应的cDNA (SEQ ID NO: 28) 的合成和克隆，所述miRNAx模板具有在5’和3’末端处的随机化核苷酸残基，但是，用手工混合的核苷酸来合成miRNAx寡核苷酸以得到在随机化位置处更均匀的核苷酸残基比例，并且在450 mM NaCl、5 mM MgCl₂、20 mM Tris-HCl、pH 7.5中和1 mM dNTP在60℃进行反转录反应10 min。如图2所述，使用CircLigase II，通过CircLigase操作克隆cDNA，并通过bySOLiD测序进行分析。显示的SOLiD序列(按照出现的次序，分别为SEQ ID NO 117-136)是2,239,072个高质量读出中最常见的20个，在右侧的数字指示了该序列的读出的数目。所有序列与从IA-P1 RNA/Pc DNA模板-引物底物(公开为SEQ ID NO: 27的“IA-P1 RNA”序列)至miRNAx的单个模板转换产生的分子相对应。用带有下划线和阴影的字母指示已经随机化的核苷酸位置；用小写字母显示突变体核苷酸残基，并用粗体小写字母显示非模板核化苷酸残基。通过Sanger测序得到了类似的结果(未显示)。

图8. 具有不同末端碱基对的平端RNA模板/DNA引物底物的模板转换。使用³²P-标记的平端RNA模板/DNA引物底物(与互补的42-nt DNA退火的42-nt IA/P1 RNA模板)（在5’RNA/3’DNA末端处具有4种可能的碱基对中的每一种）模板转换至miRNAx’s，其3’末端核苷酸残基为A、C、G或U。所述反转录反应在450 mM NaCl、5 mM MgCl₂、20 mM Tris-HCl、pH 7.5中在60℃和1 mM dNTP进行15 min。通过加入RT来开始反应，并通过加入125 mM EDTA和0.05% SDS来终止反应。在苯酚-CIA提取以后，在变性20% 聚丙烯酰胺凝胶中分析产物，用PhosphorImager™扫描所述凝胶。M，用作大小标志物的³²P-标记的10-bp梯度物(Invitrogen™)。* 表示在引物的5’末端处的³²P-标记。基于模板转换产物带的放射性的定量（对每个凝胶泳道中的放射性量标准化），从5’G RNA/3’C DNA底物至具有不同3’-端核苷酸残基的RNA的模板转换事件的百分比为：A，16%；C，15%；G，19%，和U，50%。其它3种平端底物显示出向具有3’C-残基的RNA的模板转换的偏好。

图9. II型内含子TeI4c-MRF RT从3’-突出端底物的模板转换. (A) 用初始³²P-标记的RNA模板/DNA引物底物(IA-P1 RNA/Pc 3’-突出端DNA)进行模板转换反应，所述初始³²P-标记的RNA模板/DNA引物底物具有不同的单核苷酸3’突出端(A、C、G、T或所有4种核苷酸(N)的等摩尔混合物) 以靶向具有不同3’核苷酸残基(A、C、G或U)的miRNAx’s (SEQ ID NO: 137)。在高盐反应介质(450 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 1 mM dNTP)中用2µM TeI4c-MRF RT在60℃反应10 min，所述高盐反应介质会减少RT的非模板化核苷酸添加。在变性20% 聚丙烯酰胺凝胶中分析产物，用PhosphorImager™扫描所述凝胶。在凝胶左侧的数字指示标记的大小标志物的位置(10-bp梯度物)。*，在引物的5’末端的³²P-标记。(B) 从具有等摩尔单核苷酸3’突出端的IA-P1 RNA/Pc DNA向具有3’磷酸化C残基的miRNAx（在用T4多核苷酸激酶(分别为P和DP)去磷酸化之前和之后）的模板转换，或向相同序列的DNA寡核苷酸(miDNAx)的模板转换。

图10. II型内含子RT GsI-IIC-MRF从3’-突出端底物的模板转换。从具有等摩尔A、C、G或T单核苷酸3’突出端的IA-P1 RNA/Pc DNA向具有(P)或没有3’磷酸化C残基的miRNAx (SEQ ID NO: 137) 的模板转换，或向相同序列的DNA寡核苷酸(miDNAx)的模板转换。在高盐反应介质(450 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 1 mM dNTP)中用2 μM GsI-IIc-MRF在60℃反应10 min。在变性20% 聚丙烯酰胺凝胶中分析产物，用PhosphorImager™扫描所述凝胶。在凝胶左侧的数字指示标记的大小标志物的位置(10-bp梯度物)。*，在引物的5’末端的³²P-标记。

图11. TeI4c-MRF RT从RNA/DNA或DNA/DNA模板引物的模板转换。用³²P-标记的DNA引物底物(IA-P1 RNA/Pc 3'-突出端DNA)进行模板转换反应，所述³²P-标记的DNA引物底物具有与IA-P1 RNA或DNA退火的A、C、G或T单核苷酸3’突出端的等摩尔混合物。在高盐反应介质(450 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 1 mM dNTP)中用2 μM TeI4c-MRF RT在60℃反应10 min。在变性20% 聚丙烯酰胺凝胶中分析产物，用PhosphorImager™扫描所述凝胶。*，在引物的5’末端的³²P-标记。箭头指示模板转换产物。图11将“miRNAx”序列公开为SEQ ID NO: 137。

图12. 使用II型内含子RT模板转换进行miRNA的克隆和测序。用TeI4c-MRF RT (2µM) 进行从初始IA-P1 RNA模板/Pc DNA引物底物(100 nM)至miRNA参照集合(963等摩尔的miRNA, 110 nM; Miltenyi miRXplore)的模板转换反应。所述初始IA-P1 RNA模板/Pc DNA引物底物具有以等摩尔比(TS1)或以2:0.5:1:1 (TS2)混合的单个A、C、G或T 3’-突出端，以调节具有3’U-或G-残基的miRNA的表示(参见图9)。如在图9中所示进行反应，并如在图2中所述克隆cDNA。使用Total RNA-Seq试剂盒(Applied Biosystems™; ABI)或小RNA样品制备集合3试剂盒(New England BioLabs®; NEB)，从miRNA的相同等分试样制备Parallel RNA-seq文库。这些试剂盒将用于SOLiD测序的接头同时地(ABI)或顺序地(NEB)连接至miRNA 3'和5'末端，并使用与3' 接头互补的DNA引物用ArrayScript或SuperScript II进行逆转录。(A) 该图显示了具有独特的可鉴别的核心序列（从最低丰度至最高丰度排序）的898 miRNA子集的计数，将中位值标准化，进行log₂转换，并绘图以对比通过文库制备方法引入的差异。(B)和(C) 该Venn图显示了不同的RNA-seq文库中过低表示的和过高表示的miRNA之间的重叠。使用R鉴别出在每个文库中的5%最低和最高丰度miRNA，并使用VennDiagram R包绘图(Chen和Boutros 2011)。

图13. 通过II型内含子RT模板转换和2个市售试剂盒制备的RNA-seq文库中的miRNA 3’-端核苷酸残基的表示。用TeI4c-MRF RT、Total RNA-Seq试剂盒(Applied Biosystems™)或小RNA样品制备集合3试剂盒(New England BioLabs®)，通过模板转换制备RNA-seq文库。使用IA-P1 RNA/Pc DNA模板/引物底物进行用TeI4c-MRF RT实现的模板转换反应，所述IA-P1 RNA/Pc DNA模板/引物底物具有以等摩尔比(TS1)或以2:0.5:1:1 (TS2)的比例混合的单个A、C、G或T 3’-突出端，以调节具有3' U-或G-残基的miRNA的表示。柱形图对比了在miRXplore参照集合中以4种碱基中的每一种结尾的miRNA的百分比(黑色)和在RNA-seq文库中在miRNA的3'末端处的该碱基的百分比(TeI4c-MRF/TS1，虚线；TeI4c-MRF/TS2，深灰色；ABI Total RNA Seq，斜线；NEB Small RNA Sample Prep，浅灰色)。在图A中，将RNA-seq文库中的miRNA的3’-核苷酸残基鉴别为在内部接头（Internal Adaptor）之前的碱基。为了避免引物二聚体、仅接头和低质量序列，当确定每个样品中的末端碱基时，需要与内部接头（Internal Adaptor）的8个碱基（从每个序列的起点不低于15 bp）的完美匹配。在图B中，从具有独特核心序列的898 miRNA集合的丰度调节的3’-核苷酸残基分布推断出RNA-seq文库中的miRNA的3’-核苷酸残基(参见图12)。对于两种鉴别miRNA的3’-端残基的方法而言，观察到类似的趋势。

具体实施方式

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。在本文的发明描述中使用的术语仅仅用于描述特定实施方案，无意限制本发明。

定义

如在发明描述和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”同样意图包括复数形式，除非上下文另外清楚地指出。另外，通过端点对数字范围的记载包括在该范围内包含的所有数字(例如，1-5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

本文中使用的“分离的”多核苷酸是指，已经从它的天然环境中取出的、使用重组技术生产的、或者化学或酶促合成的多核苷酸。还可以纯化多核苷酸，即，基本上不含有任何其它多核苷酸和有关的细胞产物或其它杂质。

核苷酸的组成为，通过磷酸酯键与戊糖(RNA中的核糖，和DNA中的脱氧核糖)连接的磷酸基团，所述戊糖又与有机碱基连接。核酸的单体单元是核苷酸。天然存在的DNA和RNA各包含四种不同的核苷酸：具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶碱基的核苷酸存在于天然存在的DNA中，而具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶碱基的核苷酸存在于天然存在的RNA中。碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶经常分别缩写成A、G、C、T和U。

互补的核苷酸是在双链寡核苷酸中容易地形成碱基对的那些核苷酸。腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶互补，反之亦然，鸟嘌呤与胞嘧啶互补，反之亦然。互补性表示在邻近链中的相对核苷酸互补的可能性，高互补性指示高数目的互补核苷酸，并且低互补性表示更低数目的互补核苷酸。

核苷酸包括游离的一磷酸、二磷酸和三磷酸形式 ( 即，其中磷酸基团分别具有一个、两个或三个磷酸部分 ) 。因此，核苷酸包括核糖核苷三磷酸 ( 例如， ATP 、 UTP 、 CTG 和 GTP) 和脱氧核糖核苷三磷酸 ( 例如， dATP 、 dCTP 、 dITP 、 dGTP 和 dTTP) ，及其衍生物。核苷酸也包括双脱氧核糖核苷三磷酸 (ddNTP ，包括 ddATP 、 ddCTP 、 ddGTP 、 ddITP 和 ddTTP) 及其衍生物。

本文中使用的多核苷酸可以是指包括多个核苷酸的任意分子，包括、但不限于DNA或RNA。优选地，多核苷酸包括至少5个核苷酸，且更优选地，它包括10个或更多个核苷酸。单链的描述也定义了互补链的序列。因而，核酸也包括所述单链的互补链。多核苷酸可以是单链的或双链的，或者可以含有双链和单链序列的某些部分。如本领域技术人员理解的，双链的多核苷酸是彼此结合的序列和它的互补序列。多核苷酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA)、RNA或杂交物，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合和碱基（包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤）的组合。可以通过化学合成方法或通过重组方法得到多核苷酸。当已经将多核苷酸定义为由DNA或RNA组成时，它可以分别被称作DNA链或RNA链。

在本文中使用的寡核苷酸表示如本文中定义的多核苷酸，但是寡核苷酸的长度通常更小。寡核苷酸包括多个核苷酸，并因此具有2个核苷酸的最小大小，在某些实施方案中，具有6个核苷酸的最小值。关于它们的最大大小，寡核苷酸通常具有100个核苷酸或更少的大小，在某些实施方案中，限度为70个核苷酸或更少。

在本文中使用的术语“突出端序列”表示从双链区域伸出的核酸的单链区域。

本文中使用的术语“引物”表示这样的寡核苷酸：其天然地存在，如在纯化的限制酶切消化中，或合成地产生，其特征在于依靠模板寡核苷酸来延伸的能力，使得其序列与模板分子的至少一部分序列互补的寡核苷酸连接至引物（当它们都处于核苷酸存在下在合适的温度和pH时）。但是，仅仅以此方式使用的能力不要求引物靠着模板充分延伸，且在某些实施方案中，引物仅仅用作添加小量非模板化核苷酸的位点。可以使用引物，诸如具有至少6个核苷酸长度的引物六聚体。优选的引物具有在约6-100个核苷酸范围内的长度，或在某些实施方案中，在10-70个核苷酸范围内。但是，在某些实施方案中，可以使用更大的引物。这些更大的引物是本文中定义的多核苷酸。

在本文中在2个或更多个寡核苷酸的背景下使用的“相同的”或“同一性”可以是指，所述序列在对比区域内具有指定百分比的相同残基。所述百分比可以如下计算：最佳地比对2个序列，在指定的区域内对比2个序列，确定在2个序列中存在相同残基的位置的数目以产生匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以对比区域中的位置的总数，并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。“基本上相似的”是指，给定的核酸序列与参照序列具有至少85%、更优选至少90%、且甚至更优选至少95%同一性。在2个序列具有不同长度或者比对产生1个或多个交错末端且指定的对比区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基可以被包括在分母中，而不作为计算的分子。当对比DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U) 可以视作等价物。同一性确定可以手工地进行，或者通过使用计算机序列算法诸如BLAST或BLAST 2.0。

本文中使用的术语“聚合酶链式反应”(“PCR”) 表示在DNA序列混合物中增加靶序列区段浓度而无克隆或纯化的方法。参见例如Bartlett和Stirling (2003)，其提供了PCR及其进展的综述。该用于扩增靶序列的方法通常由以下步骤组成：将大量过量的两条寡核苷酸引物引入包含所需靶序列的DNA混合物中，然后是在DNA聚合酶存在下的系列精确的热循环。两条引物与其各自的双链靶序列的链互补。为了扩增靶序列，使混合物变性，然后引物与其在靶分子内的互补序列退火。退火以后，用聚合酶延伸引物以形成新的互补链对。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可重复多次，以获得高浓度的扩增的所需靶序列区段。除非另外指明，本文所用PCR也包括PCR的变体，例如等位基因特异性PCR、不对称PCR、热启动PCR、连接介导PCR、多重PCR、逆转录PCR或者本领域技术人员所知的任何其它PCR变体。

本文中使用的术语“模板转换”表示逆转录酶从初始核酸序列模板转换至新核酸序列模板的3’末端的能力，所述新核酸序列模板与从初始模板合成的cDNA的3’末端几乎没有或没有互补性。本文中的模板转换的突出例子是，逆转录酶从初始核酸序列模板/引物底物转换至新核酸序列模板的3’末端的能力，所述新核酸序列模板与DNA引物链的3’末端几乎没有或没有互补性。

如本说明书所用，不管在过渡性短语还是在权利要求主体中，术语“包含”和“包括”应解释为具有开放式含义。也就是说，所述术语应解释为与短语“至少具有”或者“至少包含”同义。当用于方法语境时，术语“包括”意指该方法至少包括记载的步骤，但可包括另外的步骤。当用于化合物或组合物语境时，术语“包含”意指化合物或组合物包含至少记载的特征或组分，但也可包含另外的特征或组分。

在一个方面，提供了使用模板转换来制备靶多核苷酸的DNA拷贝的方法。模板转换允许使用逆转录酶来制备DNA拷贝，所述逆转录酶从初始核酸序列模板转换至新核酸序列模板的3’末端，所述新核酸序列模板与从初始模板合成的DNA的3’末端几乎没有或没有互补性，由此允许合成连续产物DNA，该产物DNA无需连接而将接头序列直接连接至靶寡核苷酸序列。

所述靶多核苷酸可以是各种不同的核酸序列。所述靶多核苷酸可以由RNA (例如，miRNA)构成，或者所述靶多核苷酸可以由DNA构成。就本文所述的方法而言，多核苷酸的大小和序列没有特别限制，尽管优选的是，所述靶多核苷酸具有至少10个核苷酸的大小。

制备靶多核苷酸的DNA拷贝的方法包括：在反应介质中将双链模板/引物底物与靶多核苷酸混合。所述双链模板/引物底物由与互补寡核苷酸模板链结合的DNA引物寡核苷酸组成。尽管所述双链模板/引物底物通常包括寡核苷酸链，在其它实施方案中，所述链之一或二者可以是如本文定义的多核苷酸。所述DNA引物和模板链可以包括接头序列，且还可以包括为靶多核苷酸提供有用功能性的其它序列。例如，所述引物可以包括帮助靶多核苷酸的检测、鉴别、PCR扩增和/或克隆的序列。引物链还可以含有使纯化容易的亲和标签或可以将引物连接至固体表面的标签。引物和互补的模板寡核苷酸可以含有防止它们被拷贝的修饰。所述引物还可以是具有发夹构型的多核苷酸。有用引物链的例子包括Illumina®小RNA引物、多重测序引物、Roche®454引物、NexTera™引物和用户设计的用于富集目标序列的引物，诸如optimus引物。

通过将合适量的非逆转录病毒逆转录酶加入反应介质中，开始DNA引物寡核苷酸与靶多核苷酸的连接。合适量是本领域技术人员已知的，并提供在本文的实施例中。这会造成逆转录酶从其3’末端延伸DNA引物寡核苷酸以产生DNA拷贝链，所述DNA拷贝链产生互补的靶DNA多核苷酸，后者使用靶多核苷酸作为模板来合成。

术语“逆转录酶”(即，RNA-指导的DNA聚合酶) 表示一组具有逆转录酶活性(即，其催化从RNA模板合成DNA)的酶。通常，这样的酶包括、但不限于逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶、细菌逆转录酶、II型内含子-衍生的逆转录酶、及其突变体、变体或衍生物。非逆转录病毒逆转录酶包括无-LTR逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶和II型内含子逆转录酶。II型内含子逆转录酶的例子包括：乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）Ll.LtrB内含子逆转录酶、细长热聚球蓝细菌（Thermosynechococcus elongatus）TeI4c内含子逆转录酶或嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）GsI-IIC内含子逆转录酶。其它细菌逆转录酶参见Simon和Zimmerly (2008),和Kojima和Kanehisa (2008)，它们描述了许多类别的非逆转录病毒逆转录酶(即，逆转录子、II型内含子和产生多样性的逆转录因子以及其它)。逆转录酶主要用于将RNA转录为cDNA，cDNA可接着被克隆到载体中用于进一步操作或者用于多种扩增方法，例如聚合酶链式反应、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、自动维持序列复制(3SR)、多样化引物延伸反应、5’RACE、化学修饰的检测或者其它需要使用RNA模板合成DNA的技术。

除了它们的常见表达形式以外，还可以使用逆转录酶的功能片段。逆转录酶的功能结构域是本领域技术人员众所周知的，并且可以制备不包括逆转录酶结构的功能片段。例如，使用亚克隆基因片段的常规分子遗传操作，诸如Sambrook等人(1989)和Ausubel等人所述(1999和先前版本)，可以生产编码已知逆转录酶的基因的亚克隆。然后在体外或在体内在细菌细胞中表达亚克隆，以产生更小的蛋白或多肽，可以测试它们的逆转录酶活性以确定它是否是逆转录酶的功能片段。

在某些实施方案中，所述非逆转录病毒逆转录酶是II型内含子逆转录酶。多种II型内含子-衍生的逆转录酶是已知的。参见例如Zimmerly Lab网站的Mobile Group II Introns(可移动的II型内含子)，其描述了105种全长II型内含子-衍生的逆转录酶。Dai等人(2003)和Candales等人(2012)描述了该网站的使用。在其它实施方案中，可以使用可移动的II型内含子逆转录酶或稳定化的逆转录酶融合蛋白。稳定化的逆转录酶融合蛋白是已经通过连接至蛋白（诸如麦芽糖结合蛋白）而稳定化的逆转录酶。在本文实施例1和2中进一步描述了用于制备稳定化的逆转录酶融合蛋白的示例性方法。稳定化的逆转录酶融合蛋白的更完整描述参见美国专利公开号2012/0009630。

II型内含子编码一类已知其自剪接反应的RNA。在特定的体外条件下，II型内含子编码的RNA可在无蛋白帮助下将其自身从前体RNA切除并将它们侧翼的外显子连接在一起。剪接反应机制与核前mRNA内含子的剪接相似。许多II型内含子也编码逆转录酶(RT)开放阅读框(ORF)并且是活性可动元件。ORF通常存在于II型内含子编码的RNA的DIV结构域中。II型内含子RT通过稳定催化活性RNA结构辅助RNA剪接，并然后在核糖核蛋白(RNP)中保持与切除内含子RNA结合，该核糖核蛋白通过称为“反向归巢(retrohoming)”的过程促进内含子移动性。反向归巢通过其中RNP中的切除内含子RNA直接插入DNA靶位点中并通过RT逆转录的机制发生。在反向归巢期间，II型内含子促进内含子靶向合适DNA序列，II型内含子RT必须生产内含子RNA的精确cDNA拷贝，内含子RNA通常2-2.5kb长且折叠成高度稳定和致密的二级和三级结构。因此，II型内含子RT必须具有高的持续合成能力和保真度，以便执行其生物学功能。II型内含子衍生的RT也缺乏RNA酶H活性，其可以是有益的，因为RNA酶H特异降解RNA:DNA杂合体的RNA，使任何RNA仅能够复制一次并可导致降低的全长cDNA产率。

在反应介质中进行通过非逆转录病毒逆转录酶实现的从DNA引物寡核苷酸向靶多核苷酸的模板转换。所述反应介质包括，或者可以制成在所述方法中包括，足量的脱氧核糖核苷三磷酸或二脱氧核糖核苷三磷酸以允许制备DNA拷贝，并且应当保持在适合非逆转录病毒逆转录酶工作的温度(例如，25℃至约81℃)。还包括本领域技术人员已知的量的逆转录酶在水性介质中工作所需的缓冲液和其它物质，例如含有20 mM Tris pH 7.5、10 mM MgCl₂、75 mM KCl和1 mM DTT的缓冲液(Levesque-Sergerie等人 . 2007)。

用于促进DNA拷贝形成的双链模板/引物底物由与互补寡核苷酸模板链结合的DNA引物寡核苷酸构成。在某些实施方案中，互补寡核苷酸模板链可以由RNA构成以提供互补的RNA链。在其它实施方案中，互补寡核苷酸可以由DNA构成以提供互补的DNA链。优选地，互补寡核苷酸模板链由RNA构成，因为它会被更有效地使用，最可能因为逆转录酶的天然模板是RNA。但是，还可以使用DNA。参见例如图11，该图显示了使用RNA/DNA或DNA/DNA模板引物的模板转换。

通过逆转录酶延伸的双链模板/引物底物的末端可以是平端，这意味着DNA引物寡核苷酸的3’末端和互补寡核苷酸模板链的5’末端可以在相同位置结束，或者“直接对齐”，没有未配对的核苷酸。可替代地，双链模板/引物底物的相同末端可以具有“突出端”，其中DNA引物寡核苷酸的3’末端比互补寡核苷酸模板链的5’末端伸出1个核苷酸。模板转换对仅单个突出端或平端的要求，会提供胜过逆转录病毒逆转录酶的优点，所述逆转录病毒逆转录酶需要在DNA引物链的3’末端和新RNA模板的3’末端之间的至少2个碱基对才能进行模板转换(Oz-Gleenberg等人 . 2011)。可以使用单核苷酸突出端来特异性地模板转换至具有互补3’末端的核酸，或者可以使用根据经验设计的所有4种突出端的混合物来减少模板转换中的偏倚。单核苷酸突出端胜过平端的一个优点是，可以根据需要调节构成突出端的核苷酸的比例，使其与单个靶多核苷酸的3’核苷酸残基或与靶多核苷酸的混合物的3’核苷酸残基互补。当存在突出端时，优选的是，在靶多核苷酸的3’末端处的核苷酸与在DNA引物链的3’末端处的突出端核苷酸互补，以促进通过这2个核苷酸的碱基配对实现的结合。

在执行本文所述的方法的一些实施方案时，还可以在不同的位置提供“突出端”。在这些实施方案中，非逆转录病毒逆转录酶会在DNA引物寡核苷酸的3’末端处添加1-15个额外的非互补的核苷酸，然后产生DNA拷贝多核苷酸，后者包括互补的靶DNA多核苷酸。因为这些核苷酸没有与其它链结合，它们在添加时是非互补的，尽管在具有适当序列的靶多核苷酸变得可用的情况下它们当然会变成互补的。在其它实施方案中，在DNA引物寡核苷酸的3’末端处的突出端可以短于1-15个核苷酸。例如，它可以是1-6个核苷酸、1-3个核苷酸，或者它可以是单核苷酸。

在某些实施方案中，可能希望在拷贝靶多核苷酸的背景之外在DNA引物寡核苷酸的3’末端处提供突出端。因此，本公开内容也提供了向DNA引物寡核苷酸添加额外核苷酸的方法。该方法包括：向反应介质中加入合适量的非逆转录病毒逆转录酶，所述反应介质包括如本文所述的、由与互补寡核苷酸模板链结合的DNA引物寡核苷酸组成的双链模板/引物底物，然后用非逆转录病毒逆转录酶在DNA引物寡核苷酸的3’末端处添加1-15个额外的非互补的核苷酸。在该方法的某些实施方案中，所述非逆转录病毒逆转录酶是II型内含子逆转录酶。在其它实施方案中，可能优选的是，向DNA引物寡核苷酸的3’末端添加仅1-6个额外的非互补的核苷酸或甚至单个非互补的核苷酸。

本文所述的方法的某些实施方案可以在互补寡核苷酸模板链的3’末端处包括封闭剂，以终止寡核苷酸和阻碍逆转录酶的进一步再拷贝。所述封闭剂会阻碍逆转录酶使用该寡核苷酸作为靶标。合适的封闭剂的例子包括3'-氨基-改性剂C3和3'-氨基-改性剂C7，它们二者含有支链接头，其中氨基被芴基甲氧基羰基(Fmoc)基团保护。其它潜在的3’改性剂可以是巯基；DPTA (3,3′-(羟基亚硝基肼基]二-1-丙胺)，其也可以用于将寡核苷酸缀合至金表面；间隔物亚磷酰胺（phosphoamidite）改性剂；或甘油。间隔物改性剂可以制成光可裂解的。本领域技术人员会理解使用封闭剂用于防止再拷贝，并且因此其它封闭剂可以与本文所述的方法一起使用。

使用模板转换将引物连接至靶多核苷酸的优点之一是，使合适的引物同时结合多种不同多核苷酸的能力。因此，本文中描述的方法可以用于制备具有多个DNA拷贝多核苷酸的克隆文库。所述克隆文库如下制备：将如本文所述的双链模板/引物底物与多个不同的靶多核苷酸在反应介质中混合，并将合适量的非逆转录病毒逆转录酶加入所述反应介质中，以形成与靶多核苷酸互补的DNA多核苷酸的文库，所述靶多核苷酸包括促进后续拷贝和/或鉴别的序列(例如，接头序列)。可以包括任意数目的额外靶多核苷酸。例如，使用本文所述的方法，可以与接头序列同时结合2个、5个、10个、50个、100个或更多的不同的靶寡核苷酸。

其它实施方案还可以包括使DNA拷贝多核苷酸环化的其它步骤。使链环化表示：使DNA拷贝多核苷酸的3’末端与5’末端连接，以产生DNA环而不是线性的多核苷酸链。可以如下进行环化：例如，用CircLigase (例如，CircLigase I或CircLigase II)处理DNA拷贝多核苷酸，该酶会将单链DNA环化。DNA的环化允许使用PCR和双向引物容易地扩增链。

可以将逆转录酶(例如，II型内含子逆转录酶)和双链模板/引物底物掺入试剂盒中，所述试剂盒可用于制备DNA拷贝多核苷酸或可用于非模板化核苷酸添加。所述双链模板/引物底物可以包括如前所述的平端或突出端。这样的试剂盒可以包括载体装置，所述载体装置被分隔以容纳一个或多个容器，诸如管形瓶、试管等，它们中的每一个包括用于制备DNA拷贝多核苷酸的单独元件之一。例如，可以提供第一容器，其内容物包括在溶液中的逆转录酶。此外，可以提供任意数目的额外容器，其内容物可以独立地包括双链模板/引物底物和反应介质组分，诸如合适的缓冲液和用于DNA合成的核苷酸诸如脱氧核苷酸三磷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP)。所述试剂盒还可以包括一种或多种靶多核苷酸，或者所述试剂盒可以构造成与从另外来源提供的靶多核苷酸结合使用。可以提供上述组分的任意组合。所述试剂盒可以构造成提供它的各种组分的稳定贮存，同时允许逆转录酶加入反应介质中，以使双链模板/引物底物的DNA引物寡核苷酸从它的3’末端延长，以提供DNA拷贝多核苷酸，其包括使用靶多核苷酸作为模板合成的互补靶DNA多核苷酸。

下述实施例提供了制备非逆转录病毒逆转录酶的方法和使用它们使用模板转换将DNA引物寡核苷酸连接至靶多核苷酸的方法或使用它们将额外核苷酸添加至模板/引物底物的方法。附上的这些这些实施例为了例证目的，且无意限制本发明的范围。

实施例

实施例 1: TeI4c-MRF 和 GsI-IIc RT 的制备

表达质粒pMalE-RF-TeI4c含有细长热 聚球蓝细菌 (Thermosynechococcus elongatus)TeI4cII型内含子的RT ORF，其具有融合的N-端MalE标签，该标签被克隆在pMal-c2t中的tac启动子的后面，所述pMal-c2t是pMal-c2x (New England Biolabs®, Ipswich, MA)的衍生物，具有替代因子Xa位点的TEV蛋白酶-切割位点(Kristelly等人 . 2003)。如下构建该质粒：用附带限制位点(EcoRI和PstI)的引物PCR扩增克隆在pUC19中的TeI4c内含子的TeI4c RT ORF (Mohr等人 . 2010)，然后将所述PCR产物克隆进pMal-c2t的对应位点中。使用Accuprime聚合酶(Invitrogen™; Makarova等人 . 2000)，通过Quick Change PCR操作，用刚性接头(TVDAALAAAQTNAAAAA) (SEQ ID NO: 4) 替代TEV-蛋白酶可切割的接头(TVDEALKDAQTNS₃N₁₀LENLYFQG) (SEQ ID NO: 3)。

如下构建pMalE-GsI-IIC：用附带BamHI位点的引物，从嗜热脂肪土芽孢杆菌 (Geobacillus stearothermophilus)菌株10基因组DNA (得自Greg Davis, Sigma-Aldrich) PCR扩增RT ORF，并将PCR产物克隆在pMal-c2t的对应位点之间。GsI-IIC是在嗜热脂肪土芽孢杆菌基因组中的多拷贝中发现的第II组C内含子(CP001794, Moretz和Lampson 2010)。克隆的GsI-IIC RT ORF对应于这些基因组序列之一，并与Vellore等人(2004)克隆的RT ORF相比具有3个氨基酸序列改变。

在大肠杆菌Rosetta 2 (Novagen®, EMD Biosciences, Gibbstown NJ)或ScarabXpress®T7lac (ScarabGemomics™, Madison WI)中从pMalE-RF-TeI4c或pMalE-RF-GsI-IIc表达MalE-RF RT。用表达质粒转化大肠杆菌菌株，于37℃在TB或LB培养基中培养到对数中期(O.D.₆₀₀＝0.8),通过加入1 mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导并在18℃温育约24 h。然后通过离心沉淀出细胞，再悬浮于45 ml缓冲液A (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM二硫苏糖醇,和10% 甘油)中，并在-80℃冷冻。

为了纯化MalE-RF RT，融化细胞混悬液，在冰上用溶菌酶(1 mg/ml; Sigma-Aldrich®, St. Louis MO)处理15 min，在干冰上冻融三次，进行超声处理(Branson 450 Sonifier, Branson Ultrasonics, Danbury CT；以60％的振幅在冰上进行3或4次10秒脉冲(burst)，脉冲(burst)之间间隔10秒)，并在18,500 x g在4℃离心30 min。通过加入聚乙烯亚胺(PEI)至终浓度为0.2%，沉淀出核酸，并在15,000 x g在4℃离心15 min。将所得上清液施加于已经在缓冲液A中平衡的直链淀粉柱(10 ml柱体积；Amylose High-Flow; New England Biolabs™, Ipswich, MA)，并用5柱体积的各包含0.5 M、1.5 M和0.5 M KCl的缓冲液A洗涤柱，然后用包含10 mM麦芽糖的缓冲液A洗脱。通过肝素-琼脂糖色谱法(3个串联的1 ml柱；GE Healthcare Biosciences™Corp.)进一步纯化合并的蛋白级分，该柱已在包含100 mM KCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、10% 甘油的20 mM Tris-HCl（pH 7.5）中预平衡。将在缓冲液A的蛋白施加到柱上，并用40柱体积从上柱浓度到2M KCl的梯度洗脱。合并峰级分，并在20 mM Tris-HCl、pH 7.5、0.5 M KCl、1 mM EDTA、1 mM DTT和50% 甘油中透析，快速冷冻，并在-80℃保存。

实施例 2: Ll.LtrBII 型内含子 RT (LtrA 蛋白 ) 的制备

在大肠杆菌BL21(DE3)中从质粒pMAL-LtrA表达LtrA蛋白，所述质粒pMAL-LtrA含有克隆在tac启动子下游的LtrA ORF (Mills等人 . 1996) 以及在蛋白-表达载体pMAL-c2t的BamHI和HindIII之间的Φ10 Shine-Dalgarno序列(参见上文)。在LB培养基中在37℃培养起始细胞培养物过夜，并用于接种含有0.5 L LB培养基的超高产量烧瓶，如下进行自诱导：在37℃培养3 h，随后在18℃培养24 h (Studier 2005)。通过离心收获细胞(Beckman JLA-8.1000; 4,000 x g, 15 min, 4℃)，并再悬浮于1 M NaCl、20 mM Tris-HCl pH 7.5、20% 甘油和0.1 mg/ml溶菌酶(Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO)中。通过如上关于TeI4c-MRF RT的制备所述的3个冻融循环和超声处理进行裂解。在沉淀细胞碎片(Beckman Coulter™JA-14转子, 10,000 rpm, 30 min, 4℃)以后，用0.4% 聚乙烯亚胺(PEI)从上清液中沉淀出核酸，并在4℃恒定搅拌20 min，随后离心(Beckman Coulter™JA-14转子, 14,000 rpm, 30 min, 4℃)。然后如下从上清液中沉淀出蛋白：加入硫酸铵至50%饱和，并在4℃恒定搅拌1 h。使沉淀出的蛋白沉淀(Beckman Coulter™JA-14转子, 14,000 rpm 30 min, 4℃)，并溶解于500 mM NaCl、20 mM Tris-HCl pH 7.5、10% 甘油中。将蛋白施加于10 ml直链淀粉柱(Amylose High-Flow树脂; New England Biolabs™, Ipswich, MA)，用3柱体积的500 mM NaCl、20 mM Tris-HCl pH 7.5、10% 甘油洗涤，并用含有10 mM麦芽糖的500 mM NaCl、20 mM Tris-HCl pH 7.5、10% 甘油洗脱。将含有MalE-LtrA的级分与80 μg/ml TEV蛋白酶一起在4℃温育18 h。通过FPLC穿过加载了40 mM咪唑的Ni-NTA柱从TEV蛋白酶中进一步纯化这些级分，用3柱体积的500 mM NaCl、20 mM Tris-HCl pH 7.5、10% 甘油、40 mM咪唑洗涤，并在500 mM NaCl、20 mM Tris-HCl pH 7.5、10% 甘油、300 mM咪唑中洗脱。通过FPLC穿过含有肝素琼脂糖(New England Biolabs®)的柱进一步纯化单体LtrA。然后将纯化的蛋白浓缩至30 μM，并通过透析交换进100 mM NaCl、20 mM Tris-HCl pH 7.5、10% 甘油中。

实施例 3: 通过 II 型内含子 RT 模板转换实现的 cDNA 克隆和测序

通过将纯化的蛋白与由Integrated DNA Technologies®(IDT; Coralville, IA)合成的人工寡核苷酸底物一起温育，进行使用TeI4c-MRF RT的反转录反应。在有些实验中，使用噬菌体T4多核苷酸激酶(New England Biolabs®)，根据生产商的方案，用[γ-³²P]-ATP (10 Ci/mmol; Perkin-Elmer®)标记DNA引物的5’-末端。如下使引物与RNA模板链退火：以1.1:1摩尔比在10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1 mM EDTA中混合，加热至82℃保持2 min，然后使用PCR仪(Gene Amp 9700, Life Technologies™Corporation, Carlsbad, CA)历时10 min冷却至室温。在图例中指定的条件下，在10-40 μl反应介质中进行反转录反应。通过加入酶来开始反应，并通过加入125 mM EDTA、0.05% SDS来终止反应，随后进行苯酚-CIA提取。对于使用标记的引物的实验，在变性20% 聚丙烯酰胺凝胶中分析产物，用PhosphorImager™扫描所述凝胶。

对于通过II型内含子RT模板转换进行的cDNA克隆和测序，发明人使用了由具有3’氨基修饰剂(AmMO，即通过6-7个碳的接头连接的伯胺；IDT) (5’-cgccuuggccguacagcagccucucuaugggcagucggugau-AmMO-3’) (SEQ ID NO. 5) 的IA-P1 RNA寡核苷酸组成的合成RNA模板/DNA引物，其以1:1.1摩尔比与含有脱氧尿苷的5’-标记的Pc引物(5’-atcaccgactgcccatagagagcc/dU/GCTGTA 3’) (SEQ ID NO. 6) 退火。对于反转录反应，将模板/引物底物(50或100 nM)与等摩尔miRNAx (5’Phos-NNCGCUUCAGAGAGAAAUCNN 3’) (SEQ ID NO. 7)和RT (终浓度2-2.5 μM)一起在50-100 μl反应介质中在图例所述条件下温育。用热稳定的RNA酶H (Hybridase™; 20单位; Epicentre®) 在55℃处理得到的cDNA 5 min。如下从变性20% 聚丙烯酰胺凝胶分离出cDNA产物带：破碎凝胶片，并将它们在0.5 M NH₄Cl、0.1 M EDTA、10 mM MOPS、pH 6.5、0.1% SDS中浸泡过夜。用苯酚提取洗脱的cDNA，在有线性丙烯酰胺载体(58 μg/ml)存在下用0.3 M醋酸钠沉淀，溶解在水中，且在某些情况下，使用Qiagen™MinElute试剂盒进行纯化。然后根据生产商的说明书用CircLigase I或II (Epicentre®) 将cDNA环化，并根据生产商的说明书用外切核酸酶I (Epicentre®) 处理，以除去任何残余的线性cDNA分子。使用Epicentre®尿嘧啶DNA切除(UDE) 试剂盒，根据生产商的说明书，将环化的cDNA重新线性化，其中切除缓冲液在0.5x浓度以保持EDTA浓度对于PCR而言足够低。如下扩增反应产物：根据生产商的说明书使用Accuprime Pfx聚合酶(Invitrogen™)或Flash Phusion®(Finnzymes)，使用SOLiD 5’和3’引物（SOLID 5’: 5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT；(SEQ ID NO. 8) SOLID 3’: 5’-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCT/条形码/CTGCTGTACGGCCA AGGCG) (SEQ ID NO. 9-10)），进行15-35个在95℃、55℃和68℃各保持5秒的循环。从3% 琼脂糖凝胶(Wizard SV Gel和PCR Clean-Up试剂盒: Promega®, Madison, WI)分离PCR产物带，并要么进行TA克隆(Taq DNA聚合酶, TOPO TA克隆试剂盒; Invitrogen™)，要么克隆进Zero Blunt®PCR克隆试剂盒(Invitrogen™) 中用于使用M13 F(-20) 引物的Sanger测序或通过SOLiD测序来直接测序。

如下用II型内含子Ll.LtrB RT (LtrA蛋白)进行反转录反应：在20 μl 450 mM NaCl、5 mM MgCl₂、20 mM Tris-HCl pH 7.5、1 mM二硫苏糖醇(DTT)和200 μM dNTP中与人工寡核苷酸底物(参见下文)一起温育纯化的蛋白。在冰上装配反应组分，最后加入底物，并在30℃温育30 min。通过苯酚-CIA提取来终止反应。将反应产物的部分(3 μl)加入等体积的凝胶上样缓冲液II (95% 甲酰胺、18 mM EDTA以及各0.025%的SDS、二甲苯蓝和溴酚蓝(Ambion, Austin, TX))中，在98℃变性7 min，并在变性10或15% 聚丙烯酰胺凝胶中泳动，用PhosphorImager™扫描所述凝胶。

在图4中描述的反应使用Ll.LtrB RNA (5’-GUGCGCCCAGAUAGGGUGUUCUCGUUGGCAAUGGUGUCCAACUUGUGCUGCCAGUGCUCG-AmMO-3’) (SEQ ID NO. 11) 和退火引物c (5’-CGAGCACTGGCAGCACAAG/dU/TGGACACCATTGCCAACGAGAACAC) (SEQ ID NO. 12)和外显子1 DNA (5’-TGTGATTGCAACCCACGTCGATCGTGAACACATCCATAAC) (SEQ ID NO. 13)或RNA (5’-UGUGAUUGCAACCCACGUCGAUCGUGAACACAUCCAUAAC) (SEQ ID NO. 14)。

在图5中描述的反应使用外显子2 DNA (5’-CATATCATTTTTAATTCTACGAATCTTTATACTGGCAAAC) (SEQ ID NO. 15)或外显子2 RNA (5’-CAUAUCAUUUUUAAUUCUACGAAUCUUUAUACUGGCAAAC) (SEQ ID NO. 16) 和退火引物e2 (5’-CATCTGGCGGCTGTTCTCG/dU/TGGACACCATTGCCAACGAGGTTTGCCAGTA TAAAGATTCGTAGAATTAA) (SEQ ID NO. 17)。

DNA和RNA寡核苷酸得自Integrated DNA Technologies®(IDT; Coralville, IA)，并如下在变性10% (w/v) 聚丙烯酰胺凝胶中进行凝胶纯化：在Eppendof管中在-80℃冷冻10 min，然后破碎凝胶片，并将它们在4℃在0.5 M NH₄Cl、0.1 M EDTA、10 mM MOPS（pH 6.5）和0.1% SDS中浸泡过夜。使用0.45 μm孔径的Costar Spin-X离心管过滤器(Corning™Inc, Lowell, MA)，从凝胶片段中分离寡核苷酸，然后在有线性丙烯酰胺载体(58 μg/ml)存在下进行乙醇沉淀，并溶解于无核酸酶的水中。使用噬菌体T4多核苷酸激酶(New England Biolabs®)，根据生产商的方案，用[γ-³²P]-ATP (10 Ci/mmol; Perkin-Elmer) 标记DNA引物的5’-末端。对于引物的退火，以在RT测定中使用的浓度的20倍，混合寡核苷酸，然后加热至82℃，并在1x退火缓冲液(100 mM Tris-HCl pH 7.5和5 mM EDTA)中缓慢地冷却至25℃保持45 min。通过在含有Tris-硼酸盐-EDTA (90 mM Tris, 90 mM硼酸, 2 mM EDTA)的非变性10% 聚丙烯酰胺凝胶中在30℃电泳来评估退火效率(Sambrook等人 . 1989)。

对于用Ll.LtrB RT合成的cDNA的克隆和测序，如下从变性10% (w/v) 聚丙烯酰胺凝胶片凝胶纯化cDNA产物：切离带，在Eppendorf管中在-80℃冷冻10 min，在试管中破碎，加入600 μl 500 mM NH₄Cl、100 μM EDTA、10 mM MOPS pH 6.5和0.1% SDS，并在4℃温育过夜。使用0.45 μm孔径的Costar Spin-X离心管过滤器(Corning™Inc, Lowell, MA)，从凝胶片段中分离寡核苷酸，然后在有线性丙烯酰胺载体(58 μg/ml)存在下进行乙醇沉淀，并溶解于无核酸酶的水中。使用CircLigase I或II (Epicentre®)将cDNA环化，用外切核酸酶I (Epicentre®)处理，并用尿嘧啶-DNA切除酶混合物(Epicentre®)线性化，它们都根据生产商的说明书，其中切除缓冲液在0.5x浓度以保持EDTA浓度对于PCR而言足够低。对于图4的实验，使用含有HF缓冲液的Phusion®High Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs™, Ipswich, MA) 对线性化产物进行PCR扩增，所述Phusion®High Fidelity PCR Master Mix含有引物Anchor 6补充物(5’-CTTGTGCTGCCAGTGCTCG) (SEQ ID NO. 18)和Anchor 5 (5’-TGGACACCATTGCCAACGAG) (SEQ ID NO. 19)。对于图5的实验，用引物Anchor 4补充物(5’-CGAGAACAGCCGCCAGATG) (SEQ ID NO. 20)和Anchor 5 (参见上文)类似地PCR扩增线性化产物。用下述循环条件，在50 μl含有HF缓冲液的反应介质Phusion®High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs™) 中进行PCR：在98℃初始变性2 min，25个在98℃保持10秒、在60℃保持10秒、在72℃保持5秒的循环，和在72℃保持7 min的最后延伸。在2% 琼脂糖中分离PCR产物，并用MinElute Gel Extraction试剂盒(Qiagen®)进行凝胶纯化，然后根据生产商的方案克隆进TOPO-TA pCR2.1载体(Invitrogen™) 中。挑取随机菌落，并通过集落PCR使用含有HF缓冲液的Phusion®High Fidelity PCR Master Mix用引物M13 F(-20) (5’-GTAAAACGACGGCCAGT) (SEQ ID NO. 21)和M13 R(-26) (5’-CAGGAAACAGCTATGAC) (SEQ ID NO. 22)扩增克隆的PCR产物，然后使用M13 R(-24) (5’-GGAAACAGCTATGACCATG) (SEQ ID NO. 23) 引物测序。

实施例 4 ：通过热稳定的 TeI4c-MRFII 型内含子 RT 实现的模板转换和非模板化核苷酸添加的分析

图1对比了热稳定的TeI4c-MRFII型内含子RT和Superscript III RT从表示为IA-P1 RNA/Pc DNA的RNA模板/DNA引物底物模板转换至21-nt RNA寡核苷酸(表示为miRNAx)的3’末端的能力，所述miRNAx的序列类似于在5’-和3’-末端处具有2个随机化核苷酸残基(N’s)的植物miRNA的序列(拟南芥 (Arabidopsis thaliana) ath mir-173; Park等人 . 2002)，以评估在模板转换过程中的偏倚。所述模板/引物底物由42-nt模板RNA (表示为IA-P1 RNA)组成，所述IA-P1 RNA含有用于SOLiD下一代测序的内部接头（Internal Adaptor）(IA)和P1序列，其中退火的31-nt DNA引物(表示为Pc) 与P1和IA序列的一部分互补(图2)。用3’-氨基修饰剂(AmMO; IDT) 合成了IA-P1模板RNA，以阻碍它通过向它的3’末端的模板转换来再拷贝，并对Pc DNA引物的5’末端进行³²P标记，且所述引物含有内部脱氧尿苷，用于使用尿嘧啶DNA切除混合物对环化的cDNA进行随后线性化(UDE; Epicentre；图2)。在每种酶的最佳条件下进行使用TeI4c-MRF和SuperScript III RT的反转录反应(参见图1图例)。

尽管SuperScript III会产生约42个nt的单一优势产物(IA-P1 cDNA)（其得自Pc引物向IA-P1 RNA模板的5’末端的延伸），TeI4c-MRF RT会产生类似的产物以及一系列更大的带，所述带具有关于将21-nt miRNAx的1个、2个或3个拷贝连接至IA-P1接头序列的模板转换所预见到的大小。使用TeI4c-MRF RT在IA-P1 RNA的末端处终止cDNA合成所产生的主要的约42-核苷酸带稍微大于用SuperScript III得到的带，这提示，II型内含子RT在到达RNA模板的5’末端以后具有更大的向cDNA的3’末端添加额外核苷酸残基的倾向。这样的额外核苷酸添加是其它DNA聚合酶和RT的性质(Clark等人 . 1987; Clark 1988, Hu 1993, Patel和Preston 1994, Peliska和Benkovic 1992, Golinelli和Hughes 2002)。它通常被称作“非模板化核苷酸添加”或“末端转移酶”活性(Golinelli和Hughes 2002, Andrade等人 . 2009)，因为它发生在DNA产物链的3’末端，在该酶已经到达模板的5’末端以后。在本文中，我们将它称作非模板化核苷酸添加活性或额外核苷酸添加活性。

为了对通过II型内含子RT模板转换合成的cDNA进行克隆和测序，发明人开发了图2所示的操作。在用II型内含子RT进行cDNA合成以后，将产物与RNA酶H一起温育以消化RNA模板链，在变性20% 聚丙烯酰胺凝胶中纯化，用CircLigase环化，并用外切核酸酶消化以除去未连接的cDNA。然后用尿嘧啶DNA切除混合物在已经掺入Pc DNA引物序列中的脱氧尿苷残基处将环状cDNA重新线性化(图2，下部)，从而实现使用SOLiD 5’和3’引物的容易扩增。

对于不需要鉴别特定大小的cDNA带的应用，可以省却图2操作中的cDNA的凝胶纯化步骤。还可以如下在不使用CircLigase的情况下克隆cDNA：将第二接头连接至cDNA的3’末端，或使用RT或其它酶(例如，末端脱氧核苷酸基转移酶)的非模板化核苷酸添加活性来添加同聚物尾巴(例如，聚(dA))，从而实现含有互补同聚物批次(例如，聚(dT))的第二接头的退火。另外，如果在变性凝胶中对cDNA进行凝胶纯化，那么RNA酶H处理是任选的。还可以在没有尿嘧啶-切除线性化步骤下对环化的cDNA进行PCR扩增，或者通过一些其它方法（诸如在掺入寡核苷酸接头中的限制位点处的限制性酶消化）进行线性化。在下述的不同实验中，将扩增cDNA所得到的PCR产物克隆进TOPO TA载体中，或者克隆进Zero Blunt®PCR克隆试剂盒(Invitrogen™)中，并通过Sanger方法测序，或者通过下一代SOLiD测序法直接测序。

图3显示了在与图1相同的条件下通过TeI4c-MRF RT的模板转换产生的cDNA的序列。分离可能源自从IA-P1 RNA/DNA引物底物至miRNAx的第一模板转换至第二种miRNAx分子的第二模板转换的cDNA的带，并使用图2所示的操作进行克隆，用M13F(-20) 引物通过Sanger方法测序。约65-nt产物的克隆和测序证实，它得自从IA-P1 RNA接头序列至miRNA的模板转换，由此将接头连接至miRNA序列。在所有情况下，模板转换无缝地进行，无需在2个RNA序列的连接区处添加额外核苷酸残基。但是，在到达miRNA模板的5’末端以后，向cDNA的3’末端添加1-15个额外核苷酸残基，优先添加A-残基作为第一个额外核苷酸。另外，cDNA序列表现出在miRNA模板的3’-端核苷酸残基的相对位置处的显著偏倚：A，46%；C；33%；G，21%；和U，0%。在cDNA序列中的这些偏倚提示，从模板/引物底物的模板转换偏好具有3’末端U-残基的miRNA，且强烈讨厌具有3’末端A-残基的miRNA。

约85-nt产物的克隆和测序证实，它得自向miRNA模板的2次连续模板转换，从而产生与miRNA序列的2个串联拷贝连接的IA-P1接头序列(未显示)。再次无缝地发生接头序列的连接，在分析的11个克隆中，没有额外核苷酸残基掺入在第一或第二模板转换的连接区中。但是，额外核苷酸残基再次添加在完成的cDNA的3’末端，优先添加A-残基作为第一个额外核苷酸，并且初始模板转换再次表明从IA-P1 RNA向具有3’A-残基的miRNA (用在cDNA序列的3’-端miRNA核苷酸的相对位置处的T-残基的缺乏来指示(未显示))的转换的强偏倚。

实施例 5: 通过乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis) Ll.LtrBII 型内含子 RT (LtrA 蛋白 ) 实现的模板转换和非模板化核苷酸添加的分析

为了确定模板转换和非模板化核苷酸添加是否是II型内含子RT的一般性能的倾向，我们用嗜温性的乳酸乳球菌Ll.LtrBII型内含子RT进行了生化测定。在图4A所示的实验中，初始模板/引物底物由60-核苷酸RNA模板组成，其5’末端对应于具有退火的45-nt DNA引物(引物c；在图中表示为Pri c)的Ll.LtrB内含子的末端。Ll.LtrB RT启动内含子RNA模板从退火的DNA引物的反转录，并使它向RNA的5’末端延伸，此处它然后可以跳至具有ltrB外显子1的核苷酸序列的40-nt DNA或RNA模板(E1 RNA或DNA)。Ll.LtrB RNA的3’末端具有氨基修饰剂(AmMO) 以阻碍RT的向初始模板的第二分子转换的能力。所述反应在含有200 μM dNTP、450 mM NaCl、5 mM MgCl₂、20 mM Tris-HCl pH 7.5和1 mM二硫苏糖醇(DTT)的反应介质中进行，以前已经证实Ll.LtrB RT的最佳活性需要高盐浓度(Saldanha等人 . 1999)。

图4A泳道5和6表明，Ll.LtrB RT会有效地延长引物至内含子RNA模板的末端，从而产生约60-nt的主要标记产物（从Pri c DNA引物向初始Ll.LtrB RNA模板的末端的延伸预期该大小）以及更小量的更大产物，所述更大产物具有从模板转换至外显子1 DNA或RNA (100nt)或模板转换至第二种Ll.LtrB RNA分子(120核苷酸)（不论氨基修饰剂）预见到的大小。约60-nt产物被分离为双带，这可能反映了向初始cDNA的3’末端的非模板化核苷酸添加。对照泳道(泳道1-4)表明，对于引物c自身，或对于与RT自身一起温育的引物c，或对于在有外显子1 RNA或DNA存在下与RT一起温育的引物c (泳道1-4)，没有检测到这样的标记产物。

在图4B和C中总结了cDNA产物的克隆和测序。测序证实，主要的约60-nt产物(泳道5中的带a和b，泳道6中的带h和i)对应于延伸至Ll.LtrB RNA的5’末端或其附近的cDNA，双带反映了额外核苷酸核苷酸残基（主要是A-残基）在到达RNA模板的末端后向cDNA的3’末端的添加(图4B和C)。

更大的带(泳道5中的带c-g，泳道6中的带h-n)含有从内含子的5’末端向外显子1 DNA或RNA的3’末端的模板转换产生的产物(图4B和C），以及通过模板转换至内部区域或模板转换至Ll.LtrB RNA的3’末端（不论氨基修饰剂）产生的产物（未显示）。带c、d和e含有通过模板转换至外显子1 DNA产生的产物(图4B)。带j、k和l含有通过模板转换至外显子1 RNA产生的产物(图4C)。大多数(70%) 向外显子1 DNA的模板转换无缝地进行，但是在某些(30%) 模板转换连接区处以及在大多数(92%) DNA产物的3’末端处发现了额外核苷酸残基（主要是A-残基）。我们发现，61% 的与外显子1 RNA的模板转换连接区具有额外核苷酸残基，且44% 的cDNA 3’末端具有额外核苷酸残基，在两种情况下主要是A-残基。我们发现，48%的与Ll.LtrB RNA的模板转换连接区具有额外核苷酸残基，且50%的cDNA 3’末端具有额外核苷酸残基，在两种情况下主要是A-残基(未显示)。在某些情况下，Ll.LtrB RT会添加A-残基的批次。带g含有通过向外显子1 DNA的2次连续模板转换产生的产物。带n含有通过向外显子1 RNA的2次连续模板转换产生的产物。带d、f、j、k和m含有通过向Ll.LtrB RNA的模板转换产生的产物。带m也含有通过向Ll.LtrB RNA的2次连续模板转换产生的产物。带k也含有通过2次连续模板转换产生的产物：首先向外显子1 RNA，继之以Ll.LtrB RNA。含多模板转换的产物具有与含单个模板转换的产物类似的特征，包括非模板化核苷酸残基A-残基，在大多数情况下，其掺入在一些模板转换连接区处和在大多数cDNA的3’末端处。在这些实验中，与TeI4c-MRF RT相比，Ll.LtrB RT在模板转换之间添加额外非模板化核苷酸残基的倾向更大，这反映了RT或实验条件的差异。值得注意的是，图4的实验表明，不论第二模板是RNA还是DNA，都可以发生通过II型内含子RT实现的模板转换。

图5显示了用Ll.LtrB RT进行的第二组生化测定，其中使用与含有退火的DNA引物(e2)的ltrB外显子2 (E2) DNA或RNA对应的不同模板/引物底物。如从以前的工作(Smith等人 . 2005)预见到的，Ll.LtrB RT在RNA模板上表现出高RT活性，但是在DNA模板上仅表现出低DNA依赖性的DNA聚合酶活性(图5A, 泳道3和4)。用RNA模板得到的大多数产物延伸了超过10-nt 5’突出端(图5A, 泳道4)，并且这些cDNA的克隆和测序揭示了添加在cDNA的3’末端的额外核苷酸残基，现在大部分是C-残基，包括至多7个C-残基的同聚物批次(图5B)。测序表明，在图5B泳道4中的更大产物通过从初始E2 RNA向第二E2 RNA分子和有时第三E2 RNA分子的模板转换产生，所述E2 RNA分子在该实验中不具有3’氨基修饰剂来阻碍模板转换(图5B)。在这些情况下，在模板转换之间的连接区处和在cDNA的3’末端处发现了额外核苷酸残基，再次大部分是C-残基。这些发现表明，对于不同的模板/引物底物和cDNA，通过II型内含子RT实现的非模板化核苷酸添加的特异性可以是不同的。对于其它RT和DNA聚合酶已经得到类似的发现，并归因于DNA产物链的末端核苷酸残基的差异，所述末端核苷酸残基可以例如参与碱基堆积相互作用，所述碱基堆积相互作用对一些输入核苷酸的偏好胜过其它核苷酸(Hu 1993; Magnuson等人 . 1996; Golinelli和Hughes 2002)。II型内含子RT的向cDNA的3’末端添加额外核苷酸残基（包括同聚物批次）的能力，可以用于cDNA克隆–例如，克隆进含有互补核苷酸残基突出端的载体中，或者通过实现第二接头与互补同聚物序列的退火。

实施例 6: 改变反应条件对通过 II 型内含子 RT 实现的非模板化核苷酸添加的影响

尽管可能是有用的，II型内含子RT的向cDNA的3’末端添加额外核苷酸残基的能力就某些需要准确设定cDNA大小的应用(例如，毛细管电泳)而言可能是有害的，且可通过在cDNA的3’末端和新RNA模板的3’末端之间引入互补性来促进模板转换中的偏倚。在图3的实验中，例如，由TeI4c-MRF RT实现的额外A-残基向cDNA的3’末端的优先添加可以使它偏向模板转换至具有互补3’U残基的miRNA，且讨厌具有相反3’A残基的miRNA。尽管由II型内含子RT实现的模板转换也可以在没有cDNA和新RNA模板之间的碱基配对的情况下发生，碱基配对或与添加在cDNA的3’末端的额外核苷酸残基的碰撞的潜力会强烈地有利于转换至一些模板胜过其它模板。因而，花费了时间来寻找这样的条件：在其中可以最小化或控制cDNA的3’末端的非模板化核苷酸添加程度。

为了找到这样的条件，使用了图6所示的测定，其采用具有平5’RNA/3’DNA末端的RNA模板/DNA引物底物，所述末端模仿充分延伸至RNA模板的5’末端的cDNA引物。在不同的反应条件下，在有不同浓度4种dNTP中的每一种存在下，将该DNA底物与TeI4c-MRF RT一起温育。结果表明，(i) 就该模板/引物底物RNA而言，TeI4c-MRF RT向DNA链的3’末端添加非模板化核苷酸残基的偏好次序为A > G > C > T；(ii) 通过更高单价盐和更低Mg²⁺ 浓度(例如，450 mM NaCl和5 mM Mg²⁺)和更低dNTP浓度(例如，1 μM而不是1 mM)的组合，可以减少非模板化核苷酸添加。还发现，ATP可以减少非模板化核苷酸添加，以前发现ATP会减少通过HIV-1 RT实现的非模板化核苷酸添加(Golinelli和Hughes 2002)。在其它实验中，发明人还发现，通过II型内含子RT实现的非模化板核苷酸添加与cDNA合成相比是相对较慢的反应，因而可以通过短时间地进行该反应来减少。已经报道，低pH会减少通过HIV1 RT实现的非模板化核苷酸添加(Golinelli和Hughes 2002)，并可以类似地减少通过II型内含子RT实现的非模板化核苷酸添加。非模板化核苷酸添加对dNTP浓度的强依赖性提示，通过使用不同的dNTP比例，可能有利于一种特定dNTP的添加，从而产生同聚物批次，诸如聚(A)或聚(C)，其可实现与互补核苷酸的退火，用于cDNA克隆和测序。II型内含子RT也可以用于含单一dNTP的单独反应步骤中，以将所需的尾巴添加至DNA的3’末端。

实施例 7 ：在使非模板化核苷酸添加最小化的反应条件下通过模板转换实现的 cDNA 克隆和测序

由于已经鉴别出使通过II型内含子RT实现的非模板化核苷酸添加最小化的反应条件，重复了miRNA克隆和测序实验，其中TeI4c-MRF RT从IA-P1 RNA/Pc DNA模板-引物底物模板转换至在5’和3’末端处具有2个随机化核苷酸的21-核苷酸miRNA，但是现在在意图减少非模板化核苷酸添加的反应条件(450 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5，进行10 min)下。使用图2的方案克隆得到的cDNA，并使用1 mM dNTP的浓度通过Sanger (未显示)和下一代SOLiD测序进行分析。

图7显示了在通过SOLiD测序得到的2,239,072个高质量读出中的20个最丰富的序列。在2,239,072高质量读出中，49% 具有1个拷贝的miRNAx，51% 具有2个串联的miRNAx序列，这反映了向其它miRNAx模板的第二模板转换。通过在测序之前对初始cDNA产物的更严格凝胶纯化，可以增加miRNAx单体与二聚体读数之比。序列证实，改进的反应条件减少向cDNA的3’末端的非模板化核苷酸添加(图7)。在通过Sanger测序分析的cDNA中，仅33% 具有额外的3’-核苷酸残基，最常见的是单个A-残基(未显示)。对于SOLiD测序，在975,020个高质量读出（使用与P2序列连接的miRNAx单体序列）中，50% 具有一个或多个额外的3’-核苷酸残基，最常见的是单个A-残基(244,877个读出)，且在miRNAx二聚体的1,138,636个高质量读出中，48% 具有一个或多个额外的3’-核苷酸残基，最常见的仍然是单个A-残基(255,257个读出；未显示)。但是，cDNA序列仍然在与miRNAx模板的3’-端核苷酸残基相对的位置出表现出强偏倚(在cDNA序列中，A，75%；C，8%，G，9%；T；8%，基于974,276个高质量miRNAx单体读出(参见上文)，其中该位置可以明确地读出)，尽管在RNA模板的倒数第二个核苷酸残基的相对随机化位置处没有分辨出显著的偏倚。在3’-端模板位置的对面看到的偏倚与这样模型相一致：在所述模型中，模板转换优先发生在具有3’U-残基的miRNAx分子，所述U-残基可以与优先添加在cDNA的3’末端处的非模板化A-残基碱基配对。

实施例 8 ：通过使用不同的 RNA 模板 /DNA 引物底物使模板转换偏倚最小化

探究了减少由非模板化核苷酸添加造成的模板转换偏倚的其它方案。在一个方案中，发明人试验了从具有不同末端碱基对的平端RNA/DNA模板-引物底物的模板转换，其模仿了当cDNA到达初始RNA模板的末端时的结构。图8显示了从以4种可能的5’RNA/3’DNA碱基对中的每一种结尾的平端底物至具有不同3’-端核苷酸的miRNAx寡核苷酸的模板转换的凝胶分析。通过定量模板转换产物的带强度和关于每个泳道中的放射性的量标准化，得到了发生的向以4种核苷酸残基中的每一种结尾的RNA的模板转换的百分比的估测值。尽管以U/A、C/G或A/T碱基对结尾的RNA模板/DNA引物底物都表现出向具有3’C残基的miRNAx的模板转换偏好，以G/C碱基对结尾的RNA模板/DNA引物底物有效地模板转换至以所有4种核苷酸残基结尾的miRNAx，尽管对以3’U残基结尾的miRNAx具有某种偏好(在3个单独的实验中，U，43-59%；G，29-30%；C，17-19%；和A，4-12%)。因而，可以使用具有不同几何形状和核苷酸序列的RNA模板/DNA引物底物（诸如以G/C碱基对结尾的平端RNA模板/DNA引物底物）来使模板转换偏倚最小化。

图9A显示了使用具有不同引发链3’突出端的IA-P1 RNA模板/Pc DNA引物底物集合的第二方案，所述引发链3’突出端模仿预期向cDNA的3’末端的一个核苷酸残基的非模板化添加以外的结构。结果表明，如预期的，这些模板/引物底物有利于在具有互补3’-核苷酸残基的RNA模板上的起始，但是仍然在某种程度上模板转换至具有其它3’-端核苷酸的RNA。因而，具有3’A突出端的模板/引物底物表现出模板转换至具有互补3’U残基的miRNAx的强偏好；具有3’C突出端的模板/引物底物有效地模板转换至具有互补3’G-残基的miRNAx以及具有非互补3’C-残基的miRNAx；具有3’G突出端的模板/引物底物有效地模板转换至具有互补3’C-残基的miRNAx以及具有非互补3’G-残基的miRNA；并且具有3’T突出端的模板/引物底物有效地模板转换至具有互补3’A-残基的miRNAx，且稍微更低效地模板转换至具有3’G-残基的miRNAx，这可能反映了TG碱基对的形成。在某些情况下，向具有非互补3’核苷酸残基(-1位置)的RNA的模板转换可以反映与在-2或-3位置处的核苷酸残基的碱基配对(例如，具有3’G突出端的引物可以通过与在miRNA模板的-3位置处的C-残基的碱基配对来开始，跳过2个末端核苷酸残基)。尽管逆转录病毒RT可以通过使用由RT添加的非模板化核苷酸和新RNA模板的3’末端之间的互补性来模板转换，该反应需要至少2个碱基对，其中之一必须是相对稳定的GC或CG对(Oz-Gleenberg等人 . 2011)。TeI4c-MRF RT的模板转换反应是新颖的，因为即使在60℃，即TeI4c-MRF RT的工作温度，任意类型的仅单个碱基对足以促进模板转换。

重要的是，具有不同3’突出端的模板/引物底物的混合物表现出对不同模板的大幅降低的偏倚。例如，在3个单独的实验中，将模板/引物底物的等摩尔混合物（其中转换至具有不同3’-核苷酸残基的miRNA的4种可能的3’突出端中的每一个如下：A，15-27%；C，28-30%；G，28-30%；和U，16-27%）计算为，在关于每个凝胶泳道中的总放射性标准化以后的模板转换总数的百分比。因而，适当比例的RNA模板/DNA引物底物（具有不同3’DNA突出端）的混合物可以用于降低对未知序列RNA的cDNA合成和克隆的模板转换偏倚。相反，RNA模板/DNA引物底物（具有特定3’DNA突出端）可以分别用于帮助已知序列的特定RNA的扩增。

其它表征表明，II型内含子RT模板转换反应：(i) 被3’磷酸抑制，所述3’磷酸得自常规RNA酶切割或碱切割，但是通过3’磷酸除去恢复；(ii) 针对DNA以及RNA发生，这指示不需要3’-端核苷酸上的2’OH基团(图9B)。因而，除了miRNA克隆和测序以外，II型内含子RT模板转换应当可用于通过诸如HITS-CLIP/CRAC或核糖体绘图等操作中的RNA酶消化产生的蛋白结合的RNA片段的克隆和测序(Polidoros等人 . 2006, Holton和Graham 1991, Granneman等人 . 2009, Zhang和Darnell 2011, Ingolia等人 . 2009)；且可能用于构建DNAseq文库。

实施例9：使用额外II型内含子RT和RNA/DNA或DNA/DNA模板/引物底物的模板转换

如图10所示，使用GsI-IIC-MRFII型内含子显示了从3’-突出端底物的模板转换。该图显示了使用模板转换连接具有miRNA序列的引物，并更一般地表明，属于不同结构亚类(亚型IIC)的第三种II型RT（GsI-IIC-MRF）实现了与Ll.LtrB和TeI4c-MRFRT（它们分别属于亚型IIA和IIB）相同的模板转换反应。图11提供了模板转换的另一个实施例，该图显示了使用TeI4c-MRF RT从初始RNA/DNA或DNA/DNA模板/引物底物的模板转换。该图证实，任一类模板/引物底物适合用于实现模板转换，尽管RNA/DNA模板引物底物是更有效的。

实施例10：II型内含子RT模板转换用于miRNA克隆和测序的用途

为了评估它用于文库构建的实用性，使用II型内含子RT模板转换和2种采用常规RNA-连接方法的市售试剂盒(Applied Biosystems™和New England BioLabs™)来制备文库，所述文库用于由963等摩尔miRNA组成的参照集合的SOLiD测序。发明人然后对比了898个具有独特的可鉴别的核心序列的miRNA的文库丰度。该图表明，通过TeI4c-MRF RT从具有不同比例的3’突出端(TS1和TS2)的模板-引物底物的模板转换制备的2个文库具有比通过任一种市售试剂盒制备的那些文库更均匀的miRNA序列分布(更扁的线)(图12A)。离群值的分析鉴别出9个在所有文库中未被充分代表的miRNA，但是在其它方面在被不同方法过低或过高代表的miRNA之间几乎没有重叠(分别是图12B和C)。图13表明，通过使用具有不同比例的A、C、G或T 3’突出端的模板/引物底物，可以调节通过II型内含子RT模板转换产生的cDNA文库中具有不同3’末端核苷酸的miRNA的表示。

总之，前述结果证实了如下使用模板转换制备靶多核苷酸的DNA拷贝的一般方法：将双链模板/引物底物（其由与互补寡核苷酸模板链结合的DNA引物寡核苷酸组成）与靶多核苷酸一起在反应介质中混合，将合适量的II型内含子逆转录酶加入反应介质中，以使DNA引物寡核苷酸从它的3’末端延伸，以提供DNA拷贝多核苷酸，其包括使用靶多核苷酸作为模板合成的互补靶DNA多核苷酸。

结果也证实了如下使用模板转换制备靶多核苷酸的DNA拷贝的方法：将双链模板/引物底物与靶多核苷酸一起在反应介质中混合，将合适量的非逆转录病毒逆转录酶加入反应介质中，以使DNA引物寡核苷酸从它的3’末端延伸，以提供DNA拷贝多核苷酸，其包括使用靶多核苷酸作为模板合成的互补靶DNA多核苷酸。在该实施方案中，所述DNA引物寡核苷酸具有平端（其中所述DNA引物寡核苷酸的3’末端与互补寡核苷酸模板链的5’末端直接对齐）或突出末端（其中所述DNA引物寡核苷酸的3’末端延伸超出互补寡核苷酸模板链的5’末端1个核苷酸）。

结果也证实了向DNA引物寡核苷酸添加额外核苷酸的方法，所述方法包括：将合适量的非逆转录病毒逆转录酶加入包括双链模板/引物底物的反应介质中，其中II型内含子会在DNA引物寡核苷酸的3’末端处添加1-15个额外的非互补核苷酸。

参考文献

Andrade P, Mart í n MJ, Ju á rez R, L ó pez de Saro F, Blanco L (2009). Limited terminal transferase in human DNA polymerase mu defines the required balance between accuracy and efficiency in NHEJ. Proc Natl Acad Sci USA 106:16203-08.

Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore, DD ( 编 ). (1999 and preceeding editions) Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons (New York, NY)

Bartlett JM, Stirling D (2003). A short history of the polymerase chain reaction. Methods Mol Biol 226:3-6.

Bibillo A, Eickbush TH (2002). The reverse transcriptase of the R2 non-LTR retrotransposon: continuous synthesis of cDNA on non-continuous RNA templates. J Mol Biol 316:459-473.

Bibillo A, Eickbush TH (2004). End-to-end template jumping by the reverse transcriptase encoded by the R2 retrotransposon. J Biol Chem 15:14945-53.

Blocker FJH, Mohr G, Conlan LH, Qi L, Belfort M, Lambowitz AM (2005). Domain structure and three-dimensional model of a group II intron-encoded reverse transcriptase. RNA 11:14-28.

Candales MA, Duong A, Hood KS, Li T, Neufeld RAE, Sun R, McNeil BA, Wu L, Jarding AM, Zimmerly S (2011).Database of bacterial group II introns. Nucleic Acids Res doi:10.1093/nar/gkr1043.

Chen B, Lambowitz AM (1997). De novo and DNA primer-mediated initiation of cDNA synthesis by the Mauriceville retroplasmid reverse transcriptase involve recognition of a 3' CCA sequence. J Mol Biol 3:311-32.

Chen, H, & Boutros, PC (2011). VennDiagram: a package for the generation of highly-customizable Venn and Euler diagrams in R. BMC Bioinformatics 12:35, doi:10.1186/1471-2105-12-35.

Clark JM (1988). Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases. Nucl Acids Res 16:9677-86.

Clark JM, Joyce CM, Beardsley GP (1987). Novel blunt-end addition reactions catalyzed by DNA polymerase I of Escherichia coli. J Mol Biol 198:123-7.

Dai L, Toor N, Olson R, Keeping A, Zimmerly S. (2003). Database for mobile group II introns. Nucleic Acids Research 31:424-26.

England TE, Uhlenbeck OC (1978). Enzymatic oligoribonucleotide synthesis with T4 RNA ligase. Biochemistry 17:2069-76.

Golinelli MP, Hughes SH (2002). Nontemplated base addition by HIV-1 RT can induce nonspecific strand transfer in vitro. Biochemistry 41:5894-906.

Granneman S, Kudla G, Petfalski E, Tollervey D (2009). Identification of protein binding sites on U3 snoRNA and pre-rRNA by UV cross-linking and high-throughput analysis of cDNAs. Proc Natl Acad Sci USA 106:9613-8.

Holton, TA & Graham, MW (1991). A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors. Nucleic Acids Res 19:1156.

Hu G (1993). DNA polymerase-catalyzed addition of nontemplated extra nucleotides to the 3' end of a DNA fragment. DNA Cell Biol 12:763-70.

Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS (2009). Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science 324:218-23.

Kennell, JC. Wang, H & Lambowitz, AM (1994). The Mauriceville plasmid of Neurospora spp. uses novel mechanisms for initiating reverse transcription in vivo. Mol Cell Biol 14:3094-3107.

Kojima, KK & Kanehisa, M (2008). Systematic survey for novel types of prokaryotic retroelements based on gene neighborhood and protein architecture. Mol Biol Evol 25:1395-1404.

König J, Zarnack K, Rot G, Curk T, Kayikci M, Zupan B, Turner DJ, Luscombe NM, Ule J (2010). iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nature Struct & Mol Biol 17:909-15.

Kristelly R, Earnest BT, Krishnamoorthy L, Tesmer JJ. (2003). Preliminary structure analysis of the DH/PH domains of leukemia-associated RhoGEF. Acta Crystallog sect D 59:1859-62.

Lambowitz AM, Zimmerly S (2010). Group II introns: mobile ribozymes that invade DNA. In: RNA Worlds: From Life ’ s Origins to Diversity in Gene Regulation (R.F. Gesteland, T.R. Cech, and J.F. Atkins, Editors), Cold Spring Harbor Perspect Biol 1:a003616.

Lamm AT, Stadler MR, Zhang H, Gent JI, and Fire, AZ (2011). Multimodal RNA-seq using single-strand, double-strand, and CircLigase-based capture yields a refined and extended description of the C. elegans transcriptome. Genome Research 1:1-11.

Lau NC, Lim LP, Weinstein, EG, Bartel DP (2001). An abundant class of tiny RNAs with probably regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science 294:858-62.

Levesque-Sergerie JP, Duquette M, Thibault C, Delbecchi L, Bissonnette N (2007). Detection limits of several commercial reverse transcriptase enzymes: impact on the low- and high-abundance transcript levels assessed by quantitative RT-PCR. BMC Mol Biol 8:93.

Levin JZ, Yassour M, Adiconis X, Nusbaum C, Thompson DA, Friedman N, Gnirke A, Regev A (2010). Comprehensive comparative analysis of strand-specific RNA sequencing methods. Nature Methods 7:709-15.

Linsen SEV, de Wit E, Janssens G, Heater S, Chapman L, Parkin RK, Fritz B, Wyman SK, de Bruijn E, Voest EE, Kuersten S, Tewari M & Cuppen E (2009). Limitations and possibilities of small RNA digital gene expession profiling. Nature Methods 6:474-476.

Magnuson VL, Ally DS, Nylund SJ, Karanjawala ZE, Rayman JB, Knapp JI, Lowe AL, Ghosh S, Collins FS (1996). Substrate nucleotide-determined non-templated addition of adenine by Taq DNA polymerase: implications for PCR-based genotyping and cloning. Biotechniques 4:700-9.

Makarova O, Kamberov E, Margolis B (2000). Generation of deletion and point mutations with one primer in a single cloning step. Biotechniques 5:970-2.

Mills DA, McKay LL, Dunny GM (1996). Splicing of a group II intron involved in the conjugative transfer of pRS01 in Lactococci.J Bacteriol 178: 3531-38.

Mohr G, Ghanem E, Lambowitz AM (2010). Mechanisms used for genomic proliferatoin by thermophilic group II introns. PLoS Biol 8:e1000391.

Moretz, S.E. & Lampson, B.C. (2010). A group IIC-type intron interrupts the rRNA methylase gene of Geobacillus stearothermophilus strain 10. J Bacteriol 192: 5245-5248.

Oz-Gleenberg I, Herschhorn A, Hizi A (2011). Reverse transcriptases can clamp together nucleic acids strands with two complementary bases at their 3'-termini for initiating DNA synthesis.Nucleic Acids Res 3:1042-53.

Park W, Li J, Song R, Messing J, Chen X (2002). CARPEL FACTORY, a Dicer homolog, and HEN1, a novel protein, act in microRNA metabolism in Arabidopsis thaliana. Curr Biol 12:1484-95.

Patel PH, Preston BD (1994).Marked infidelity of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase at RNA and DNA template ends. Proc Natl Acad Sci USA 91:549-53.

Peliska JA, Benkovic SJ (1992). Mechanism of DNA strand transfer reactions catalyzed by HIV-1 reverse transcriptase. Science 258:1112-8.

Polidoros AN, Pasentsis K, Tsaftaris AS (2006). Rolling circle amplification-RACE: a method for simultaneous isolation of 5' and 3' cDNA ends from amplified cDNA templates. Biotechniques 41:35-42.

Saldanha R, Chen B, Wank H, Matsuura M, Edwards J, Lambowitz AM (1999). RNA and protein catalysis in group II intron splicing and mobility reactions using purified components. Biochemistry 38:9069-83.

Sambrook J, Fritsch EF, and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY.

Simon D & Zimmerly S (2008). A diversity of uncharacterized retroelements in bacteria. Nucleic Acids Res 36:7219-7229.

Smith D, Zhong J, Matsuura M, Lambowitz AM, Belfort M (2005). Recruitment of host functions suggests a repair pathway for late steps in group II intron retrohoming. Genes Dev 19:2477-87.

Studier FW (2005). Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif 1:207-34.

Vellore J, Moretz SE & Lampson BC (2004). A group II intron-type open reading frame from the thermophile Bacillus (Geobacillus) stearothermophilus encodes a heat-stable reverse transcriptase. Appl Environ Microbiol 70:7140-7147 (2004).

Xiong Y, Eickbush TH (1990). Origin and evolution of retroelements based upon their reverse transcriptase sequences. EMBO J 9:3353-62.

Zhang C & Darnell RB (2011). Mapping in vivo protein-RNA interactions at single-nucleotide resolution from HITS-CLIP data. Nat Biotechnol 29: 607-614.

Zhong J, Lambowitz AM (2003). Group II intron mobility using nascent strands at DNA replication forks to prime reverse transcription. EMBO J 22:4555-65.

Zhu YY, Machleder EM, Chenchik A, Li R, Siebert PD (2001). Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques 30: 892-97.

在本文中引用的所有专利、专利申请和出版物和可电子得到的材料的完整公开内容通过引用并入。前述详细描述和实施例仅仅为了理解清楚的目的而给出。从其中不应理解不必要的限制。本发明不限于显示的和描述的确切细节，因为本领域技术人员显而易见的变化将被包括在由权利要求限定的发明内。

CPCH1362448P

序列表

<110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM, AUSTIN,

TX

<120> 模板转换用于DNA 合成的用途

<130> 30159/04024

<140>

<141>

<150> 61/445,761

<151> 2011-02-23

<160> 137

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 1

gugcgcccag auaggguguu aagucaagua 30

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的引物

<400> 2

aacaccctat ctgggcgcac 20

<210> 3

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的接头肽

<400> 3

Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn Ser Ser Ser Asn

1 5 10 15

Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln

20 25 30

Gly

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的接头肽

<400> 4

Thr Val Asp Ala Ala Leu Ala Ala Ala Gln Thr Asn Ala Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 5

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 5

cgccuuggcc guacagcagc cucucuaugg gcagucggug au 42

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的引物

<220>

<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的引物

<400> 6

atcaccgact gcccatagag agccugctgt a 31

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (1)..(2)

<223> a、c、u、g、未知或其它

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (20)..(21)

<223> a、c、u、g、未知或其它

<400> 7

nncgcuucag agagaaaucn n 21

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的引物

<400> 8

ccactacgcc tccgctttcc tctctatggg cagtcggtga t 41

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的引物

<400> 9

ctgccccggg ttcctcattc tct 23

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的引物

<400> 10

ctgctgtacg gccaaggcg 19

<210> 11

<211> 60

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 11

gugcgcccag auaggguguu cucguuggca auggugucca acuugugcug ccagugcucg 60

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的引物

<220>

<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的引物

<400> 12

cgagcactgg cagcacaagu tggacaccat tgccaacgag aacac 45

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 13

tgtgattgca acccacgtcg atcgtgaaca catccataac 40

<210> 14

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 14

ugugauugca acccacgucg aucgugaaca cauccauaac 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 15

catatcattt ttaattctac gaatctttat actggcaaac 40

<210> 16

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 16

cauaucauuu uuaauucuac gaaucuuuau acuggcaaac 40

<210> 17

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的引物

<220>

<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的引物

<400> 17

catctggcgg ctgttctcgu tggacaccat tgccaacgag gtttgccagt ataaagattc 60

gtagaattaa 70

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 18

cttgtgctgc cagtgctcg 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 19

tggacaccat tgccaacgag 20

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 20

cgagaacagc cgccagatg 19

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的引物

<400> 21

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的引物

<400> 22

caggaaacag ctatgac 17

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的引物

<400> 23

ggaaacagct atgaccatg 19

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的引物

<220>

<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的引物

<400> 24

atcaccgact gcccatagag aggcugctgt a 31

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 25

cctatctggg cgccacgtta 20

<210> 26

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (1)..(2)

<223> a、c、u、g、未知或其它

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (20)..(21)

<223> a、c、u、g、未知或其它

<400> 26

nncgcuucag agagaaaucn n 21

<210> 27

<211> 15

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 27

cgccuuggcc guaca 15

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (1)..(2)

<223> a, c, t, g, 未知或其它

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (20)..(21)

<223> a, c, t, g, 未知或其它

<400> 28

nngatttctc tctgaagcgn n 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 29

aaggcgattt ctctctgaag 20

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 30

aaggcgatga tttctctctg aag 23

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 31

aaggcgggct gctagctctg aagcgct 27

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 32

aaggcgccga tttctctctg aagcgct 27

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 33

aaggcgaaga tttctctctg aagcgct 27

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 34

aaggcgcgga tttctctctg aagcgcca 28

<210> 35

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 35

aaggcgatga tttctctctg aagcggca 28

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 36

aaggcggcga tttctctctg aagcgtgg 28

<210> 37

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 37

aaggcgatga tttctctctg tgttagga 28

<210> 38

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 38

aaggcgcgat ttctctctga agcggcaa 28

<210> 39

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 39

aaggcgatga tttctctctg aagcggtga 29

<210> 40

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (26)..(26)

<223> a, c, t, g, 未知或其它

<400> 40

aaggcgagga tttctctctg aagcgntga 29

<210> 41

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 41

aaggcgatga tttctctctg aagcgctga 29

<210> 42

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 42

aaggcgcgga tttctctctg aagcgacaa 29

<210> 43

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 43

aaggcgcgga tttctctctg aagcgacaa 29

<210> 44

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 44

aaggcggtga tttctctctg aagcgtgga 29

<210> 45

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 45

aaggcgacga tttctatctg aagcgagac 29

<210> 46

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 46

aaggcggaga tttctctctg aagcgccaa 29

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 47

aaggcgctga tttctctctg aagcgccaag 30

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 48

aaggcgaaga tttctctctg aagcgtcaag 30

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 49

aaggcgcgga tttctctctg aagcgccaga 30

<210> 50

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 50

aaggcgatga tttctctctg aagcgccagg at 32

<210> 51

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (14)..(14)

<223> a, c, t, g, 未知或其它

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (16)..(18)

<223> a, c, t, g, 未知或其它

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (20)..(20)

<223> a, c, t, g, 未知或其它

<400> 51

aaggcggtga tttntnnntn aagcgcaaac ccctcaaa 38

<210> 52

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 52

aaggcgctga tttctctctg aagcgccaac ccccctca 38

<210> 53

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 53

aaggcgacga tttctctctg aagcgccagc aggacgttca tg 42

<210> 54

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<220>

<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 54

taacgugcgc ccagauagg 19

<210> 55

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 55

cctatctggg cgcacgtta 19

<210> 56

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 56

cctatctggg cgca 14

<210> 57

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 57

cctatctggg cgcac 15

<210> 58

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 58

cctatctggg cgcacaa 17

<210> 59

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 59

cctatctggg cgcacaaa 18

<210> 60

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 60

cctatctggg cgcacaagtt a 21

<210> 61

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 61

cctatctggg cgcacgtta 19

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 62

cctatctggg cgcacagtta 20

<210> 63

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 63

cctatctggg cgcacaagtt a 21

<210> 64

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 64

uaacgugcgc ccagauagg 19

<210> 65

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 65

tctatctggg cgcac 15

<210> 66

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 66

cctatctggg cgcacat 17

<210> 67

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 67

cctatctggg cgcacaga 18

<210> 68

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 68

cctatctggg ctcacaaaa 19

<210> 69

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 69

cctatctggg cgcacatta 19

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 70

cctatctggg cgcacgatta 20

<210> 71

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 71

cctatctggg cgcacctta 19

<210> 72

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 72

cctatctggg cgcactta 18

<210> 73

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 73

cctatctggg cgcacatta 19

<210> 74

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 74

cctatctgag cgcacaagtt a 21

<210> 75

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 75

catatcattt 10

<210> 76

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 76

aaatgatatg 10

<210> 77

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 77

aaatgatatg ccca 14

<210> 78

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 78

aaatgatatg cccaaa 16

<210> 79

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 79

aaatgatatg ccccaa 16

<210> 80

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 80

aaatgatatg cccgaa 16

<210> 81

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 81

aaatgatatg cccaaaa 17

<210> 82

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 82

aaatgatatg cccccaa 17

<210> 83

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 83

aaatgatatg ccccccc 17

<210> 84

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 84

aaatgatatg ccccgaa 17

<210> 85

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 85

aaaatgatat gccca 15

<210> 86

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 86

aaaatgatat gcccg 15

<210> 87

<211> 14

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 87

aaaccauauc auuu 14

<210> 88

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 88

aaatgatatg gttt 14

<210> 89

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 89

tatgcccaaa 10

<210> 90

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 90

aaatgatatg cccgggttt 19

<210> 91

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 91

tatgcccgaa 10

<210> 92

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 92

aaatgatatg ccccggttt 19

<210> 93

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 93

tatgcccggg ttt 13

<210> 94

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 94

aaatgatatg cccggggttt 20

<210> 95

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 95

tatgcccggg gttt 14

<210> 96

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 96

aaatgatatg cccaggggtt t 21

<210> 97

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 97

tatgccccag 10

<210> 98

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 98

tatgcccctg gttt 14

<210> 99

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 99

aaatgatatg ccccccgttt 20

<210> 100

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 100

tatgcccagg ttt 13

<210> 101

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 101

aaatgatatg cccgaggggg ttt 23

<210> 102

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 102

tatgcccact ggttt 15

<210> 103

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 103

aaatgatatg cccctgggtt t 21

<210> 104

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 104

tatgcccagg ggttt 15

<210> 105

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 105

aaatgatatg ccccactggt tt 22

<210> 106

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 106

tatgcccaaa a 11

<210> 107

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 107

tatgccccag ggttt 15

<210> 108

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 108

aaatgatatg ccccggttt 19

<210> 109

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 109

tatgcccaat 10

<210> 110

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 110

tatgccctgg gttt 14

<210> 111

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 111

aaatgatatg cccagggggt tt 22

<210> 112

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 112

tatgcccaaa a 11

<210> 113

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 113

tatgccccag gttt 14

<210> 114

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 114

aaatgatatg cccctgggtt t 21

<210> 115

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 115

tatgcccggt tt 12

<210> 116

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 116

aaatgatatg cccaaacgca g 21

<210> 117

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 117

aggatttctc tctgaagcgc t 21

<210> 118

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 118

acgatttctc tctgaagcgc t 21

<210> 119

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 119

aggatttctc tctgaagcgc c 21

<210> 120

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 120

aagatttctc tctgaagcgc t 21

<210> 121

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 121

acgatttctc tctgaagcgc c 21

<210> 122

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 122

atgatttctc tctgaagcgc t 21

<210> 123

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 123

aggatttctc tctgaagcgc a 21

<210> 124

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 124

acgatttctc tctgaagcga t 21

<210> 125

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 125

acgatttctc tctgaagcgt a 21

<210> 126

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 126

acgatttctc tctgaagcgt t 21

<210> 127

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 127

atgatttctc tctgaagcgc c 21

<210> 128

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 128

aggatttctc tctgaagcgt c 21

<210> 129

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 129

aggatttctc tctgaagcgt t 21

<210> 130

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 130

atgatttctc tctgaagcgc a 21

<210> 131

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 131

aggatttctc tctgaagcga c 21

<210> 132

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 132

aggatttctc tctgaagcgc ca 22

<210> 133

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 133

acgatttctc tctgaagcgc ca 22

<210> 134

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 134

atgatttctc tctgaagcgc ca 22

<210> 135

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 135

atgatttctc tctgaagcga ca 22

<210> 136

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<400> 136

aggatttctc tctgaagcga ca 22

<210> 137

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的寡核苷酸

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (21)..(21)

<223> a、c、u、g、未知或其它

<400> 137

gccgcuucag agagaaaucg n 21

Claims

1.一种使用模板转换制备靶多核苷酸的DNA拷贝的方法，该方法包括：

将至少一种双链模板/引物底物与至少一种靶多核苷酸在反应介质中混合，该双链模板/引物底物由与互补寡核苷酸模板链结合的DNA引物寡核苷酸组成，和

将合适量的非逆转录病毒逆转录酶加入反应介质中，以使DNA引物寡核苷酸从它的3’末端延伸，以提供DNA拷贝多核苷酸，该DNA拷贝多核苷酸包括使用靶多核苷酸作为模板合成的互补靶DNA多核苷酸，

其中该双链模板/引物底物具有平端或突出末端，在平端的情况下，该DNA引物寡核苷酸的3’末端与互补寡核苷酸模板链的5’末端直接对齐，在突出末端的情况下，该DNA引物寡核苷酸的3’末端延伸超出互补寡核苷酸模板链的5’末端1个核苷酸。

2.根据权利要求1的方法，其中该靶多核苷酸由RNA组成。

3.根据权利要求2的方法，其中该靶多核苷酸是miRNA。

4.根据权利要求1的方法，其中该靶多核苷酸由DNA组成。

5.根据权利要求1的方法，其中该互补寡核苷酸模板链由RNA组成。

6.根据权利要求1的方法，其中该互补寡核苷酸模板链由DNA组成。

7.根据权利要求1的方法，其中该双链模板/引物底物具有突出末端，且其中使用多个不同的具有由2-4个不同核苷酸组成的突出末端的双链模板/引物底物。

8.根据权利要求1的方法，其中该DNA引物寡核苷酸具有突出末端，且其中在靶多核苷酸的3’末端处的核苷酸与在DNA引物寡核苷酸的3’末端处的核苷酸互补。

9.根据权利要求1的方法，其中在拷贝靶多核苷酸以合成DNA拷贝多核苷酸之前，该非逆转录病毒逆转录酶在DNA引物寡核苷酸的3’末端处添加1-15个额外的非互补的核苷酸。

10.根据权利要求9的方法，其中该非逆转录病毒逆转录酶添加仅单个额外的非互补的核苷酸。

11.根据权利要求1的方法，其中通过封闭剂终止互补寡核苷酸模板链的3’末端。

12.根据权利要求1的方法，其中该非逆转录病毒逆转录酶是II型内含子逆转录酶。

13.根据权利要求1的方法，其中使用多种不同的靶多核苷酸来制备多个DNA拷贝多核苷酸的克隆文库。

14.根据权利要求1的方法，该方法另外包括使DNA拷贝多核苷酸环化的步骤。

15.一种使用模板转换制备靶多核苷酸的DNA拷贝的方法，该方法包括：

将合适量的II型内含子逆转录酶加入反应介质中，以使DNA引物寡核苷酸从它的3’末端延伸，以提供DNA拷贝多核苷酸，该DNA拷贝多核苷酸包括使用靶多核苷酸作为模板合成的互补靶DNA多核苷酸。

16.根据权利要求15的方法，其中该靶多核苷酸由RNA组成。

17.根据权利要求16的方法，其中该靶多核苷酸是miRNA。

18.根据权利要求15的方法，其中该靶多核苷酸由DNA组成。

19.根据权利要求15的方法，其中该互补寡核苷酸模板链由RNA组成。

20.根据权利要求15的方法，其中该互补寡核苷酸模板链由DNA组成。

21.根据权利要求15的方法，其中该双链模板/引物底物具有平端，其中，该DNA引物寡核苷酸的3’末端与互补寡核苷酸模板链的5’末端直接对齐。

22.根据权利要求15的方法，其中该双链模板/引物底物具有突出末端，其中，该DNA引物寡核苷酸的3’末端延伸超出互补寡核苷酸模板链的5’末端1个核苷酸。

23.根据权利要求22的方法，其中使用多个不同的具有由2-4个不同核苷酸组成的突出末端的双链模板/引物底物。

24.根据权利要求22的方法，其中在靶多核苷酸的3’末端处的核苷酸与在DNA引物寡核苷酸的3’末端处的核苷酸互补。

25.根据权利要求15的方法，其中在拷贝靶多核苷酸以合成DNA拷贝多核苷酸之前，该逆转录酶在DNA引物寡核苷酸的3’末端处添加1-15个额外的非互补的核苷酸。

26.根据权利要求25的方法，其中该逆转录酶添加仅单个额外的非互补的核苷酸。

27.根据权利要求15的方法，其中通过封闭剂终止互补寡核苷酸模板链的3’末端。

28.根据权利要求15的方法，其中使用多种不同的靶多核苷酸来制备多个DNA拷贝多核苷酸的克隆文库。

29.根据权利要求15的方法，该方法另外包括使DNA拷贝多核苷酸环化的步骤。

30.一种向DNA引物寡核苷酸添加额外核苷酸的方法，该方法包括：将合适量的非逆转录病毒逆转录酶加入反应介质中，该反应介质包含由与互补寡核苷酸模板链结合的DNA引物寡核苷酸组成的双链模板/引物底物，其中该非逆转录病毒逆转录酶会在DNA引物寡核苷酸的3’末端处添加1-15个额外的非互补核苷酸。

31.根据权利要求30的方法，其中该非逆转录病毒逆转录酶是II型内含子逆转录酶。

32.根据权利要求30的方法，其中添加1-6个额外的非互补的核苷酸。

33.根据权利要求30的方法，其中添加单个非互补的核苷酸。