KR20140037046A - Ｄｎａ 합성을 위한 주형 스위칭의 용도 - Google Patents

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Abstract

주형 스위칭을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 DNA 카피를 제조하는 방법을 기술한다. 본 방법은 반응 배지 중에서 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥에 회합된 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드로 구성된 이중 가닥 주형/프라이머 기질을 표적 폴리뉴클레오티드와 혼합하는 단계, 및 적합한 양의 비레트로바이러스 역전사 효소를 반응 배지에 첨가하여 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드를 그의 3' 말단으로부터 연장시킴으로써 DNA 카피 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계를 포함한다. 본 DNA 카피 폴리뉴클레오티드는 주형으로서 표적 폴리뉴클레오티드를 사용하여 합성되는 상보적인 표적 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드를 이중 가닥 주형/프라이머 기질에 부가하는 방법 또한 기술한다. 본 방법을 사용하여 RNA 및 DNA 서열의 검출, PCR 증폭, 클로닝, 및 측정을 용이하게 수행할 수 있다.

Description

ＤＮＡ 합성을 위한 주형 스위칭의 용도{USE OF TEMPLATE SWITCHING FOR DNA SYNTHESIS}
계속 출원 데이터
본 출원은 2011년 2월 23일 출원된 미국 가출원 시리얼 번호 제61/445,761호의 이점을 주장하고, 이 출원은 본원에서 참고로 포함된다.
정부의 재정 지원
본 연구는 적어도 부분적으로는 미국 국립보건원(National Institutes of Health), 보건복지부(Department of Health and Human Services)로부터 지원금 번호 GM37947 및 GM37951의 지원을 받았다. 미국 정부는 본 발명에서 일정 권리를 가진다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 2012년 2월 23일 작성된 상기 ASCII 사본의 파일명은 31594024.txt이고, 그 크기는 34,166 바이트이다.
역전사 효소(RT: Reverse transcriptase)는 생명 공학에서 RT-PCR 및 qRT-PCR, cDNA 라이브러리 구성, 마이크로어레이를 위한 프로브 생성, 및 종래 및 차세대 RNA 서열 분석을 비롯한, 다양한 적용을 위해 RNA의 cDNA 카피를 합성하는 데 사용된다. 긴 폴리아데닐화된 RNA에 상응하는 cDNA의 합성은, 폴리(A) 테일에 상보적인 랜덤 헥사머 프라이머 또는 올리고(dT) 함유 프라이머를 사용함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 비폴리아데닐화된 RNA, 예컨대, miRNA 또는 단백질 결합 RNA 단편에 상응하는 cDNA의 가닥 특이 클로닝 및 서열 분석을 위해서는 전형적으로 PCR 프라이머 결합 부위를 함유하는 DNA, RNA 또는 키메라 RNA/DNA 올리고뉴클레오티드 어댑터를 RNA 또는 cDNA 가닥의 말단에 결찰시켜야 한다(문헌 [Lau et al. 2001]; [Levin et al. 2010]; [Lamm et al. 2011]). 어댑터는 보편적으로 RNA 리가제를 사용하여 RNA 주형에, 순차적으로 RNA의 3' 및 5' 말단에(예컨대, 로시 454 라이프 사이언시즈(Roch 454 Life Sciences)® 서열 분석 및 일루미나(Iliumina)® 차세대 서열 분석), 또는 동시에 RNA의 양 말단(예컨대, SOLiD™ 차세대 서열 분석)에 결찰된다(문헌 [Linsen et al. 2009]). 일부 적용의 경우, 제1 어댑터는 역전사를 위한 RNA의 3' 말단에 결찰되고, 제2 어댑터는 생성된 cDNA의 3' 말단에 결찰된다(예컨대, 단백질 결합 RNA 단편의 cDNA의 교차 결합 및 분석(CRAC: cross-linking and analysis of cDNA); 문헌 [Granneman et al. 2009]). 한 변형 방법에서는, cDNA의 3' 말단에 C 잔기를 부가하는 역전사 효소의 비주형 뉴클레오티드 부가 반응을 사용함으로써, 제2 가닥 합성을 위한 상보적인 G 잔기를 함유하는 제2 어댑터의 어닐링이 일어나도록 하면서, 제2 어댑터의 결찰을 회피한다(문헌 [Zhu et al. 2001]). 또 다른 변형 방법에서, 예를 들어, 개별 뉴클레오티드 분해 UV 교차 결합 및 면역침전(iCLIP: individual-nucleotide resolution UV-crosslinking and immunoprecipitation, 문헌 [Koenig et al. 2010]) 또는 리보솜 프로파일링을 이용한 뉴클레오티드 분해를 이용하는 번역에 관한 전 게놈(genome-wide) 시험관내 분석(문헌 [Ingolia et al. 2009])에서는 cDNA의 폐환화(circularizing) 후, 이어서, 선형화하고, 제1 어댑터 중의 양방향 프라이머 결합 부위를 사용하여 PCR 증폭을 수행함으로써 제2 어댑터의 결찰을 회피한다.
불행하게도, 비폴리아데닐화된 RNA 및 RNA 단편에 상응하는 cDNA의 클로닝 및 서열 분석을 위해 용이하게 PCR을 증폭시키기 위해서는 올리고뉴클레오티드 어댑터를 부착시켜야 하지만, 리가제를 사용하여 어댑터를 부착시키는 것은 장시간이 소요되고, 고가이며, 비효율적인 단계이다. 또한, 어댑터 결찰에 보편적으로 사용되는 RNA 리가제는 결찰되는 말단에 대한 뚜렷한 뉴클레오티드 선호도를 가지는데, 이로 인해 구성되는 라이브러리에서 cDNA는 편향되어 출현하게 된다(문헌 [Linsen et al. 2009]; [Levin et al. 2010]).
RT를 코딩하는 유전 요소인 레트로엘리먼트(retroelement)는 LTR 함유 레트로엘리먼트 및 비LTR 함유 레트로엘리먼트로 언급되는 2가지 주요 패밀리로 나뉜다(문헌 [Xiong and Eickbush 1990]). 그의 RT가 생명 공학에서 보편적으로 사용되는 것인 레트로바이러스는 잘 알려져 있는 LTR 함유 레트로엘리먼트의 일례이다. 비LTR 레트로엘리먼트는 레트로플라스미드, 비LTR 레트로트랜스포존, 레트론, 및 이동 II군(group II) 인트론을 포함하는 RT 코딩 요소로 이루어진 다양한 패밀리이다(문헌 [Xiong and Eickbush 1990]). 이동 II군 인트론은 함께 RNA 스플라이싱 및 인트론 이동을 촉진시키는 작용을 하는, 촉매 활성 인트론 RNA("리보자임") 및 인트론 코딩된 RT로 구성된다(문헌 [Lambowitz and Zimmerly 2010]). II군 인트론 RT는 전형적으로 4개의 보존 도메인: 레트로바이러스 RT의 핑거(finger) 및 팜(palm) 영역에서 발견되는 7개의 보존 서열 블록(RT1-7)을 함유하는 RT; 적어도 부분적으로 레트로바이러스 RT의 썸(thumb) 도메인에 상응하는 RNA 스플라이싱 활성에 필요한 영역인 X; DNA 표적 부위 인식에 관여하는 DNA 결합 도메인인 D; 및 DNA 표적 부위를 절단하여 역전사를 위한 프라이머를 생성하는 DNA 엔도뉴클레아제 도메인인 En으로 구성된다(문헌 [Blocker et al. 2005]; [Lambowitz and Zimmerly 2010]). 일부 II군 인트론 RT에는 En 도메인이 결실되어 있으며, 역전사를 프라이밍시키기 위해서는 DNA 복제 분기점에 있는 초기 가닥을 대신 사용한다(문헌 [Zhong and Lambowitz 2003]; [Lambowitz and Zimmerly 2010]). N 말단 연장, 추가의 N 말단 보존 서열 블록(RT-0), 및 RT 및 X/썸 도메인 중의 보존 서열 블록 사이에의 삽입에 기인하여 II군 인트론 RT의 RT 및 X/썸 도메인은 레트로바이러스 RT의 것보다 더 크다(문헌 [Lambowitz and Zimmerly 2010]). RT-0 및 RT 도메인 중의 보존 서열 블록 사이의 삽입부 중 일부는 또한 다른 비LTR 레트로엘리먼트 RT에서도 발견된다(문헌 [Blocker et al. 2005]). 레트로바이러스 RT와 달리, II군 인트론 및 비LTR 레트로엘리먼트 RT에는 RN아제 H 도메인이 존재하지 않는다.
레트로플라스미드 및 비LTR 레트로트랜스포존에 의해 코딩되는 RT는 초기 RNA 주형을, 초기 주형으로부터 합성된 cDNA의 3' 말단에 대해 거의 상보적이지 않거나, 또는 전혀 상보적이지 않은 새로운 RNA 주형의 3' 말단으로 직접 주형 스위칭할 수 있다는 점에서 레트로바이러스 RT와 다른 것으로 나타났다(문헌 [Chen and Lambowitz 1997]; [Bibillo and Eickbush 2002, 2004]; [Kennell et al. 1994]).
본 발명의 요약
본원에 개시되어 있는 바와 같이, 특정 부류의 레트로엘리먼트, 특히, 이동 II군 인트론에 의해 코딩되는 역전사 효소(RT)가 어댑터 결찰과 관련된 어려움에 대한 해결안을 제공하고, 더욱 일반적으로는 RNA 및 DNA 서열의 검출, PCR 증폭, 및 클로닝을 용이하게 수행될 수 있도록 하는 신규한 방법을 제공한다. 본 발명자들은 비레트로바이러스 RT가 상보성은 거의 없거나, 또는 전혀 없이, 초기 주형으로부터 합성된 cDNA와, 새로운 RNA 또는 DNA 주형의 3' 말단 사이의 주형 스위칭할 수 있고, 이러한 반응을 사용하여 결찰없이도 어댑터 서열을 표적 RNA 또는 DNA 서열에 직접 연결시키는 연속 cDNA를 합성할 수 있을 것이라는 가설을 세웠다. 이어서, 복합 cDNA를 cDNA의 3' 말단에서 제2 어댑터 분자에 결찰시킬 수 있거나, 또는 예를 들어, 단일 가닥 DNA을 효율적으로 폐환화시키는 효소인 Circ리가제(문헌 [Polidoros et al. 2006])에 의해 폐환화시킴으로써 제1 어댑터의 다른 부분에 어닐링된 양방향 프라이머로 PCR 증폭이 이루어질 수 있도록 할 수 있다. 일부 적용의 경우, 차세대/딥(deep) 서열 분석을 위해 상기와 같은 프라이머에 바코드를 첨가할 수 있다.
하나 이상의 어댑터 서열, 및/또는 cDNA의 3' 말단에 부가되는 비주형 뉴클레오티드 잔기로부터의 주형 스위칭에 의해 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 또는 관심의 대상이 되는 서열을 함유하는 가닥을 연결하는, cDNA를 합성하기 위한 비레트로바이러스 역전사 효소(RT)의 용도를 기술한다. 하나 이상의 어댑터 서열, 및/또는 cDNA의 3' 말단에 부가되는 비주형 뉴클레오티드 잔기로부터의 주형 스위칭에 의해 어댑터 서열은 PCR 프라이머 결합 부위를 함유할 수 있는데, 그가 부착되면, 후속되는 RNA 또는 DNA 분자의 검출, PCR 증폭, cDNA 라이브러리 구성, 및 서열 분석은 용이하게 수행된다. 어댑터 서열은 또한 예컨대, 후속되는 cDNA의 정제를 위한 친화성 태그 서열과 같은 다른 유용한 서열도 함유할 수 있다. cDNA의 3' 말단에 비주형 뉴클레오티드를 부가하면, 예를 들어, 비주형 뉴클레오티드 부가에 의해 부가된 것에 상보적인 뉴클레오티드 잔기를 함유하는 PCR 프라이머의 어닐링이 일어나도록 하거나, 또는 cDNA가 비주형 뉴클레오티드 부가에 의해 부가된 것에 상보적인 뉴클레오티드 잔기를 함유하는 벡터로 클로닝될 수 있도록 함으로써 그의 후속되는 증폭 및 클로닝은 용이하에 이루어질 수 있다. 역전사 효소에 의해 특이적인 3' 말단 뉴클레오티드 잔기를 가지는 표적 폴리뉴클레오티드 서열로의 주형 스위칭을 지시하는 방법, 및 상이한 3' 말단 뉴클레오티드 잔기를 가지는 폴리뉴클레오티드 가닥들 중에서 역전사 효소에 의한 주형 스위칭의 편향성을 최소화시키는 방법 또한 기술한다. 본 개시내용은 또한 역전사 효소에 의한 RNA에서 DNA 주형으로의, 또는 DNA 주형 간의 주형 스위칭에 의해 상이한 DNA 및 RNA 서열을 연결시키는, 역전사 효소에 의한 주형 스위칭 방법을 제공한다. 예를 들어, DNA 주형 간에 주형 점핑할 수 있는 역전사 효소의 능력은 제2 가닥 합성을 위해, 또는 단일 가닥 게놈 DNA로부터 DNA 라이브러리를 제조하기 위해서 어댑터를 단일 가닥 DNA에 부착시키는 데 사용될 수 있다. 검출, PCR 증폭, 클로닝, 및 서열 분석이 용이하게 이루어지도록 하기 위해 RT에 의해 합성되지 않은 다른 DNA에 비주형 뉴클레오티드 잔기를 부가하기 위해서 비레트로바이러스 RT를 사용하는 방법 또한 기술한다. 본 개시내용은 또한 예컨대, 모세관 전기영동, RNA 구조 지도화, 및 RNA 풋프린팅에 의해 정확한 cDNA 길이를 측정하고자 하는 경우와 같이, 상기와 같은 비주형 뉴클레오티드 부가가 유해할 수 있는 경우의 적용을 위해서는 비레트로바이러스 RT에 의한 비주형 뉴클레오티드 부가를 감소시키는 방법을 제공한다.
청구되는 바와 같이, 상기의 일반적인 설명 및 하기의 상세한 설명, 두가지 모두 단지 예시적인 것이고, 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것이 아님을 이해하여야 한다.
도 1. TeI4c-MRF 및 수퍼스크립트(Superscript) III RT의 주형 스위칭 활성 비교. 5' 32P 표지된 프라이머 Pc를 포함하는 IA-P1 RNA/Pc DNA 주형/프라이머 기질(50 nM)을 등몰 농도의 miRNAx와 혼합하고, TeI4c-MRF RT(2 μM) 또는 수퍼스크립트 III(SSIII) RT(10 유니트/㎕)로 역전사시켰다. 각 효소에 대해 최적인 조건하에서 반응을 수행하였다(TeI4c-MRF RT의 경우, 75 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 및 1 mM dNTP, 60℃에서, 및 수퍼스크립트 III RT의 경우, 75 mM KCl, 10 mM MgCl2, 40 mM 트리스 HCl(pH 8.3), 및 1 mM dNTP, 50℃에서). RT를 첨가하여 반응을 개시시키고, 30 min 동안 인큐베이션시키고, EDTA/SDS(0.125 M, 0.05% 최종)를 첨가하여 종결시킨 후, 페놀 클로로포름-이소아밀 알콜(25:24:1; 페놀 CIA)로 추출하였다. 변성 20% 폴리아크릴아미드 겔 중에서 생성물을 분석하였는데, 상기 겔은 포스포르이미저(PhosphorImager)™로 스캐닝하였다. -RT 대조군 레인은 TeI4c-MRF RT 반응 조건하에서 RT없이 인큐베이션된 IA-P1 RNA/Pc DNA 주형/프라이머 기질을 나타낸다. M인 32P 표지된 10 bp 래더(인비트로겐(Invitrogen)™)가 크기 마커로서 사용되었다. AmMO는 IA-P1 RNA의 3' 말단의 아미노개질제를 나타내는 것이고, *는 프라이머의 5' 말단의 32P 표지를 나타내는 것이고, N'은 주형 스위칭 동안 편향성을 평가하기 위해서 후기 실험에서 사용되는 miRNAx 올리고뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단, 둘 모두에의 두 무작위화된 뉴클레오티드 잔기를 나타내는 것이다.
도 2. II군 인트론 RT에 의한 주형 스위칭 및 Circ리가제에 의한 폐환화를 통한 cDNA 클로닝 방법. 제1 단계에서, II군 인트론 RT에 의해 IA-P1 RNA/Pc DNA 주형/프라이머로부터 miRNAx로 주형 스위칭하여 IA-P1 어댑터 서열을 miRNAx의 것에 연결하는 연속 cDNA를 생성한다. 생성물을 RN아제 H와 인큐베이션시켜 RNA 주형을 분해하고, 겔 정제시키고, Circ리가제 I 또는 II에 의해 폐환화시킨다. 도입되지 않은 프라이머를 엑소뉴클레아제 I로 분해한 후, 프라이머 내로 도입된 데옥시우리딘(Pc DNA 프라이머 서열 중 밑줄 표시된 U)에서 cDNA 생성물을 우라실-DNA 절제 믹스(UDE: uracil-DNA excision mix; 에피센터(Epicentre)®)로 다시 선형화시킨 후, 추가의 어댑터 서열과 차세대 서열 분석을 위한 바코드를 도입한 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시킨다. IA-P1 RNA/Pc DNA 주형-프라이머 기질 및 SOLiD 서열 분석을 위한 PCR 프라이머의 서열(출현 순서대로 각각 서열 번호 5, 24 및 8-10)은 하단에 제시되어 있다. IA-P1 RNA는 상기 RNA 말단에의 주형 스위칭을 방해하기 위해 3' 아미노개질제(AmMO로 표시)를 가진다. X'는 바코드(BC) 뉴클레오티드 잔기를 나타내고, *는 프라이머의 5' 말단의 32P 표지를 나타내는 것이다.
도 3. 2개의 5'- 및 2개의 3'-뉴클레오티드 잔기를 무작위화시킨, miRNA(서열 번호 26)에 상응하는 cDNA(서열 번호 28)의 클로닝 및 서열 분석. 도 1의 TeI4c-MRF RT 효소에 대한 반응 조건하에서 15 min 동안 IA-P1 RNA/Pc DNA 주형/프라이머 기질(서열 번호 27로서 개시된 "IA-P1 RNA" 서열)에서 miRNAx로의 TeI4c-MRF RT에 의한 주형 스위칭을 통해 cDNA를 합성하고, 겔 정제하고, Circ리가제에 의해 폐환화시키고, SOLiD 5' 및 3' 프라이머와 함께 플래쉬 퓨전(Flash Phusion)® 폴리머라제를 사용하여 PCR 증폭시키고, PCR2.1 TOPO(인비트로겐™)로 TA 클로닝하고, M13(-20)F 프라이머로 생어 서열 분석을 수행하였다. miRNA의 5' 및 3' 말단의 무작위화된 뉴클레오티드의 위치는 각각 밑줄체로 표시, 및 회색 음영으로 강조하여 표시되어 있다. 생성물 서열(출현 순서대로 각각 서열 번호 29-53)에서, 돌연변이체 뉴클레오티드 잔기는 소문자로 표시되어 있고, 비주형 뉴클레오티드 잔기는 굵은체 소문자로 표시되어 있다. 생성물 서열에서 N은 서열 중 분명하게 확인할 수 없는 뉴클레오티드를 나타내는 것이다.
도 4. Ll.LtrB 인트론 RNA의 5' 말단에 상응하는 RNA 주형/DNA 프라이머 기질을 사용한 비주형 뉴클레오티드 부가 및 Ll.LtrB II군 인트론 RT에 의한 주형 스위칭. (A) 겔 검정법. Ll.LtrB 인트론 RT(LtrA 단백질; 40 nM)를 30℃에서 30 min 동안 200 μM dNTPs, 450 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 및 1 mM 디티오트레이톨(DTT)을 함유하는 반응 배지 중에서 겔의 우측에 도해되어 있는 소형 인공 기질과 함께 인큐베이션시켰다. 인공 기질은 단독으로 44 nM의 5' 32P 표지된 DNA 프라이머 c(Pri c; 45 nt)이거나, 또는 40 nM 엑손 1(E1; 40 nt) DNA 또는 RNA와 함께 40 nM Ll.LtrB RNA(60 nt)에 어닐링시켰다. 인큐베이션시킨 후, 페놀 CIA 추출에 의해 반응을 종결시키고, 변성 15% 폴리아크릴아미드 겔 중에서 생성물을 분석하였는데, 상기 겔은 포스포르이미저™로 스캐닝하였다. 레인(1) 및 (2)는 32P 표지된 Pri c를 각각 LtrA없이, 및 LtrA와 함께 인큐베이션시킨 것이고; (3) 및 (4)는 LtrA를 각각 32P 표지된 Pri c 및 E1 DNA 또는 RNA와 함께 인큐베이션시킨 것이고; (5) 및 (6)은 LtrA를 각각 Ll.LtrB RNA/32P 표지된 Pri c 주형/프라이머 기질 및 E1 DNA 또는 RNA와 함께 인큐베이션시킨 것이다. 본 개략도에서, Ll.LtrB RT는 회색 타원으로 표시되어 있고, DNA 합성 방향은 회색 타원 안의 점선 화살표로 표시되어 있다. DNA 서열 분석을 위해 절제된 밴드(a-n)는 겔에 표시되어 있다. 겔 우측의 수치는 5' 32P 표지된 10 bp 래더(인비트로겐™)의 뉴클레오티드 위치를 나타내는 것이다. (B) 및 (C) DNA 생성물의 서열. 도 4B에는 출현 순서대로 각각 서열 번호 54-61, 61, 61, 1, 61-62, 62-63, 61 및 25가 개시되어 있다. 레인 5 및 6에 나타난 겔 밴드로부터 수득된 생성물은 각각 Ll.LtrB RNA 주형/DNA 프라이머 c 기질 중 Ll.LtrB RNA의 5' 말단에의 프라이머 c 연장, 및 이어서, 엑손 1 DNA 또는 RNA로의 주형 스위칭으로부터 생성된 생성물이다. DNA 생성물 서열 중 돌연변이체 뉴클레오티드 잔기는 소문자로 표시되어 있고, 주형 스위칭 연접부 또는 cDNA의 3' 말단에 삽입된 추가의 뉴클레오티드 잔기는 굵은체 소문자로 표시되어 있다. 도면에 제시되어 있지 않은 DNA 생성물 서열 중 일부는 엑손 1 DNA 생성물의 경우, 1개의 G → A 전이, 및 엑손 1 RNA 생성물의 경우, 2개의 A → G 전이를 포함하였다. 우측에 기재된 수치는 각 서열의 빈도수를 나타낸 것이다. *는 프라이머의 5' 말단의 32P 표지를 나타내는 것이다.
도 5. 3' Ll.LtrB 인트론-엑손 2 통합 연접부에 상응하는 RNA 주형/DNA 프라이머 기질을 사용한 비주형 뉴클레오티드 부가 및 Ll.LtrB II군 인트론 RT에 의한 주형 스위칭. (A) 겔 검정법. Ll.LtrB RT(LtrA 단백질; 40 nM)를 30℃에서 30 min 동안 200 μM dNTPs, 450 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 1 mM 디티오트레이톨을 함유하는 반응 배지 중에서 겔의 우측에 도해되어 있는 소형 인공 기질과 함께 인큐베이션시켰다. 인공 기질은 단독으로 44 nM의 5' 32P 표지된 프라이머 e2(Pri e2; 70 nt)이거나, 또는 40 nM E2 RNA 또는 DNA(40 nt)에 어닐링시켰다. 페놀 CIA 추출에 의해 반응을 종결시키고, 변성 10% 폴리아크릴아미드 겔 중에서 생성물을 분석하였는데, 상기 겔은 포스포르이미저™로 스캐닝하였다. 레인(1) 및 (2)는 32P 표지된 Pri e2 DNA를 각각 LtrA없이, 및 LtrA와 함께 인큐베이션시킨 것이고; (3) 및 (4)는 LtrA를 각각 어닐링된 32P 표지된 Pri e2와 같이 E2 DNA 또는 RNA 주형과 함께 인큐베이션시킨 것이다. 본 개략도에서, Ll.LtrB RT는 회색 타원으로 표시되어 있고, DNA 합성 방향은 점선 화살표로 표시되어 있다. IS는 인트론 삽입 부위를 나타낸다. 겔 우측의 수치는 5' 32P 표지된 10 bp 래더(인비트로겐™)의 위치를 나타내는 것이다. (B) cDNA 생성물의 서열. 도 5B에는 출현 순서대로 각각 서열 번호 75-76, 76-92, 87-88 및 93-116이 개시되어 있다. 겔(a-d)에 나타난 밴드를 절제하고, 클로닝하고, 서열 분석하였다. 주형 및 예상 DNA 생성물 서열(박스 표시)은 각각의 실험으로 결정된 DNA 생성물 서열 세트 위에 제시되어 있다. DNA 생성물 서열 중 돌연변이체 뉴클레오티드 잔기는 소문자로 표시되어 있고, 주형 스위칭 연접부 또는 cDNA의 3' 말단에 삽입된 추가의 뉴클레오티드 잔기는 굵은체 소문자로 표시되어 있다. 우측에 기재된 수치는 각 서열의 빈도수를 나타낸 것이다. *는 프라이머의 5' 말단의 32P 표지를 나타내는 것이다.
도 6. 평활 말단(blunt end) RNA 주형/DNA 프라이머 기질에의 비주형 뉴클레오티드 부가에 대한 검정법. RNA 주형/DNA 프라이머 기질은 RNA 주형(40 nt RNA 주형
Figure pct00001
(서열 번호 1); 20 nt DNA 프라이머
Figure pct00002
(서열 번호 2))의 5' 말단으로 완전하게 연장된 cDNA를 모방하는 평활 말단을 가진다. TeI4c-MRF RT(2 μM)를 60℃에서 10 min 동안, 각 레인에 표시되어 있는 바와 같이, 450 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5) 또는 75 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5) 및 1 또는 100 μM dATP, dCTP, dGTP, 또는 dTTP(겔에서 좌측 방향으로), 또는 1 μM 또는 1 mM의 4가지 dNTPs 모두 및 3 mM ATP(겔에서 우측 방향으로)를 함유하는 반응 배지 중에서 RNA 주형/DNA 프라이머 기질(100 nM)과 함께 인큐베이션시켰다. 125 mM EDTA 및 0.05% SDS를 첨가한 후, 이어서, 페놀 CIA 추출을 수행하여 반응을 종결시킨 후, 변성 25% 폴리아크릴아미드 겔 중에서 생성물을 분석하였는데, 상기 겔은 포스포르이미저™로 스캐닝하였다. 10 bp 래더 마커(인비트로겐™)의 위치는 겔 우측에 표시되어 있다. *는 프라이머의 5' 말단의 32P 표지를 나타내는 것이다.
도 7. 비주형 뉴클레오티드 부가를 감소시키는 반응 조건하에서 II군 인트론 RT에 의한 주형 스위칭을 통해 miRNAx로부터 합성된 cDNA의 차세대 SOLiD 서열 분석. 5' 및 3' 말단에 무작위화된 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 miRNAx 주형(서열 번호 7)에 상응하는 cDNA(서열 번호 28)의 합성 및 클로닝은 도 3에서와 같이 수행하였는데, 단, 예외적으로, miRNAx 올리고뉴클레오티드는 수동 혼합된 뉴클레오티드를 이용하여 합성함으로써 무작위화된 위치에서 더욱 균등한 비로 뉴클레오티드 잔기를 수득하였고, 60℃에서 10 min 동안 1 mM dNTP를 이용하여 450 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5) 중에서 역전사 반응을 수행하였다. 도 2에 기술되어 있는 바와 같이, Circ리가제 II를 사용하여 Circ리가제 방법을 통해 cDNA를 클로닝하고, SOLiD 서열 분석에 의해 분석하였다. 제시된 SOLiD 서열(출현 순서대로 각각 서열 번호 117-136)은 2,239,072개의 고품질 리드(reads) 중 빈도수가 가장 큰 20개의 리드이며, 여기서, 우측에 기재된 수치는 해당 서열에 대한 리드의 개수를 나타내는 것이다. 모든 서열은 IA-P1 RNA/Pc DNA 주형-프라이머 기질(서열 번호 27로서 개시된 "IA-P1 RNA" 서열)에서 miRNAx로의 단일 주형 스위치로부터 생성된 분자에 상응한다. 무작위화된 뉴클레오티드 위치는 밑줄체로 음영 표시되어 있고; 돌연변이체 뉴클레오티드 잔기는 소문자로 제시되어 있으며, 비주형 뉴클레오티드 잔기는 굵은체 소문자로 표시되어 있다. 생어 서열 분석에서 유사한 결과를 얻었다(나타내지 않음).
도 8. 상이한 말단 염기쌍을 가지는 평활 말단 RNA 주형/DNA 프라이머 기질로부터의 주형 스위칭. 5' RNA/3' DNA 말단에 각각의 4가지 가능한 염기쌍을 가지는 32P 표지된 평활 말단 RNA 주형/DNA 프라이머 기질(상보적인 42 nt DNA에 어닐링된 42 nt IA/Pl RNA 주형)을 사용하여 miRNAx로의 주형 스위치를 수행하였으며, 여기서, 그의 3' 말단 뉴클레오티드 잔기는 A, C, G, 또는 U였다. 60℃에서 15 min 동안 1 mM dNTPs를 이용하여 450 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5) 중에서 역전사 반응을 수행하였다. RT를 첨가하여 반응을 개시시키고, 125 mM EDTA 및 0.05% SDS를 첨가하여 종결시켰다. 변성 20% 폴리아크릴아미드 겔 중에서 생성물을 분석하였는데, 상기 겔은 포스포르이미저™로 스캐닝하였다. M인 32P 표지된 10 bp 래더(인비트로겐™)가 크기 마커로서 사용되었다. *는 프라이머의 5' 말단의 32P 표지를 나타내는 것이다. 각 겔 레인에서 방사능량에 대해 정규화된 주형 스위칭 생성물 밴드의 방사능 정량화에 기초하면, 5'G RNA/3'C DNA 기질로부터 상이한 3' 말단 뉴클레오티드 잔기를 가지는 RNA로의 주형 스위칭 비율(%)은 A의 경우, 16%; C의 경우, 15%; G의 경우, 19%, 및 U의 경우, 50%였다. 다른 나머지 3가지의 평활 말단 기질은 3' C 잔기를 가지는 RNA로의 주형 스위치를 선호하는 것으로 나타났다.
도 9. 3' 오버행 기질로부터의 II군 인트론 TeI4c-MRF RT의 주형 스위칭. (A) 상이한 단일 뉴클레오티드 V 오버행(A, C, G, T, 또는 4가지 뉴클레오티드 모두의 등몰의 혼합물(N))을 가지는 초기 32P 표지된 RNA 주형/DNA 프라이머 기질(IA-P1 RNA/Pc 3' 오버행 DNA)의 상이한 3' 뉴클레오티드 잔기(A, C, G, 또는 U)를 가지는 표적 miRNAx(서열 번호 137)로의 주형 스위칭 반응을 수행하였다. 반응은 60℃에서 10 min 동안, RT에 의한 비주형 뉴클레오티드 부가를 감소시키는 고염 반응 배지(450 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 1 mM DTT, 1 mM dNTPs) 중에서 2 μM TeI4c-MRF RT을 이용하여 수행하였다. 변성 20% 폴리아크릴아미드 겔 중에서 생성물을 분석하였는데, 상기 겔은 포스포르이미저™로 스캐닝하였다. 겔 좌측의 수치는 표지된 크기 마커(10 bp 래더)의 위치를 나타내는 것이다. *는 프라이머의 5' 말단의 32P 표지를 나타내는 것이다. (B) T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 이용한 탈인산화 전후(각각 P 및 DP)의, 등몰의 단일 뉴클레오티드 3' 오버행을 가지는 IA-P1 RNA/Pc DNA로부터 3' 인산화된 C 잔기를 가지는 miRNAx로의, 또는 동일한 서열로 이루어진 DNA 올리고뉴클레오티드(miDNAx)로의 주형 스위칭.
도 10. 3' 오버행 기질로부터의 II군 인트론 RT GsI-IIC-MRF의 주형 스위칭. 등몰의 A, C, G, 또는 T 단일 뉴클레오티드 3' 오버행을 가지는 IA-P1 RNA/Pc DNA로부터 3' 인산화된 C 잔기를 가지거나(P), 3' 인산화된 C 잔기를 포함하지 않는 miRNAx(서열 번호 137), 또는 동일한 서열로 이루어진 DNA 올리고뉴클레오티드(miDNAx)로의 주형 스위칭. 반응은 60℃에서 10 min 동안 고염 반응 배지(450 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 1 mM DTT, 1 mM dNTPs) 중에서 2 μM GsI-IIc-MRF를 이용하여 수행하였다. 변성 20% 폴리아크릴아미드 겔 중에서 생성물을 분석하였는데, 상기 겔은 포스포르이미저™로 스캐닝하였다. 겔 좌측의 수치는 표지된 크기 마커(10 bp 래더)의 위치를 나타내는 것이다. *는 프라이머의 5' 말단의 32P 표지를 나타내는 것이다.
도 11. RNA/DNA 또는 DNA/DNA 주형 프라이머로부터의 TeI4c-MRF RT의 주형 스위칭. 등몰의, IA-P1 RNA 또는 DNA에 어닐링된 A, C, G, 또는 T 단일 뉴클레오티드 3' 오버행의 혼합물을 포함하는 32P 표지된 DNA 프라이머 기질(IA-P1 RNA/Pc 3' 오버행 DNA)을 이용하여 주형 스위칭 반응을 수행하였다. 반응은 60℃에서 10 min 동안 고염 반응 배지(450 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 1 mM DTT, 1 mM dNTPs) 중에서 2 μM TeI4c-MRF RT를 이용하여 수행하였다. 변성 20% 폴리아크릴아미드 겔 중에서 생성물을 분석하였는데, 상기 겔은 포스포르이미저™로 스캐닝하였다. *는 프라이머의 5' 말단의 32P 표지를 나타내는 것이다. 화살표는 주형 스위칭 생성물을 나타내는 것이다. 도 11은 서열 번호 137로서 "miRNAx" 서열을 개시한다.
도 12. II군 인트론 RT에 의한 주형 스위칭을 사용한 miRNA의 클로닝 및 서열 분석. 초기 IA-P1 RNA 주형/Pc DNA 프라이머 기질(100 nM)로부터 miRNA 참조 세트(963개의 동몰의 miRNA, 110 nM; 밀테니이(Miltenyi) miRXplore)로의 주형 스위칭 반응을 TeI4c-MRF RT(2 μM)를 이용하여 수행하였다. 초기 IA-P1 RNA 주형/Pc DNA 프라이머 기질은, 3' U 또는 G 잔기를 가지는 miRNA의 출현을 조정하기 위해 등몰비로(TS1), 또는 2:0.5:1:1(TS2)로 혼합된 단일 A, C, G, 또는 T 3' 오버행을 가졌다(도 9 참조). 도 9에서와 같이 반응을 수행하였고, 도 2에 기술되어 있는 바와 같이 cDNA를 클로닝하였다. 토탈 RNA-Seq(Total RNA-Seq) 키트(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)™; ABI) 또는 소형 RNA 샘플 프렙 세트 3(small RNA sample prep set 3) 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs)®; NEB)를 이용하여 동일한 분취량의 miRNA로부터 병렬 RNA-seq 라이브러리를 제조하였다. 상기 키트는 SOLiD 서열 분석을 위해 어댑터를 miRNA 3' 및 5' 말단에 동시에(ABI) 또는 순차적으로(NEB) 결찰시키고, 3' 어댑터에 상보적인 DNA 프라이머를 이용하여 어레이스크립트(ArrayScript) 또는 수퍼스크립트 II로 역전사한다. (A)는 최소 존재비에서부터 최대 존재비까지로 등급화하고, 중앙값으로 정규화하고, 로그2로 변환시키고, 라이브러리 제조 방법에 의해 도입된 변량 비교를 위해 플롯팅한, 독특하게 식별가능한 핵심 서열을 포함하는 898개의 miRNA의 서브세트에 대한 계수를 보여주는 플롯을 나타낸 것이다. (B) 및 (C)는 상이한 RNA-seq 라이브러리에서 상이한 RNA-seq 라이브러리에서 과소출현한 miRNA와, 과다출현한 miRNA 사이의 중복을 보여주는 벤다이어그램을 나타낸 것이다. R을 사용하여 각 라이브러리에서 최소 존재비 및 최대 존재비가 5%인 miRNA를 확인하고, 벤다이어그램 R 패키지(VennDiagram R package)를 사용하여 플롯팅하였다(문헌 [Chen & Boutros 2011]).
도 13. II군 인트론 RT에 의한 주형 스위칭 및 2개의 시판용 키트에 의해 제조된 RNA-seq 라이브러리에서의 miRNA 3' 말단 뉴클레오티드 잔기의 출현. RNA-seq 라이브러리를 TeI4c-MRF RT; 토탈 RNA-Seq 키트(어플라이드 바이오시스템즈™); 또는 소형 RNA 샘플 프렙 세트 3(뉴 잉글랜드 바이오랩스®)을 이용하여 주형 스위칭하여 제조하였다. TeI4c-MRF RT를 이용하는 주형 스위칭 반응은 3' U 또는 G 잔기를 가지는 miRNA의 출현을 조정하기 위해 등몰비로(TS1), 또는 2:0.5:1:1(TS2)로 혼합된 단일 A, C, G, 또는 T 3' 오버행을 가지는 IA-P1 RNA/Pc DNA 주형/프라이머 기질을 사용하여 수행하였다. 막대 그래프는 miRXplore 참조 세트 중 말단이 각각의 4가지 염기인 miRNA의 비율(%)(검은색)을 RNA-seq 라이브러리 중의 miRNA의 3' 말단의 상기 염기의 비율(%)(TeI4c-MRF/TS1, 도트 표시; TeI4c-MRF/TS2, 짙은 회색; ABI 토탈 RNA Seq, 빗금 표시; NEB 소형 RNA 샘플 프렙, 옅은 회색)을 비교하는 것이다. 패널 A에서, RNA-seq 라이브러리 중의 miRNA의 3' 뉴클레오티드 잔기는 내부 어댑터 이전의 염기인 것으로 확인되었다. 프라이머 이량체, 오직 어댑터인 것, 및 저품질 서열을 피하기 위해, 각 시료 중의 말단 염기를 측정할 때에는 각 서열의 출발점으로부터 15 bp 이상 떨어져 있는 내부 어댑터의 8개의 염기와 완벽하게 매칭되도록 하였다. 패널 B에서, RNA-seq 라이브러리에서 miRNA의 3' 뉴클레오티드 잔기는 독특한 핵심 서열을 포함하는 898개의 miRNA로 이루어진 세트에 대한 3' 뉴클레오티드 잔기의 존재비가 조정된 분포로부터 추론하였다(도 12 참조). miRNA의 3' 말단을 확인하는 두 방법 모두에서 유사한 경향이 관찰된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 숙련가가 보편적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원 본 발명의 상세한 설명에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
정의
본 발명의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바, 단수 형태의 "하나"("a," "an") 및 "그"라는 것은 문맥상 분명하게 달리 명시되지 않는 한, 복수 형태도 포함하는 것으로 한다. 추가로, 종점에 의해 수치 범위를 열거한 것은그 범위 내에 포함된 모든 수치를 포함한다(예컨대, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함한다).
본원에서 사용되는 바, "단리된" 폴리뉴클레오티드란 그의 천연 환경으로부터 제거되었거나, 재조합 기법을 사용하여 제조되었거나, 또는 화학적으로 또는 효소적으로 합성된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 또한 정제될 수 있으며, 즉, 임의의 다른 폴리뉴클레오티드 및 회합되어 있는 세포 생성물 또는 다른 불순물을 함유하지 않을 수 있다.
뉴클레오티드(nt)는 포스포에스테르 결합에 의해 펜토스(RNA에서는 리보스, 및 DNA에서는 데옥시리보스)에 연결되어 있고, 결과적으로 유기 염기에 연결되어 있는 포스페이트 기로 구성된다. 핵산의 단량체 단위는 뉴클레오티드이다. 천연적으로 발생된 DNA 및 RNA는 각각 4가지 상이한 뉴클레오티드를 함유하며: 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티미딘 염기를 가지는 뉴클레오티드는 천연적으로 발생된 DNA에서 발견되고, 아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실 염기를 가지는 뉴클레오티드는 천연적으로 발생된 RNA에서 발견된다. 염기인 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 및 우라실은 보통 각각 A, G, C, T 및 U로 약칭된다.
상보적인 뉴클레오티드는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드로 쉽게 염기쌍을 형성하는 것이다. 아데닌은 티미딘 또는 우라실과 상보적이고, 그 반대의 경우도 성립하고, 구아닌은 시토신과 상보적이고, 그 반대의 경우도 성립한다. 상보성이란 인접한 가닥에 있는 대향 뉴클레오티드가 상보적일 가능성을 의미하는 것으로 상보성이 높다는 것은 상보적인 뉴클레오티드의 개수가 많다는 것을 나타내고, 상보성이 낮다는 것은 상보적인 뉴클레오티드의 개수가 적다는 것을 의미한다.
뉴클레오티드는 유리 모노, 디 및 트리포스페이트 형태를 포함한다(즉, 포스페이트 기가 각각 1, 2, 또는 3개의 포스페이트 모이어티를 가진다). 따라서, 뉴클레오티드는 리보뉴클레오시드 트리포스페이트(예컨대, ATP, UTP, CTG 및 GTP) 및 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(예컨대, dATP, dCTP, dITP, dGTP 및 dTTP), 및 그의 유도체를 포함한다. 뉴클레오티드는 또한 디데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddrrP 및 ddTTP를 비롯한, ddNTPs), 및 그의 유도체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 폴리뉴클레오티드란 DNA 또는 RNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 복수 개의 뉴클레오티드를 포함하는 임의의 분자를 의미할 수 있다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 5개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 더욱 바람직하게는, 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 단일 가닥이라고 서술한 것 또한 상보적인 가닥의 서열을 정의한다. 따라서, 핵산은 또한 서술된 단일 가닥의 상보적인 가닥도 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 또는 이중 가닥 및 단일 가닥 서열 둘 모두의 일부를 함유할 수 있다. 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 서로 회합되어 있는 서열 및 그의 상보적인 서열이다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, 게놈 및 cDNA, 둘 모두, RNA, 또는 핵산이 데옥시리보뉴클레오티드와 리보뉴클레오티드의 조합을 함유할 수 있는 것인 하이브리드, 및 우라실, 아데닌, 티미딘, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴, 히포크산틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 비롯한 염기 조합일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 수득할 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 DNA 또는 RNA로 구성된 것으로서 정의된 경우, 이는 각각 DNA 가닥, 또는 RNA 가닥으로서 지칭될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 올리고뉴클레오티드란 본원에서 정의된 것과 같은 폴리뉴클레오티드를 의미하는데, 단, 예외적으로, 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 그 길이가 더 짧다. 올리고뉴클레오티드는 복수 개의 뉴클레오티드를 포함하고, 그러므로, 그의 최소 크기는 2개의 뉴클레오티드 크기이며, 일부 실시양태에서는 6개의 뉴클레오티드 크기이다. 그의 최대 크기와 관련하여, 올리고뉴클레오티드의 크기는 일반적으로 100개 이하의 뉴클레오티드 크기이고, 일부 실시양태에서는 70개 이하의 뉴클레오티드 크기로 제한된다.
본원에서 사용되는 바, "오버행 서열"이라는 용어는 이중 가닥 영역으로부터 연장되는 핵산의 단일 가닥 영역을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "프라이머"라는 용어는, 주형 올리고뉴클레오티드에 대해 연장될 수 있는 능력을 가지며, 이로써 모두가 뉴클레오티드의 존재하에 적합한 온도 및 pH에 배치되었을 때에 주형 분자의 적어도 일부의 서열에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드가 프라이머에 연결되는 것인, 상기와 같은 능력을 특징으로 하는, 정제된 제한 분해물과 같이 천연적으로 발생되거나, 또는 합성적으로 제조된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 그러나, 상기와 같은 방식으로 사용될 수 있는 단순한 능력을 위해서 프라이머가 주형에 대해 완전하게 연장될 필요는 없고, 일부 실시양태에서, 프라이머는 단지 소수의 비주형 뉴클레오티드 부가를 위한 부위로서만 사용된다. 프라이머, 예컨대, 길이가 6개 이상의 뉴클레오티드 길이인 프라이머 헥사머가 사용될 수 있다. 바람직한 프라이머의 길이는 약 6-100개 범위의 뉴클레오티드 길이거나, 일부 실시양태에서, 10 내지 70개의 뉴클레오티드 길이이다. 그러나, 일부 실시양태에서는 더 큰 프라이머가 사용될 수 있다. 이러한 더 큰 프라이머는 본원에서 정의된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드이다.
2개 이상의 올리고뉴클레오티드와 관련하여 "동일한" 또는 "동일성"이란 서열이 비교 영역에 걸쳐 명시된 백분율로 동일한 잔기를 가진다는 것을 의미할 수 있다. 상기 백분율은 두 서열을 최적으로 정렬하고, 명시된 영역에 걸쳐 두 서열을 비교하고, 두 서열 모두에 동일한 잔기가 존재하는 위치의 개수를 측정하여 매치되는 위치의 개수를 얻고, 상기 매치되는 위치의 개수를 비교 영역에 존재하는 총 위치 개수를 나누고, 결과 값에 100을 곱하여 서열 동일성(%)을 얻음으로써 계산할 수 있다. "실질적으로 유사한"이라는 것은 주어진 핵산 서열이 참조 서열과 85% 이상, 더욱 바람직하게는, 90% 이상, 및 더욱더 바람직하게는, 95% 이상의 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 두 서열의 길이가 다르거나, 또는 정렬로 인해 말단이 1번 이상 엇갈리게 되고, 명시된 비교 영역이 오직 단일의 서열만을 포함하게 되는 경우, 단일 서열 잔기를 계산시 분모에 포함시킬 수 있지만, 분자에는 포함시킬 수 없다. DNA 및 RNA를 비교할 때, 티미딘(T) 및 우라실(U)을 등가인 것으로 간주할 수 있다. 동일성 측정은 수동으로, 또는 컴퓨터 서열 알고리즘, 예컨대, BLAST 또는 BLAST 2.0을 사용하여 수행할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "중합효소 연쇄 반응"("PCR": polymerase chain reaction)이란 클로닝 또는 정제시키지 않고, DNA 서열의 혼합물 중 표적 서열의 세그먼트의 농도를 증가시키는 방법을 의미한다. 예를 들어, PCR에 대한 개요 및 그의 개발에 관해 제공하는 문헌 [Bartlett & Stirling (2003)]을 참조할 수 있다. 표적 서열을 증폭시키는 상기와 같은 공정은 전형적으로 과량의 두 올리고뉴클레오티드 프라이머를, 원하는 표적 서열을 함유하는 DNA 혼합물 내로 도입한 후, DNA 폴리머라제의 존재하에서 정확한 서열을 열 순환시키는 것으로 구성된다. 두 프라이머는 이중 가닥 표적 서열의 그의 각 가닥에 상보적이다. 표적 서열을 증폭시키기 위해, 혼합물을 변성시킨 후, 프라이머를 표적 분자 내의 그의 상보적인 서열을 어닐링시킨다. 어닐링 후, 프라이머는 폴리머라제에 의해 연장되고, 이로써 상보적인 가닥의 새로운 쌍이 형성된다. 변성 단계, 프라이머 어닐링 단계 및 폴리머라제 연장 단계를 수회 반복함으로써 원하는 표적 서열의 증폭된 세그먼트를 고농도로 수득할 수 있다. 달리 언급하지 않는 한, 본원에서 사용되는 바, PCR은 또한 PCR의 변형 방법, 예컨대, 대립 유전자 특이 PCR, 비대칭 PCR, 핫 스타트 PCR, 결찰 매개 PCR, 다중 PCR, 역전사 PCR, 또는 당업자에게 공지된 다른 PCR 변형 방법 중 임의의 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "주형 스위칭"이라는 용어는 초기 핵산 서열 주형으로부터, 초기 주형으로부터 합성된 cDNA의 3' 말단에 대해 거의 상보적이지 않거나, 또는 전혀 상보적이지 않은 새로운 RNA 주형의 3' 말단으로 스위칭시킬 수 있는 역전사 효소의 능력을 의미한다. 본원에서 주형 스위칭의 가장 핵심적인 예는 초기 핵산 서열 주형/프라이머 기질로부터, DNA 프라이머 가닥의 3' 말단에 대해 거의 상보적이지 않거나, 또는 전혀 상보적이지 않은 새로운 핵산 서열 주형의 3' 말단으로 스위칭시킬 수 있는 역전사 효소의 능력이다.
본 명세서에서 사용되는 바, 과도 단계에서든 또는 특허청구범위에서든 상관없이, "포함하다" 및 "~포함하는"이라는 용어는 개방형 의미를 가지는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 "~이상을 가지는" 또는 "~이상을 포함하는"이라는 것과 동의어로 해석되어야 한다. 상기 공정과 관련하여 사용될 때, "~포함하는"이라는 용어는 공정이 언급된 단계 이상을 포함하지만, 다수는 추가의 단계도 포함한다는 것을 의미한다. 화합물 또는 조성물과 관련하여 사용될 때, "~포함하는"이라는 용어는 화합물 또는 조성물이 언급된 특징 또는 성분 이상을 포함하지만, 추가의 특징 및 성분도 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
한 측면에서, 주형 스위칭를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 DNA 카피를 제조하는 방법을 제공한다. 초기 핵산 서열 주형으로부터, 초기 주형으로부터 합성된 DNA의 3' 말단에 대해 거의 상보적이지 않거나, 또는 전혀 상보적이지 않은 새로운 핵산 서열 주형의 3' 말단으로 스위칭시키는 역전사 효소를 사용함으로써 주형 스위칭를 통해 DNA 카피를 제조할 수 있고, 이로써 결찰없이도 어댑터 서열을 표적 올리고뉴클레오티드 서열에 직접 연결시키는 연속 생성물 DNA를 합성할 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드는 각종 상이한 핵산 서열일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 RNA(예컨대, miRNA)로 제조될 수 있거나, 표적 폴리뉴클레오티드는 DNA로 제조될 수 있다. 본원에 기술된 방법을 위해 폴리뉴클레오티드의 크기 및 서열에 있어서는 특별한 제한이 없지만, 표적 폴리뉴클레오티드의 크기가 10개 이상의 뉴클레오티드 크기인 것이 바람직하다.
표적 폴리뉴클레오티드의 DNA 카피를 제조하는 방법은 반응 배지 중에서 이중 가닥 주형/프라이머 기질를 표적 폴리뉴클레오티드와 혼합하는 단계를 포함한다. 이중 가닥 주형/프라이머 기질은 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥과 회합된 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 이중 가닥 주형/프라이머 기질은 전형적으로 올리고뉴클레오티드인 가닥을 포함하지만, 추가의 실시양태에서는 가닥 중 하나, 또는 양 가닥 모두가 본원에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드일 수 있다. DNA 프라이머 및 주형 가닥은 어댑터 서열을 포함할 수 있고, 이는 또한 표적 폴리뉴클레오티드에 유용한 기능을 제공하는 다른 서열도 포함할 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 표적 폴리뉴클레오티드의 검출, 확인, PCR 증폭, 및/또는 클로닝이 용이하게 이루어질 수 있도록 하는 서열을 포함할 수 있다. 프라이머 가닥은 또한 용이한 정제를 위한 친화성 태그 서열 또는 고체 표면에 프라이머를 연결시킬 수 있는 태그를 함유할 수 있다. 프라이머 및 상보적인 주형 올리고뉴클레오티드는 그가 카피되지 못하도록 하는 변형을 포함할 수 있다. 프라이머는 또한 헤어핀 구조를 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 유용한 프라이머 가닥의 예로는 일루미나® 소형 RNA 프라이머, 다중(Multiplex) 서열 분석 프라이머, 로슈(Roche)® 454 프라이머, 넥스테라(NexTera)™ 프라이머 및 관심의 대상이 된 서열을 강화시키기 위한 주문 디자인된 프라이머, 예컨대, 옵티머스(optimus) 프라이머를 포함한다.
DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드를 표적 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 것은 적합한 양의 비레트로바이러스(non-retroviral) 역전사 효소를 반응 배지에 첨가함으로써 개시된다. 적합한 양은 당업자에게 공지되어 있고, 이는 본원 실시예예서 제공된다. 이를 통해 역전사 효소는 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드를 그의 3' 말단으로부터 연장시켜 DNA 카피 가닥을 제조하고, 이는 주형으로서 표적 폴리뉴클레오티드를 사용하여 합성되는 상보적인 표적 DNA 폴리뉴클레오티드를 생성한다.
"역전사 효소"(즉, RNA 지정 DNA 폴리머라제)라는 용어는 역전사 효소 활성(즉, RNA 주형으로터의 DNA 합성을 촉매화시키는 활성)을 가지는 일군의 효소를 의미한다. 일반적으로, 상기와 같은 효소로는 레트로바이러스 역전사 효소, 레트로트랜스포존 역전사 효소, 레트로플라스미드 역전사 효소, 레트론 역전사 효소, 박테리아 역전사 효소, II군 인트론 유래 역전사 효소, 및 그의 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비레트로바이러스 역전사 효소로는 비LTR 레트로트랜스포존 역전사 효소, 레트로플라스미드 역전사 효소, 레트론 역전사 효소, 및 II군 인트론 역전사 효소를 포함한다. II군 인트론 역전사 효소의 예로는 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) Ll.LtrB 인트론 역전사 효소, 써모시네코코쿠스 엘론가투스(Thermosynechococcus elongatus) TeI4c 인트론 역전사 효소, 또는 게오바실러스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus) GsI-IIC 인트론 역전사 효소를 포함한다. 추가의 박테리아 역전사 효소가 문헌 [Simon & Zimmerly (2008)], [Kojima and Kanehisa (2008)]에 기술되어 있으며, 상기 문헌에는 여러 부류의 비레트로바이러스 역전사 효소(즉, 특히, 레트론, II군 인트론, 및 다양성 발생 레트로엘리먼트)가 기재되어 있다. 역전사 효소는 주로 RNA를 cDNA로 전사시키는 데 사용되어 왔으며, 이 cDNA는 이어서 추가 조작을 위해 벡터로 클로닝될 수 있거나, 또는 다양한 증폭 방법, 예컨대, 중합효소 연쇄 반응, 핵산 서열 기반 증폭(NASBA: nucleic acid sequence-based amplification), 전사 매개 증폭(TMA: transcription mediated amplification), 자가 유지 서열 복제(3SR: self-sustained sequence replication), 다양한 프라이머 연장 반응, 5'RACE, 화학 변형 검출 또는 RNA 주형을 사용한 DNA 합성을 필요로 하는 다른 기법에서 사용될 수 있다.
그의 일반적으로 발현된 형태 이외에도, 역전사 효소의 기능성 단편 또한 사용될 수 있다. 역전사 효소의 기능성 도메인은 당업자에게 주지되어 있으며, 역전사 효소의 구조를 포함하지 않는 기능성 단편이 제조될 수 있다. 예를 들어, 공지된 역전사 효소를 코딩하는 유전자의 서브클론은 예컨대, 문헌 [Sambrook et al. (1989)], 및 [Ausubel et al. (1999)] 및 그 이전 판에 기술되어 있는 바와 같이, 서브클로닝 유전자 단편을 위해 종래의 분자 유전자 조작을 사용함으로써 제조될 수 있다. 이어서, 서브클론을 시험관내 또는 생체내 박테리아 세포에서 발현시켜 소형의 단백질 또는 폴리펩티드를 수득할 수 있고, 이것이 역전사 효소의 기능성 단편인지 여부를 결정짓는 역전사 효소 활성에 대해 테스트할 수 있다.
일부 실시양태에서, 비레트로바이러스 역전사 효소는 II군 인트론 역전사 효소이다. 매우 다양한 II군 인트론 유래 역전사 효소가 공지되어 있다. 예를 들어, 105개의 전장의 II군 인트론 유래 역전사 효소가 기술되어 있는, 이동 II군 인트론에 대한 (Zimmerly Lab) 웹사이트를 참고할 수 있다. 상기 웹사이트 사용은 문헌 [Dai et al. [2003]] 및 [Candales et al. (2012)]에 기술되어 있다. 추가의 실시양태에서, 이동 II군 인트론 역전사 효소 또는 안정화된 역전사 효소 융합 단백질이 사용될 수 있다. 안정화된 역전사 효소 융합 단백질은 단백질, 예컨대, 말토스 결합 단백질에의 부착에 의해 안정화된 역전사 효소이다. 안정화된 역전사 효소 융합 단백질을 제조하는 방법의 예는 추가로 본원 실시예 1 및 2에 기술되어 있다. 안정화된 역전사 효소 융합 단백질에 대한 보다 완전한 설명은 미국 특허 공개 번호 제2012/0009630호에서 찾아볼 수 있다.
II군 인트론은 그의 자가 스플라이싱 반응을 위한 것으로 알려져 있는 RNA 부류를 코딩한다. 특정 시험관내 조건하에서, II군 인트론 코딩된 RNA는 전구체 RNA로부터 자기 스스로 절제할 수 있고, 단백질 도움없이도 그의 측면에 위치하는 엑손과 함께 결찰된다. 스플라이싱 반응 기전은 핵 프리mRNA 인트론의 스플라이싱과 유사하다. 다수의 II군 인트론은 또한 역전사 효소(RT) 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame)을 코딩하고, 이는 능동적 이동 요소이다. ORF는 전형적으로 II군 인트론 코딩된 RNA의 도메인 DIV에서 발견된다. II군 인트론 RT는 촉매 활성 RNA 구조를 안정화시킴으로써 RNA 스플라이싱을 지원한 후, "레트로호밍(retrohoming)"으로 명명되는 과정에 의해 인트론 이동을 촉진시키는 리보뉴클레오단백질(RNP: ribonucleoprotein) 중 절제된 인트론 RNA에 결합된 상태 그대로 유지된다. 레트로호밍은 RNP 중 절제된 인트론 RNA가 DNA 표적 부위 내로 직접된 삽입되고, RT에 의해 역전사되는 기전에 의해 일어난다. II군 인트론을 통해 인트론이 적절한 DNA 서열로 용이하게 표적화되는 레트로호밍 동안, II군 인트론 RT는 인트론 RNA의 정확한 cDNA 카피를 제조하여야 하는데, 이는 전형적으로 길이가 2-2.5 kb이고, 고도로 안정적이고, 조밀한 2차 및 3차 구조로 폴딩된다. 따라서, II군 인트론 RT는 그의 생물학적 기능을 수행하기 위해서는 고도한 진행성 및 신뢰성을 가져야 한다. II군 인트론 유래 RT는 또한 RN아제 H 활성이 없는데, RN아제 H가 RNA:DNA 하이브리드의 RNA를 특이적으로 분해하고, 이로써 임의의 RNA는 오직 1회 카피될 수 있으며, 이로 인해 전장의 cDNA의 수율은 감소할 수 있게 되는 바, RN아제 H 활성이 없는 것은 유익할 수 있다.
비레트로바이러스 역전사 효소에 의한 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드로부터 표적 폴리뉴클레오티드로의 주형 스위칭은 반응 배지에서 수행된다. 반응 배지는 DNA 카피가 제조될 수 있도록 충분량의 데옥시 또는 디데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함하거나, 또는 상기 방법 동안 포함하도록 제조할 수 있고, 비레트로바이러스 역전사 효소 작동에 적합한 온도(예컨대, 25℃ 내지 약 81℃)로 유지되어야 한다. 수성 배지 중 완충제 및 역전사 효소 작동에 필요한 다른 물질 또한 당업자에게 공지된 양으로 포함되는데, 예를 들어, 완충제는 20 mM 트리스(pH 7.5), 10 mM MgCl2, 75 mM KCl, 및 1 mM DTT를 함유한다(문헌 [Levesque-Sergerie et al. 2007]).
DNA 카피의 형성을 용이하게 하는 데 사용되는 이중 가닥 주형/프라이머 기질은 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥에 회합된 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 일부 실시양태에서, 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥은 상보적인 RNA 가닥을 제공하는 RNA로 제조될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상보적인 올리고뉴클레오티드는 상보적인 DNA 가닥을 제공하는 DNA로 제조될 수 있다. 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥은 RNA로 제조되는 것이 바람직한데, 그 이유는 상기와 같은 것이 더욱 효율적으로 사용되기 때문이며, 역전사 효소의 천연 주형이 RNA라는 이유가 가능성이 가장 크다. 그러나, DNA 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, RNA/DNA 또는 DNA/DNA 주형 프라이머를 사용한 주형 스위치를 보여주는 도 11을 참조할 수 있다.
역전사 효소에 의해 연장되는 이중 가닥 주형/프라이머 기질의 말단은 평활 말단형일 수 있는데, 이는 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 및 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥의 5' 말단이 같은 위치에서 종료될 수 있거나, 또는 "일직선으로 정렬된 것일 수 있고," 쌍을 형성하지 못한 뉴클레오티드는 없다는 것을 의미한다. 별법으로, 이중 가닥 주형/프라이머 기질의 같은쪽 말단은 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥의 5' 말단보다 1개의 뉴클레오티드만큼 더 연장되어 있는 것인 "오버행"을 가질 수 있다. 주형 스위칭을 위해 오직 단일의 오버행, 또는 평활 말단인 것을 필요로 하는 것은, 주형 스위칭을 위해 DNA 프라이머 가닥의 3' 말단과 새로운 RNA 주형의 3' 말단 사이의 2개 이상의 염기쌍을 필요로 하는 레트로바이러스 역전사 효소보다 이점을 제공한다(문헌 [Oz-Gleenberg et al. 2011]). 단일 뉴클레오티드 오버행은 특별히 상보적인 3' 말단을 가지는 핵산의 주형 스위칭을 위해 사용될 수 있거나, 경험적으로 디자인된 4가지 오버행 모두의 혼합물은 주형 스위칭에서의 편향성을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 평활 말단보다 단일 뉴클레오티드 오버행이 가지는 장점은 오버행을 구성하는 뉴클레오티드의 비는 원하는 대로 단일 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 뉴클레오티드 잔기에 상보적이도록, 또는 표적 폴리뉴클레오티드의 혼합물의 3' 뉴클레오티드 잔기에 상보적이도록 조정될 수 있다는 점이다. 오버행이 존재할 경우, 하기 두 뉴클레오티드의 염기쌍 형성을 통한 회합이 용이하게 이루어지도록 하기 위해서는 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드는 DNA 프라이머 가닥의 3' 말단의 오버행 뉴클레오티드에 상보적인 것이 바람직하다.
"오버행"은 또한 본원에 기술된 방법의 일부 실시양태를 수행하면서 다른 위치에 제공될 수 있다. 상기 실시양태에서, 비레트로바이러스 역전사 효소는 상보적인 표적 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 카피 폴리뉴클레오티드를 형성하기 이전에, DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 1-15개의 추가의 비상보적인 뉴클레오티드를 부가한다. 상기 뉴클레오티드는 또 다른 가닥과 회합하지 않기 때문에, 부가시 물론 상보적이 될 수도 있지만, 비상보적이며, 적절한 서열을 가지는 표적 폴리뉴클레오티드가 이용가능하여야 한다. 추가의 실시양태에서, DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 오버행은 1-15개의 뉴클레오티드보다 짧을 수 있다. 예를 들어, 1-6개의 뉴클레오티드, 1-3개의 뉴클레오티드일 수 있거나, 또는 단일 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오드의 카피와는 상관없이 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 오버행을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 추가의 뉴클레오티드를 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드에 부가하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같이, 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥과 회합된 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드로 구성된 이중 가닥 주형/프라이머 기질을 포함하는 반응 배지에 적합한 양의 비레트로바이러스 역전사 효소를 첨가하는 단계, 이어서, 비레트로바이러스 역전사 효소를 통해 1-15개의 추가의 비상보적인 뉴클레오티드를 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 부가하도록 하는 단계를 포함한다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 비레트로바이러스 역전사 효소는 II군 인트론 역전사 효소이다. 추가의 실시양태에서, 단지 1-6개의 추가의 비상보적인 뉴클레오티드, 또는 심지어 단일의 비상보적인 뉴클레오티드를 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 부가하는 것이 바람직할 수 있다.
본원에 기술된 본 방법의 특정 실시양태는 올리고뉴클레오티드를 종결시키고, 역전사 효소에 의한 추가의 재카피를 방해하기 위해 상보적인(complimentary) 올리고뉴클레오티드 주형 가닥의 3' 말단에 차단제(blocking agent)를 포함할 수 있다. 차단제는 역전사 효소가 상기 올리고뉴클레오티드를 표적으로서 사용하지 못하도록 방해한다. 적합한 차단제의 예로는 3'-아미노개질제 C3 및 3'-아미노개질제 C7를 포함하며, 이 둘은 모두, 아미노기가 프루오레닐메톡시카보닐(Fmoc)기로 보호되어 있는 분지형 링커를 함유한다. 잠재적인 다른 3' 개질제는 티올기; DPTA (3,3'-(하이드록시니트로소하이드라지노]비스-1-프로판아민)(이는 또한 올리고뉴클레오티드를 금 표면에 컨쥬게이트시키는 데에도 사용될 수 있다); 스페이서 포스포아미다이트 개질제; 또는 글리세롤일 수 있다. 스페이서 개질제는 광절단가능한 것으로 제조될 수 있다. 재카피가 일어나지 못하도록 막는 차단제의 용도는 당업자에 의해 이해될 것이며, 따라서, 다른 차단제는 본원에 기술된 방법과 함께 사용될 수 있다.
주형 스위칭를 사용하여 프라이머를 표적 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 것이 가지는 장점들 중 하나는 적합한 프라이머를 매우 다양한 다른 폴리뉴클레오티드와 함께 동시에 회합시킬 수 있다는 점이다. 따라서, 본원에 기술된 방법을 사용하여 복수 개의 DNA 카피 폴리뉴클레오티드를 가지는 클로닝 라이브러리를 제조할 수 있다. 반응 배지 중에서 본원에 기술된 바와 같은 이중 가닥 주형/프라이머 기질을 복수 개의 상이한 표적 폴리뉴클레오티드와 함께 혼합하고, 적합한 양의 비레트로바이러스 역전사 효소를 반응 배지에 첨가하여 후속되는 카피 및/또는 확인이 용이하게 이루어질 수 있도록 하는 서열(예컨대, 어댑터 서열)을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 DNA 폴리뉴클레오티드로 이루어진 라이브러리를 형성함으로써 클로닝 라이브러리를 제조한다. 추가의 표적 폴리뉴클레오티드를 임의 개수로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법을 사용하여 2, 5, 10, 50, 100개 이상의 상이한 표적 올리고뉴클레오티드를 동시에 어댑터 서열과 회합시킬 수 있다.
추가의 실시양태는 또한 DNA 카피 폴리뉴클레오티드를 폐환화시키는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 상기 가닥을 폐환화시킨다는 것은 DNA 카피 폴리뉴클레오티드의 3' 말단을 5' 말단과 연결시켜 폴리뉴클레오티드 가닥 이외의 DNA 고리를 형성하는 것을 의미한다. 예를 들어, 단일 가닥 DNA를 폐환화시키는 효소인 Circ리가제(예컨대, Circ리가제 I 또는 Circ리가제 II)로 DNA 카피 폴리뉴클레오티드를 처리함으로써 폐환화를 수행할 수 있다. DNA의 폐환화를 통해 PCR 및 양방향 프라이머를 사용함으로써 가닥을 쉽게 증폭시킬 수 있다.
DNA 카피 폴리뉴클레오티드 제조 또는 비주형 뉴클레오티드 부가에 유용한 키트에 역전사 효소(예컨대, II군 인트론 역전사 효소) 및 이중 가닥 주형/프라이머 기질을 도입시킬 수 있다. 이중 가닥 주형/프라이머 기질은 상기 기술된 바와 같이, 평활 말단 또는 오버행 말단을 포함할 수 있다. 상기 키트는 각각은 DNA 카피 폴리뉴클레오티드를 사용하는 데 사용되는 개별 요소들 중 하나를 포함하는 것인, 예컨대, 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용할 수 있도록 구획화된 캐리어 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 그의 내용물은 용액 중의 역전사 효소를 포함하는 것인 제1 용기를 제공할 수 있다. 추가로, 그의 내용물은 독립적으로 이중 가닥 주형/프라이머 기질 및 반응 배지의 성분들, 예컨대, 적합한 완충제 및 DNA 합성을 위한 뉴클레오티드, 예컨대, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(예컨대, dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP)를 포함할 수 있는 것인, 임의 개수의 추가의 용기들을 제공할 수 있다. 키트는 또한 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 또는 또 다른 공급원으로부터 제공되는 표적 폴리뉴클레오티드와 함꼐 사용되도록 구성될 수 있다. 상기 성분들로 이루어진 임의의 조합물을 제공할 수 있다. 키트는 역전사 효소를 반응 배지에 첨가하여 이중 가닥 주형/프라이머 기질의 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드를 그의 3' 말단으로부터 연장시킴으로써 주형으로서 표적 폴리뉴클레오티드를 사용하여 합성된 상보적인 표적 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 카피 폴리뉴클레오티드를 제공하면서, 그의 다양한 성분들을 안정하게 보관할 수 있도록 구성될 수 있다.
하기 실시예는 비레트로바이러스 역전사 효소를 제조하고, 그를 사용하여 주형 스위칭을 이용함으로써 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드를 표적 폴리뉴클레오티드에 연결시키거나, 또는 추가의 뉴클레오티드를 주형/프라이머 기질에 부가하는 방법을 제공한다. 본 실시예는 단지 예시 목적으로 포함된 것이며, 본 발명의 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: TeI4c - MRF 및 GsI - IIc RT 의 제조
발현 플라스미드 pMalE-RF-TeI4c는 인자 Xa 부위 대신 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 pMal-c2x(뉴 잉글랜드 바이오랩스®: 미국 매사추세츠주 입스위치)의 유도체인 pMal-c2t 중 tac 프로모터 뒤에 클로닝된 융합된 N 말단 MalE 태그를 포함하는 써모시네코코쿠스 엘론가테스(Thermosynechococcus elongates) TeI4c II군 인트론의 RT ORF를 함유한다(문헌 [Kristelly et al. 2003]). pUC19 중 클로닝된 TeI4c 인트론의 TeI4c RT ORF를(문헌 [Mohr et al. 2010]), 제한 부위(EcoRI 및 PstI)를 첨부하는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시킨 후, PCR 생성물을 pMal-c2t의 상응하는 부위로 클로닝하여 플라스미드를 구성하였다. 퀵 체인지(Quick Change) PCR 방법에 의해 아큐프라임(Accuprime) 폴리머라제(인비트로겐™; 문헌 [Makarova et al. 2000])를 이용함으로써 TEV 프로테아제 절단가능한 링커
Figure pct00003
(서열 번호 3)를 강성 링커
Figure pct00004
(서열 번호 4)로 대체하였다.
(그레그 데이비스(Greg Davis)(시그마 알드리치(Sigma-Aldrich))로부터 입수한) 게오바실러스 스테아로써모필루스 균주 10 게놈 DNA로부터의 RT ORF를 BamHI 부위를 첨부하는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시킨 후, PCR 생성물을 pMal-c2t의 상응하는 부위 사이에 클로닝하여 pMalE-GsI-IIC를 구성하였다. GsI-IIC는 G. 스테아로써모필루스 게놈(CP001794, 문헌 [Moretz and Lampson 2010])에서 다중 카피로 발견되는 IIC군 인트론이다. 클로닝된 GsI-IIC RT ORF는 이들 게놈 서열 중 하나에 상응하고, 문헌 [Vellore et al. (2004)]에 의해 클로닝된 RT ORF와 비교하였을 때, 3개의 아미노산 서열 변이를 가진다.
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 로제타(Rosetta) 2(노바겐(Novagen)®, EMD 바이오사이언시즈(EMD Biosciences: 미국 뉴저지주 깁스타운)) 또는 스카라브X프레스(ScarabXpress)® T7lac(스카라브 게노믹스™(Scarab Genomics™: 미국 위스콘신주 매디슨))에서 pMalE-RF-TeI4c 또는 pMalE-RF-GsI-IIc로부터 MalE-RF RT를 발현시켰다. E. 콜라이(E. coli) 균주를 발현 플라스미드로 형질전환시키고, 37℃에서 TB 또는 LB 배지 중에서 중앙 로그기(O.D.600 = 0.8)까지 성장시키고, 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(EPTG)를 첨가하고, 18℃에서 ~24 h 동안 인큐베이션시킴으로써 유도하였다. 이어서, 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 45 ml의 완충제 A(20 mM 트리스 HCl(pH 7.5, 0.5 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM 디티오트레이톨, 및 10% 글리세롤) 중에 재현탁시키고, -80℃에서 냉동시켰다.
MalE-RF RT를 정제하기 위해, 세포 현탁액을 해동시키고, 얼음상에서 15 min 동안 리소자임(1 mg/ml; 시그마 알드리치(미국 미주리주 세인트루이스))으로 처리하고, 드라이아이스 상에서 3회에 걸쳐 냉동-해동시키고, 초음파처리하고(브랜슨 450 소니파이어(Branson 450 Sonifier)(브랜슨 울트라소닉스(Branson Ultrasonics: 미국 미국 코네티컷주 댄버리)); 60%의 진폭으로 얼음 상에서 3 또는 4회의 10 sec 버스트, 버스트 사이는 10 sec), 4℃에서 18,500 x g로 30 min 동안 원심분리하였다. 폴리에틸렌이미드(PEI)를 최종 농도 0.2%까지 첨가하고, 4℃에서 15,000 x g로 15 min 동안 원심분리하여 핵산을 침전시켰다. 생성된 상청액을, 완충제 A 중에서 평형화된 아밀로스 칼럼(10 ml 칼럼 부피; 아밀로스 하이 플로우(Amylose High-Flow); 뉴 잉글랜드 바이오랩스™: 미국 매사추세츠주 입스위치)에 가하고, 상기 칼럼을, 각각은 0.5 M, 1.5 M, 및 0.5 M KCl를 함유하는 완충제 A인 5 칼럼 부피로 세척한 후, 10 mM 말토스를 함유하는 완충제 A로 용리시켰다. 풀링된 단백질 분획을, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% 글리세롤을 함유하는 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5) 중에서 예비 평형화된 헤파린 세파로스 크로마토그래피(3개의 탠덤 1 ml 칼럼; GE 헬쓰케어 바이오사이언시즈™ 코포레이션(GE Healthcare Biosciences™ Corp.))에 의해 추가로 정제하였다. 단백질을 완충제 A 중 칼럼에 가하고, 로딩 농도에서부터 2 M KCl가 될 때까지 40 칼럼 부피 구배로 용리시켰다. 피크 분획을 풀링하고, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 0.5 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 및 50% 글리세롤에 대해 투석하고, 급속 냉동시키고, -80℃에서 보관하였다.
실시예 2: Ll . LtrB II 군 인트론 RT ( LtrA 단백질)의 제조
LtrA 단백질을, tac 프로모터의 하류에 클로닝된 LtrA ORF(문헌 [Mills et al. 1996]) 및 단백질 발현 벡터 pMAL-c2t의 BamHI와 HindIII 사이에 φ10 샤인-달가모(Shine-Dalgamo) 서열을 함유하는 플라스미드 pMAL-LtrA로부터 E. 콜라이 BL21(DE3)에서 발현시켰다(상기 참조). 세포의 스타터 배양물을 37℃에서 밤새도록 LB 배지 중에서 성장시키고, 이를 사용하여 0.5 L의 LB 배지를 함유하는 울트라 수율 플라스크에 접종하고, 37℃에서 3 h 동안, 이어서 18℃에서 24 h 동안 성장시켜 자기 유도화시켰다(문헌 [Studier 2005]). 원심분리(벡크만(Beckman) JLA-8.1000; 4,000 x g, 15 min, 4℃)에 의해 세포를 수거하고, 1 M NaCl, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 20% 글리세롤, 및 0.1 mg/ml 리소자임(시그마 알드리치®: 미국 미주리주 세인트루이스) 중에 재현탁시켰다. 3회에 걸쳐 냉동-해동 사이클을 거쳐 용해시키고, TeI4c-MRF RT 제조를 위해 상기 기술된 바와 같이 초음파처리하였다. 세포 파쇄물(벡크만 쿨터(Beckman Coulter)™ JA-14 회전자, 10,000 rpm, 30 min, 4℃)을 펠릿화한 후, 4℃에서 20 min 동안 일정하게 교반하면서 0.4% 폴리에틸렌이민(PEI)을 이용하여 상청액으로부터 핵산을 침전시킨 후, 원심분리하였다(벡크만 쿨터™ JA-14 회전자, 14,000 rpm, 30 min, 4℃). 이어서, 4℃에서 1 h 동안 일정하게 교반하면서, 황산암모늄을 50%로 포화될 때까지 첨가함으로써 단백질을 상청액으로부터 침전시켰다. 침전된 단백질을 펠릿화하고(벡크만 쿨터™ JA-14 회전자, 14,000 rpm 30 min, 4℃), 500 mM NaCl, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 10% 글리세롤에 용해시켰다. 단백질을 10 ml 아밀로스 칼럼(아밀로스 하이 플로우 수지; 뉴 잉글랜드 바이오랩스™: 미국 매사추세츠주 입스위치)에 가하고, 500 mM NaCl, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 10% 글리세롤로 이루어진 3 칼럼 부피로 세척하고, 10 mM 말토스를 함유하는 500 mM NaCl, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 10% 글리세롤로 용리시켰다. MalE-LtrA를 함유하는 분획을 4℃에서 18 h 동안 80 ㎍/ml TEV 프로테아제와 함께 인큐베이션시켰다. 상기 분획을 40 mM 이미다졸이 로딩된 Ni-NTA 칼럼을 통해 FPLC에 의해서 TEV 프로테아제로부터 추가로 정제하고, 500 mM NaCl, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 10% 글리세롤, 40 mM 이미다졸로 이루어진 3 칼럼 부피로 세척하고, 500 mM NaCl, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 10% 글리세롤, 300 mM 이미다졸 중에서 용리시켰다. 헤파린 세파로스(뉴 잉글랜드 바이오랩스®)를 이용하여 칼럼을 통해 FPLC에 의해 단량체 LtrA를 추가로 정제하였다. 이어서, 정제된 단백질을 30 μM로 농축시키고, 투석에 의해 100 mM NaCl, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 10% 글리세롤로 교환하였다.
실시예 3: II 군 인트론 RT 에 의한 주형 스위칭을 통한 cDNA 클로닝 및 서열 분석
정제된 단백질을 인티그레이티드 DNA 테크놀로지즈(Integrated DNA Technologies)®(IDT: 미국 아이오와주 코랄빌)에 의해 합성된 인공 올리고뉴클레오티드 기질과 함께 인큐베이션시킴으로써 TeI4c-MRF RT를 이용한 역전사 반응을 수행하였다. 일부 실험에서는, 제조사의 프로토콜에 따라 파지 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(뉴 잉글랜드 바이오랩스®)를 이용하여 DNA 프라이머의 5' 말단을 [γ-32P]-ATP(10 Ci/mmol; 퍼킨 엘머(Perkin-Elmer)®)로 표지하였다. 1.1:1 몰비로 10 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 1 mM EDTA 중에서 혼합하고, 2 min 동안 82℃로 가열한 후, PCR 기기(진(Gene) Amp 9700, 라이프 테크놀로지즈™ 코포레이션(Life Technologies™ Corporation: 미국 캘리포니아주 칼즈배드))를 이용하여 10 min 동안에 걸쳐 실온으로 냉각시킴으로써 프라이머를 RNA 주형 가닥에 어닐링시켰다. 도면 설명에서 명시된 바와 같은 조건하에 10-40 ㎕의 반응 배지 중에서 역전사 반응을 수행하였다. 상기 효소를 첨가하여 반응을 개시시키고, 125 mM EDTA, 0.05% SDS를 첨가하여 종결시킨 후, 페놀 CIA 추출을 수행하였다. 표지된 프라이머를 이용하는 실험의 경우, 변성 20% 폴리아크릴아미드 겔 중에서 생성물을 분석하였는데, 상기 겔은 포스포르이미저™로 스캐닝하였다.
II군 인트론 RT에 의한 주형 스위칭을 통해 cDNA 클로닝 및 서열 분석을 수행하기 위하여, 본 발명자들은 데옥시우리딘을 함유하는 5' 표지된 Pc 프라이머
Figure pct00005
(서열 번호 6)에 1:1.1 몰비로 어닐링된 3' 아미노개질제(AmMO, 6-7개의 탄소로 이루어진 링커를 통해 부착된 1차 아민; IDT)를 포함하는 IA-P1 RNA 올리고뉴클레오티드
Figure pct00006
(서열 번호 5)로 구성된 합성 RNA 주형/DNA 프라이머를 사용하였다. 역전사 반응을 위해, 주형/프라이머 기질(50 또는 100 nM)을 도면 설명에서 명시된 바와 같은 조건하에 50-100 ㎕의 반응 배지 중에서 등몰의 miRNAx
Figure pct00007
(서열 번호 7) 및 RT(2-2.5 μM 최종)와 함께 인큐베이션시켰다. 생성된 cDNA를 55℃에서 5 min 동안 열안정성 RN아제 H(하이브리다제(Hybridase)™; 20 유니트; 에피센터®)로 처리하였다. 겔 슬라이스를 파쇄시키고, 이를 밤새도록 0.5 M NH4Cl, 0.1 M EDTA, 10 mM MOPS(pH 6.5), 0.1% SDS 중에 침지시킴으로써 cDNA 생성물 밴드를 변성 20% 폴리아크릴아미드 겔로부터 분리시켰다. 용리된 cDNA를 페놀 추출하고, 선형 아크릴아미드 캐리어(58 ㎍/ml)의 존재하에 0.3 M 아세트산나트륨으로 침전시키고, 물 중에 용해시키고, 일부 경우에는 퀴아젠™ 미니일루트 키트(Qiagen™ MinElute kit)를 사용하여 정제하였다. 이어서, 제조사의 설명서에 따라 cDNA를 Circ리가제 I 또는 II(에피센터®)로 폐환화시키고, 제조사의 설명서에 따라 엑소뉴클레아제 I(에피센터®)로 처리하여 남아있는 임의의 선형 cDNA 분자를 제거하였다. 0.5x농도의 절제 완충제와 함께, 제조사의 설명서에 따라 에피센터® 우라실 DNA 절제(UDE) 키를 사용하여 폐환화된 cDNA를 다시 선형화시킴으로써 EDTA 농도를 PCR에 충분한 낮은 농도로 유지시켰다. 제조사의 설명서에 따라 아큐프라임 Pfx 폴리머라제(인비트로겐™) 또는 플래쉬 퓨전®(핀자임스(Finnzymes))을 이용하고, SOLiD 5' 및 3' 프라이머(SOLID 5':
Figure pct00008
; (서열 번호 8) SOLID 3':
Figure pct00009
(서열 번호 9-10)를 사용하여 각각 5 sec씩 95℃, 55℃ 및 68℃로 15 내지 35회 싸이클을 수행함으로써 반응 생성물을 증폭시켰다. 3% 아가로스 겔(위자드 SV 겔(Wizard SV Gel) 및 PCR 클린 업 키트(PCR Clean-Up Kit): 프로메가®(Promega®: 미국 위스콘신주 매디슨))로부터 PCR 생성물 밴드를 분리시키고, M13 F(-20) 프라이머를 이용하여 생어 서열 분석을 수행하기 위해 TA 클로닝하거나(Taq DNA 폴리머라제, TOPO TA 클로닝 키트; 인비트로겐™), 또는 제로 블런트(Zero Blunt)® PCR 클로닝 키트(인비트로겐™)로 클로닝하거나, SOLiD 서열 분석에 의해 직접 서열을 분석하였다.
정제된 단백질을 20 ㎕의 450 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 1 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 200 μM dNTPs 중에서 인공 올리고뉴클레오티드 기질(하기 참조)과 함께 인큐베이션시킴으로써 II군 인트론 Ll.LtrB RT(LtrA 단백질)를 이용한 역전사 반응을 수행하였다. 반응 성분을 얼음 상에서 마지막으로 첨가된 기질과 함께 조립하고, 30℃에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 페놀 CIA 추출에 의해 반응을 종결시켰다. 반응 생성물 중 일부(3 ㎕)를 동일한 부피의 겔 로딩 완충제 II(95% 포름아미드, 18 mM EDTA 및 0.025% 각각의 SDS, 크실렌 시아놀, 및 브로모페놀 블루(앰비온(Ambion: 미국 텍사스주 오스틴))에 첨가하고, 98℃에서 7 min 동안 변성시키고, 변성 10 또는 15% 폴리아크릴아미드 겔 중에서 전개시키고, 이를 포스포르이미저™로 스캐닝하였다.
도 4에 기술된 반응은 어닐링된 프라이머 c
Figure pct00010
(서열 번호 12) 및 엑손 1 DNA
Figure pct00011
(서열 번호 13) 또는 RNA
Figure pct00012
(서열 번호 14)와 함께 Ll.LtrB RNA
Figure pct00013
를 사용하였다.
도 5에 기술된 반응은 어닐링된 프라이머 e2
Figure pct00014
와 함께 엑손 2 DNA
Figure pct00015
(서열 번호 15) 또는 엑손 2 RNA
Figure pct00016
(서열 번호 16)를 사용하였다.
인티그레이티드 DNA 테크놀로지즈®(IDT: 미국 아이오와주 코랄빌)로부터 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드를 수득하고, -80℃에서 10 min 동안 에펜도르프 튜브 중에서 냉동시켜 변성 10%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔 중에서 겔 정제시키고, 겔 슬라이스를 파쇄시키고, 이를 밤새도록 0.5 M NH4Cl, 0.1 M EDTA, 10 mM MOPS(pH 6.5) 및 0.1% SDS 중에 침지시켰다. 코스타 스핀-X(Costar Spin-X) 원심분리 튜브 필터(0.45 ㎛ 공극 크기, 코닝™ 인코퍼레이티드(Corning™ Inc.: 미국 매사추세츠주 로웰))를 사용하여 겔 단편으로부터 올리고뉴클레오티드를 분리시킨 후, 선형 아크릴아미드 캐리어(58 ㎍/ml)의 존재하에 에탄올 침전시키고, 뉴클레아제 무함유 물에 용해시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 파지 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(뉴 잉글랜드 바이오랩스®)를 이용하여 DNA 프라이머의 5' 말단을 [γ-32P]-ATP(10 Ci/mmol; 퍼킨 엘머)로 표지하였다. 프라이머 어닐링을 위해, 올리고뉴클레오티드를 RT 검정법에서 사용되는 농도의 20x인 농도로 혼합한 후, 82℃로 가열하고, 1x 어닐링 완충제(100 mM 트리스 HCl(pH 7.5) 및 5 mM EDTA) 중에서 45 min 동안 25℃로 천천히 냉각시켰다. 30℃에서 트리스-보레이트-EDTA(90 mM 트리스, 90 mM 붕산, 2 mM EDTA)를 사용하여 비변성 10% 폴리아크릴아미드 겔 중에서 전기영동함으로써 어닐링율을 평가하였다(문헌 [Sambrook et al. 1989]).
Ll.LtrB RT로 합성된 cDNA의 클로닝 및 서열 분석을 수행하기 위해, 밴드를 절제하여 변성 10%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔 슬라이스로부터 cDNA 생성물을 겔 정제시키고, -80℃에서 10 min 동안 에펜도르프 튜브에서 냉동시키고, 상기 튜브에서 파쇄시키고, 600 ㎕의 500 mM NH4Cl, 100 μM EDTA, 10 mM MOPS(pH 6.5) 및 0.1% SDS를 첨가하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 코스타 스핀-X 원심분리 튜브 필터(0.45 ㎛ 공극 크기, 코닝™ 인코퍼레이티드(미국 매사추세츠주 로웰))를 사용하여 겔 단편으로부터 올리고뉴클레오티드를 분리시킨 후, 선형 아크릴아미드 캐리어(58 ㎍/ml)의 존재하에 에탄올 침전시키고, 뉴클레아제 무함유 물에 용해시켰다. 하기 단계는 모두 제조사의 설명서에 따라 Circ리가제 I 또는 II(에피센터®)를 사용하여 cDNA를 폐환화시키고, 엑소뉴클레아제 I(에피센터®)로 처리하고, EDTA 농도를 PCR에 충분한 낮은 농도로 유지시키는 농도의 0.5x인 농도로 절제 완충제를 이용하여 우라실-DNA 절제 효소 믹스(에피센터®)로 선형화하였다. 도 4의 실험을 위해, 프라이머 앵커(Anchor) 6 보체
Figure pct00017
(서열 번호 18) 및 앵커 5 (서열 번호 19)와 함께 HF 완충제(뉴 잉글랜드 바이오랩스™: 미국 매사추세츠주 입스위치)를 포함하는 퓨전® 하이 피델리티 PCR 마스터 믹스(Phusion® High Fidelity PCR Master Mix)에 의해 선형화된 생성물을 PCR 증폭시켰다. 도 5의 실험을 위해, 유사하게 프라이머 앵커 4 보체
Figure pct00019
(서열 번호 20) 및 앵커 5(상기 참조)로 선형화된 생성물을 PCR 증폭시켰다. 98℃에서 2 min 동안 초기 변성, 98℃에서 10 sec, 60℃에서 10 sec, 72℃에서 5 sec로 25회 싸이클, 및 72℃에서 7 min 동안 최종 연장인 싸이클링 조건으로 50 ㎕의 반응 배지 중에서 HF 완충제(뉴 잉글랜드 바이오랩스™)를 포함하는 퓨전® 하이 피델리티 PCR 마스터 믹스에 의해 PCR을 수행하였다. PCR 생성물을 2% 아가로스 중에서 분석하고, 미니일루트 겔 추출 키트(퀴아젠®)로 겔 정제한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 TOPO-TA pCR2.1 벡터(인비트로겐™)로 클로닝하였다. 임의 콜로니를 취하고, 클로닝된 PCR 생성물을 프라이머 M13 F(-20)
Figure pct00020
(서열 번호 21) 및 M13 R(-26)
Figure pct00021
(서열 번호 22)와 함께 HF 완충제를 포함하는 퓨전® 하이 피델리티 PCR 마스터 믹스를 사용하여 콜로니 PCR에 의해 증폭시킨 후, M13 R(-24)
Figure pct00022
(서열 번호 23) 프라이머를 사용하여 서열 분석하였다.
실시예 4: 열안정성 TeI4c - MRF II 군 인트론 RT 에 의한 주형 스위칭 및 비주 형 뉴클레오티드 부가 분석
도 1은 IA-P1 RNA/Pc DNA로 표시된 RNA 주형/DNA 프라이머 기질로부터, 주형 스위칭 동안 편향성을 평가하기 위하여 5' 및 3' 양말단 모두에 2개의 무작위화된 뉴클레오티드 잔기(N's)를 가지는, 서열이 식물 miRNA의 것과 유사한(아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) ath mir-173; 문헌 [Park et al. 2002]) (miRNAx로 표시) 21 nt RNA 올리고뉴클레오티드의 3' 말단으로 주형 스위칭할 수 있는 열안정성 TeI4c-MRF II군 인트론 RT 및 수퍼스크립트 III RT의 능력을 비교하여 나타낸 것이다. 주형/프라이머 기질은 P1 및 IA 서열의 일부에 상보적인 31 nt DNA 프라이머(Pc 표시)가 어닐링되어 있는, 내부 어댑터(IA: Internal Adaptor) 및 SOLiD 차세대 서열 분석용 P1 서열을 함유하는 42 nt 주형 RNA(IA-P1 RNA로 표시)로 구성되었다(도 2). 그의 3' 말단으로의 주형 스위칭에 의한 재카피를 방해하기 위해 3'-아미노개질제(AmMO; IDT)를 이용하여 IA-P1 주형 RNA를 합성하고, Pc DNA 프라이머의 5' 말단을 32P 표지하였고, 폐환화된 cDNA를 우라실 DNA 절제 믹스(UDE; 에피센터; 도 2)를 이용한 후속 선형화를 위해 내부 데옥시우리딘을 포함하였다. 각 효소에 대해 최적인 조건(도 1 설명 참조)하에서 TeI4c-MRF 및 수퍼스크립트 III RT를 이용하여 역전사 반응을 수행하였다.
수퍼스크립트 III의 경우, Pc 프라이머로부터 IA-P1 RNA 주형의 5' 말단으로의 연장 결과로서 우세하게 존재하는 ~42 nt의 단일 생성물을 수득한 반면, TeI4c-MRF RT의 경우에는 유사한 생성물과 함께, 21 nt miRNAx의 1, 2, 또는 3개의 카피를 IA-P1 어댑터 서열에 연결하는, 주형 스위칭이 예측되는 크기를 가진 일련의 더 큰 밴드를 수득하였다. IA-P1 RNA의 말단에서 cDNA 합성의 종결로부터 생성된 주요 ~42 nt 밴드는 수퍼스크립트 III의 경우보다 TeI4c-MRP RT의 경우에 약간 더 컸는데, 이는 II군 인트론 RT는 그가 RNA 주형의 5' 말단에 도달한 후, 추가의 뉴클레오티드 잔기를 cDNA의 3' 말단에 부가하는 성향이 더 크다는 것을 제안한다. 상기 추가의 뉴클레오티드 부가는 다른 DNA 폴리머라제 및 RT의 성향이다(문헌 [Clark et al. 1987]; [Clark 1988, Hu 1993], [Patel and Preston 1994], [Peliska and Benkovic 1992], [Golinelli and Hughes 2002]). 이는 효소가 주형의 5' 말단에 도달한 이후에 DNA 생성물 가닥의 3' 말단에서 이루어지기 때문에 일반적으로는 "비주형 뉴클레오티드 부가" 또는 "말단 트랜스퍼라제" 활성이라고 명명된다(문헌 [Golinelli and Hughes 2002], [Andrade et al. 2009]). 본원에서 본 발명자들은 이를 비주형 뉴클레오티드 부가 활성 또는 추가의 뉴클레오티드 부가 활성이라고 지칭하였다.
II군 인트론 RT에 의한 주형 스위칭을 통해 합성된 cDNA를 클로닝하고 서열 분석하기 위해, 본 발명자들은 도 2에서 개략적으로 설명된 방법을 개발하였다. II군 인트론 RT를 이용하여 cDNA를 합성한 후, 생성물을 RN아제 H와 함께 인큐베이션시켜 RNA 주형 가닥을 분해하고, 변성 20% 폴리아크릴아미드 겔 중에서 정제하고, Circ리가제에 의해 폐환화하고, 엑소뉴클레아제로 분해하여 결찰되지 않은 cDNA를 제거하였다. 이어서, Pc DNA 프라이머 서열 내로 도입된 데옥시우리딘 잔기(도 2, 하단)에서 우라실 DNA 절제 믹스로 환형 cDNA를 다시 선형화시키고, 이로써 SOLiD 5' 및 3' 프라이머를 이용하여 용이하게 증폭을 수행할 수 있었다.
특정 크기의 cDNA 밴드를 확인할 필요가 없는 적용인 경우에는 크기도 2의 방법에서 cDNA의 겔 정제 단계는 생략될 수 있다. cDNA는 또한 Circ리가제를 사용하지 않고도, 제2 어댑터를 cDNA의 3' 말단에 결찰시키거나, 또는 RT 또는 또 다른 효소(예컨대, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제)의, 동종중합체 테일(예컨대, 폴리(dA))을 부가하는 비주형 뉴클레오티드 부가 활성을 이용하여 상보적인 동종중합체 런(run)(예컨대, 폴리(dT))을 함유하는 제2 어댑터가 어닐링될 수 있도록 함으로써 클로닝할 수 있었다. 추가로, cDNA를 변성 겔 중에서 겔 정제시키는 경우라면, RN아제 H 처리는 임의적인 것이었다. 폐환화된 cDNA 또한 우라실 절제 선형화 단계없이 PCR 증폭시킬 수 있거나, 또는 일부 다른 수단, 예컨대, 올리고뉴클레오티드 어댑터에 도입된 제한 부위에서의 제한 효소 분해에 의해 선형화될 수 있었다. 하기 기술되는 상이한 실험에서는, cDNA의 증폭으로부터 생성된 PCR 생성물을 TOPO TA 벡터로 클로닝하거나, 또는 제로 블런트® PCR 클로닝 키트(인비트로겐™)로 클로닝하고, 생어 방법에 의해 서열을 분석하거나, 또는 차세대 SOLiD 서열 분석에 의해 직접 서열을 분석하였다.
도 3은 도 1과 동일한 조건하에서 TeI4c-MRF RT의 주형 스위칭에 의해 생성된 cDNA의 서열을 보여주는 것이다. 잠재적으로, IA-P1 RNA/DNA 프라이머 기질로부터 miRNAx로의 제1 주형 스위치 및 miRNAx의 제2 분자로의 제2 주형 스위치로부터 생성된 cDNA의 밴드를 분리시키고, 도 2에 제시된 방법을 사용하여 클로닝하고, M13F(-20) 프라이머를 이용하여 생어 방법에 의해 서열을 분석하였다. ~65 nt 생성물에 대한 클로닝 및 서열 분석을 통해, IA-P1 RNA 어댑터 서열로부터 miRNA로의 주형 스위치와, 그에 의한 어댑터의 miRNA 서열에의 연결에 의해 상기 생성물이 생성되었다는 것을 확인하였다. 모든 경우에 있어서, 주형 스위치는 2개의 RNA 서열로 이루어진 연접부에서의 추가의 뉴클레오티드 잔기의 부가없이도 연속적으로(seamlessly)으로 발생하였다. 그러나, miRNA 주형의 5' 말단에 도달한 후, 1-15개의 추가의 뉴클레오티드 잔기를 cDNA의 3' 말단에 부가하고, A 잔기가 우선적으로 제1 추가의 뉴클레오티드로서 부가되었다. 추가로, cDNA 서열은 miRNA 주형의 3' 말단 뉴클레오티드 잔기의 대향 위치에서 유의적인 편향성을 보였다: A, 46%; C; 33%; G, 21%; 및 U, 0%. cDNA 서열에서의 상기와 같은 편향성은 주형/프라이머 기질로부터의 주형 스위치는 3' 말단 U 잔기를 가지는 miRNA는 선호하였고, 3' 말단 A 잔기를 가지는 miRNA는 강하게 비선호하였다는 것을 제안한다.
~85 nt 생성물에 대한 클로닝 및 서열 분석을 통해 상기 생성물은 miRNA 주형으로의 2회 연속된 주형 스위치로부터 생성된 것이며, 그를 통해 miRNA 서열의 2개의 탠덤 카피에 연결된 IA-P1 어댑터 서열(나타내지 않음)을 얻었다는 것을 확인하였다. 또한, 어댑터 서열의 부착은 연속적으로 이루어졌고, 분석된 11개의 클론 중 제1 또는 제2 주형 스위치의 연접부에 의해 도입된 추가의 뉴클레오티드 잔기는 없었다. 그러나, 추가의 뉴클레오티드 잔기를 다시 완성된 cDNA의 3' 말단에 부가하였고, A 잔기가 제1 추가의 뉴클레오티드로서 우선적으로 부가되었고, 초기 주형 스위치는 다시 (cDNA 서열 중 3' 말단 miRNA 뉴클레오티드의 대향 위치에서 T 잔기가 없는 것으로 표시되는(나타내지 않음)) IA-P1 RNA로부터 3' A 잔기를 가지는 miRNA로의 스위칭에 대한 강력한 편향성을 보였다.
실시예 5: 락토코쿠스 락티스 Ll . LtrB II 군 인트론 RT ( LtrA 단백질)에 의한 주형 스위칭 및 비주형 뉴클레오티드 부가 분석
주형 스위칭 및 비주형 뉴클레오티드 부가에 대한 성향이 II군 인트론 RT의 일반적인 성향인지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 중온 락토코쿠스 락티스 Ll.LtrB II군 인트론 RT를 이용하여 생화학적 검정법을 수행하였다. 도 4A에 제시된 실험에서, 초기 주형/프라이머 기질은 5' 말단이 45 nt DNA 프라이머에 어닐링된 Ll.LtrB 인트론의 것에 상응하는 것인 60 nt RNA 주형으로 구성되었다(프라이머 c; 도에서 Pri c로 표시). Ll.LtrB RT는 어닐링된 DNA 프라이머로부터 인트론 RNA 주형의 역전사를 개시하고, RNA의 5' 말단으로 연장하였고, 여기서, ltrB 엑손 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2의 40 nt DNA 또는 RNA 주형(E1 RNA 또는 DNA)으로 점핑할 수 있었다. Ll.LtrB RNA의 3' 말단은 초기 주형의 제2 분자로 스위칭할 수 있는 RT의 능력을 방해하는 아미노개질제(AmMO)를 가졌다. 200 μM dNTPs, 450 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 및 1 mM 디티오트레이톨(DTT)을 함유하는 반응 배지 중에서 반응을 수행하였으며, 앞서 제시된 바와 같이, 고염 농도는 Ll.LtrB RT의 최적의 활성을 위해서는 필요하였다(문헌 [Saldanha et al. 1999]).
도 4A 레인 5 및 6은 Ll.LtrB RT가 프라이머를 인트론 RNA 주형의 말단으로 효율적으로 연장시킴으로써 Pri c DNA 프라이머의 초기 Ll.LtrB RNA 주형의 말단으로의 연장에 대해 예측되는 크기인 ~60 nt의 주요 표지된 생성물과, 엑손 1 DNA 또는 RNA(100 nt)로의, 또는 아미노개질제에도 불구하고 Ll.LtrB RNA의 제2 분자(120 nt)로의 주형 스위칭에 대해 예측되는 크기를 가지는 보다 소량의 더 큰 생성물도 함께 수득하였다는 것을 보여준다. ~60 nt 생성물을 이중체로서 분석하였고, 짐작컨대, 초기 cDNA의 3'말단에의 비주형 뉴클레오티드 부가를 반영하는 것으로 가정하였다. 대조군 레인(레인 1-4)은 상기 표지된 생성물은 프라이머 c 단독인 경우, 또는 단독으로 RT와 함께 인큐베이션된 프라이머 c의 경우, 또는 엑손 1 RNA 또는 DNA의 존재하에서는 검출되지 않았다는 것을 나타낸다(레인 1-4).
cDNA 생성물의 클로닝 및 서열 분석은 도 4B 및 C에 요약되어 있다. 서열 분석을 통해 주요 ~60 nt 생성물(레인 5에서 밴드 a 및 b, 및 레인 6에서 h 및 i)은 Ll.LtrB RNA의 5' 말단으로 또는 그 부근으로 연장되는 cDNA에 상응하는 것이고, 이중체는 RNA 주형의 말단에의 도달시 추가의 뉴클레오티드 뉴클레오티드 잔기, 주로 A 잔기의 cDNA의 3' 말단에의 부가를 반영한다(도 4B 및 C)는 것을 확인하였다.
크기가 더 큰 밴드(레인 5에서 밴드 c-g 및 레인 6에서 h-n)는 인트론의 5' 말단으로부터 엑손 1 DNA 또는 RNA의 3' 말단으로의 주형 스위칭에 의해 생성된 생성물(도 4B 및 C) 뿐만 아니라, 아미노개질제에도 불구하고 내부 영역으로 또는 Ll.LtrB RNA의 3' 말단으로의 주형 스위칭에 의해 생성된 생성물(나타내지 않음)을 함유하였다. 밴드 c, d 및 e는 엑손 1 DNA로의 주형 스위칭에 의해 생성된 생성물을 함유하였다(도 4B). 밴드 j, k 및 l은 엑손 1 RNA으로의 주형 스위칭에 의해 생성된 생성물을 함유하였다(도 4C). 엑손 1 DNA로의 주형 스위치 중 대부분(70%)는 연속적으로 이루어졌지만, 추가의 뉴클레오티드 잔기, 주로 A 잔기는 주형 스위칭 연접부 중 일부(30%) 뿐만 아니라, 대부분(92%)의 DNA 생성물의 3' 말단에서 발견되었다. 본 발명자들은 엑손 1 RNA로의 주형 스위칭 연접부 중 61%가 추가의 뉴클레오티드 잔기를 가지고, cDNA의 3' 말단 중 44%가 추가의 뉴클레오티드 잔기를 가지며, 상기 두 경우 모두에서 추가의 뉴클레오티드 잔기는 주로 A 잔기인 것을 발견하게 되었다. 본 발명자들은 Ll.LtrB RNA로의 주형 스위칭 연접부 중 48%가 추가의 뉴클레오티드 잔기를 가지고, cDNA의 3' 말단의 50%가 추가의 뉴클레오티드 잔기를 가지며, 상기 두 경우 모두에서 추가의 뉴클레오티드 잔기는 주로 A 잔기인 것을 발견하게 되었다(나타내지 않음). 일부 경우에, Ll.LtrB RT는 A 잔기의 런들(runs)을 부가하였다. 밴드 g는 엑손 1 DNA로의 2회 연속 주형 스위치에 의해 생성된 생성물을 함유하였다. 밴드 n은 엑손 1 RNA로의 2회 연속 주형 스위치에 의해 생성된 생성물을 함유하였다. 밴드 d, f, j, k, 및 m은 Ll.LtrB RNA로의 주형 스위칭에 의해 생성된 생성물을 함유하였다. 밴드 m 또한 Ll.LtrB RNA로의 2회 연속 주형 스위치에 의해 생성된 생성물을 함유하였다. 밴드 k 또한 엑손 1 RNA로, 이어서, Ll.LtrB RNA로인, 2회 연속 주형 스위치에 의해 생성된 생성물을 함유하였다. 다회 주형 스위치에 의한 생성물은 단일 주형 스위치에 의한 생성물과 유사한 특징, 예를 들어, 비주형 뉴클레오티드 잔기, 대개는 A 잔기가 주형 스위칭 연접부 중 일부에 및 대부분의 cDNA의 3' 말단에 도입되는 것인 특징을 포함하였다. 본 실험에서 주형 스위치 사이에 추가의 비주형 뉴클레오티드 잔기를 부가하는 성향은 TeI4c-MRF RT보다는 Ll.LtrB RT의 경우에 더 크게 나타났는데, 이는 RT의 차이 또는 실험 조건의 차이를 반영한다. 특히, 도 4의 실험은 II군 인트론 RT에 의한 주형 스위칭은 제2 주형이 RNA인지 또는 DNA인지와는 상관없이 일어날 수 있다는 것을 보여준다.
도 5는 DNA 프라이머(e2)가 어닐링된 ltrB 엑손 2(E2) DNA 또는 RNA에 상응하는 상이한 주형/프라이머 기질을 사용하고 Ll.LtrB RT를 이용한 제2 세트의 생화학적 검정법을 보여주는 것이다. 기존 연구로부터 예측할 수 있는 바와 같이(문헌 [Smith et al. 2005]), Ll.LtrB RT는 RNA 주형에 대해 높은 RT 활성을 보였지만, DNA 주형에 대해서는 단지 낮은 DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 보였다(도 5A, 레인 3 및 4). RNA 주형으로 수득된 생성물들 대다수는 10 nt 5' 오버행 너머까지 연장되었고(도 5A, 레인 4), 상기 cDNA의 클로닝 및 서열 분석을 통해 최대 7개의 C 잔기로 이루어진 동종중합체 런들을 비롯한, 추가의 뉴클레오티드 잔기, 이제 주로 C 잔기가 cDNA의 3' 말단에 부가되었다는 것이 밝혀졌다(도 5B). 서열 분석 결과, 도 5B 레인 4의 보다 큰 생성물은 초기 E2 RNA의 E2 RNA의 제2 분자 및 때때로는 제3 분자로의 주형 스위칭에 의해 생성되었고, 본 실험에서는 주형 스위칭을 방해하는 3' 아미노개질제가 없었던 것으로 밝혀졌다(도 5B). 이러한 경우, 추가의 뉴클레오티드 잔기, 다시 주로 C 잔기는 주형 스위치 사이의 연접부에서, 및 cDNA의 3' 말단에서 발견되었다. 이러한 관찰 결과는 II군 인트론 RT에 의한 비주형 뉴클레오티드 부가의 특이성은 상이한 주형/프라이머 기질 및 cDNA에 대하여 다를 수 있다는 것을 나타낸다. 다른 RT 및 DNA 폴리머라제에 대해서도 유사한 관찰 결과를 얻었는데, 이는 DNA 생성물 가닥의 말단 뉴클레오티드 잔기의 차이에 기인하는 것이며, 예를 들어, 상기와 같은 차이는 다른 것보다도 일부 도입(incoming) 뉴클레오티드를 선호하는 염기 적층 상호작용에 관여할 수 있다(문헌 [Hu 1993]; [Magnuson et al. 1996]; [Golinelli and Hughes 2002]). 동종중합체 런들을 비롯한 추가의 뉴클레오티드 잔기를 cDNA의 3' 말단에 부가할 수 있는 II군 인트론 RT의 능력은 예컨대, 상보적인 뉴클레오티드 잔기 오버행을 함유하는 벡터로 cDNA 클로닝하는 데 또는 상보적인 동종중합체 서열과 제2 어댑터가 어닐링될 수 있도록 함으로써 사용될 수 있다.
실시예 6: 반응 조건 변화가 II 군 인트론 RT 에 의한 비주형 뉴클레오티드 부가에 미치는 효과
비록 잠재적으로 유용하기는 하지만, 추가의 뉴클레오티드 잔기를 cDNA의 3' 말단에 부가할 수 있는 II군 인트론 RT의 능력은 cDNA를 크기순으로 정확하게 배열(예컨대, 모세관 전기영동)해야 하는 일부 적용의 경우에는 유해할 수 있고, cDNA의 3' 말단과 새로운 RNA 주형의 3' 말단 사이에 상보성을 도입함으로써 주형 스위칭에서의 편향성에 원인이 될 것이다. 도 3의 실험에서, 예를 들어, TeI4c-MRF RT에 의한 추가의 A 잔기의 cDNA의 3' 말단으로의 차별적인 부가는 상보적인 3' U 잔기를 포함하는 miRNA로의 주형 스위치로 편향시킬 수 있으며, 맞붙는 3' A 잔기를 가지는 miRNA는 비선호할 수 있다. II군 인트론 RT에 의한 주형 스위칭은 cDNA와 새로운 RNA 주형 사이의 염기쌍 형성없이도 이루어질 수 있지만, cDNA의 3' 말단에 부가된 추가의 뉴클레오티드 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있거나, 또는 맞붙을 수 있는 잠재능은 다른 것보다도 일부 주형으로의 스위칭을 강력하게 선호할 수 있다. 따라서, cDNA의 3' 말단에의 비주형 뉴클레오티드 부가 정도를 최소화하거나, 조절할 수 있는 조건을 찾아내는 데 많은 시간이 소요되었다.
상기와 같은 조건을 찾아내기 위해, 도 6에 제시되어 있는 바와 같이, RNA 주형의 5' 말단으로 완전하게 연장되는 cDNA 프라이머를 모방하는, 평활 말단형 5' RNA/3' DNA 말단을 가지는 RNA 주형/DNA 프라이머 기질을 사용하여 검정법을 사용하였다. 상이한 농도의 각 4가지 dNTPs의 존재하에 상이한 반응 조건하에서 상기 DNA 기질을 TeI4c-MRF RT와 함께 인큐베이션시켰다. 그 결과, (i) 상기 주형/프라이머 기질 RNA의 경우, TeI4c-MRF RT에 의한 DNA 가닥의 3' 말단에의 비주형 뉴클레오티드 잔기의 부가에 대한 선호도 순서는 A > G > C > T였고; (ii) 비주형 뉴클레오티드 부가는 보다 고농도의 1가 염 및 보다 저농도의 Mg+2(예컨대, 450 mM NaCl 및 5 mM Mg+2) 및 보다 저농도의 dNTP의 조합(예컨대, 1 mM보다는 1 μM)의 조합에 의해 감소될 수 있는 것으로 나타났다. 또한 비주형 뉴클레오티드 부가는 ATP에 의해서도 감소될 수 있는 것으로 밝혀졌는데, 이는 앞서 HIV-1 RT에 의한 비주형 뉴클레오티드 부가를 감소시키는 것으로 밝혀져 있다(문헌 [Golinelli and Hughes 2002]). 다른 실험에서, 본 발명자들은 또한 II군 인트론 RT에 의한 비주형 뉴클레오티드 부가가 cDNA 합성과 비교하였을 때, 상대적으로 느린 반응이며, 따라서, 단시간 동안 반응을 수행함으로써 상기 비주형 뉴클레오티드 부가를 감소시킬 수 있다는 것도 발견하게 되었다. 낮은 pH가 HIV1 RT에 의한 비주형 뉴클레오티드 부가를 감소시키는 것으로 보고된 바 있으며(문헌 [Golinelli and Hughes 2002]), 낮은 pH는 유사하게 II군 인트론 RT에 의한 비주형 뉴클레오티드 부가도 감소시킬 수 있다. 비주형 뉴클레오티드 부가가 dNTP 농도에 대해 강하게 의존한다는 것은 dNTPs를 상이한 비로 사용함으로써 하나의 특이적인 dNTP의 부가를 선호함으로써 cDNA 클로닝 및 서열 분석을 위해 상보적인 뉴클레오티드와 어닐링할 수 있는 동종중합체 런들, 예컨대, 폴리(A) 또는 폴리(C)를 얻을 수 있다고 제안되었다. II군 인트론 RT는 또한 원하는 테일을 DNA의 3' 말단에 부가하기 위해 단일 dNTP를 사용하는 별도의 반응 단계에서 사용될 수도 있다.
실시예 7: 비주형 뉴클레오티드 부가를 최소화시키는 반응 조건하에서의 주형 스위칭에 의한 cDNA 클로닝 및 서열 분석
II군 인트론 RT에 의한 비주형 뉴클레오티드 부가를 최소화시키는 반응 조건을 확인하였는 바, IA-P1 RNA/Pc DNA 주형-프라이머 기질로부터, 5' 및 3' 말단 둘 모두에 2개의 무작위화된 뉴클레오티드를 포함하는 21 nt miRNA로의 TeI4c-MRF RT에 의한 주형 스위치가 이루어지는 miRNA 클로닝 및 서열 분석 실험을 반복하였는데, 단, 이는 비주형 뉴클레오티드 부가를 감소시키고자 하는 반응 조건(1 min 동안 450 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5))하에서 이루어졌다. 도 2의 프로토콜을 사용하여 생성된 cDNA를 클로닝하고, 1 mM 농도의 dNTPs를 사용하여 생어(나타내지 않음) 및 차세대 SOLiD 서열 분석 둘 모두에 의해 분석하였다.
도 7에는 SOLiD 서열 분석에 의해 얻은 2,239,072개의 고품질 리드 중 존재비가 가장 큰 20개의 서열이 제시되어 있다. 2,239,072개의 고품질 리드 중, 49%는 1 카피의 miRNAx를 가지고, 51%는 2개의 탠덤 miRNAx 서열을 가지는데, 이는 또 다른 miRNAx 주형으로의 제2 주형 스위치를 반영하는 것이다. miRNAx 단량체 대 이량체 리드의 비는 서열 분석에 의해 초기 cDNA 생성물에 대한 보다 엄격한 겔 정제에 의해 증가될 수 있다. 서열을 통해, 변형된 반응 조건이 cDNA의 3' 말단에의 비주형 뉴클레오티드 부가를 감소시켰다는 것을 확인하였다(도 7). 생어 서열 분석에 의해 분석된 cDNA 중, 단지 33%만이 추가의 3' 뉴클레오티드 잔기를, 가장 빈번하게는 단일의 A 잔기를 가졌다(나타내지 않음). SOLiD 서열 분석의 경우, P2 서열에 연결된 miRNAx 단량체 서열을 포함하는 975,020개의 고품질 리드 중, 50%가 하나 이상의 추가의 3' 뉴클레오티드 잔기를, 가장 빈번하게는 단일의 A 잔기를 가졌고(244,877개의 리드), miRNAx 이량체인 1,138,636개의 고품질 리드 중에서는 48%가 하나 이상의 추가의 3' 뉴클레오티드 잔기를, 다시 가장 빈번하게는 단일의 A 잔기를 가졌다(255,257개의 리드; 나타내지 않음). 그러나, cDNA 서열은 여전히 miRNAx 주형의 3' 말단 뉴클레오티드 잔기의 대향 위치에 강한 편향성을 보인 반면(상기 위치가 분명하게 판독될 수 있는 것인 974,276개의 고품질 miRNAx 단량체 리드에 기초하여 cDNA 서열 중 A, 75%; C, 8%, G, 9%; T; 8%(상기 참조)), RNA 주형의 끝에서 2번째의 뉴클레오티드 잔기의 대향되는 무작위화된 위치에서는 어떤 유의적인 편향성도 포착되지 않았다. 3' 말단 주형의 대향되는 위치에서 관찰된 편향은 cDNA의 3' 말단에 우선적으로 부가되는 비주형 A 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있는 3' U 잔기를 포함하는 miRNAx 분자로 우선적으로 주형 스위치가 일어난 모델과 일치하였다.
실시예 8: 상이한 RNA 주형/ DNA 프라이머 기질 사용에 의한 주형 스위치 편향성의 최소화
비주형 뉴클레오티드 부가에 의해 발생되는 주형 스위칭 편향성을 감소시키기 위해 다른 접근법에 대한 조사하였다. 한 접근법에서, 본 발명자들은 cDNA가 초기 RNA 주형의 말단에 도달하였을 때의 구조를 모방하면서, 상이한 말단 염기쌍을 가지는 평활 말단 RNA/DNA 주형-프라이머 기질로부터의 주형 스위칭을 테스트하였다. 도 8에는 가능한 4가지 5' RNA/3' DNA 염기쌍 중 각각의 것으로 종결되는 말단을 가지는 평활 말단 기질로부터 상이한 3' 말단 뉴클레오티드를 가지는 miRNAx 올리고뉴클레오티드로의 주형 스위칭에 관한 겔 분석이 제시되어 있다. 주형 스위칭 생성물의 밴드 강도를 정량화하고, 각 레인 중의 방사능량에 대한 정규화함으로써, 4가지 뉴클레오티드 잔기 중 각각의 것으로 종결되는 말단을 가지는 RNA로 이루어지는 주형 스위치의 예측 비율을 수득하였다. U/A, C/G 또는 A/T 염기쌍으로 종결되는 말단을 가지는 RNA 주형/DNA 프라이머 기질들 모두 3' C 잔기를 가지는 miRNAx로의 주형 스위칭을 선호하는 것으로 나타났지만, 비록 일부는 3' U 잔기로 종결되는 말단을 가지는 miRNAx를 선호하는 것으로 나타나기는 하였지만, G/C 염기쌍 으로 종결되는 말단을 가지는 RNA 주형/DNA 프라이머 기질은 4가지 뉴클레오티드 잔기 모두로 종결되는 말단을 가지는 miRNAx로 효율적으로 주형 스위칭하였다(3회에 걸쳐 별개로 실시된 실험에서, U, 43-59%; G, 29-30%; C, 17-19%; 및 A, 4-12%). 따라서, 상이한 기하학적 구조 및 뉴클레오티드 서열을 가지는 RNA 주형/DNA 프라이머 기질, 예컨대, G/C 염기쌍으로 종결되는 말단을 가지는 평활 말단 RNA 주형/DNA 프라이머 기질을 사용하는 것은 주형 스위칭 편향성을 최소화시키는 데 사용될 수 있다.
도 9A에는 cDNA의 3' 말단에의 하나의 뉴클레오티드 잔기의 비주형 부가로 예상되는 구조를 모방하면서, 프라이밍 가닥의 상이한 3' 오버행을 가지는 IA-P1 RNA 주형/Pc DNA 프라이머 기질 세트를 이용하는 제2 접근법이 제시되어 있다. 그 결과, 예상대로 상기 주형/프라이머 기질은 상보적인 3'-뉴클레오티드 잔기를 가지는 RNA 주형 상에서의 개시를 선호하는 것으로 나타났는데, 그러나, 어느 정도로는 여전히 다른 3' 말단 뉴클레오티드를 가지는 RNA로의 주형 스위칭이 이루어질 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, 3' A 오버행을 가지는 주형/프라이머 기질은 상보적인 3' U 잔기를 가지는 miRNAx로의 주형 스위칭을 강하게 선호하는 것으로 나타났고; 3' C 오버행 주형을 가지는 주형/프라이머 기질은 상보적인 3' G 잔기를 가지는 miRNAx 뿐만 아니라, 비상보적인 3' C 잔기를 가지는 miRNAx로도 효율적으로 스위칭하였으며; 3'G 오버행 주형을 가지는 주형/프라이머 기질은 상보적인 3' C 잔기를 가지는 miRNAx 뿐만 아니라, 비상보적인 3' G 잔기를 가지는 miRNA로도 효율적으로 스위칭하였고; 3' T 오버행 주형을 가지는 주형/프라이머 기질은 상보적인 3'A 잔기를 가지는 miRNAx로는 효율적으로 스위칭하였고, 3' G 잔기를 가지는 miRNAx로는 다소 덜 효율적으로 스위칭하였는데; 이는 가능하게는 TG 염기쌍 형성을 반영하는 것일 수 있다. 일부 경우에서, (-1 위치에) 비상보적인 3' 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 RNA로의 주형 스위칭은 -2 또는 -3 위치에서의 뉴클레오티드 잔기에 대한 염기쌍 형성을 반영할 수 있다(예컨대, 3' G 오버행을 가지는 프라이머는 2개의 말단 뉴클레오티드 잔기를 건너뛰면서, miRNA 주형의 -3 위치에서 C 잔기와 염기쌍을 형성함으로써 개시할 수 있다). 비록 레트로바이러스 RT는 RT에 의해 부가된 비주형 뉴클레오티드와 새로운 RNA 주형의 3' 말단 사이의 상보성을 사용하여 주형 스위칭을 할 수 있지만, 상기 반응을 위해서는 2개 이상의 염기쌍이 필요하고, 그중 하나는 상대적으로 안정적인 GC 또는 CG 쌍이어야 한다(문헌 [Oz-Gleenberg et al. 2011]). 심지어 TeI4c-MRF RT의 작동 온도인 60℃에서도 주형 스위칭을 촉진시키는 데 임의 유형인 유일의 단일의 염기쌍도 충분하기 때문에, TeI4c-MRF RT의 주형 스위칭 반응은 신규한 것이다.
중요하게는 상이한 3' 오버행을 가지는 주형/프라이머 기질의 혼합물이 상이한 주형에 대하여 훨씬 감소된 편향성을 보였다. 예를 들어, 3회에 걸쳐 별개로 실시된 실험에서, 등몰의, 4가지 가능한 3' 오버행 중 각각의 것을 가지는 주형/프라이머 기질의 혼합물은 하기와 같이 상이한 3' 뉴클레오티드 잔기를 가지는 miRNA로 스위칭하였다: A, 15-27%; C, 28-30%; G, 28-30%; 및 U, 16-27%(각 겔 레인에서의 총 방사능에 대해 정규화한 후 주형 스위치의 총 개수의 백분율로서 계산됨). 따라서, 상이한 3' DNA 오버행을 가지는 RNA 주형/DNA 프라이머 기질을 적절한 비로 함유하는 혼합물을 사용함으로써 비공지 서열의 RNA의 cDNA 합성 및 클로닝을 위한 주형 스위칭 편향성을 감소시킬 수 있다. 반대로, 특이적인 3' DNA 오버행을 가지는 RNA 주형/DNA 프라이머 기질을 사용함으로써 별개로 공지된 서열의 특이 RNA를 우선적으로 증폭시킬 수 있다.
추가의 특징 규명을 통해 II군 인트론 RT에 의한 주형 스위칭 반응은 (i) 종래 RN아제 또는 알칼리 절단으로부터 생성되는 3' 포스페이트에 의해 억제되지만, 3' 포스페이트 제거에 의해서 회복될 수 있고; (ii) DNA 뿐만 아니라, RNA에서도 일어날 수 있다(3' 말단 뉴클레오티드 상의 2' OH 기가 필요한 것은 아니라는 것을 시사한다)(도 9B)는 것으로 나타났다. 따라서, miRNA 클로닝 및 서열 분석 이외에도, II군 인트론 RT에 의한 주형 스위칭은 예컨대, HITS-CLIP/CRAC 또는 리보솜 프로파일링과 같은 방법에서 RN아제 분해에 의해 생성된 단백질 결합 RNA 단편의 클로닝 및 서열 분석(문헌 [Polidoros et al. 2006], [Holton & Graham 1991], [Granneman et al. 2009], [Zhang & Darnell 2011], [Ingolia et al. 2009]); 및 짐적컨대, DNAseq 라이브러리의 구성에서도 유용하여야 한다.
실시예 9: 추가의 II 군 인트론 RT 및 RNA / DNA 또는 DNA / DNA 주형/ 프라이머 기질을 이용한 주형 스위칭
도 10에 제시된 바와 같이, GsI-IIC-MRF II군 인트론을 사용하여 3' 오버행 기질로부터의 주형 스위칭을 입증하였다. 상기 도면에서는 프라이머를 miRNA 서열에 연결하기 위한 주형 스위칭의 용도가 입증되었고, 더욱 일반적으로는 상이한 구조 서브부류(IIC 서브군)에 속하는 제3의 II군 RT, GsI-IIC-MRF가 각각 서브군 IIA 및 IIB에 속하는 Ll.LtrB 및 TeI4c-MRF RT와 동일한 주형 스위칭 반응을 수행하였다는 것을 보여준다. 주형 스위칭의 또 다른 예는 도 11에서 제공하는데, 여기서는 TeI4c-MRF RT를 사용한 초기 RNA/DNA 또는 DNA/DNA 주형/프라이머 기질로부터의 주형 스위칭이 제시되어 있다. 비록 RNA/DNA 주형 프라이머 기질이 더 효율적이기는 하지만, 어느 유형의 주형/프라이머 기질든 주형 스위칭을 수행하는 데에는 적합하다는 것이 상기 도면에서 입증되었다.
실시예 10: miRNA 클로닝 및 서열 분석을 위한 II 군 인트론 RT 에 의한 주형 스위칭의 용도
라이브러리 구성을 위한 그의 유용성을 평가하기 위해, II군 인트론 RT에 의한 주형 스위칭, 및 종래 RNA 결찰 방법을 사용하는 시판용 키트 2개(어플라이드 바이오시스템즈™ 및 뉴 잉글랜드 바이오랩스™)를 사용하여 963개의 등몰의 miRNA로 구성된 참조 세트로 이루어진 SOLiD 서열 분석용 라이브러리를 작성하였다. 이어서, 독특하게 식별가능한 핵심 서열을 포함하는 898개의 miRNA의 라이브러리 존재비를 비교하였다. 플롯은, 상이한 비로 3' 오버행(TS1 및 TS2)을 가지는 주형-프라이머 기질로부터의 TeI4c-MRF RT에 의한 주형 스위칭에 의해 제조된 2개의 라이브러리가 두 시판용 키트에 의해 제조된 것보다 miRNA 서열 분포에 있어서 더 균일(더 평평한 선)하다는 것을 나타낸다(도 12A). 이상치를 분석하여 전체 라이브러리 중에서 과소출현된 9개의 miRNA를 확인하였지만, 상이한 방법에 의해서 과소출현하거나 과다출현한 miRNA 사이에 중복은 거의 없었다(각각 도 12B 및 C). 도 13은 II군 인트론 RT에 의한 주형 스위칭에 의해 작성된 cDNA 라이브러리 중 상이한 3' 말단 뉴클레오티드를 가지는 miRNA의 출현은 A, C, G, 또는 T 3' 오버행을 상이한 비로 가지는 주형/프라이머 기질을 사용함으로써 조정될 수 있다는 것을 나타낸다.
종합해보면, 상기 결과는 반응 배지 중에서 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥과 회합된 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드로 구성된 이중 가닥 주형/프라이머 기질을 표적 폴리뉴클레오티드와 혼합하고, 적합한 양의 II군 인트론 역전사 효소를 반응 배지에 첨가하여 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드를 그의 3' 말단으로부터 연장시킴으로써 주형으로서 표적 폴리뉴클레오티드를 사용하여 합성되는 상보적인 표적 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 카피 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것인, 주형 스위칭을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 DNA 카피를 제조하는 방법을 입증한다.
본 결과는 또한 반응 배지 중에서 이중 가닥 주형/프라이머 기질을 표적 폴리뉴클레오티드와 혼합하고, 적합한 양의 비레트로바이러스 역전사 효소를 반응 배지에 첨가하여 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드를 그의 3' 말단으로부터 연장시킴으로써 주형으로서 표적 폴리뉴클레오티드를 사용하여 합성되는 상보적인 표적 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 카피 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것인, 주형 스위칭을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 DNA 카피를 제조하는 방법도 입증한다. 본 실시양태에서, DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드는 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥의 5' 말단과 일직선으로 정렬되는 것인 평활 말단, 또는 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥의 5' 말단보다 1개의 뉴클레오티드만큼 더 연장되어 있는 것인 오버행을 가진다.
본 결과는 또한 이중 가닥 주형/프라이머 기질을 포함하는 반응 배지에 적합한 양의 비레트로바이러스 역전사 효소를 첨가하고, 여기서, II군 인트론은 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 1-15개의 추가의 비상보적인 뉴클레오티드를 부가하는 것인 단계를 포함하는, 추가의 뉴클레오티드를 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드에 부가하는 방법을 입증한다.
참조 문헌
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
본원에서 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공개문헌, 및 전자적으로 이용가능한 자료의 개시내용 전문은 참고로 인용된다. 상기의 상세한 설명 및 실시예는 단지 명확한 이해를 위해 제공된 것이다. 그로부터 이해하여야 한다는 불필요한 제한은 없다. 본 발명은 제시되고 기술된 정확한 설명으로 제한되지 않으며, 변형도 본 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명 내에 될 것이라는 당업자에게 명백하다.
SEQUENCE LISTING <110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM, AUSTIN, TX <120> USE OF TEMPLATE SWITCHING FOR DNA SYNTHESIS <130> 30159/04024 <140> <141> <150> 61/445,761 <151> 2011-02-23 <160> 137 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 gugcgcccag auaggguguu aagucaagua 30 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 aacaccctat ctgggcgcac 20 <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 3 Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn Ser Ser Ser Asn 1 5 10 15 Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 20 25 30 Gly <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 4 Thr Val Asp Ala Ala Leu 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unknown or other <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 51 aaggcggtga tttntnnntn aagcgcaaac ccctcaaa 38 <210> 52 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 aaggcgctga tttctctctg aagcgccaac ccccctca 38 <210> 53 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 aaggcgacga tttctctctg aagcgccagc aggacgttca tg 42 <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 54 taacgugcgc ccagauagg 19 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 cctatctggg cgcacgtta 19 <210> 56 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 56 cctatctggg cgca 14 <210> 57 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 57 cctatctggg cgcac 15 <210> 58 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 58 cctatctggg cgcacaa 17 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 59 cctatctggg cgcacaaa 18 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 60 cctatctggg cgcacaagtt a 21 <210> 61 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 61 cctatctggg cgcacgtta 19 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 62 cctatctggg cgcacagtta 20 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 cctatctggg cgcacaagtt a 21 <210> 64 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 64 uaacgugcgc ccagauagg 19 <210> 65 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 tctatctggg cgcac 15 <210> 66 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 cctatctggg cgcacat 17 <210> 67 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 67 cctatctggg cgcacaga 18 <210> 68 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 68 cctatctggg ctcacaaaa 19 <210> 69 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 cctatctggg cgcacatta 19 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 cctatctggg cgcacgatta 20 <210> 71 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 71 cctatctggg cgcacctta 19 <210> 72 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 72 cctatctggg cgcactta 18 <210> 73 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 73 cctatctggg cgcacatta 19 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 74 cctatctgag cgcacaagtt a 21 <210> 75 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 catatcattt 10 <210> 76 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 aaatgatatg 10 <210> 77 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 77 aaatgatatg ccca 14 <210> 78 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 aaatgatatg cccaaa 16 <210> 79 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 79 aaatgatatg ccccaa 16 <210> 80 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 80 aaatgatatg cccgaa 16 <210> 81 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 aaatgatatg cccaaaa 17 <210> 82 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 82 aaatgatatg cccccaa 17 <210> 83 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 aaatgatatg ccccccc 17 <210> 84 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 aaatgatatg ccccgaa 17 <210> 85 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 aaaatgatat gccca 15 <210> 86 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 aaaatgatat gcccg 15 <210> 87 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 87 aaaccauauc auuu 14 <210> 88 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 88 aaatgatatg gttt 14 <210> 89 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 89 tatgcccaaa 10 <210> 90 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 90 aaatgatatg cccgggttt 19 <210> 91 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 91 tatgcccgaa 10 <210> 92 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 92 aaatgatatg ccccggttt 19 <210> 93 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 93 tatgcccggg ttt 13 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 94 aaatgatatg cccggggttt 20 <210> 95 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 95 tatgcccggg gttt 14 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 96 aaatgatatg cccaggggtt t 21 <210> 97 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 97 tatgccccag 10 <210> 98 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 98 tatgcccctg gttt 14 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 99 aaatgatatg ccccccgttt 20 <210> 100 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 100 tatgcccagg ttt 13 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 aaatgatatg cccgaggggg ttt 23 <210> 102 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 tatgcccact ggttt 15 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 aaatgatatg cccctgggtt t 21 <210> 104 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 tatgcccagg ggttt 15 <210> 105 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 aaatgatatg ccccactggt tt 22 <210> 106 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 tatgcccaaa a 11 <210> 107 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 107 tatgccccag ggttt 15 <210> 108 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 aaatgatatg ccccggttt 19 <210> 109 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 tatgcccaat 10 <210> 110 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 tatgccctgg gttt 14 <210> 111 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 111 aaatgatatg cccagggggt tt 22 <210> 112 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 tatgcccaaa a 11 <210> 113 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 tatgccccag gttt 14 <210> 114 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 aaatgatatg cccctgggtt t 21 <210> 115 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 tatgcccggt tt 12 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 aaatgatatg cccaaacgca g 21 <210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 117 aggatttctc tctgaagcgc t 21 <210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 118 acgatttctc tctgaagcgc t 21 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 aggatttctc tctgaagcgc c 21 <210> 120 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 120 aagatttctc tctgaagcgc t 21 <210> 121 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 121 acgatttctc tctgaagcgc c 21 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 122 atgatttctc tctgaagcgc t 21 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 123 aggatttctc tctgaagcgc a 21 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 acgatttctc tctgaagcga t 21 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 125 acgatttctc tctgaagcgt a 21 <210> 126 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 acgatttctc tctgaagcgt t 21 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 atgatttctc tctgaagcgc c 21 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 aggatttctc tctgaagcgt c 21 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 129 aggatttctc tctgaagcgt t 21 <210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 atgatttctc tctgaagcgc a 21 <210> 131 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 131 aggatttctc tctgaagcga c 21 <210> 132 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 aggatttctc tctgaagcgc ca 22 <210> 133 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 acgatttctc tctgaagcgc ca 22 <210> 134 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 atgatttctc tctgaagcgc ca 22 <210> 135 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 atgatttctc tctgaagcga ca 22 <210> 136 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 aggatttctc tctgaagcga ca 22 <210> 137 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 137 gccgcuucag agagaaaucg n 21

Claims (33)

  1. 반응 배지 중에서 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥에 회합된 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드로 구성된 1 이상의 이중 가닥 주형/프라이머 기질을 1 이상의 표적 폴리뉴클레오티드와 혼합하는 단계, 및
    적합한 양의 비레트로바이러스 역전사 효소를 반응 배지에 첨가하여 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드를 그의 3' 말단으로부터 연장시킴으로써 주형으로서 표적 폴리뉴클레오티드를 사용하여 합성되는 상보적인 표적 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 카피 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계
    를 포함하고, 여기서, 이중 가닥 주형/프라이머 기질은, DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥의 5' 말단과 일직선으로 정렬되는(directly aligned) 것인 평활 말단, 또는 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥의 5' 말단보다 1개의 뉴클레오티드만큼 더 연장되어 있는 것인 오버행 말단을 가지는 것인, 주형 스위칭을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 DNA 카피를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 RNA로 구성된 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 miRNA인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 DNA로 구성된 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥이 RNA로 구성된 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥이 DNA로 구성된 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 이중 가닥 주형/프라이머 기질이 오버행 말단을 가지고, 여기서, 2-4개의 상이한 뉴클레오티드로 구성된 오버행 말단을 가지는 복수 개의 상이한 이중 가닥 주형/프라이머 기질이 사용되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드가 오버행 말단을 가지고, 여기서, 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 있는 뉴클레오티드가 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 있는 뉴클레오티드에 상보적인 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 비레트로바이러스 역전사 효소는 표적 폴리뉴클레오티드를 카피하여 DNA 카피 폴리뉴클레오티드를 합성하기 이전에 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 1-15개의 추가의 비상보적인 뉴클레오티드를 부가하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 비레트로바이러스 역전사 효소가 오직 단일의 추가의 비상보적인 뉴클레오티드만을 부가하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥의 3' 말단이 차단제에 의해 종결되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 비레트로바이러스 역전사 효소가 II군 인트론 역전사 효소인 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 복수 개의 상이한 표적 폴리뉴클레오티드를 사용하여 복수 개의 DNA 카피 폴리뉴클레오티드의 클로닝 라이브러리를 제조하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, DNA 카피 폴리뉴클레오티드를 폐환화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 반응 배지 중에서 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥에 회합된 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드로 구성된 1 이상의 이중 가닥 주형/프라이머 기질을 1 이상의 표적 폴리뉴클레오티드와 혼합하는 단계, 및
    적합한 양의 II군 인트론 역전사 효소를 반응 배지에 첨가하여 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드를 그의 3' 말단으로부터 연장시킴으로써 주형으로서 표적 폴리뉴클레오티드를 사용하여 합성되는 상보적인 표적 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 카피 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계
    를 포함하는, 주형 스위칭을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 DNA 카피를 제조하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 RNA로 구성된 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 miRNA인 것인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 DNA로 구성된 것인 방법.
  19. 제15항에 있어서, 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥이 RNA로 구성된 것인 방법.
  20. 제15항에 있어서, 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥이 DNA로 구성된 것인 방법.
  21. 제15항에 있어서, 이중 가닥 주형/프라이머 기질이, DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥의 5' 말단과 일직선으로 정렬되는 것인 평활 말단을 가지는 것인 방법.
  22. 제15항에 있어서, 이중 가닥 주형/프라이머 기질이, DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥의 5' 말단보다 1개의 뉴클레오티드만큼 더 연장되어 있는 것인 오버행 말단을 가지는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 2-4개의 상이한 뉴클레오티드로 구성된 오버행 말단을 가지는 복수 개의 상이한 이중 가닥 주형/프라이머 기질이 사용되는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 있는 뉴클레오티드가 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 있는 뉴클레오티드에 상보적인 것인 방법.
  25. 제15항에 있어서, 역전사 효소는 표적 폴리뉴클레오티드를 카피하여 DNA 카피 폴리뉴클레오티드를 합성하기 이전에 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 1-15개의 추가의 비상보적인 뉴클레오티드를 부가하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 역전사 효소가 오직 단일의 추가의 비상보적인 뉴클레오티드만을 부가하는 것인 방법.
  27. 제15항에 있어서, 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥의 3' 말단이 차단제에 의해 종결되는 것인 방법.
  28. 제15항에 있어서, 복수 개의 상이한 표적 폴리뉴클레오티드를 사용하여 복수 개의 DNA 카피 폴리뉴클레오티드의 클로닝 라이브러리를 제조하는 것인 방법.
  29. 제15항에 있어서, DNA 카피 폴리뉴클레오티드를 폐환화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  30. 상보적인 올리고뉴클레오티드 주형 가닥에 회합된 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드로 구성된 이중 가닥 주형/프라이머 기질을 포함하는 반응 배지에 적합한 양의 비레트로바이러스 역전사 효소를 첨가하는 단계를 포함하고, 여기서 비레트로바이러스 역전사 효소가 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 1-15개의 추가의 비상보적인 뉴클레오티드를 부가하는 것인, 추가의 뉴클레오티드를 DNA 프라이머 올리고뉴클레오티드에 부가하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 비레트로바이러스 역전사 효소가 II군 인트론 역전사 효소인 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 1-6개의 추가의 비상보적인 뉴클레오티드를 부가하는 것인 방법.
  33. 제30항에 있어서, 단일의 비상보적인 뉴클레오티드를 부가하는 것인 방법.
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