CN104093835B - 用于改进核酸合成反应的方法 - Google Patents

用于改进核酸合成反应的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104093835B
CN104093835B CN201380007277.0A CN201380007277A CN104093835B CN 104093835 B CN104093835 B CN 104093835B CN 201380007277 A CN201380007277 A CN 201380007277A CN 104093835 B CN104093835 B CN 104093835B
Authority
CN
China
Prior art keywords
omega
amino acid
reactions
nucleic acid
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201380007277.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104093835A (zh
Inventor
松村清之
上森隆司
向井博之
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takara Bio Inc
Original Assignee
Takara Bio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takara Bio Inc filed Critical Takara Bio Inc
Publication of CN104093835A publication Critical patent/CN104093835A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104093835B publication Critical patent/CN104093835B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供以下：用于改进核酸合成反应的反应性的方法，其包括向反应溶液添加ω-氨基酸的步骤；用于核酸合成反应的组合物，其包含DNA聚合酶、反应缓冲液、至少一条引物、至少一种脱氧核糖核苷酸三磷酸、和ω-氨基酸；和用于核酸合成反应的反应缓冲液，其包含ω-氨基酸。

Description

用于改进核酸合成反应的方法
技术领域
本发明涉及用于改进核酸合成反应的反应性的方法、用于核酸合成反应的组合物，和用于核酸合成反应的反应缓冲液。
背景技术
核酸合成方法，特别是聚合酶链反应（PCR）方法是用于在试管中简单扩增目的核酸片段的技术，并且近来不仅成为用于遗传研究的重要实验手段，还成为了生物、医学和农业广泛领域中的重要实验手段。
使用DNA聚合酶的核酸合成反应，如PCR在其反应性如特异性方面经常有问题。为了避免非特异性的核酸合成反应，尝试开发新型DNA聚合酶、改进引物设计方法、优化反应溶液组成、添加化合物等。例如，发现添加甜菜碱在扩增富含CG的模板中有效（非专利参考文献1和2）。
引用列表
非专利参考文献
非专利参考文献1:"AmericanJournalofHumanGenetics",1994年9月1日,第55卷,附录第3号,第A238页
非专利参考文献2:"NucleicAcidsResearch",1997年10月1日,第25卷,第19号,第3957-3958页。
发明概述
本发明待解决的问题
已经尝试改进核酸合成反应的反应性。然而，核酸合成反应可能仍然伴随有非特异性反应或可能不能合成足够量的DNA。由于这些原因，需要核酸合成反应的反应性中的进一步改进。本发明的目标是提供用于改进核酸合成反应的反应性的方法、用于核酸合成反应的组合物、和用于核酸合成反应的反应缓冲液。
问题的解决方案
本发明人发现可以通过向反应溶液添加ω-氨基酸来改进核酸合成反应的反应性。因此，完成本发明。
即，本发明涉及：
[1]用于改进核酸合成反应的反应性的方法，其包括向反应溶液添加ω-氨基酸的步骤；
[2]根据[1]的方法，其中所述ω-氨基酸是下式1代表的化合物：
[化学式1]
其中n是2或更大的整数；
[3]根据[2]的方法，其中n是2到7的整数；
[4]根据[1]的方法，其中所述核酸合成反应是聚合酶链反应；
[5]根据[1]的方法，其包括制备反应溶液的步骤，所述反应溶液含有ω-氨基酸、DNA聚合酶、至少一条引物和至少一种脱氧核糖核苷酸三磷酸；
[6]根据[1]的方法，其进一步包括向所述反应溶液中添加甜菜碱的步骤；
[7]用于核酸合成反应的组合物，其含有：DNA聚合酶、反应缓冲剂、至少一条引物和至少一种脱氧核糖核苷酸三磷酸和ω-氨基酸；
[8]根据[7]的组合物，其中所述ω-氨基酸是由如[2]中定义的式1代表的化合物；
[9]根据[7]的组合物，其进一步含有甜菜碱；
[10]用于核酸合成反应的反应缓冲液，其含有ω-氨基酸；
[11]根据[10]的反应缓冲液，其中所述ω-氨基酸是由如[2]中定义的式1代表的化合物；
[12]根据[10]的反应缓冲液，其进一步含有甜菜碱；
[13]用于核酸合成反应的试剂盒，其包含以下组分：
DNA聚合酶，
反应缓冲剂，
至少一种脱氧核糖核苷酸三磷酸，和
ω-氨基酸；
[14]根据[13]的试剂盒，其中所述ω-氨基酸是由如[2]中定义的式1代表的化合物；
[15]根据[13]的试剂盒，其进一步包含甜菜碱。
发明效果
根据本发明，提供了用于改进核酸合成反应的反应性的方法、用于核酸合成反应（其具有极佳的反应性）的组合物、和用于核酸合成反应的反应缓冲液。
附图简述
[图1]图1显示了实施例1中琼脂糖凝胶电泳的结果。
[图2]图2显示了实施例2中琼脂糖凝胶电泳的结果。
[图3]图3显示了实施例3中琼脂糖凝胶电泳的结果。
[图4]图4显示了实施例4中琼脂糖凝胶电泳的结果。
[图5]图5显示了实施例5中琼脂糖凝胶电泳的结果。
实施本发明的方式
用于改进本发明的核酸合成反应的反应性的方法包括向反应溶液添加ω-氨基酸的步骤。当在含有ω-氨基酸的反应溶液中使用DNA聚合酶进行核酸合成反应时，可以改进核酸合成反应的反应性。本发明还提供具有极佳反应性的核酸合成方法。
本发明方法中的核酸合成反应不是特别受限的，只要其是用于合成与DNA或RNA模板互补的DNA的反应。核酸合成反应的实例是本领域所熟知的核酸合成反应，包括引物延伸反应、逆转录反应、PCR、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、ICAN方法、LAMP方法和SDA方法。
当本发明用于改进PCR的反应性时，一般条件可应用于PCR的热循环条件。例如，通过由三个步骤组成的反应进行PCR：双链DNA模板熔解（变性）成单链、引物退火至单链DNA模板、和从引物合成（延伸）互补链，或通过两步骤反应，称为“穿梭PCR(shuttlePCR)”[参见“PCRmethod-Forefront(SaiZenSen)”，“Protein,NucleicAcid,andEnzyme”的特刊,第41卷，第5号，第425-428页(1996)]，其中上述三步骤反应的退火步骤和延伸步骤在相同温度下进行。
如本文所用，核酸合成反应的反应性的改进表示，例如，选自反应特异性的改进和具有目标核苷酸序列的DNA的合成量的增加的效果，但本发明并不限于此。根据本发明，可以通过向反应溶液添加ω-氨基酸改进核酸合成反应的反应性。当从改进ω-氨基酸对本发明已经显示的核酸合成反应的反应性的影响推断时，ω-氨基酸可能具有改进引物的引发特异性的能力，但本发明并不限于此。核酸合成反应的反应性通过ω-氨基酸的改进可以通过如下证实：例如利用含有ω-氨基酸的反应溶液进行核酸合成反应和利用不含有ω-氨基酸的反应溶液进行核酸合成反应，将反应后获得的反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，并随后比较核酸合成反应之间的反应特异性或具有目标核苷酸序列的DNA的合成量。核酸合成反应的反应性通过ω-氨基酸的改进还可以通过如下证实：使用嵌入染料FRET（荧光共振能量转移）标记的探针等监测核酸的扩增，并随后比较利用含有ω-氨基酸的反应溶液的核酸合成反应与利用不含有ω-氨基酸的反应溶液的核酸合成反应之间的反应特异性或具有目标核苷酸序列的DNA的合成量。例如基于非特异性核酸扩增频率的降低或非特异性扩增核酸的合成量的减少评估上述反应特异性的改进。
如本文所用，在广泛意义上解释氨基酸并且所述氨基酸还包括在羧基位置上包含磺酸基的氨基酸。如本文所用，ω-氨基酸表示具有这样的伯氨基的氨基酸，所述伯氨基结合到与羧基或磺酸基结合的碳相反一侧上的末端碳上，并且排除α-氨基酸。如本文所用，ω-氨基酸还包括β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸和ε-氨基酸。可以用于本发明的ω-氨基酸的实例包括，但不限于含有3个或更多个碳原子的ω-氨基酸，并优选含有3-8个碳原子的ω-氨基酸。该ω-氨基酸的实例包括由下式1代表的化合物：
[化学式2]
其中n是2或更大的整数。在此类化合物中，优选的是式1代表的化合物，其中n是2-7的整数。
式1代表的ω-氨基酸的实例包括β-丙氨酸、γ-氨基正丁酸(GABA)、δ-氨基戊酸(5-氨基戊酸)、ε-氨基己酸(6-氨基己酸)、ω-氨基庚酸(7-氨基庚酸)，和8-氨基辛酸、9-氨基壬酸，和10-氨基癸酸。
在本发明的方法中，以有效改进通过DNA聚合酶的核酸合成反应的反应性的量向反应溶液添加ω-氨基酸。可以通过例如用于验证改进核酸合成反应的反应性的上述方法容易地确定反应溶液中ω-氨基酸的浓度，预期其改进核酸合成反应的反应性。例如，当6-氨基己酸在本发明的方法中用作ω-氨基酸时，反应溶液中6-氨基己酸的浓度优选低于300mM，更优选10-200mM，并仍然更优选20-200mM，例如100mM，但本发明并不限于此。当β-丙氨酸在本发明的方法中用作ω-氨基酸时，反应溶液中β-丙氨酸的浓度优选为1M或更低，更优选100-500mM，并仍然更优选250-500mM，例如500mM。可以根据待使用的DNA聚合酶的种类、目标序列等，例如以与稍后所述的实施例4或实施例5相同的方式容易地确定反应溶液中ω-氨基酸的适当浓度范围。
可以从含有ω-氨基酸、DNA聚合酶、反应缓冲试剂、至少一条引物、至少一种脱氧核糖核苷酸和作为模板的核酸等的组合物组合制备用于本发明方法中的核酸合成反应的反应溶液。作为本发明的一个方面，提供的是含有DNA聚合酶、反应缓冲试剂、至少一条引物、至少一种脱氧核糖核苷酸和ω-氨基酸的组合物。作为本发明的另一方面，提供的是含有DNA聚合酶、反应缓冲试剂、至少一种脱氧核糖核苷酸三磷酸和ω-氨基酸的试剂盒。所述试剂盒可以含有一条或多条引物。
可以用于本发明的DNA聚合酶可以是任何种类的DNA聚合酶，只要其具有合成与DNA或RNA模板互补的DNA的能力。可以用于本发明的DNA聚合酶优选为热稳定的DNA指导的DNA聚合酶。该DNA聚合酶的实例包括来源于细菌的热稳定DNA聚合酶，如来源于属栖热菌属（Thermus）的细菌的DNA聚合酶（来源于栖热水生菌（Thermusaquaticus）的DNA聚合酶等）和来源于属芽孢杆菌属（Bacillus）的嗜热细菌的DNA聚合酶（来源于热坚芽孢杆菌（Baciluscaldotenax）的DNA聚合酶等），和来源于古菌的DNA聚合酶，如来源于属火球菌属（Pyrococcus）的古菌的DNA聚合酶（来源于火球菌属物种的DNA聚合酶等）和来源于属热球菌属（Thermococcus）的古菌的DNA聚合酶（来源于ThermococcusKodakaraensis的DNA聚合酶）。
作为DNA聚合酶，两种或更多种类的DNA聚合酶可以组合使用。两种或更多种类的DNA聚合酶的实例包括具有3'→5'外切核酸酶活性的DNA聚合酶和基本上不具有3'→5'外切核酸酶活性的DNA聚合酶的组合。利用含有此类两种DNA聚合酶的反应溶液的PCR的技术称为LA-PCR(长且精确的PCR)。
本发明方法中DNA聚合酶使用的量并不特别受限，并且例如其可以是用于常规核酸合成反应的量。对于PCR，合适的DNA聚合酶所用的量为本领域技术人员所熟知。例如，当在25μl的反应溶液中使用来自栖热水生菌的DNA聚合酶进行DNA合成反应时，反应溶液中含有的酶的量是0.125U-5U。
如本文所用的反应缓冲试剂表示具有减少反应溶液的氢离子浓度(pH)变化的能力的化合物或混合物。弱酸及其盐或弱碱及其盐的混合溶液广泛用作用于控制pH目的的反应缓冲试剂，因为所述混合溶液一般具有强的缓冲作用。在本发明中，可以使用生物化学领域中已知的多种反应缓冲试剂。反应缓冲试剂的实例包括良好的缓冲剂，如Tris盐酸、Tris乙酸、HEPES氢氧化钾，和HEPES氢氧化钠，和磷酸盐缓冲剂。本发明方法中的反应溶液的pH适当地设定在进行基因扩增反应的常用范围内，例如在25℃下pH8.0-9.5的范围内。
引物是具有与模板核酸互补的核苷酸序列的寡核苷酸。引物不是特别受限，只要其在所用的反应条件下退火至模板核酸。当本发明用于PCR时，可以设计并使用两条或更多条引物，其可以扩增目标序列并彼此定向相对。从特异性退火观点上，引物长度优选为6个核苷酸或更多，更优选10个核苷酸或更多，并且从寡核苷酸合成观点上，优选100个核苷酸或更少，更优选30个核苷酸或更少。例如可以通过已知方法化学合成寡核苷酸。所述寡核苷酸也可以是来源于生物样品的寡核苷酸。例如，可以通过从DNA的消化产物分离而制备寡核苷酸，利用限制性内切核酸酶从天然样品中制备所述DNA。
脱氧核糖核苷酸是这样的化合物，其中脱氧核糖键合到有机碱上并且磷酸基团通过磷酸酯键键合到脱氧核糖上。在天然DNA中发现了分别具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶碱基的四种脱氧核糖核苷酸。腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶经常分别缩写为A、G、C和T。脱氧核糖核苷酸包括游离的单磷酸类型、二磷酸类型和三磷酸类型（即，其中磷酸基由一个、两个或三个磷酸部分构成）。已知具有次黄嘌呤或尿嘧啶作为碱基的脱氧核糖核苷酸三磷酸也可以用于核酸合成反应。在本发明中，使用脱氧核糖核苷酸三磷酸中（例如，dATP、dCTP、dITP、dGTP和dTTP）及其衍生物的至少一种。本发明组合物中含有的脱氧核糖核苷酸三磷酸的优选实例包括四种脱氧核糖核苷酸三磷酸的混合物，即dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物。
在本发明的方法中，可以在反应溶液制备过程中的任何阶段进行向反应溶液添加ω-氨基酸的步骤。优选在用于核酸合成反应的合适温度下孵育反应溶液之前进行向反应溶液添加ω-氨基酸的步骤。例如，可以在含有反应缓冲试剂的溶液（反应缓冲液）（之前向其加入了ω-氨基酸）与DNA聚合酶、至少一条引物、至少一种脱氧核糖核苷酸三磷酸和模板核酸组合以制备反应溶液后进行核酸合成反应。
因此，用于核酸合成反应的含有ω-氨基酸的反应缓冲液是本发明的优选方面。除了ω-氨基酸和反应缓冲试剂，反应缓冲液可以进一步含有二价阳离子和/或单价阳离子，或其盐，和用于核酸合成反应的其他组分。二价阳离子的优选实例包括二价金属离子，如镁离子和锰离子。单价阳离子的优选实例包括钠离子、钾离子和铵离子。用于核酸合成反应的其他组分的优选实例包括阴离子表面活性剂、非离子型表面活性剂，和四甲铵盐。
本发明的方法可以进一步包括向反应溶液添加甜菜碱的步骤。可以在反应溶液制备过程中的任何阶段进行向反应溶液添加甜菜碱的步骤。优选在核酸合成反应的合适温度下孵育反应溶液之前进行向反应溶液添加甜菜碱的步骤。本发明的组合物和本发明的反应缓冲液也可以含有甜菜碱。如本文所用的甜菜碱共同表示这样的化合物，其在同一分子中彼此并不邻接的位置处具有正电荷和负电荷，其中可分离的氢原子不结合具有正电荷的原子，并且作为完整分子不具有电荷。甜菜碱的代表性实例包括三甲基甘氨酸及其衍生物。
甜菜碱已知为添加剂，其能够增加核酸合成反应的反应性。本发明人已经发现，ω-氨基酸和甜菜碱对核酸合成反应的反应性产生协同作用。尽管核酸扩增反应可能被添加高浓度的ω-氨基酸所抑制，但是本发明人已经观察到通过添加甜菜碱去除对核酸扩增反应的抑制。本发明方法中的甜菜碱的添加量并不特别受限，只要其在这样的范围内，所述范围使得发现核酸合成反应的反应性被甜菜碱所增加，并且它优选为0.1M-3M，更优选0.3M-2.5M。
本发明也可以用于实时PCR，其中可以使用嵌入染料、FRET标记的探针等监测核酸的扩增。在该情况下，本发明方法中的反应溶液、本发明的组合物、和本发明的反应缓冲液可以含有嵌入染料或FRET标记的探针。
实施例
在下文中，通过参考本发明并不受限于其的实施例更明确地解释本发明。在以下实施例中，TaKaRaPCRThermalCyclerDice(注册商标)Gradient(由TAKARABIOINC.制造)用作用于PCR的反应设备。
实施例1
在β-丙氨酸（由SIGMA-ALDRICH制造）溶解在超纯水(Milli-Q水)中后，逐滴加入Tris乙酸缓冲液(pH8.9)，以制备pH8.5的5Mβ-丙氨酸溶液。以相同的方式，在6-氨基己酸（由SIGMA-ALDRICH制造）溶解在超纯水(Milli-Q水)中后，调节溶液的pH，以制备2M，pH8.5的6-氨基己酸溶液，并且在8-氨基辛酸（由SIGMA-ALDRICH制造）溶解在超纯水(Milli-Q水)中后，调节溶液的pH，以制备1M，pH8.5的8-氨基辛酸溶液。甜菜碱（三甲基甘氨酸；B2629，由SIGMA-ALDRICH制造）溶解在超纯水(Milli-Q水)中以制备5M的甜菜碱溶液。这些用于制备下文所述的反应溶液。
使用TaKaRaExTaq(注册商标)HotStartVersion(由TAKARABIOINC.制造)、100ng人基因组DNA(由ClontechLaboratoriesInc.制造)作为模板，和由SEQIDNO:1中显示的碱基序列组成的引物和由SEQIDNO:2中显示的碱基序列组成的引物作为引物对在冰上制备用于扩增TGFβ1基因区域的987bp(GC比例:72.3%)的PCR反应溶液。制备了共四种PCR反应溶液，其具有在商品化产品附带说明书中描述的反应溶液组合物，并且其每一种是额外含有终浓度为500mM的β-丙氨酸、终浓度为100mM的6-氨基己酸或终浓度为50mM的8-氨基辛酸作为ω-氨基酸的20μL反应溶液，或作为对照的不含有ω-氨基酸的20μL反应溶液。此外，向因此获得的反应溶液的组合物中加入甜菜碱（三甲基甘氨酸），以制备含有终浓度为300mM的甜菜碱的额外四种反应溶液。接着，使因此在冰上制备的PCR反应溶液进行PCR，其由在94℃下1分钟的活化反应和然后35个循环组成，所述35个循环具有由98℃10秒、55℃30秒和72℃1分钟组成每一个循环。PCR完成后，4μL的每一种反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，以验证链长度和扩增产物的扩增量。琼脂糖凝胶电泳的结果显示在图1中。在图1中，M显示泳道，其中装载了200ng的1kbDNALadder(由TAKARABIOINC.制造)标志物。
因此，当PCR反应溶液不含有ω-氨基酸时，难以检测到对应于期望的987bp扩增产物的条带。相反，当PCR反应溶液含有任何ω-氨基酸时，检测到对应于期望的987bp扩增产物的条带。当PCR反应溶液除了含有ω-氨基酸还含有甜菜碱时，期望的987bp扩增产物的扩增量增加。当PCR反应溶液含有β-丙氨酸或PCR反应溶液含有6-氨基己酸和甜菜碱时，检测到期望的987bp扩增产物的特异性扩增。
实施例2
以与实施例1相同的方式检查ω-氨基酸的作用，除了使用Pyrobest(注册商标)DNA聚合酶(由TAKARABIOINC.制造)代替TaKaRaExTaq(注册商标)(由TAKARABIOINC.制造)，并且含有甜菜碱的PCR反应溶液中甜菜碱的终浓度调整至1M。Pyrobest(注册商标)DNA聚合酶是含有来源于火球菌属物种的DNA聚合酶的商品化产品。
PCR完成后，4μL的每一种反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示于图2中。在图2中，M显示泳道，其中装载了200ng的1kbDNALadder(由TAKARABIOINC.制造)标志物。结果是，当PCR反应溶液不含有ω-氨基酸和甜菜碱时，仅检测到非特异性的扩增产物。相反，当PCR反应溶液含有ω-氨基酸时，期望的987bp产物被检测为主要的扩增产物，此外，还验证了扩增量的增加。当PCR反应溶液除了含有ω-氨基酸还含有甜菜碱时，难以观察到非特异性扩增并且期望的987bp产物被特异性扩增。当PCR反应溶液含有β-丙氨酸或PCR反应溶液含有6-氨基己酸和甜菜碱时，与仅含有甜菜碱的PCR反应溶液相比，期望的987bp产物的扩增量增加。
实施例3
以与实施例1相同的方式验证ω-氨基酸的作用，除了使用用于扩增智人（Homosapiens）DNA，22q11:C型(TypeC)(GenBank:AB261999.1)区域上的易位断裂点序列的的965bp(GC比例:35.4%)的引物对（由SEQIDNO:3中显示的碱基序列组成的引物和由SEQIDNO:4中显示的碱基序列组成的引物）代替用于扩增TGFβ1基因区域的引物对。
PCR完成后，4μL的每一种反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示于图3中。在图3中，M显示泳道，其中装载了200ng的1kbDNALadder(由TAKARABIOINC.制造)标志物。结果是，当PCR反应溶液不含有ω-氨基酸时，除了观察到期望产物的扩增，还观察到非特异性的扩增。相反，当PCR反应溶液含有任何ω-氨基酸时，非特异性扩增被抑制。
上述结果显示，向PCR反应溶液中添加ω-氨基酸不仅对扩增具有高GC比例的模板DNA有效，还对扩增难以扩增的具有低GC比例（高AT比例）的模板DNA有效。
实施例4
检查对改进核酸合成反应的反应性有效的6-氨基己酸的浓度。共制备九种反应溶液，其是与实施例1中的那些相同的反应溶液，除了它们含有终浓度为2mM、5mM、10mM、20mM、50mM、100mM、200mM或300mM的6-氨基己酸代替多种ω-氨基酸，并且20μL不含有ω-氨基酸的反应溶液作为对照。接着，以与实施例1相同的方式进行PCR，然后4μL的每一种反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，以验证扩增产物的链长度和扩增量。琼脂糖凝胶电泳的结果显示在图4中。在图4中，M显示泳道，其中装载了200ng的1kbDNALadder(由TAKARABIOINC.制造)标志物。
结果是，当加入20mM或更多的6-氨基己酸时，观察到可能对应于期望的扩增DNA的条带。当加入200mM的6-氨基己酸时，仅扩增期望的DNA。
实施例5
以与实施例4相同的方式检查6-氨基己酸的有效浓度（其对改进核酸合成反应的反应性有效），除了使用用于智人（Homosapiens）DNA，22q11:C型(GenBank:AB261999.1)区域上的易位断裂点序列的引物对（由SEQIDNO:3中显示的碱基序列组成的引物和由SEQIDNO:4中显示的碱基序列组成的引物）代替用于扩增TGFβ1基因区域的引物对。
PCR完成后，4μL的每一种反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示于图5中。在图5中，M显示泳道，其中装载了200ng的1kbDNALadder(由TAKARABIOINC.制造)标志物。结果是，当加入10mM或更多的6-氨基己酸时，观察到可能对应于期望的扩增DNA的条带。当加入50mM、100mM或200mM的6-氨基己酸时，仅扩增期望的DNA。
工业实用性
本发明用于广泛领域，包括基因技术、生物学、医学和农业。
序列表自由文本
SEQIDNO:1；用于PCR以扩增TGF-β1基因的合成引物。
SEQIDNO:2；用于PCR以扩增TGF-β1基因的合成引物。
SEQIDNO:3；用于PCR以扩增易位断裂点序列区的合成引物。
SEQIDNO:4；用于PCR以扩增易位断裂点序列区的合成引物。

Claims (15)

1.用于改进核酸合成反应的反应性的方法，其包括向反应溶液添加ω-氨基酸的步骤，其中在含有所述ω-氨基酸的所述反应溶液中使用DNA聚合酶进行所述核酸合成反应。
2.权利要求1的方法，其中所述ω-氨基酸是下式1代表的化合物：
[化学式1]
其中n是2或更大的整数。
3.权利要求2的方法，其中n是2-7的整数。
4.权利要求1的方法，其中所述核酸合成反应是聚合酶链反应。
5.权利要求1的方法，其包括制备含有ω-氨基酸、DNA聚合酶、至少一条引物和至少一种脱氧核糖核苷酸三磷酸的反应溶液的步骤。
6.权利要求1的方法，其进一步包括向所述反应溶液添加甜菜碱的步骤。
7.用于核酸合成反应的组合物，其含有：
DNA聚合酶，
反应缓冲试剂，
至少一条引物，
至少一种脱氧核糖核苷酸三磷酸，和
ω-氨基酸。
8.权利要求7的组合物，其中所述ω-氨基酸是如权利要求2中定义的式1代表的化合物。
9.权利要求7的组合物，其进一步含有甜菜碱。
10.用于核酸合成反应的反应缓冲液，其含有ω-氨基酸。
11.权利要求10的反应缓冲液，其中所述ω-氨基酸是如权利要求2中定义的式1代表的化合物。
12.权利要求10的反应缓冲液，其进一步含有甜菜碱。
13.用于核酸合成反应的试剂盒，其包含以下组分：
DNA聚合酶，
反应缓冲试剂，
至少一种脱氧核糖核苷酸三磷酸，和
ω-氨基酸。
14.权利要求13的试剂盒，其中所述ω-氨基酸是如权利要求2中定义的式1代表的化合物。
15.权利要求13的试剂盒，其进一步包含甜菜碱。
CN201380007277.0A 2012-01-31 2013-01-24 用于改进核酸合成反应的方法 Active CN104093835B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012017665 2012-01-31
JP2012-017665 2012-01-31
PCT/JP2013/051490 WO2013115067A1 (ja) 2012-01-31 2013-01-24 核酸合成反応の向上方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104093835A CN104093835A (zh) 2014-10-08
CN104093835B true CN104093835B (zh) 2015-12-02

Family

ID=48905108

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380007277.0A Active CN104093835B (zh) 2012-01-31 2013-01-24 用于改进核酸合成反应的方法

Country Status (6)

Country Link
US (2) US9689013B2 (zh)
EP (1) EP2811020B1 (zh)
JP (1) JP5849107B2 (zh)
KR (1) KR20140127819A (zh)
CN (1) CN104093835B (zh)
WO (1) WO2013115067A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015050980A (ja) * 2013-09-09 2015-03-19 東洋紡株式会社 非特異増幅を低減させる方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1271019A (zh) * 1999-02-03 2000-10-25 奥索临床诊断有限公司 通过载体核酸增强核酸扩增的特异性
WO2003042383A1 (fr) * 2001-11-14 2003-05-22 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Promoteurs de replication de l'adn, facteurs associes a l'adn polymerase et utilisation de ces derniers
JP2010246528A (ja) * 2009-03-27 2010-11-04 Toyobo Co Ltd 核酸増幅のための新規な核酸増幅用組成物

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6787305B1 (en) 1998-03-13 2004-09-07 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced synthesis of nucleic acid molecules
JP2003144169A (ja) * 2001-11-14 2003-05-20 Toyobo Co Ltd Ｄｎａ合成反応を促進する添加剤
US7955795B2 (en) * 2003-06-06 2011-06-07 Qiagen Gmbh Method of whole genome amplification with reduced artifact production
US8822670B2 (en) * 2005-08-19 2014-09-02 Sumitomo Bakelite Company, Ltd. Method of synthesizing cDNA and method of synthesizing RNA chains, and nucleotide-immobilized carrier
US8470573B2 (en) * 2011-06-21 2013-06-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Hybrid polymerases having the ability to produce long amplicons

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1271019A (zh) * 1999-02-03 2000-10-25 奥索临床诊断有限公司 通过载体核酸增强核酸扩增的特异性
WO2003042383A1 (fr) * 2001-11-14 2003-05-22 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Promoteurs de replication de l'adn, facteurs associes a l'adn polymerase et utilisation de ces derniers
JP2010246528A (ja) * 2009-03-27 2010-11-04 Toyobo Co Ltd 核酸増幅のための新規な核酸増幅用組成物

Also Published As

Publication number Publication date
EP2811020B1 (en) 2018-06-27
US10093968B2 (en) 2018-10-09
JP5849107B2 (ja) 2016-01-27
WO2013115067A1 (ja) 2013-08-08
CN104093835A (zh) 2014-10-08
US20140363849A1 (en) 2014-12-11
KR20140127819A (ko) 2014-11-04
JPWO2013115067A1 (ja) 2015-05-11
EP2811020A4 (en) 2015-12-23
EP2811020A1 (en) 2014-12-10
US20170260578A1 (en) 2017-09-14
US9689013B2 (en) 2017-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20110117559A1 (en) Small rna detection assays
US20230002754A1 (en) Vitro Cleavage of DNA Using Argonaute
WO2016170147A1 (en) Efficiency improving ligation methods
CN114207145A (zh) 基于III型CRISPR/Cas的诊断
WO2016135300A1 (en) Efficiency improving methods for gene library generation
US20220389427A1 (en) Thermostable polymerase inhibitor compositions and methods
ES2964592T3 (es) Circularización y amplificación de ácido nucleico asistida por ligasa
EP2989178A1 (en) Composite visible colorant and method for quantitative amplification
US20160340712A1 (en) Cation chelator hot start
US9212378B2 (en) Method of amplifying DNA from RNA in a sample
CN104093835B (zh) 用于改进核酸合成反应的方法
US9896682B2 (en) Stabilized RNA solutions
CN102648289A (zh) 用于对模板dna进行复制、扩增和测序的方法
WO2020035698A1 (en) Synthesis of dna with improved yield
WO2020098474A1 (zh) 用于核酸扩增比色反应的缓冲液及其应用
van Pelt-Verkuil et al. Deoxynucleotide triphosphates and buffer components

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant