KR101606929B1

KR101606929B1 - 모세관 전기영동에 의한 다중 ｍＲＮＡ 또는 16ＳｒＲＮＡ분석을 위한 주형 변형방법 및 이를 이용한 미생물검출방법

Info

Publication number: KR101606929B1
Application number: KR1020080040773A
Authority: KR
Inventors: 정규열; 박진현; 조양숙; 신기원; 구정모
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2008-04-30
Filing date: 2008-04-30
Publication date: 2016-03-29
Also published as: KR20090114897A

Abstract

본 발명은 모세관 전기영동에 의한 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석을 위한 주형 변형방법 및 이를 이용한 미생물 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 분석 대상인 mRNA 또는 rRNA를 동시에 여러 종 증폭하기 위하여 주형이 되는 서열의 앞뒤에 공통의 염기서열을 갖는 변형된 이중가닥 DNA 주형을 제작하고, 공통 프라이머를 이용하여 변형된 이중가닥 DNA 주형을 PCR 증폭한 다음, 증폭된 산물을 모세관 전기영동-단일쇄 형태변환 다형성(single strand conformation polymorphism)을 통해 분리 및 정량함으로써 분석 민감도 및 정확도가 높고 분석시간이 크게 단축되는 효과를 가짐과 동시에 이를 이용하여 미생물을 검출할 수 있는 모세관 전기영동에 의한 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석을 위한 주형 변형방법 및 이를 이용한 미생물 검출방법에 관한 것이다.

RNA, template switching, modification, 모세관 전기영동

Description

모세관 전기영동에 의한 다중 ｍＲＮＡ 또는 16ＳｒＲＮＡ 분석을 위한 주형 변형방법 및 이를 이용한 미생물 검출방법{Method for modifying template to analyze multiple mRNA or 16S rRNA by capillary electrophoresis and detecting microorganism by using the same}

mRNA의 정확한 정량을 통해서 질병에 대한 관찰 및 신약 개발시 후보물질에 대한 모니터링이 가능하다. 현재 이러한 mRNA를 정량하기 위한 방법으로, 혈액샘플에서 정확한 mRNA 정량하기 위해서 혈액 용해물로부터 직접 mRNA를 포착할 수 있는 다중교잡 탐침(multiple hybridization probe)으로 단일 또는 다중 유전자 발현 분석을 수행하고 그 반응을 증폭하기 위해서 분지된(branched) DNA를 사용한다. 96-웰 단일 분석(96-well plate singleplex assay)은 화학적비열발광(chemiluminescence) 검출을 사용하고, 다중 분석(multiplex assay)은 형광 검출과 루미넥스 인코드된 비즈(Luminex-encoded bead)를 겸하여 사용한다(ZHI ZHENG 외 2명, Clinical Chemistry, 2006, 52:7, 1294-1302).

또한, mRNA에 대한 정량 및 코드화하기 위해 작은 형광 분자(eTag)를 사용하는 새로운 다중기술을 이용한다. 이 다중적인 방법(multiplexing approach)으로 염증을 유발시키는 사이토카인 인터루킨 1B를 자극하는 인간 탯줄(umbilical) 정맥 내피세포에서 염증반응 유전자의 패널을 검사한다. 모세관 전기영동에서 전기적인 샘플(electrokinetic sample) 주입방법과 레이저 유도 형광 검출(laser-induced fluorescence detection)은 mRNA 분자의 수천 복사체를 민감하게 정량화할 수 있다(Huan Tian 외 11명,Nucleic Acid Research, 2004, Vol. 32, No. 16, 126-138).

한편, rRNA를 통해서 미생물의 검출하는 방법으로, 혈액 유래 20종 병원균을 다중 검출하기 위해 고효율 분석(PCR-ligase detection reaction-capillary electrophoresis; PCR-LDR-CE)을 실시하는 방법이 있다. 이 방법은 미생물의 16S rRNA 유전자 내의 두 부분을 증폭하는 것, 유니버설 PCR 프라이머 사용과 하위 시퀀스 LDR의 증폭된 부분 내에서 특별한 단일 뉴클레오타이드 다형성(single-nucleotide polymorphism)의 동일성에 대한 쿼리(query)하는 것을 토대로 한다. 이 시험방법을 통해 목적하는 미생물을 검출한다(Maneesh R. Pingle 외 9명, Journal of Clinical Microbiology, June 2007, Vol. 45, No. 6, 1927-1935).

또한, 안전성에서 생존상태에 있는 미생물을 검출하는데 적합하지 않다고 생각된 rRNA를 표적으로 이용하면 의외로 사멸세포를 반영하지 않고 생존상태에 있는 미생물수를 정확하게 정량 검출할 수 있으며, 정량 검출시 RT-RCR법을 이용한다(대한민국 공개특허 제2007-7017768호).

상기와 같은 종래기술을 살펴보면 여러 가지 대상 유전자가 혼합된 상황에서 한 가지 혹은 두세 가지의 목적 유전자만을 선택적으로 증폭하여 정량하기는 비교적 쉬운 것으로 알려져 있으며, 이는 특정 유전자 영역에 선택적으로 결합 (hybirdization)하는 프라이머의 디자인을 통하여 가능하다. 이러한 점을 십분 활용한 예가 바로 real-time PCR 기술로서, 보고된 바에 의하면 4가지 서로 다른 유전자를 동시에 증폭하여 정량할 수 있다. 하지만 이 기술 역시 형광 염료를 통하여 서로 다른 유전자를 구분하기 때문에 더 많은 종류의 유전자를 동시 분석하기에는 한계가 있다.

또한, 종래의 기술은 mRNA를 동시 정량할 수 있도록 분지된 DNA (이하 bDNA)를 루미넥스 인코드된 비드와 함께 사용하였으나 대상 mRNA에 비드와 DNA를 결합 (hybiridization) 시키는 과정이 16시간 정도로 비교적 길고, 하나의 mRNA에 특이 적인 프루브를 세 가지 이상 설계해야 하므로 폭넓게 적용하기가 용이하지 않다.

eTag을 적용한 분석기술 역시 전기영동 시, 서로 다른 이동도를 갖는 eTag을 타겟에 특이적인 프루브에 인코딩하여 프루브가 특이적 결합을 할 경우에만 eTag 분자가 프루브로부터 분리(cleavage) 될 수 있도록 하여 여러 가지 mRNA 타겟을 동시에 특이적으로 증폭하고 분석할 수 있도록 한 것이다. eTag 분석 시스템은 ACLARA Bioscience 社에 의해 상용화되어 시장 진출을 위한 마케팅이 진행 중인 것으로 알려져 있다. 하지만 이 기술의 문제점은 eTag 분자를 프루브로부터 분리시키는 과정에 있는데, 이 과정은 클리베아제(cleavase)라 칭하는 효소에 의한 반응으로, 반응의 안정성과 재현성에 대한 의문이 제기되어 왔다.

본 발명의 목적은 동시에 정량 및 정성 분석이 힘들고, 시간이 다소 많이 걸리는 종래기술의 단점을 개선하여 다중의 mRNA 또는 16S rRNA를 정성 또는 정량 분석하기 위한 mRNA 또는 16S rRNA의 주형 변형 및 이를 이용한 분석방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 주형 변형을 통해 모세관 전기영동을 통해 목적물(미생물, 진핵생물)에 대한 정량 및 정성 분석을 동시에 수행하며 분석 시간을 단축할 수 있는 미생물 검출방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

i) mRNA 또는 16S rRNA 주형 특이적 서열 및 공통된 overhang 염기서열을 포함하는 프라이머를 이용한 역전사 효소반응을 통해 5'-말단쪽에 공통된 염기서열(universal region)을 갖는 cDNA 제조 단계;

ii) 상기 단계로부터 얻은 cDNA의 3'-말단쪽 CCC 서열과 결합하는, 5'-말단쪽에 공통된 염기서열을 포함하는 주형 스위칭 프라이머(template switching primer)를 제작 단계; 및

iii) 상기 ii) 단계에서 제작된 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시켜 양끝에 공통된 염기서열을 갖는 변형된 이중가닥 DNA 주형을 제작하는 단계를 포함하는 것 을 특징으로 하는 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석을 위한 주형 변형방법을 제공한다.

본 발명은 또한

본 발명의 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석을 위한 주형 변형방법을 통해 변형된 이중가닥 DNA 주형을 제조하는 단계;

공통 프라이머(universal primer) 세트를 이용하여 상기 변형된 이중가닥 DNA 주형을 PCR 증폭시키는 단계; 및

상기 단계에서 증폭된 PCR 산물을 모세관 전기영동-단일쇄 형태변환 다형성 (capillary electrophoresis-single strand conformation polymorphism)을 통해 분리 및 분석하는 단계를 포함하는 모세관 전기영동에 의한 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석방법을 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호 7 및 8로 이루어진 mRNA 또는 16S rRNA 분석용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석방법을 이용한 미생물의 검출방법을 제공한다.

본 발명의 mRNA 혹은 rRNA의 다중 분석 기술은

i) 공통 프라이머를 도입하여 여러 서로 다른 주형을 동시에 증폭할 수 있다는 점,

ii) 이들을 모세관 전기영동과 결합한 단일쇄 형태변환 다형성 기술로 높은 해상도로 분리하여 동시 정량을 용이한 점, 즉, 실험 단계가 어렵지 않고 보통 실험실에서 널리 쓰이는 시약으로 실험이 이루어지면서도 높은 민감도와 정확도로 동시 분석이 가능한 점,

iii) bDNA를 이용한 분석 기술과 같이 결합 (hybiridization) 단계가 필요하지 않아 역전사, 주형 변형, PCR, CE-SSCP 등의 전체 분석시간이 단축되는 장점이 있다.

본 발명은 분석 대상인 유전자가 서로 매우 유사한 물성을 공유하고 있기 때문에 동시 정량 및 정성 분석이 어려운 종래기술의 단점을 개선하기 위해 안출되었다.

따라서, 유전자를 동시 정량 및 정성 분석하기 위해서는 동시 증폭된 유전자를 잘 분리하는 기술이 필요하다. 모세관 전기영동과 단일쇄 형태변환 다형성을 결합한 유전자 분리 기술은 하나의 염기서열의 변화에도 민감하게 유전자를 분리해 내는 것으로 보고되어 있어 상기한 문제점을 해결하는데 적합하다.

단, 동시에 효과적으로 유전자를 증폭할 수 있어야 한다는 단서가 붙는데 본 발명은 이를 해결하기 위해 주형(template)이 되는 모든 mRNA 혹은 rRNA를 앞뒤의 염기서열이 공통된 이중가닥 DNA로 변형시킴으로써 이를 한 쌍의 공통 프라이머로 쉽게 증폭할 수 있게 한다. 공통 프라이머로 증폭되는 DNA 이중가닥들은 동일한 효율로 증폭되므로, 다음 식에서와 같이 특정 DNA 가닥에 대한 상대값이 변화하지 않는 특징이 있어, 알려진 양의 표준 유전자를 함께 증폭함으로써 대상 유전자의 절대량을 알 수 있다는 것을 특징으로 한다.

다음 식에서, X는 n 사이클(cycle)에서의 유전자의 양이며, I는 초기 유전자의 양, E는 유전자의 증폭 효율이다. E는 각 유전자에 따라 다른 값을 가지며 주로 대상 유전자를 증폭하는 프라이머에 의해 좌우되며, 사이클(cycle)이 진행될수록 낮아진다. 즉, 증폭 효율 E가 서로 같은 값이라면 서로 다른 유전자의 초기량의 비(I₁ / I₂)는 증폭후 유전자의 양의 비 (X₁/X₂)와 같아지게 된다.

X = I ( 1 + E )ⁿ

X₁/X₂ = I₁ / I₂

따라서, 알려진 양의 표준 유전자를 함께 증폭하게 되면, 대상 유전자의 양의 초기값을 계산할 수 있다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은

i) mRNA 또는 16S rRNA 주형 특이적 서열 및 공통된 overhang 염기서열을 포 함하는 프라이머를 이용한 역전사 효소반응을 통해 5'-말단쪽에 공통된 염기서열(universal region)을 갖는 cDNA 제조 단계;

iii) 상기 ii) 단계에서 제작된 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시켜 양끝에 공통된 염기서열을 갖는 변형된 이중가닥 DNA 주형을 제작하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석을 위한 주형 변형방법에 관한 것이다.

mRNA 또는 16S rRNA 주형을 변형하는 목적은 분석 대상인 mRNA 혹은 rRNA를 동시에 여러 종 증폭하기 위하여 앞뒤에 공통의 염기서열을 수식하는 데에 있으며, 도 1을 참조하여 설명하면,

우선, mRNA 또는 16S rRNA 주형 특이적인 서열과 공통된 overhang 염기서열이 연결되어 이루어진 프라이머로 mRNA 혹은 rRNA를 역전사 효소반응을 통하여 cDNA로 변환한다. 이때 모든 cDNA는 5'-말단쪽에 첫 번째 공통된 염기서열로 수식된다.

주형으로 사용되는 mRNA 또는 16S rRNA는 특별히 제한되지는 않으나, 대장균(E.coli) 유래의 rpiA, rpiB, dnaK, ppc, ptsG, 또는 pykF 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.

상기 mRNA 또는 16S rRNA 주형 특이적인 서열과 공통된 overhang 염기서열이 연결되어 이루어진 프라이머는 특별히 제한되지는 않으나, 서열목록 서열번호 1 내지 6에 기재된 서열 중 어느 하나를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 cDNA에 포함되는 공통된 overhang 염기서열은 임의의 공통 서열일 수 있어 특별히 제한하지는 않으나, 서열번호 7에 기재된 서열인 것이 바람직하다.

다음으로, 역전사 반응의 특성상 모든 cDNA의 3'-말단에는 시토신(cytosine)이 세 번 연속하여 존재하며(CCC-3'), 이에 상보적인 구아닌(guanine)이 세 번 연속 3'-말단에 존재하는 프라이머(GGG-3')를 설계하여 결합시킨다. 상기 프라이머의 5'-말단에는 두 번째 공통된 염기서열이 존재한다.

상기 구아닌(guanine)이 세 번 연속 3'-말단에 존재하는 프라이머(GGG-3')를 "주형 스위칭 프라이머(template switching primer)"라 한다.

상기 주형 스위칭 프라이머는 특별히 제한하지는 않으나, 서열번호 9에 기재된 서열인 것이 바람직하다.

또한, 상기 주형 스위칭 프라이머는 공통된 염기서열 즉, 공통된 overhang 염기서열을 포함하는 데, 바람직하게는 서열번호 8에 기재된 서열인 것이 좋다.

다음으로, CCC와 GGG가 결합한 형태의 DNA는 CCC와 GGG의 중합체(혹은 결합체)를 제외하고는 단일쇄로 존재하므로 단일쇄를 이중가닥으로 만들어 주기 위하여 DNA 중합효소를 첨가하여 반응시켜 PCR 증폭시키고, 최종적으로 양끝에 공통된 염기서열을 갖는 변형된 이중가닥 DNA 주형을 얻는다.

본 발명은 또한

상기 단계에서 증폭된 PCR 산물을 모세관 전기영동-단일쇄 형태변환 다형성 (capillary electrophoresis-single strand conformation polymorphism)을 통해 분리 및 분석하는 단계를 포함하는 모세관 전기영동에 의한 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석방법에 관한 것이다.

본 발명의 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석을 위한 주형 변형방법을 통해 변형된 이중가닥 DNA 주형은 앞뒤에 공통된 염기서열을 갖는 것이 특징이며 이 부분을 대상으로 프라이머를 설계하여 PCR을 수행할 수 있다.

즉, 서로 다른 mRNA 혹은 rRNA로부터 변형된 이중가닥 DNA는 중간에 특이적인 부분을 포함하면서 양끝의 염기서열은 공통되어 공통 프라이머(universal primers)로 여러 가지 서로 다른 mRNA 혹은 rRNA를 동시에 증폭하는 것을 용이하게 한다. 이때, 증폭 시 한쪽의 프라이머의 5'-말단에는 형광 염료가 수식되어 이후 PCR 증폭 산물의 검출을 용이하게 한다.

상기 공통 프라이머(universal primers)는 cDNA에 포함된 공통된 overhang 염기서열을 이용하여 제작하는 것이 바람직하다.

상기 공통 프라이머는 공통된 overhang 염기서열에 따라 달라질 수 있어 특 별히 제한하지는 않으나, 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 공통 프라이머 세트 중 어느 하나의 프라이머의 5'-말단에 수식되는 형광 염료는 특별히 제한하지는 않으나, HEX 인 것이 바람직하다.

또한, PCR 증폭 결과 생성된 증폭 산물은 모세관 전기영동을 통하여 분리 및 정량한다. 모세관 전기영동 시 비변성(non-denaturing) 조건에서 전기영동을 시켜주게 되면, 단일가닥 DNA 입자의 이동속도가 그 길이뿐만 아니라 구조적 차이 따라서도 좌우된다. 이점을 이용한 것이 바로 단일쇄 형태변환 다형성 (single strand conformation polymorphism)이며 이를 통하여 보다 세밀한 분리가 가능한 것이 특징이다. 이렇게 세밀한 분리 기술과 분리된 DNA 입자의 양을 수식된 형광 염료의 세기를 측정함으로써 알 수 있어, 분리와 정량을 동시에 할 수 있다.

본 발명은 또한 서열번호 7 및 8로 이루어진 mRNA 또는 16S rRNA 분석용 프라이머 세트에 관한 것이다.

상기 프라이머는 mRNA 또는 16S rRNA 주형을 변형하여 양끝에 공통된 염기서열을 갖는 이중가닥 DNA 주형을 PCR 증폭하기 위해 사용되는 것으로, mRNA 또는 16S rRNA의 정성 또는 정량분석, 미생물 검출 시 이용된다.

본 발명은 또한 본 발명의 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석방법을 이용한 미생물의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명의 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석방법을 이용하여 검출할 수 있는 미생물로 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 세라시아 마르세센스(Serratia marcescens), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 애시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 스테노트로포나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스타필로코커스 헤모리티커스(Staphylococcus haemolyticus), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코커스 아갈티애(Streptococcus agalctiae), 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 아스퍼질러스 퓨미가투스(Aspergillus fumigatus), 이샅켄키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis), 또는 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 등을 단독 또는 2종 이상을 검출할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통해 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> mRNA 분석

본 발명의 기술을 적용하여, 다음과 같은 6종의 mRNA에 대한 분석을 시도하였다. 6종의 mRNA는 모두 대장균(E. coli)의 대사과정에 중요한 효소를 인코딩하고 있는 유전자이다.

rpiA, rpiB, dnaK, ppc, ptsG, pykF의 6종이며 이를 분석하기 위한 프라이머 세트의 염기서열은 도 2와 같다(서열번호 1 내지 6).

도 2에서 "specific RT primer" 는 역전사 과정 시 대상 mRNA에 결합하는 올리고머이며, 붉은 글자로 표시된 염기서열을 5'-말단쪽에 공통으로 갖는다. 이 공통 부분이 추후 공통 프라이머의 표적이 되는 영역이다. 도 1에서는 ①에 해당한다.

"template switching primer"는 역전사 후 cDNA의 3'-말단쪽의 CCC에 결합하는 올리고머로, 3'-말단에 이에 상보적인 GGG를 포함하고 있으며, 나머지 부분의 염기서열은 추후 공통 프라이머의 표적이 되는 영역이다. 도 1에서는 ②에 해당한다.

"Universal primer"는 주형 변환 후 PCR 반응에 쓰이는 프라이머이며 한쪽 프라이머에 HEX로 수식되어 있다. 도 1에서는 ③, ④에 결합하도록 설계되어 있다.

6종의 mRNA는 무세포(in vitro) 역전사 과정을 통하여 준비하였고, 그 농도는 Agilent Bioanalyzer 2100으로 측정하였다. 각각의 mRNA에 특이적으로 프라이머가 반응하는지 알아보기 위해 각각의 프라이머를 시험하였고 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 주요 피크가 모두 한 개씩 관측되었고, 소수의 작 은 피크가 관측되었다.

6종의 mRNA의 혼합액에서 rpiB만을 희석하여 반응시킨 결과는 도 4와 같다.

도 5는 rpiB mRNA의 양과 상대적 피크 넓이를 나타낸 것으로, rpiA (양이 고정됨)의 피크의 넓이에 대한 rpiB (희석함)의 피크 넓이가 선형적으로 상관성이 있음을 확인할 수 있다.

<실시예 2> 16S rRNA 분석

게놈 DNA(genomic DNA)는 미생물(프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) KCTC1117, 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium) KCTC2022, 세라시아 마르세센스(Serratia marcescens) KCTC2798, 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) KCTC3511)로부터 Qiagen사의 게놈 DNA 분리용 키트를 이용해 분리하였다.

시료에서 분리한 게놈 DNA는 이미 확보된 16S rRNA의 유전자 정보를 이용하여 T7 overhang된 forward primer와 reverse primer를 이용하여 16S rRNA 전체를 PCR 반응으로 증폭하였다. PCR 반응은 주형 DNA의 변성(denaturation) 단계, 프라이머(primer)의 결합(annealing) 단계 및 DNA의 합성(polymerization)를 통하여 수행하였다.

PCR로 증폭된 16S rRNA를 주형으로 하여 Ambion사의 Megascript T7 kit를 사용하여 in vitro transcription을 실시하였다. In vitro transcription은 제공되는 ATP, GTP, CTP, UTP를 각각 2㎕씩 넣고, 10X 반응 버퍼와 선형 주형 DNA(1㎍), enzyme mix를 잘 섞어주었다. 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 제공되는 Turbo DNase 1㎕를 넣고 37℃에서 15분간 반응시켰다.

합성된 RNA는 Qiagen사의 RNA Mini kit를 이용해 확보하였다. 방법은 제공되는 RLT buffer 1㎖당 β-mercaptoethanol 10㎕를 넣어 잘 섞었다. In vitro transcription한 샘플 혼합물에 DEPC water 80㎕를 넣어 전체 100㎕를 제조하였다. 각 샘플에 350㎕의 RLT/ β-mercaptoethanol buffer를 넣고 잘 섞었다. 여기에 250㎕의 100% 에탄올을 넣고 피펫으로 잘 섞어주었다. 키트에서 제공되는 RNeasy mini spin column에 샘플 700㎕를 넣고 8000g에서 15초간 원심분리하였다. Collection tube의 액을 버리고 새로운 2㎖ collection tube로 교체하였다. 샘플에 500㎕ RPE buffer(containing ethanol)를 넣고 원심분리에서 2회 세척하였다. 최고의 속도로 2분간 원심분리하였다. 최고 속도로 1분간 더 원심분리하여 칼럼을 건조시켰다. 제공되는 RNase free 1.5㎖ collection tube에 칼럼을 옮기고 DEPC 또는 Nuclase free water를 50㎕ 넣고 용출하였다.

Clean up 된 RNA는 Agilent 사의 bioanalyzer를 이용하여 농도를 측정하였다. 측정된 RNA는 electrogram과 gel image로 확인할 수 있고, 전체 합성된 RNA 중에서 16S rRNA의 %를 조합하여 실제 16S rRNA만의 농도를 구하였다.

16S rRNA는 invitrogen사의 Superscript Ⅱ를 이용하여 first strand cDNA synthesis 및 template switching하였다. RT-PCR용 프라이머 고안은 다음과 같다.

상동성(Homology)이 높은 염기서열들을 동시에 template switching을 행하기 위한 reverse transcription primer의 제작하였다.

European Bioinformatics Institute에서 제공하는 서열 정렬 프로그램인 Clustal W2를 이용하여 서열들을 homology에 따라 정렬시키면 각 서열들에 개별적으로 존재하는 특이적 부분들을 획득할 수 있다. 여기서 얻어진 특이적 서열을 주형으로 하는 reverse complement를 얻어낸 뒤, 이들을 University of Helsinki의 Institute of Biotechnology에서 제공하는 FastPCR 프로그램을 이용하여 multiplex로 reverse transcription을 행할 경우 어떤 결과를 얻을 수 있는지 알아보고 reverse complement의 서열을 조정하여, 한 서열에 하나의 reverse transcription primer가 특이하게 반응할 수 있도록 한다.

먼저, RNA를 최대 500ng/㎕를 7㎕와 각 시료의 specific한 T7 overhang된 RT-PCR용 primer 1㎕를 넣고 잘 섞어주었다. 70℃에서 3분간 변성한 후 바로 얼음에 넣었다. 시료의 master mix(5×first strand buffer 4㎕, template switch oligomer(1㎍/㎕) 1㎕, RNA inhibitor 1㎕, 0.1M DTT 2㎕, 10mM dNTP 2㎕, superscript Ⅱ 2㎕)를 제조하였다. 각 튜브에 master mix 12㎕씩 넣고 잘 섞어주고, 42℃에서 90분간 반응시켰다.

이중가닥 DNA로 만들기 위해 second strand synthesis를 수행하였다.

먼저, 시료의 master mix(DEPC water 108㎕, 10×advantage PCR buffer 15㎕, RNase H(5U/㎕) 1㎕, 10mM dNTP 3㎕, advantage polymerase 3㎕)를 제조하였다. first strand cDNA synthesis mixture에 130㎕의 master mix를 넣고 잘 섞어주었다. 37℃에서 5분, 94℃에서 2분 변성, 65℃에서 3분 specific priming, 75℃에 서 30분 extension 반응시킨 다음, 이후에는 반응을 정지시켰다.

합성된 이중가닥 cDNA는 Qiagen사의 PCR purification kit를 이용하여 clean up하였다. 반응 mixture의 5배 양의 PB Qiagen buffer를 넣어 잘 섞어준 다음, 피펫으로 용액을 칼럼에 넣었다. 원심분리기를 이용해 1분간 최고속도로 돌려주었다. 흘러나온 액은 버리고 제공되는 튜브는 다시 넣었다. 제공되는 PE buffer(containing ethanol) 750㎕를 넣고 2회 세척하였다. 최고속도로 1분간 원심분리를 2회하여 칼럼의 완충용액을 완전히 제거하였다. 1.5㎖ collection tube에 칼럼을 옮기고 28㎕로 용출하였다.

공통 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다. forward primer와 reverse primer-HEX를 이용하여 PCR 반응으로 증폭하였다. PCR 반응은 주형 DNA의 변성(denaturation) 단계, 프라이머(primer)의 결합(annealing) 단계 및 DNA의 합성(polymerization)를 통하여 수행하였다. 1% 아가로우즈 젤에서 5㎕ 로딩하여 15분간 러닝하여 UV 상에서 확인하였다.

증폭된 목적 유전자에 대하여 단일 가닥 구조다형성(SSCP)을 수행하였다.

도 6에서 각 4종의 미생물에 대한 각각의 16S rRNA에 대한 피크를 확인하였다.

또한, 이러한 방법을 통해서 다양한 미생물의 16S rRNA가 혼합되어 있는 경우에도 각각의 피크를 확인할 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 본 발명의 mRNA 또는 16S rRNA 주형 변환 과정을 도시한 것이다.

도 2는 본 발명의 mRNA 또는 16S rRNA 주형 변환 과정에 사용된 프라이머 세트의 염기서열을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 mRNA 또는 16S rRNA 분석을 이용한 mRNA의 개별 피크 확인 및 프라이머 특이성 시험 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 mRNA 또는 16S rRNA 분석을 이용하여 rpiB 희석 후 혼합액 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 mRNA 또는 16S rRNA 분석을 이용하여 rpiB mRNA의 양과 상대적 피크 넓이의 그래프를 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 mRNA 또는 16S rRNA 분석을 이용하여 미생물의 16S rRNA 증폭된 피크를 나타낸 것이다.

<110> FOOD SCIENCE CO.,LTD. POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Method for modifying template to analyze multiple mRNA or 16S rRNA by capillary electrophoresis and detecting microorganism by using the same <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific RT primer: dnaK <400> 1 tcctggatta tgcctggcac catacttcag cagaaatctg cggcg 45 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific RT primer: rpiB <400> 2 tcctggatta tgcctggcac catagccacg catccacaat ca 42 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific RT primer: pykF <400> 3 tcctggatta tgcctggcac catgcaggat agcggcggtt tt 42 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific RT primer: ptsG <400> 4 tcctggatta tgcctggcac catctgccat aacatgcgat acaac 45 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific RT primer: ppc <400> 5 tcctggatta tgcctggcac catgactaaa cgcacgcgca acg 43 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific RT primer: rpiA <400> 6 tcctggatta tgcctggcac catgggctga acatactgaa gtgcc 45 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer: Reverse primer or universal region 2(figure 1) <400> 7 tcctggatta tgcctggcac cat 23 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer: Forward primer or universal region 1(figure 1) <400> 8 agtcgtacga ctcacgatag gcgagtacgc 30 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Template switching primer <400> 9 agtcgtacga ctcacgatag gcgagtacgc ggg 33

Claims

복수 개의 mRNA 또는 16S rRNA 주형에 대해, 각 mRNA 또는 16S rRNA 주형 내 임의의 염기서열 부위에 상보적인 서열과 서열번호 7에 기재된 오버행 염기서열로 구성된 특이 역전사 프라이머(specific RT primer)를 이용하여 역전사 효소반응을 수행하여, 5'-말단에는 서열번호 7에 기재된 오버행 염기서열이 존재하고, 3'-말단에는 CCC 연속 서열이 존재하는 cDNA를 제조하는 단계;

서열번호 8에 기재된 오버행 염기서열의 3'-말단에 GGG 서열이 연결된 주형 스위칭 프라이머를 사용하여 상기 cDNA에 대해 PCR 증폭하여 5'-말단 및 3'-말단에 각각 서열번호 7 및 8에 기재된 오버행 염기서열이 존재하는 변형 이중가닥 DNA를 제작하고,

상기 GGG 서열은 상기 cDNA의 3'-말단에 존재하는 CCC 연속 서열과 결합하는 것인, 단계;

상기 변형 이중가닥 DNA의 5'-말단 및 3'-말단에 존재하는 오버행 염기서열 각각에 특이적인 서열번호 7 및 8에 기재된 유니버셜 프라이머(universal primer) 세트를 이용하여 상기 변형 이중가닥 DNA를 PCR 증폭시키는 단계; 및

상기 단계에서 얻은 PCR 증폭 산물을 모세관 전기영동-단일쇄 형태변환 다형성(capillary electrophoresis-single strand conformation polymorphism)을 통해 분리 및 정량 분석하는 단계를 포함하는, 모세관 전기영동에 의한 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석방법.
제1항에 있어서,

mRNA는 대장균 유래의 rpiA, rpiB, dnaK, ppc, ptsG 및 pykF로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 모세관 전기영동에 의한 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석방법.
제1항에 있어서,

특이 역전사 프라이머는 서열목록 서열번호 1 내지 6에 기재된 서열 중 어느 하나인 모세관 전기영동에 의한 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석방법.
삭제
삭제
제1항에 있어서,

주형 스위칭 프라이머는 서열번호 9에 기재된 서열인 모세관 전기영동에 의한 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석방법.
제1항에 있어서,

유니버셜 프라이머 세트의 적어도 하나는 형광 염료가 수식되어 있는 모세관 전기영동에 의한 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석방법.
제7항에 있어서,

형광 염료는 HEX인 모세관 전기영동에 의한 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석방법.
제1항에 있어서,

모세관 전기영동에 의한 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석방법은 미생물 검출에 용하는 것인, 모세관 전기영동에 의한 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석방법.
제9항에 있어서,

미생물은 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 세라시아 마르세센스(Serratia marcescens), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 애시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 스테노트로포나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스타필로코커스 헤모리티커스(Staphylococcus haemolyticus), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코커스 아갈티애(Streptococcus agalctiae), 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 아스퍼질러스 퓨미가투스(Aspergillus fumigatus), 이샅켄키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis) 및 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 모세관 전기영동에 의한 다중 mRNA 또는 16S rRNA 분석방법.
삭제
삭제
삭제
삭제