JP2014506483A - Dna合成のためのテンプレートスイッチの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2011年2月23日に出願された米国仮出願第61/445,761号(これは、本明細書に参考として援用される)の利益を主張する。
この研究は、少なくとも部分的に、National Institutes of HealthのDepartment of Health and Human Servicesからの助成金番号GM37947およびGM37951によって支援された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本願は、EFS−Webを介してASCII形式で提出された配列表を含み、本明細書によってその全体が参考として援用される。2012年2月23日に作成された前記ASCIIコピーは、31594024.txtという名称であり、34,166バイトのサイズである。
逆転写酵素(RT)は、RT−PCRおよびqRT−PCR、cDNAライブラリーの構築、マイクロアレイ用のプローブの作製、ならびに従来および次世代のRNAシーケンシングをはじめとした種々の用途のためにRNAのcDNAコピーを合成するバイオテクノロジーにおいて使用されている。長いポリアデニル化RNAに対応するcDNAの合成は、ランダムヘキサマープライマーまたはポリ(A)テイルに相補的なオリゴ(dT)含有プライマーを使用することによって達成され得る。しかしながら、非ポリアデニル化RNA(例えば、miRNAまたはタンパク質に結合したRNAフラグメント)に対応するcDNAの鎖特異的なクローニングおよびシーケンシングは、典型的には、PCRプライマー結合部位を含む、DNA、RNAまたはキメラRNA/DNAオリゴヌクレオチドアダプターを、そのRNAまたはcDNA鎖の末端にライゲートすることを必要とする(非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3)。それらのアダプターは、通常、RNAリガーゼを使用してそのRNA鋳型に(そのRNAの3’および5’末端に順次(例えば、Roch 454 Life Sciences(登録商標)シーケンシングおよびIllumina(登録商標)次世代シーケンシング)またはRNAの両端に同時に(例えば、SOLiDTM次世代シーケンシング))ライゲートされる(Linsenら、2009)。いくつかの用途の場合、第1のアダプターが、逆転写のためにRNAの3’末端にライゲートされ、第2のアダプターが、得られたcDNAの3’末端にライゲートされる(例えば、タンパク質に結合したRNAフラグメントのcDNAの架橋および解析(CRAC);Grannemanら、2009)。1つの変法では、そのcDNAの3’末端にC残基を付加する、逆転写酵素の鋳型非依存性(non−templated)ヌクレオチド付加反応(それにより、第2鎖合成のための相補的なG残基を含む第2のアダプターのアニーリングが可能になる)を使用することによって、第2のアダプターのライゲーションが回避される(Zhuら、2001)。別の変法では、例えば、単一ヌクレオチド分解能でのUV架橋および免疫沈降(individual−nucleotide resolution UV−crosslinking and immunoprecipitation:iCLIP,Koenigら、2010)またはリボソームプロファイリングを用いたヌクレオチド分解能での翻訳のゲノムワイドインビボ解析(Ingoliaら、2009)では、cDNAを環状化した後の直鎖化、および第1のアダプター中の二方向プライマー結合部位を使用したPCR増幅によって、第2のアダプターのライゲーションが回避される。
本明細書中に開示されるように、ある特定のクラスのレトロエレメント、最も著名なものとしては、可動性グループIIイントロンによってコードされる逆転写酵素(RT)が、アダプターライゲーションに関連する困難に対する解決法を提供し、より一般的には、RNAおよびDNA配列の検出、PCR増幅およびクローニングを容易にする新しい方法を提供する。本発明者らは、非レトロウイルスRTでは、最初の鋳型から合成されたcDNAと新しいRNAまたはDNA鋳型の3’末端との間にほとんどまたはまったく相補性を有しないテンプレートスイッチが可能であり得、ならびにこの反応が、ライゲーションなしでアダプター配列を標的RNAまたはDNA配列に直接連結する連続的なcDNAを合成するために使用され得るという仮説を立てた。次いで、その複合cDNAは、そのcDNAの3’末端において第2のアダプター分子にライゲートされ得るか、または例えば、一本鎖DNAを効率的に環状化する酵素であるCircLigase(Polidorosら、2006)を用いて環状化され得、それにより、第1のアダプターの異なる部分にアニールする二方向プライマーを用いたPCR増幅が可能になる。いくつかの用途の場合、そのようなプライマーは、次世代/ディープシーケンシング用のバーコードを付加し得る。
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中の本発明の説明において使用される用語は、特定の実施形態だけを説明するためのものであって、本発明を限定すると意図されていない。
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「a」、「an」および「the」は、その文脈が明らかに他のことを示していない限り、複数形も含むと意図されている。さらに、終点による数値的な範囲の列挙は、その範囲内に包含されるすべての数字を含む(例えば、1〜5は、1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5などを含む)。
発現プラスミドpMalE−RF−TeI4cは、Xa因子部位の代わりにTEVプロテアーゼ切断部位を有する(Kristellyら、2003)pMal−c2xの誘導体であるpMal−c2t(New England Biolabs(登録商標),Ipswich,MA)においてtacプロモーターの後ろにクローニングされた融合されたN末端のMalEタグを有するThermosynechococcus elongatus TeI4cグループIIイントロンのRT ORFを含んでいる。このプラスミドは、pUC19(Mohrら、2010)にクローニングされたTeI4cイントロンのTeI4c RT ORFを、制限酵素認識部位(EcoRIおよびPstI)を付加するプライマーを用いてPCR増幅し、次いで、そのPCR産物をpMal−c2tの対応する部位にクローニングすることによって、構築された。TEVプロテアーゼで切断可能なリンカー(TVDEALKDAQTNS3N10LENLYFQG)(配列番号3)を、Accuprimeポリメラーゼ(InvitrogenTM;Makarovaら、2000)を使用するQuick Change PCR手順によって強固なリンカー(TVDAALAAAQTNAAAAA)(配列番号4)で置き換えた。
LtrAタンパク質を、大腸菌BL21(DE3)において、タンパク質発現ベクターpMAL−c2t(上記を参照のこと)のBamHIとHindIIIの間の、tacプロモーターおよびΦ10シャイン・ダルガノ配列の下流にクローニングされたLtrA ORF(Millsら、1996)を含むプラスミドpMAL−LtrAから発現させた。細胞の開始培養物をLB培地中、37℃で一晩生育させ、それを使用して0.5LのLB培地を含む高収量フラスコ(ultra yield flasks)に接種し、それを37℃で3時間生育させた後、18℃で24時間生育させることによって、自己誘導した(Studier 2005)。細胞を遠心分離(Beckman JLA−8.1000;4,000×g,15分,4℃)によって回収し、1M NaCl、20mM Tris−HCl pH7.5、20%グリセロールおよび0.1mg/mlリゾチーム(Sigma−Aldrich(登録商標),St.Louis,MO)に再懸濁した。TeI4c−MRF RTの調製について上に記載したような3回の凍結融解サイクルおよび超音波処理によって溶解を行った。細胞残屑をペレットにした後(Beckman CoulterTM JA−14ローター,10,000rpm,30分,4℃)、0.4%ポリエチレンイミン(PEI)および4℃で20分間の一定の撹拌に続く遠心分離(Beckman CoulterTM JA−14ローター,14,000rpm,30分,4℃)を用いて、その上清から核酸を沈殿させた。次いで、4℃で1時間、一定で撹拌しながら、硫酸アンモニウムを50%飽和まで加えることによって、その上清からタンパク質を沈殿させた。沈殿させたタンパク質をペレットにし(Beckman CoulterTM JA−14ローター,14,000rpm,30分,4℃)、500mM NaCl、20mM Tris−HCl pH7.5、10%グリセロールに溶解した。そのタンパク質を10mlアミロースカラム(Amylose High−Flow樹脂;New England BiolabsTM,Ipswich,MA)に適用し、それを500mM NaCl、20mM Tris−HCl pH7.5、10%グリセロールの3カラム体積で洗浄し、10mMマルトースを含む500mM NaCl、20mM Tris−HCl pH7.5、10%グリセロールで溶出した。MalE−LtrAを含む画分を、80μg/mlのTEVプロテアーゼとともに4℃で18時間インキュベートした。これらの画分を、40mMイミダゾールとともに充填され、500mM NaCl、20mM Tris−HCl pH7,5、10%グリセロール、40mMイミダゾールの3カラム体積で洗浄され、500mM NaCl、20mM Tris−HCl pH7.5、10%グリセロール、300mMイミダゾールで溶出される、Ni−NTAカラムに通すFPLCによってTEVプロテアーゼからさらに精製した。単量体LtrAを、ヘパリンSepharoseを含むカラム(New England Biolabs(登録商標))に通すFPLCによってさらに精製した。次いで、精製されたタンパク質を30μMまで濃縮し、透析によって100mM NaCl、20mM Tris−HCl pH7.5、10%グリセロールに交換した。
TeI4c−MRF RTによる逆転写反応を、上記の精製タンパク質をIntegrated DNA Technologies(登録商標)(IDT;Coralville,IA)によって合成された人工オリゴヌクレオチド基質とともにインキュベートすることによって行った。いくつかの実験において、ファージT4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs(登録商標))を製造者のプロトコルに従って使用して、DNAプライマーを[γ−32P]−ATP(10Ci/mmol;Perkin−Elmer(登録商標))で5’末端標識した。10mM Tris−HCl,pH7.5、1mM EDTA中で1.1:1のモル比で混合し、PCR機器(Gene Amp9700,Life TechnologiesTM Corporation,Carlsbad,CA)を使用して、82℃に2分間加熱し、次いで、10分間にわたって室温に冷却することによって、プライマーをRNA鋳型鎖にアニールした。図の説明文に明記されている条件下で10〜40μlの反応媒体中において逆転写反応を行った。反応を、酵素を加えることによって開始し、125mM EDTA、0.05%SDSを加えることによって終了させた後、フェノール−CIA抽出した。標識されたプライマーを用いた実験の場合、生成物を、PhosphorImagerTMでスキャンされる変性20%ポリアクリルアミドゲルにおいて解析した。
図1は、熱安定性TeI4c−MRFグループIIイントロンRTおよびSuperscript III RTが、IA−P1 RNA/PcDNAという名称のRNA鋳型/DNAプライマー基質から21ntのRNAオリゴヌクレオチド(miRNAxという名称)(その配列は、テンプレートスイッチにおける偏りを評価するために、5’末端と3’末端の両方に2つのランダム化されたヌクレオチド残基(N)を有する、植物miRNA(Arabidopsis thaliana ath mir−173;Parkら、2002)の配列と類似している)の3’末端にテンプレートスイッチする能力を比較している。その鋳型/プライマー基質は、SOLiD次世代シーケンシング用のInternal Adaptor(IA)およびP1配列を含む42ntの鋳型RNA(IA−P1 RNAという名称)(それは、P1およびIA配列の一部に相補的なアニールした31ntのDNAプライマー(Pcという名称)を有する)からなる(図2)。そのIA−P1鋳型RNAは、その3’末端へのテンプレートスイッチによる再複製を妨害する3’−アミノ修飾因子(AmMO;IDT)を用いて合成され、PcDNAプライマーは、その5’末端において32P標識され、環状化されたcDNAをその後、ウラシルDNA切り出し混合物(UDE;Epicentre;図2)を用いて直鎖化するために内部にデオキシウリジンを含む。TeI4c−MRFおよびSuperScript III RTによる逆転写反応を、各酵素に対する最適条件下で行った(図1の説明文を参照のこと)。
テンプレートスイッチおよび鋳型非依存性ヌクレオチド付加に対する傾向が、グループIIイントロンRTの一般的な特性であるか否かを決定するために、本発明者らは、中温性のLactococcus lactis Ll.LtrBグループIIイントロンRTを用いて生化学的アッセイを行った。図4Aに示される実験において、最初の鋳型/プライマー基質は、60ntのRNA鋳型(その5’末端は、アニールした45ntのDNAプライマー(プライマーc;その図ではPri cという名称)を有するLl.LtrBイントロンの末端に対応する)からなるものだった。そのLl.LtrB RTは、アニールしたDNAプライマーからイントロンRNA鋳型の逆転写を開始し、それをそのRNAの5’末端まで伸長し、次いでそのRTは、ltrBエキソン1(E1 RNAまたはDNA)のヌクレオチド配列を有する第2の40ntのDNAまたはRNA鋳型に飛び移り得る。Ll.LtrB RNAの3’末端は、そのRTが最初の鋳型の第2の分子に切り換わる能力を妨害するアミノ修飾因子(AmMO)を有する。その反応は、200μM dNTP、450mM NaCl、5mM MgCl2、20mM Tris−HCl pH7.5および1mMジチオトレイトール(DTT)を含む反応媒体において行われた(その高い塩濃度は、Ll.LtrB RTの最適な活性のために必要とされると以前に示されている(Saldanhaら、1999))。
グループIIイントロンRTがcDNAの3’末端に余分なヌクレオチド残基を付加する能力は、潜在的に有用であるが、cDNAの正確なサイジングを必要とするいくつかの用途(例えば、キャピラリー電気泳動)にとっては有害である場合があり、cDNAの3’末端と新しいRNA鋳型の3’末端との間に相補性を導入することによってテンプレートスイッチにおける偏りに関与することができた。図3の実験では、例えば、TeI4c−MRF RTによるcDNAの3’末端への余分なA残基の優先的な付加は、その優先的な付加を、相補的な3’U残基を有するmiRNAへのテンプレートスイッチに偏らせることができ、不一致の3’A残基を有するmiRNAを嫌うことがあった。グループIIイントロンRTによるテンプレートスイッチは、cDNAと新しいRNA鋳型との間の塩基対形成なしでも生じ得るが、cDNAの3’末端に付加された余分なヌクレオチド残基との塩基対形成または不一致に対する可能性は、その他のものよりもいくかの鋳型へのスイッチを強く好み得る。したがって、cDNAの3’末端への鋳型非依存性ヌクレオチド付加の程度が最小限にされ得るかまたは制御され得る条件を見つけ出すために時間を費やした。
グループIIイントロンRTによる鋳型非依存性ヌクレオチド付加を最小限にする反応条件が同定されたので、miRNAクローニングおよびシーケンシング実験(TeI4c−MRF RTが、IA−P1 RNA/PcDNA鋳型−プライマー基質から、5’末端と3’末端の両方に2つのランダム化されたヌクレオチドを有する21ntのmiRNAにテンプレートスイッチする)を繰り返したが、ここでは、鋳型非依存性ヌクレオチド付加を減少させることを意図した反応条件下で(450mM NaCl、5mM MgCl2、20mM Tris−HCl,pH7.5、10分間)行った。得られたcDNAを、図2のプロトコルを用いてクローニングし、1mM dNTPの濃度を使用して、Sangerシーケンシング(図示せず)と次世代SOLiDシーケンシングの両方によって解析した。
鋳型非依存性ヌクレオチド付加によって引き起こされるテンプレートスイッチの偏りを減少させるための他のアプローチを探索した。1つのアプローチにおいて、本発明者らは、cDNAが最初のRNA鋳型の末端に到達したときの構造を模倣する、種々の末端塩基対を有する平滑末端のRNA/DNA鋳型−プライマー基質からのテンプレートスイッチを試験した。図8は、4つの可能性のある5’RNA/3’DNA塩基対の各々で終結している平滑末端の基質から、種々の3’末端ヌクレオチドを有するmiRNAxオリゴヌクレオチドへのテンプレートスイッチのゲル解析を示している。テンプレートスイッチ産物のバンド強度を定量し、各レーンにおける放射能の量に対して正規化することによって、4種の各ヌクレオチド残基で終結しているRNAに対して生じたテンプレートスイッチのパーセンテージの推定値を得た。U/A、C/GまたはA/T塩基対で終結しているRNA鋳型/DNAプライマー基質のすべてが、3’C残基を有するmiRNAxへのテンプレートスイッチに対して優先性を示したが、G/C塩基対で終結しているRNA鋳型/DNAプライマー基質は、3’U残基で終結しているmiRNAxに対していくらかの優先性を示したにもかかわらず、4種すべてのヌクレオチド残基で終結しているmiRNAxに効率的にテンプレートスイッチした(3つの別個の実験において、U,43〜59%;G,29〜30%;C,17〜19%;およびA,4〜12%)。したがって、異なる形状およびヌクレオチド配列を有するRNA鋳型/DNAプライマー基質(例えば、G/C塩基対で終結している平滑末端RNA鋳型/DNAプライマー基質)の使用を用いることにより、テンプレートスイッチの偏りが最小限にされ得る。
3’オーバーハング基質からのテンプレートスイッチを、図10に示されるようにGsI−IIC−MRFグループIIイントロンを使用して実証した。この図は、プライマーをmiRNA配列と連結するテンプレートスイッチの使用を実証しており、より広くは、それぞれサブグループIIAおよびIIBに属するLl.LtrBおよびTeI4c−MRF RTと同じテンプレートスイッチ反応を、異なる構造のサブクラス(サブグループIIC)に属する第3のグループII RTであるGsI−IIC−MRFが行うことを示している。テンプレートスイッチの別の例は、図11に提供されており、これは、TeI4c−MRF RTを使用した、最初のRNA/DNAまたはDNA/DNA鋳型/プライマー基質からのテンプレートスイッチを示している。この図は、いずれかのタイプの鋳型/プライマー基質が、テンプレートスイッチを行うために適しているが、RNA/DNA鋳型プライマー基質がより効率的であることを実証している。
ライブラリー構築に対するその有用性を評価するために、グループIIイントロンRTのテンプレートスイッチおよび従来のRNAライゲーション法を使用する2つの市販のキット(Applied BiosystemsTMおよびNew England BioLabsTM)を使用することにより、963個の等モルのmiRNAからなる参照セットのSOLiDシーケンシング用ライブラリーを作製した。次いで、本発明者らは、ユニークに識別可能なコア配列を有するmiRNAのうちの898個のライブラリー存在量を比較した。そのプロットは、異なる比の3’オーバーハングを有する鋳型−プライマー基質(TS1およびTS2)からのTeI4c−MRF RTのテンプレートスイッチによって調製された2つのライブラリーが、いずれかの市販のキットによって調製されたものより一様なmiRNA配列の分布(より平らな線)を有することを示している(図12A)。アウトライヤーの解析から、すべてのライブラリーにおいて過小提示された9つのmiRNAが特定されたが、その他においては、異なる方法によって過小または過剰提示されたmiRNAの間の重複はほとんどなかった(それぞれ図12BおよびC)。図13は、グループIIイントロンRTのテンプレートスイッチによって生成されたcDNAライブラリー中の種々の3’末端ヌクレオチドを有するmiRNAの提示が、異なる比のA、C、GまたはT3’オーバーハングを有する鋳型/プライマー基質を使用することによって調整され得ることを示している。
Claims (33)
- テンプレートスイッチを使用して標的ポリヌクレオチドのDNAコピーを調製する方法であって、該方法は:
相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖と会合したDNAプライマーオリゴヌクレオチドからなる少なくとも1つの二本鎖鋳型/プライマー基質を少なくとも1つの標的ポリヌクレオチドと反応媒体中で混合する工程、および
該反応媒体に適当量の非レトロウイルス逆転写酵素を加えて、該DNAプライマーオリゴヌクレオチドをその3’末端から伸長して、該標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して合成される相補的な標的DNAポリヌクレオチドを含むDNAコピーポリヌクレオチドを提供する工程
を包含し、ここで、
該二本鎖鋳型/プライマー基質は、該DNAプライマーオリゴヌクレオチドの3’末端が該相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖の5’末端と直接整列される平滑末端、または該DNAプライマーオリゴヌクレオチドの3’末端が該相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖の5’末端を超えて1ヌクレオチド伸長しているオーバーハング端を有する、
方法。 - 前記標的ポリヌクレオチドが、RNAからなる、請求項1に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドが、miRNAである、請求項2に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドが、DNAからなる、請求項1に記載の方法。
- 前記相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖が、RNAからなる、請求項1に記載の方法。
- 前記相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖が、DNAからなる、請求項1に記載の方法。
- 前記二本鎖鋳型/プライマー基質が、オーバーハング端を有し、2〜4個の異なるヌクレオチドからなるオーバーハング端を有する複数の異なる二本鎖鋳型/プライマー基質が、使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記DNAプライマーオリゴヌクレオチドが、オーバーハング端を有し、前記標的ポリヌクレオチドの3’末端におけるヌクレオチドが、該DNAプライマーオリゴヌクレオチドの3’末端におけるヌクレオチドに相補的である、請求項1に記載の方法。
- 前記非レトロウイルス逆転写酵素が、前記DNAプライマーオリゴヌクレオチドの3’末端に1〜15個のさらなる非相補ヌクレオチドを付加した後、前記標的ポリヌクレオチドを複製することにより、前記DNAコピーポリヌクレオチドを合成する、請求項1に記載の方法。
- 前記非レトロウイルス逆転写酵素が、ただ1つのさらなる非相補ヌクレオチドを付加する、請求項9に記載の方法。
- 前記相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖の3’末端が、ブロッキング剤により終止されている、請求項1に記載の方法。
- 前記非レトロウイルス逆転写酵素が、グループIIイントロン逆転写酵素である、請求項1に記載の方法。
- 複数のDNAコピーポリヌクレオチドのクローニングライブラリーが、複数の異なる標的ポリヌクレオチドを使用することによって調製される、請求項1に記載の方法。
- 前記DNAコピーポリヌクレオチドを環状化する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- テンプレートスイッチを使用して標的ポリヌクレオチドのDNAコピーを調製する方法であって、該方法は:
相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖と会合したDNAプライマーオリゴヌクレオチドからなる少なくとも1つの二本鎖鋳型/プライマー基質を少なくとも1つの標的ポリヌクレオチドと反応媒体中で混合する工程、および
該反応媒体に適当量のグループIIイントロン逆転写酵素を加えて、該DNAプライマーオリゴヌクレオチドをその3’末端から伸長して、該標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して合成される相補的な標的DNAポリヌクレオチドを含むDNAコピーポリヌクレオチドを提供する工程
を包含する、方法。 - 前記標的ポリヌクレオチドが、RNAからなる、請求項15に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドが、miRNAである、請求項16に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドが、DNAからなる、請求項15に記載の方法。
- 前記相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖が、RNAからなる、請求項15に記載の方法。
- 前記相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖が、DNAからなる、請求項15に記載の方法。
- 前記二本鎖鋳型/プライマー基質が、前記DNAプライマーオリゴヌクレオチドの3’末端が前記相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖の5’末端と直接整列される平滑末端を有する、請求項15に記載の方法。
- 前記二本鎖鋳型/プライマー基質が、前記DNAプライマーオリゴヌクレオチドの3’末端が前記相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖の5’末端を超えて1ヌクレオチド伸長しているオーバーハング端を有する、請求項15に記載の方法。
- 2〜4個の異なるヌクレオチドからなるオーバーハング端を有する複数の異なる二本鎖鋳型/プライマー基質が、使用される、請求項22に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドの3’末端におけるヌクレオチドが、前記DNAプライマーオリゴヌクレオチドの3’末端におけるヌクレオチドに相補的である、請求項22に記載の方法。
- 前記逆転写酵素が、前記DNAプライマーオリゴヌクレオチドの3’末端に1〜15個のさらなる非相補ヌクレオチドを付加した後、前記標的ポリヌクレオチドを複製することにより、前記DNAコピーポリヌクレオチドを合成する、請求項15に記載の方法。
- 前記逆転写酵素が、ただ1つのさらなる非相補ヌクレオチドを付加する、請求項25に記載の方法。
- 前記相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖の3’末端が、ブロッキング剤により終止されている、請求項15に記載の方法。
- 複数のDNAコピーポリヌクレオチドのクローニングライブラリーが、複数の異なる標的ポリヌクレオチドを使用することによって調製される、請求項15に記載の方法。
- 前記DNAコピーポリヌクレオチドを環状化する工程をさらに包含する、請求項15に記載の方法。
- DNAプライマーオリゴヌクレオチドにさらなるヌクレオチドを付加する方法であって、相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖と会合したDNAプライマーオリゴヌクレオチドからなる二本鎖鋳型/プライマー基質を含む反応媒体に適当量の非レトロウイルス逆転写酵素を加える工程を包含し、ここで、該非レトロウイルス逆転写酵素は、該DNAプライマーオリゴヌクレオチドの3’末端に1〜15個のさらなる非相補ヌクレオチドを付加する、方法。
- 前記非レトロウイルス逆転写酵素が、グループIIイントロン逆転写酵素である、請求項30に記載の方法。
- 1〜6個のさらなる非相補ヌクレオチドが付加される、請求項30に記載の方法。
- 単一の非相補ヌクレオチドが付加される、請求項30に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
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