WO2013115067A1 - 核酸合成反応の向上方法 - Google Patents

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清之 松村
上森　隆司
向井　博之
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タカラバイオ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for improving the reactivity of a nucleic acid synthesis reaction, a composition for a nucleic acid synthesis reaction, and a reaction buffer for a nucleic acid synthesis reaction.
  • a nucleic acid synthesis method in particular, a polymerase chain reaction (PCR) method, is a technique for simply amplifying a desired nucleic acid fragment in a test tube.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Non-patent Documents 1 and 2 In nucleic acid synthesis reactions using DNA polymerase such as PCR, reactivity such as specificity often becomes a problem. In order to avoid non-specific nucleic acid synthesis reactions, attempts have been made to develop new DNA polymerases, improve primer design methods, optimize reaction solution compositions, add compounds, and the like. For example, it has been found that addition of betaine is effective for amplification of a GC-rich template (Non-patent Documents 1 and 2).
  • An object of the present invention is to provide a method for improving the reactivity of a nucleic acid synthesis reaction, a composition for a nucleic acid synthesis reaction, and a reaction buffer for a nucleic acid synthesis reaction.
  • the present inventors have found that the reactivity of the nucleic acid synthesis reaction can be improved by adding an ⁇ -amino acid to the reaction solution of the nucleic acid synthesis reaction, and the present invention has been completed.
  • the present invention [1] A method for improving the reactivity of a nucleic acid synthesis reaction, comprising a step of adding an ⁇ -amino acid to a reaction solution, [2] The method according to [1], wherein the ⁇ -amino acid is a compound represented by the following formula 1: (Wherein n is an integer of 2 or more), [3] The method according to [2], wherein n is an integer of 2 or more and 7 or less.
  • nucleic acid synthesis reaction is a polymerase chain reaction
  • method according to [1] comprising a step of preparing a reaction solution containing an ⁇ -amino acid, a DNA polymerase, at least one primer, and at least one deoxyribonucleotide triphosphate.
  • composition according to [7], further containing betaine [10] Reaction buffer for nucleic acid synthesis reaction containing ⁇ -amino acid, [11] The reaction buffer according to [10], wherein the ⁇ -amino acid is a compound represented by formula 1 represented by [2], [12] The reaction buffer according to [10], further containing betaine, [13] A kit for nucleic acid synthesis reaction comprising the following components: DNA polymerase, reaction buffer, at least one deoxyribonucleotide triphosphate, and ⁇ -amino acid, [14] The kit according to [13], wherein the ⁇ -amino acid is a compound represented by formula 1 represented by [2]. [15] The kit according to [13], further comprising betaine.
  • the present invention provides a method for improving the reactivity of a nucleic acid synthesis reaction, a composition for a nucleic acid synthesis reaction excellent in reactivity, and a reaction buffer for a nucleic acid synthesis reaction.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis in Example 1.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis in Example 2.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis in Example 3. It is a figure which shows the result of the agarose gel electrophoresis in Example 4. It is a figure which shows the result of the agarose gel electrophoresis in Example 5.
  • the method for improving the reactivity of the nucleic acid synthesis reaction of the present invention includes a step of adding ⁇ -amino acid to the reaction solution.
  • the reactivity of the nucleic acid synthesis reaction can be improved by performing a nucleic acid synthesis reaction with DNA polymerase in a reaction solution containing ⁇ -amino acids.
  • the present invention also provides a method for synthesizing a nucleic acid having excellent reactivity.
  • the nucleic acid synthesis reaction in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a reaction that synthesizes DNA or RNA as a template and complementary DNA thereto.
  • Primer extension reaction, reverse transcription reaction, PCR, reverse transcription polymerase chain Well-known nucleic acid synthesis reactions such as reaction (RT-PCR), ICAN method, LAMP method, SDA method and the like are exemplified.
  • the improvement in the reactivity of the nucleic acid synthesis reaction is not particularly limited to the present invention.
  • the reactivity of the nucleic acid synthesis reaction can be improved by adding an ⁇ -amino acid to the reaction solution.
  • the present invention is not particularly limited, it is estimated from the effect of improving the reactivity of the nucleic acid synthesis reaction produced by the ⁇ -amino acid revealed by the present invention, the specificity of primer priming in the nucleic acid synthesis reaction is estimated by the ⁇ -amino acid.
  • the reactivity of a nucleic acid synthesis reaction with ⁇ -amino acid is improved by, for example, performing a nucleic acid synthesis reaction using a reaction solution containing ⁇ -amino acid and a reaction solution not containing ⁇ -amino acid, and then reacting the reaction solution after the reaction. Can be confirmed by comparing the reaction specificity of the nucleic acid synthesis reaction and the synthesis amount of DNA having the target nucleic acid sequence.
  • nucleic acid amplification is monitored using intercalating dyes or FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) labeled probes, and the reaction specificity of the nucleic acid synthesis reaction or the amount of DNA synthesized having the target nucleic acid sequence is added to the reaction solution. This can also be confirmed by comparing with and without the ⁇ -amino acid.
  • the improvement in the reaction specificity is evaluated, for example, from a decrease in the frequency of nonspecific nucleic acid amplification and a decrease in the amount of synthesis of the nucleic acid.
  • an amino acid means an amino acid in a broad sense, and includes those containing a sulfonic acid group instead of a carboxyl group.
  • the ⁇ -amino acid is an amino acid having a primary amino group bonded to the end of the carbon chain opposite to the carbon to which the carboxyl group or sulfonic acid group is bonded, and is classified as an ⁇ -amino acid. It means the amino acid except.
  • ⁇ -amino acids also include ⁇ -amino acids, ⁇ -amino acids, ⁇ -amino acids, and ⁇ -amino acids.
  • ⁇ -amino acids used in the present invention include ⁇ -amino acids having 3 or more carbon atoms, and ⁇ -amino acids having 3 to 8 carbon atoms are preferred. Is exemplified. Examples of such ⁇ -amino acids include the following: (In the formula, n is an integer of 2 or more.) In particular, compounds in which n is an integer of 2 or more and 7 or less in the compound represented by Formula 1 are more preferable.
  • Examples of the ⁇ -amino acid represented by the above formula 1 include ⁇ -alanine, ⁇ -amino-n-butyric acid (GABA), ⁇ -aminopentanoic acid (5-aminopentanoic acid), ⁇ -aminohexanoic acid (6 -Aminohexanoic acid), ⁇ -aminoheptanoic acid (7-aminoenanthic acid), and 8-aminooctanoic acid, 9-aminononanoic acid, and 10-aminodecanoic acid.
  • GABA ⁇ -aminopentanoic acid
  • 5-aminopentanoic acid ⁇ -aminohexanoic acid
  • 6 -Aminohexanoic acid ⁇ -aminoheptanoic acid
  • 8-aminooctanoic acid 9-aminononanoic acid, and 10-aminodecanoic acid.
  • ⁇ -amino acid is added to the reaction solution in an amount effective for improving the reactivity of the nucleic acid synthesis reaction by DNA polymerase.
  • concentration of the ⁇ -amino acid in the reaction solution that can be expected to improve the reactivity of the nucleic acid synthesis reaction can be easily determined by, for example, the confirmation method for the improvement of the reactivity of the nucleic acid synthesis reaction described above.
  • the present invention is not particularly limited, for example, when 6-aminohexanoic acid is used as the ⁇ -amino acid in the method of the present invention, the concentration of 6-aminohexanoic acid in the reaction solution is preferably less than 300 mM.
  • the concentration of ⁇ -alanine in the reaction solution is preferably 1 M or less, more preferably 100 mM to 500 mM, further preferably 250 to 500 mM, for example 500 mM. .
  • the optimal concentration range of the ⁇ -amino acid in the reaction solution can be easily confirmed according to the type of DNA polymerase used, the target sequence, and the like, for example, by the same method as in Example 4 and Example 5 described later. it can.
  • the reaction solution for the nucleic acid synthesis reaction in the method of the present invention comprises a composition containing ⁇ -amino acid, DNA polymerase, reaction buffer, at least one primer, at least one deoxyribonucleotide, and a nucleic acid as a template.
  • a composition comprising a DNA polymerase, a reaction buffer, at least one primer, at least one deoxyribonucleotide, and an ⁇ -amino acid is an aspect of the present invention.
  • a kit containing a DNA polymerase, a reaction buffer, at least one deoxyribonucleotide triphosphate, and an ⁇ -amino acid is also an embodiment of the present invention.
  • the kit may contain one or more primers.
  • any DNA polymerase can be used in the present invention as long as it has an activity of synthesizing DNA complementary to DNA or RNA as a template.
  • the DNA polymerase used in the present invention is particularly preferably a heat-resistant DNA-dependent DNA polymerase.
  • thermostable DNA polymerases derived from eubacteria such as DNA polymerases derived from Thermos bacteria (Thermus aquaticus-derived DNA polymerases) and thermophilic Bacillus bacteria-derived DNA polymerases (Bacillus caldotenax-derived DNA polymerases, etc.), And Pyrococcus archaea-derived DNA polymerase (Pyrococcus sp.-derived DNA polymerase, etc.) and Thermococcus archaea-derived DNA polymerase (Thermococcus kodakaraensis-derived DNA polymerase etc.) are exemplified.
  • Two or more DNA polymerases may be used in combination as the DNA polymerase.
  • Examples of the two or more types of DNA polymerases include a combination of a DNA polymerase having 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity and a DNA polymerase having substantially no 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity.
  • a technique for performing PCR using a reaction solution containing two types of DNA polymerases is known as LA-PCR (Long and Accurate PCR).
  • the amount of DNA polymerase used in the method of the present invention is not particularly limited.
  • an amount used in a conventional nucleic acid synthesis reaction may be used.
  • suitable amounts of DNA polymerase used are well known to those skilled in the art.
  • the amount of the enzyme in the reaction solution is 0.125 U to 5 U.
  • the reaction buffer means a compound or a mixture having an action of reducing the fluctuation of the hydrogen ion concentration (pH) of the reaction solution.
  • a mixed solution of a weak acid and its salt or a weak base and its salt is widely used as a reaction buffer for the purpose of pH control because it has a strong buffering action.
  • Various reaction buffers known in the biochemical field can be used in the present invention.
  • reaction buffers such as Good buffer such as Tris hydrochloric acid, Tris acetic acid, HEPES potassium hydroxide, and HEPES sodium hydroxide, and phosphate buffer can be used.
  • the pH of the reaction solution in the method of the present invention is suitably set in the usual range in which the gene amplification reaction is carried out, for example, the pH at 25 ° C. is in the range of 8.0 to 9.5.
  • the primer is an oligonucleotide having a base sequence complementary to the template nucleic acid, and is not particularly limited as long as it anneals to the template nucleic acid under the reaction conditions used.
  • the primer chain length is preferably 6 nucleotides or more, more preferably 10 nucleotides or more from the viewpoint of specific annealing, and preferably 100 nucleotides or less, more preferably from the viewpoint of oligonucleotide synthesis. Is 30 nucleotides or less.
  • the oligonucleotide may be chemically synthesized by a known method, for example. Moreover, it may be an oligonucleotide derived from a biological sample, for example, isolated from a restriction endonuclease digest of DNA prepared from a natural sample.
  • Deoxyribonucleotide is a compound in which a phosphate group is bonded to deoxyribose bonded to an organic base via a phosphoester bond.
  • deoxyribonucleotides each having adenine, guanine, cytosine and thymine bases, are found in natural DNA.
  • the bases adenine, guanine, cytosine, and thymine are often abbreviated as A, G, C, and T, respectively.
  • Deoxyribonucleotides include free monophosphate, diphosphate, and triphosphate types (ie, the phosphate group has one, two, or three phosphate moieties, respectively).
  • deoxyribonucleotide triphosphates having hypoxanthine or uracil in the base moiety can also be used for nucleic acid synthesis reactions.
  • at least one of deoxyribonucleotide triphosphates eg, dATP, dCTP, dITP, dGTP, and dTTP
  • deoxyribonucleotide triphosphates contained in the composition of the present invention include four types of mixtures of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP.
  • the step of adding the ⁇ -amino acid to the reaction solution in the method of the present invention may be carried out at any stage of the preparation of the reaction solution, and preferably before the reaction solution is incubated at a temperature suitable for the nucleic acid synthesis reaction.
  • a ⁇ -amino acid is added in advance to a solution containing a reaction buffer (reaction buffer), and the reaction buffer, at least one primer, at least one deoxyribonucleotide triphosphate, and a template are added.
  • a nucleic acid synthesis reaction may be carried out after preparing a reaction solution by combining with a nucleic acid.
  • a reaction buffer for nucleic acid synthesis containing ⁇ -amino acids is a preferred embodiment of the present invention.
  • the reaction buffer may further contain divalent cations and / or monovalent cations, their salts, and other components useful for nucleic acid synthesis reactions.
  • the divalent cation include divalent metal ions such as magnesium ions and manganese ions.
  • the monovalent cation sodium ion, potassium ion, ammonium ion and the like are preferably exemplified.
  • Preferred examples of other components useful for the nucleic acid synthesis reaction include anionic surfactants, nonionic surfactants, tetramethylammonium salts, and the like.
  • the method of the present invention may further include a step of adding betaine to the reaction solution.
  • the step of adding betaine to the reaction solution in the method of the present invention may be carried out at any stage of the preparation of the reaction solution, preferably before the reaction solution is subjected to incubation at a temperature suitable for the nucleic acid synthesis reaction. Is done.
  • the composition of the present invention and the reaction buffer of the present invention may contain betaine.
  • betaine has a positive charge and a negative charge at non-adjacent positions in the same molecule, and a positively charged atom has no dissociable hydrogen atom bonded thereto, and the molecule as a whole has a charge. It refers to the generic term for compounds that do not exist. Examples of typical betaines include trimethylglycine and its derivatives.
  • Betaine is known as an additive for improving the reactivity of nucleic acid synthesis reaction.
  • the inventors of the present application have found that ⁇ -amino acid and betaine have a synergistic effect on improving the reactivity of the nucleic acid synthesis reaction.
  • the addition of a high concentration of ⁇ -amino acid can suppress the nucleic acid amplification reaction, but it has also been observed that this suppression is eliminated by the addition of betaine.
  • the amount of betaine added in the method of the present invention is not particularly limited as long as the reactivity of the nucleic acid synthesis reaction by betaine is improved, but is preferably 0.1 M or more and 3 M or less, more preferably 0.3 M or more. 2.5M or less.
  • the present invention can also be used for real-time PCR capable of monitoring nucleic acid amplification using an intercalating dye, a FRET labeled probe, or the like.
  • the reaction solution, the composition of the present invention, and the reaction buffer of the present invention in the method of the present invention may contain an intercalating dye or a FRET labeled probe.
  • Example 1 After dissolving ⁇ -alanine (SIGMA-ALDRICH) in ultrapure water (Milli-Q water), 5M ⁇ -alanine adjusted to pH 8.5 by dropwise addition of Tris acetate buffer (pH 8.9). A solution was prepared. Similarly, 2M 6-aminohexanoic acid solution prepared by dissolving 6-aminohexanoic acid (SIGMA-ALDRICH) in MilliQ water and then adjusting the pH to 8.5, and 8-aminooctanoic acid (SIGMA-ALDRICH) was dissolved in Milli-Q water, and then a 1M 8-aminooctanoic acid solution having a pH adjusted to 8.5 was prepared. Betaine (trimethylglycine; SIGMA-ALDRICH, B2629) was dissolved in milliQ water to prepare a 5M betaine solution. These were used for the preparation of the following reaction solutions.
  • Human genomic DNA 100 ng as a template, using a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 as a primer pair, 987 bp of the TGF ⁇ 1 gene region (GC ratio 72.3%)
  • a PCR reaction solution for amplifying the protein was prepared on ice using TaKaRa Ex Taq (registered trademark) Hot Start Version (Takara Bio Inc.).
  • the PCR reaction solution is a ⁇ -amino acid having a final concentration of 500 mM ⁇ -alanine, a final concentration of 100 mM 6-aminohexanoic acid, or a final concentration of 50 mM 8 mM.
  • -Four kinds of reaction liquids were prepared in total: 20 ⁇ L reaction liquid containing aminooctanoic acid and 20 ⁇ L reaction liquid not containing ⁇ -amino acid as a control.
  • four kinds of reaction solutions containing betaine (trimethylglycine) having a final concentration of 300 mM were prepared.
  • Example 2 PCR reaction such that Pyrobest (registered trademark) DNA Polymerase (Takara Bio) is used instead of TaKaRa Ex Taq (registered trademark) (Takara Bio), and the final concentration of betaine is 1 M in the reaction solution containing betaine
  • Pyrobest (registered trademark) DNA Polymerase is available from Pyrococcus sp. This product contains the derived DNA polymerase.
  • FIG. 2 shows the results of subjecting 4 ⁇ L of the reaction solution after PCR to agarose gel electrophoresis.
  • M indicates a lane subjected to electrophoresis of 200 ng of a 1 kb DNA Ladder (Takara Bio) marker.
  • Takara Bio DNA Ladder
  • the PCR reaction solution contained betaine in addition to the ⁇ -amino acid, almost no non-specific amplification was observed, and the desired product of 987 bp was specifically amplified.
  • the reaction solution containing ⁇ -alanine and the PCR reaction solution containing 6-aminohexanoic acid and betaine the amplification amount of the target product of 987 bp was increased as compared with the reaction using the PCR reaction solution containing only betaine. .
  • Example 3 Instead of the primer pair that amplifies the TGF ⁇ 1 gene region, Homo sapiens DNA, translocation breakpoint sequences on 22q11: Type C (GenBank: AB261999.1) region of 965 bp (GC ratio 35.4%) The effect of the ⁇ -amino acid was confirmed in the same manner as in Example 1 except that the primer having the base sequence of No. 4 and the primer having the base sequence of SEQ ID NO: 4 were used.
  • FIG. 3 shows the results of subjecting 4 ⁇ L of the reaction solution after PCR to agarose gel electrophoresis.
  • M indicates a lane subjected to electrophoresis of 200 ng of a 1 kb DNA Ladder (Takara Bio) marker.
  • Example 4 The concentration of 6-aminohexanoic acid effective for improving the reactivity of the nucleic acid synthesis reaction was verified.
  • Nine kinds of reaction solutions were prepared in combination with 20 ⁇ L of the reaction solution as a control not containing.
  • PCR was performed in the same manner as in Example 1, and 4 ⁇ L of each reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis to confirm the chain length and amplification amount of the amplification product.
  • the results of agarose gel electrophoresis are shown in FIG. In the figure, M indicates a lane subjected to electrophoresis of 200 ng of a 1 kb DNA Ladder (Takara Bio) marker.
  • the addition of 20 mM or more of 6-aminohexanoic acid allows the observation of a band that appears to be derived from the target amplified DNA, and the addition of 200 mM of 6-aminohexanoic acid enables amplification of only the target DNA. Became.
  • Example 5 Instead of a primer pair that amplifies the TGF ⁇ 1 gene region, homo sapiens DNA, translocation breakpoint sequences on 22q11: Type C (GenBank: AB261999.1) region primer pair (primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3) The effective concentration of 6-aminohexanoic acid effective for improving the reactivity of the nucleic acid synthesis reaction was examined in the same manner as in Example 4 except that a primer having a base sequence was used.
  • FIG. 5 shows the results of subjecting 4 ⁇ L of the reaction solution after PCR to agarose gel electrophoresis.
  • M indicates a lane subjected to electrophoresis of 200 ng of a 1 kb DNA Ladder (Takara Bio) marker.
  • the addition of 10 mM or more of 6-aminohexanoic acid resulted in the observation of a band considered to be derived from the target amplified DNA, and the addition of 50 mM, 100 mM, or 200 mM of 6-aminohexanoic acid only allowed the target DNA.
  • the present invention is useful in a wide range of fields such as genetic engineering, biology, medicine and agriculture.
  • SEQ ID NO: 1 Synthetic primer for PCR to amplify of TGF-beta 1 gene.
  • SEQ ID NO: 2 Synthetic primer for PCR to amplify of TGF-beta 1 gene.
  • SEQ ID NO: 3 Synthetic primer for PCR to amplify of translocation breakpoint sequence region.
  • SEQ ID NO: 4 Synthetic primer for PCR to amplify of translocation breakpoint sequence region.

Abstract

　ω－アミノ酸を反応液に添加する工程を含む酸合成反応の反応性の向上方法、ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及びω－アミノ酸を含有する核酸合成反応用の組成物、並びにω－アミノ酸を含有する核酸合成反応用の反応緩衝液を提供する。

Description

核酸合成反応の向上方法
　本発明は、核酸合成反応の反応性の向上方法、核酸合成反応用の組成物、及び核酸合成反応用の反応緩衝液に関する。
　核酸合成方法、特にポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）法は、試験管内において簡便に所望の核酸断片を増幅する技術であり、近年、遺伝子に関する研究のみならず、生物学、医学、農業等の幅広い分野において不可欠な実験手法となっている。
　ＰＣＲ等のＤＮＡポリメラーゼを用いる核酸合成反応では、その特異性等の反応性がしばしば問題となる。非特異的な核酸合成反応を回避するために、新たなＤＮＡポリメラーゼの開発、プライマーの設計方法の改善、反応液組成の至適化、化合物の添加等の試みがなされている。例えば、ＧＣリッチな鋳型の増幅に、ベタインの添加が効果的であることが見出されている（非特許文献１、２）。
"Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ"、１９９４年９月１日、第５５巻、補遺第３号、第Ａ２３８頁 "Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ"、１９９７年１０月１日、第２５巻、第１９号、第３９５７頁～第３９５８頁
　核酸合成反応は、その反応性について改善の試みがなされてきたが、現在においても非特異的な反応が生じる場合や十分な量のＤＮＡを合成することができない場合がある。このため、核酸合成反応の反応性の更なる改善が望まれている。本発明の目的は、核酸合成反応の反応性の向上方法、核酸合成反応用の組成物、及び核酸合成反応用の反応緩衝液を提供することにある。
　本発明者らは、核酸合成反応の反応液にω－アミノ酸を添加することにより、核酸合成反応の反応性を向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち本発明は、
［１］核酸合成反応の反応性の向上方法であって、ω－アミノ酸を反応液に添加する工程を含む方法、
［２］ω－アミノ酸が、下記の式１で表される化合物である、［１］に記載の方法、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式中ｎは、２以上の整数である）、
［３］式中ｎが２以上、７以下の整数である、［２］に記載の方法。
［４］核酸合成反応がポリメラーゼ連鎖反応である、［１］に記載の方法、
［５］ω－アミノ酸、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種のプライマー、及び少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含有する反応液を調製する工程を含む、［１］に記載の方法、
［６］さらに、ベタインを反応液に添加する工程を含む、［１］に記載の方法、
［７］核酸合成反応用の組成物であって、ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及びω－アミノ酸を含有する組成物、
［８］ω－アミノ酸が、［２］に示される式１で表される化合物である、［７］に記載の組成物、
［９］さらに、ベタインを含有する、［７］に記載の組成物、
［１０］ω－アミノ酸を含有する核酸合成反応用の反応緩衝液、
［１１］ω－アミノ酸が、［２］に示される式１で表される化合物である、［１０］に記載の反応緩衝液、
［１２］さらに、ベタインを含有する、［１０］に記載の反応緩衝液、
［１３］核酸合成反応のためのキットであって、以下の構成品を含むキット：ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及びω－アミノ酸、
［１４］ω－アミノ酸が、［２］に示される式１で表される化合物である、［１３］に記載のキット、
［１５］さらに、ベタインを含有する、［１３］に記載のキット
に関する。
　本発明により、核酸合成反応の反応性の向上方法、反応性に優れた核酸合成反応用の組成物、及び核酸合成反応用の反応緩衝液が提供される。
実施例１におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 実施例２におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 実施例３におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 実施例４におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 実施例５におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
　本発明の核酸合成反応の反応性の向上方法は、ω－アミノ酸を反応液に添加する工程を含む。ω－アミノ酸を含有する反応液でＤＮＡポリメラーゼによる核酸合成反応を行うことにより、核酸合成反応の反応性を向上させることができる。また、本発明は反応性に優れた核酸の合成方法を提供する。
　本発明の方法における核酸合成反応としては、ＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する反応であれば特に限定はないが、プライマー伸長反応、逆転写反応、ＰＣＲ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法等の当分野で周知の核酸合成反応が例示される。
　本発明をＰＣＲの反応性の向上に利用する場合、ＰＣＲの温度サイクル条件としては一般的な条件が適用できる。例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つのステップからなる反応により、又は「シャトルＰＣＲ」［『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白質核酸  酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁～４２８頁（１９９６）］と呼ばれる、前述の３ステップ反応のうちプライマーのアニーリング及び伸長のステップを同一温度で行なう２ステップ反応によりＰＣＲが実施される。
　本明細書において核酸合成反応の反応性の向上とは、本発明を特に限定するものではないが、例えば反応特異性の向上、及び標的とする核酸配列を有するＤＮＡの合成量の増大からなる群より選択される効果のことをいう。本発明によれば、ω－アミノ酸を反応液に添加することによって、核酸合成反応の反応性を向上させることができる。本発明を特に限定するものではないが、本発明により明らかになったω－アミノ酸が奏する核酸合成反応の反応性の向上効果から推測すると、ω－アミノ酸が核酸合成反応におけるプライマーのプライミングの特異性を向上させる性質を有している可能性がある。ω－アミノ酸による核酸合成反応の反応性の向上は、例えばω－アミノ酸を含む反応液と、ω－アミノ酸を含まない反応液とを用いてそれぞれ核酸合成反応を行った後、反応後の反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、核酸合成反応の反応特異性や標的とする核酸配列を有するＤＮＡの合成量を比較することにより確認することができる。また、インターカレーティング色素やＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）標識プローブ等を用いて核酸の増幅をモニターし、核酸合成反応の反応特異性や標的とする核酸配列を有するＤＮＡ合成量を、反応液にω－アミノ酸を含む場合と含まない場合とで比較することによっても確認できる。前記の反応特異性の向上は、例えば非特異的な核酸の増幅が起こる頻度の減少や当該核酸の合成量の減少から評価される。
　本明細書においてアミノ酸とは、広義のアミノ酸を意味し、カルボキシル基の代わりにスルホン酸基を含むものも含まれる。本明細書においてω－アミノ酸とは、カルボキシル基又はスルホン酸基の結合した炭素と反対側の炭素鎖末端に第一級アミノ基が結合したアミノ酸であって、α－アミノ酸に分類されるアミノ酸を除くアミノ酸のことをいう。本明細書におけるω－アミノ酸には、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、δ－アミノ酸、及びε－アミノ酸も含まれる。本発明を特に限定するものではないが、本発明に使用されるω－アミノ酸としては、炭素数が３個以上のω－アミノ酸が例示され、炭素数が３～８個のω－アミノ酸が好適に例示される。このようなω－アミノ酸としては、例えば下記の
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中ｎは、２以上の整数である。）
で表わされる化合物が例示され、なかでも前記の式１で表わされる化合物においてｎが２以上、７以下の整数である化合物がより好適に例示される。
　前記の式１で表わされるω－アミノ酸としては、例えば、β－アラニン、γ－アミノ－ｎ－酪酸（ＧＡＢＡ）、δ－アミノペンタン酸（５－アミノペンタン酸）、ε－アミノヘキサン酸（６－アミノヘキサン酸）、ω－アミノヘプタン酸（７－アミノエナント酸）、及び８－アミノオクタン酸、９－アミノノナン酸、及び１０－アミノデカン酸が挙げられる。
　本発明の方法においてω－アミノ酸は、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸合成反応の反応性の向上に効果のある量で反応液に添加される。核酸合成反応の反応性の向上が期待できる反応液中のω－アミノ酸の濃度は、例えば前記の核酸合成反応の反応性の向上の確認方法により容易に決定できる。本発明を特に限定するものではないが、例えば本発明の方法におけるω－アミノ酸として６－アミノヘキサン酸を利用する場合は、反応液中の６－アミノヘキサン酸の濃度は３００ｍＭ未満が好ましく、１０～２００ｍＭがより好ましく、２０～２００ｍＭ、例えば１００ｍＭが更により好ましい。また、本発明の方法におけるω－アミノ酸としてβ－アラニンを用いる場合は、反応液中のβ－アラニンの濃度は１Ｍ以下が好ましく、１００ｍＭ～５００ｍＭがより好ましく、２５０～５００ｍＭ、例えば５００ｍＭがさらに好ましい。反応液中のω－アミノ酸の至適な濃度範囲は、例えば後述の実施例４や実施例５と同様の方法により、使用するＤＮＡポリメラーゼの種類や標的配列等に応じて容易に確認することができる。
　本発明の方法における核酸合成反応のための反応液は、ω－アミノ酸、ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び鋳型となる核酸を含む組成物等を組み合わせて調製することができる。ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及びω－アミノ酸を含有する組成物は、本発明の一態様である。また、ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及びω－アミノ酸を含有するキットも本発明の一態様である。このキットは、１種以上のプライマーを含んでいてもよい。
　ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する活性を有するものであれば、いずれのＤＮＡポリメラーゼであっても本発明に使用できる。本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に耐熱性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）や好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）等の真正細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．由来ＤＮＡポリメラーゼ等）やＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）の古細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが例示される。
　ＤＮＡポリメラーゼとして２種以上のＤＮＡポリメラーゼを組み合わせて使用してもよい。２種類以上のＤＮＡポリメラーゼとしては、３´→５´エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３´→５´エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さないＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせが例示される。なお、このような２種類のＤＮＡポリメラーゼを含む反応液でＰＣＲを行う技術は、ＬＡ－ＰＣＲ（Ｌｏｎｇ　ａｎｄ　Ａｃｃｕｒａｔｅ　ＰＣＲ）として知られている。
　本発明の方法におけるＤＮＡポリメラーゼの使用量は、特に限定はないが、例えば従来の核酸合成反応において使用されている量を使用すればよい。ＰＣＲ法の場合、好適なＤＮＡポリメラーゼの使用量は当業者に周知である。例えばＴｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来ＤＮＡポリメラーゼを用いて反応液量２５μＬでＤＮＡ合成反応を行う場合、反応液中の該酵素量は０．１２５Ｕ～５Ｕである。
　本明細書において反応緩衝剤とは、反応液の水素イオン濃度（ｐＨ）の変動を和らげる作用を持つ化合物又は混合物のことをいう。一般に弱酸とその塩、あるいは弱塩基とその塩の混合溶液は、強い緩衝作用を持つため反応緩衝剤としてｐＨコントロールの目的で広く用いられている。本発明には生化学分野で公知の、各種の反応緩衝剤を使用することができる。例えば、Ｔｒｉｓ塩酸、Ｔｒｉｓ酢酸、ＨＥＰＥＳ水酸化カリウム、ＨＥＰＥＳ水酸化ナトリウムなどのグッドバッファーやリン酸バッファー等の反応緩衝剤が挙げられる。本発明の方法における反応液のｐＨは、遺伝子増幅反応が実施される通常の範囲、例えば２５℃におけるｐＨが８．０～９．５の範囲に設定されるのが適当である。
　プライマーは、鋳型となる核酸に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、使用される反応条件において鋳型となる核酸に対してアニールするものであれば特に限定されるものではない。本発明をＰＣＲに利用する場合には、標的配列を増幅可能な互いに対向する２種又はそれ以上のプライマーを設計して用いればよい。プライマーの鎖長は、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。前記オリゴヌクレオチドは、例えば公知の方法で化学的に合成されたものであっても良い。また、生物試料由来のオリゴヌクレオチドであっても良く、例えば天然の試料より調製したＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離して作製しても良い。
　デオキシリボヌクレオチドは、有機塩基に結合したデオキシリボースにホスホエステル結合を介してリン酸基が結合した化合物である。それぞれアデニン、グアニン、シトシン及びチミン塩基を有する４種のデオキシリボヌクレオチドが天然型ＤＮＡに見られる。塩基のアデニン、グアニン、シトシン、及びチミンはそれぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴと略されることが多い。デオキシリボヌクレオチドは、遊離の一リン酸型、二リン酸型及び三リン酸型（すなわち、リン酸基が、それぞれ、１つ、２つ又は３つのリン酸部分を有する）を含む。また、塩基部分にヒポキサンチンやウラシルを有するデオキシリボヌクレオチド三リン酸も核酸合成反応に使用できることが知られている。本発明には、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）及びそれらの誘導体の少なくとも１種が使用される。本発明の組成物に含まれるデオキシリボヌクレオチド三リン酸としては、好適にはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの４種類の混合物が例示される。
　本発明の方法におけるω－アミノ酸を反応液に添加する工程は、反応液の調製のいずれの段階において実施されてもよく、好ましくは反応液を核酸合成反応に適した温度でのインキュベートに供する前に実施される。例えば、反応緩衝剤を含む溶液（反応緩衝液）にω－アミノ酸を予め添加し、この反応緩衝液と、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び鋳型となる核酸とを組み合わせて反応液を調製した後に、核酸合成反応を実施してもよい。
　従って、ω－アミノ酸を含有する核酸合成用の反応緩衝液は、本発明の好適な一態様である。反応緩衝液には、ω－アミノ酸や反応緩衝剤の他に、２価陽イオン及び／又は１価陽イオンやそれらの塩、核酸合成反応に有用なその他の成分をさらに含んでいてもよい。２価の陽イオンとしては、マグネシウムイオンやマンガンイオン等の２価の金属イオンが好適に例示される。１価の陽イオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン等が好適に例示される。核酸合成反応に有用なその他の成分としては、陰イオン性の界面活性剤、非イオン性の界面活性剤、テトラメチルアンモニウム塩等が好適に例示される。
　本発明の方法は、さらにベタインを反応液に添加する工程を含んでいてもよい。本発明の方法におけるベタインを反応液に添加する工程は、反応液の調製のいずれの段階において実施されてもよく、好ましくは反応液を核酸合成反応に適した温度でのインキュベーションに供する前に実施される。また、本発明の組成物や本発明の反応緩衝液は、ベタインを含んでいてもよい。本発明においてベタインとは、正電荷と負電荷を同一分子内の隣り合わない位置に持ち、正電荷をもつ原子には解離しうる水素原子が結合しておらず、分子全体としては電荷を持たない化合物の総称のことを指す。代表的なベタインの例としては、トリメチルグリシンやその誘導体が挙げられる。
　ベタインは、核酸合成反応の反応性を向上させる添加物として公知である。本願発明者らは、ω－アミノ酸とベタインとは、核酸合成反応の反応性の向上に関して相乗効果を奏することを見出した。また、高濃度のω－アミノ酸の添加により核酸増幅反応が抑制されることがあるが、この抑制がベタインの添加により解消されることも観察している。本発明の方法におけるベタインの添加量は、ベタインによる核酸合成反応の反応性の向上が認められる範囲であれば特に限定はないが、好ましくは０．１Ｍ以上３Ｍ以下、さらに好ましくは０．３Ｍ以上２．５Ｍ以下である。
　本発明は、インターカレーティング色素やＦＲＥＴ標識プローブ等を用いる核酸の増幅をモニタリング可能なリアルタイムＰＣＲにも利用できる。この場合、本発明の方法における反応液、本発明の組成物、及び本発明の反応緩衝液は、インターカレーティング色素やＦＲＥＴ標識プローブを含みうる。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。なお、以下の実施例におけるＰＣＲの反応装置としては、ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（登録商標）　Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ社）を使用した。
実施例１
　β―アラニン（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）を超純水（ミリＱ水）に溶解した後、トリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．９）を滴下することでｐＨを８．５に調整した５Ｍのβ－アラニン溶液を調製した。同様にして、６－アミノヘキサン酸（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）をミリＱ水に溶解した後にｐＨを８．５に調整した２Ｍの６－アミノヘキサン酸溶液、及び８－アミノオクタン酸（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）をミリＱ水に溶解した後にｐＨを８．５に調整した１Ｍの８－アミノオクタン酸溶液を調製した。また、ベタイン（トリメチルグリシン；ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社、Ｂ２６２９）をミリＱ水に溶解し、５Ｍのベタイン溶液を調製した。これらを下記の反応液の調製に用いた。
　Ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（クロンテック社）　１００ｎｇを鋳型とし、プライマー対として配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用い、ＴＧＦβ１遺伝子領域の９８７ｂｐ（ＧＣ比率７２．３％）を増幅するためのＰＣＲ反応液を、ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（登録商標）　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社）を用いて氷上調製した。ＰＣＲ反応液は、製品に添付の説明書に記載の反応液の組成に加えて、ω－アミノ酸として終濃度５００ｍＭのβ－アラニン、終濃度１００ｍＭの６－アミノヘキサン酸、又は終濃度５０ｍＭの８－アミノオクタン酸を含む２０μＬの反応液、及びω－アミノ酸を含まない対照としての２０μＬの反応液、の合わせて４種類の反応液を調製した。また、これらの反応液の組成に加えてさらに終濃度３００ｍＭのベタイン（トリメチルグリシン）を含む反応液を４種類調製した。次に、氷上調製したこれらのＰＣＲ反応液について、９４℃、１分の活性化反応後、９８℃、１０秒～５５℃、３０秒～７２℃、１分を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲを実施した。ＰＣＲ終了後、各反応液のうち４μＬをアガロースゲル電気泳動に供して増幅産物の鎖長と増幅量を確認した。アガロースゲル電気泳動の結果を図１に示す。図中Ｍは、１ｋｂ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ（タカラバイオ社）マーカー２００ｎｇの電気泳動を行ったレーンであることを示す。
　その結果、ＰＣＲ反応液中にω－アミノ酸を含まない場合は、９８７ｂｐの目的増幅産物に相当するバンドがほとんど認められなかった。これに対し、各種ω－アミノ酸を含むＰＣＲ反応液では、９８７ｂｐの目的増幅産物に相当するバンドが認められた。また、ω－アミノ酸に加えてベタインを含むＰＣＲ反応液では、９８７ｂｐの目的増幅産物の増幅量が増加した。さらに、β―アラニンを含むＰＣＲ反応液や６－アミノヘキサン酸とベタインとを含むＰＣＲ反応液では、９８７ｂｐの目的増幅産物の特異的な増幅が認められた。
実施例２
　ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ社）に代えてＰｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いる点、及びベタインを含む反応液についてベタインの終濃度が１ＭとなるようにＰＣＲ反応液を調製する点以外は実施例１と同様の方法で、ω－アミノ酸の効果を検討した。なお、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．由来ＤＮＡポリメラーゼを含む製品である。
　ＰＣＲ後の反応液のうち４μＬをアガロースゲル電気泳動に供した結果を図２に示す。図中Ｍは、１ｋｂ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ（タカラバイオ社）マーカー２００ｎｇの電気泳動を行ったレーンであることを示す。その結果、ＰＣＲ反応液中にω－アミノ酸やベタインを含まない場合、非特異的増幅産物のみが認められた。これに対し、ＰＣＲ反応液中にω－アミノ酸が含まれる場合には、主要な増幅産物として９８７ｂｐの目的産物が認められ、さらには増幅産物量の増大も認められた。また、ＰＣＲ反応液中にω－アミノ酸に加えてベタインを含む場合には、非特異的増幅はほとんど観察されず、９８７ｂｐの目的産物が特異的に増幅していた。また、β―アラニンを含む反応液や６－アミノヘキサン酸とベタインとを含むＰＣＲ反応液では、ベタインのみを含むＰＣＲ反応液による反応に比べて、９８７ｂｐの目的産物の増幅量が増加していた。
実施例３
　ＴＧＦβ１遺伝子領域を増幅するプライマー対に代えてＨｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＤＮＡ，　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｎ　２２ｑ１１：　Ｔｙｐｅ　Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２６１９９９．１）領域の９６５ｂｐ（ＧＣ比率３５．４％）を増幅するプライマー対（配列番号３の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号４の塩基配列からなるプライマー）を使用する以外は、実施例１と同様の方法で、ω－アミノ酸の効果を確認した。
　ＰＣＲ後の反応液のうち４μＬをアガロースゲル電気泳動に供した結果を図３に示す。図中Ｍは、１ｋｂ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ（タカラバイオ社）マーカー２００ｎｇの電気泳動を行ったレーンであることを示す。その結果、ＰＣＲ反応液中にω－アミノ酸を含まない場合は、目的産物以外に非特異的な増幅が観察されたが、各種ω－アミノ酸を含むＰＣＲ反応液では、これらの非特異的な増幅は抑制されていた。
　以上のことより、ＧＣ比率の高い鋳型ばかりではなく、ＧＣ比率の低い（ＡＴ比率の高い）増幅困難な鋳型ＤＮＡに対してもＰＣＲ反応液へのω－アミノ酸の添加は有効であることが示された。
実施例４
　核酸合成反応の反応性の向上に有効な６－アミノヘキサン酸の濃度を検証した。各種のω－アミノ酸の代わりに終濃度２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、又は３００ｍＭの６－アミノヘキサン酸を含む以外は実施例１と同様の反応液、及びω－アミノ酸を含まない対照としての２０μＬの反応液、の合わせて９種類の反応液を調製した。次に、実施例１と同様の方法でＰＣＲを行った後、各反応液のうち４μＬをアガロースゲル電気泳動に供して増幅産物の鎖長と増幅量を確認した。アガロースゲル電気泳動の結果を図４に示す。図中Ｍは、１ｋｂ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ（タカラバイオ社）マーカー２００ｎｇの電気泳動を行ったレーンであることを示す。
　その結果、２０ｍＭ以上の６－アミノヘキサン酸の添加で目的の増幅ＤＮＡに由来すると思われるバンドが観察されるようになり、２００ｍＭの６－アミノヘキサン酸の添加で目的のＤＮＡのみの増幅が可能になった。
実施例５
　ＴＧＦβ１遺伝子領域を増幅するプライマー対に代えてＨｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＤＮＡ，　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｎ　２２ｑ１１：　Ｔｙｐｅ　Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２６１９９９．１）領域のプライマー対（配列番号３の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号４の塩基配列からなるプライマー）を使用する以外は実施例４と同様の方法で、核酸合成反応の反応性の向上に有効な６－アミノヘキサン酸の有効濃度を検討した。
　ＰＣＲ後の反応液のうち４μＬをアガロースゲル電気泳動に供した結果を図５に示す。図中Ｍは、１ｋｂ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ（タカラバイオ社）マーカー２００ｎｇの電気泳動を行ったレーンであることを示す。その結果、１０ｍＭ以上の６－アミノヘキサン酸の添加で目的の増幅ＤＮＡに由来すると思われるバンドが観察されるようになり、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭの６－アミノヘキサン酸の添加で目的のＤＮＡのみの増幅が可能になった。
　本発明は、遺伝子工学、生物学、医学、農業等の幅広い分野において有用である。
SEQ ID NO:1 ; Synthetic primer for PCR to amplify of TGF-beta 1 gene.
SEQ ID NO:2 ; Synthetic primer for PCR to amplify of TGF-beta 1 gene.
SEQ ID NO:3 ; Synthetic primer for PCR to amplify of translocation breakpoint sequence region.
SEQ ID NO:4 ; Synthetic primer for PCR to amplify of translocation breakpoint sequence region.

Claims (15)

  1. 　核酸合成反応の反応性の向上方法であって、ω－アミノ酸を反応液に添加する工程を含む方法。
  2. 　ω－アミノ酸が、下記の式１で表される化合物である、請求項１に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中ｎは、２以上の整数である。）
  3. 　式中ｎが２以上、７以下の整数である、請求項２に記載の方法。
  4. 　核酸合成反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１に記載の方法。
  5. 　ω－アミノ酸、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種のプライマー、及び少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含有する反応液を調製する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 　さらに、ベタインを反応液に添加する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 　核酸合成反応用の組成物であって、
    ＤＮＡポリメラーゼ、
    反応緩衝剤、
    少なくとも１種のプライマー、
    少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び
    ω－アミノ酸
    を含有する組成物。
  8. 　ω－アミノ酸が、請求項２に示される式１で表される化合物である、請求項７に記載の組成物。
  9. 　さらに、ベタインを含有する、請求項７に記載の組成物。
  10. 　ω－アミノ酸を含有する核酸合成反応用の反応緩衝液。
  11. 　ω－アミノ酸が、請求項２に示される式１で表される化合物である、請求項１０に記載の反応緩衝液。
  12. 　さらに、ベタインを含有する、請求項１０に記載の反応緩衝液。
  13. 　核酸合成反応のためのキットであって、以下の構成品を含むキット：
    ＤＮＡポリメラーゼ、
    反応緩衝剤、
    少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び
    ω－アミノ酸。
  14. 　ω－アミノ酸が、請求項２に示される式１で表される化合物である、請求項１３に記載のキット。
  15. 　さらに、ベタインを含有する、請求項１３に記載のキット。
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