JP2000279184A - 核酸増幅法 - Google Patents
核酸増幅法Info
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L9/00—Disinfection, sterilisation or deodorisation of air
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】核酸を増幅するための改良。
【解決手段】増幅反応試薬として標的核酸に特異的な一
種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマー
と、標的核酸と、核酸ポリメラーゼと、一種又は二種以
上のマグネシウム塩とが含まれる増幅反応において標的
核酸の増幅特異性を高めるための方法であって、一種又
は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと担体
核酸とを含むプライマー／担体混合物を調製し、そして
当該プライマー／担体混合物に、標的核酸、一種又は二
種以上のマグネシウム塩及び核酸ポリメラーゼを接触さ
せることを特徴とする方法を包含する。
種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマー
と、標的核酸と、核酸ポリメラーゼと、一種又は二種以
上のマグネシウム塩とが含まれる増幅反応において標的
核酸の増幅特異性を高めるための方法であって、一種又
は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと担体
核酸とを含むプライマー／担体混合物を調製し、そして
当該プライマー／担体混合物に、標的核酸、一種又は二
種以上のマグネシウム塩及び核酸ポリメラーゼを接触さ
せることを特徴とする方法を包含する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は核酸を増幅するため
の方法、特に感染性微生物の診断テストにおける方法に
関する。
の方法、特に感染性微生物の診断テストにおける方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により
核酸配列を増幅するためには、標的核酸内部の異なる配
列にハイブリダイズする少なくとも二種のオリゴヌクレ
オチド増幅プライマーが必要である。一般に、３’端の
配列に相同性がある複数のオリゴヌクレオチドの使用は
避けることが望ましい。相同３’端を有するプライマー
は互いにハイブリダイズし合う可能性があり、プライマ
ー二量体をはじめとする各種の増幅アーチファクトをも
たらすことになる。
核酸配列を増幅するためには、標的核酸内部の異なる配
列にハイブリダイズする少なくとも二種のオリゴヌクレ
オチド増幅プライマーが必要である。一般に、３’端の
配列に相同性がある複数のオリゴヌクレオチドの使用は
避けることが望ましい。相同３’端を有するプライマー
は互いにハイブリダイズし合う可能性があり、プライマ
ー二量体をはじめとする各種の増幅アーチファクトをも
たらすことになる。
【０００３】３’端が相補的であるプライマーのハイブ
リダイゼーションは、ＰＣＲ反応成分のすべてを混合し
た後、増幅開始前に、反応混合物中にマグネシウムが存
在することにより低温においてプライマー対合体が安定
化するために起こり得る。プライマー二量体の形成は、
室温又はこれより低温で、ＤＮＡポリメラーゼによるプ
ライマー対合体の伸長によって起こる。生じるプライマ
ー二量体産物はＰＣＲにおいて増幅され、プライマー及
びポリメラーゼをめぐり標的核酸と競争する。最初の段
階で十分なプライマー二量体産物が形成されてしまう
と、後続のＰＣＲ増幅においてこの産物が選定した標的
を凌駕してしまい、（１）偽陰性結果、すなわち当該試
料には特定の配列が実際には存在するのに含まれないよ
うに見えること、或いは（２）「ノー・テスト」結果、
すなわち内部陽性対照からのシグナルがまったく得られ
ないこと、をもたらす場合がある。
リダイゼーションは、ＰＣＲ反応成分のすべてを混合し
た後、増幅開始前に、反応混合物中にマグネシウムが存
在することにより低温においてプライマー対合体が安定
化するために起こり得る。プライマー二量体の形成は、
室温又はこれより低温で、ＤＮＡポリメラーゼによるプ
ライマー対合体の伸長によって起こる。生じるプライマ
ー二量体産物はＰＣＲにおいて増幅され、プライマー及
びポリメラーゼをめぐり標的核酸と競争する。最初の段
階で十分なプライマー二量体産物が形成されてしまう
と、後続のＰＣＲ増幅においてこの産物が選定した標的
を凌駕してしまい、（１）偽陰性結果、すなわち当該試
料には特定の配列が実際には存在するのに含まれないよ
うに見えること、或いは（２）「ノー・テスト」結果、
すなわち内部陽性対照からのシグナルがまったく得られ
ないこと、をもたらす場合がある。
【０００４】プライマーセットの一次配列の他、プライ
マー二量体形成に寄与する主要因子として、アッセイ特
異的マスター混合物（ＡＳＭＭ）に含まれるプライマー
のモル量が多いこと；反応体の添加順序（例えば、ＡＳ
ＭＭ、ＭｇＣｌ2 溶液、標的／試料の順に添加するとプ
ライマー二量体の形成が増加する）；ＡＳＭＭへのＭｇ
Ｃｌ2 の添加と標的の添加との間のインキュベーション
期間；並びに、ＰＣＲ熱サイクルを開始する前の、完全
な増幅反応混合物、すなわち、標的及びポリメラーゼを
はじめとする増幅に必要な成分のすべてを含むもの、を
インキュベートする時間、が挙げられる。
マー二量体形成に寄与する主要因子として、アッセイ特
異的マスター混合物（ＡＳＭＭ）に含まれるプライマー
のモル量が多いこと；反応体の添加順序（例えば、ＡＳ
ＭＭ、ＭｇＣｌ2 溶液、標的／試料の順に添加するとプ
ライマー二量体の形成が増加する）；ＡＳＭＭへのＭｇ
Ｃｌ2 の添加と標的の添加との間のインキュベーション
期間；並びに、ＰＣＲ熱サイクルを開始する前の、完全
な増幅反応混合物、すなわち、標的及びポリメラーゼを
はじめとする増幅に必要な成分のすべてを含むもの、を
インキュベートする時間、が挙げられる。
【０００５】プライマーとポリメラーゼの核酸増幅用混
合物におけるプライマー二量体の形成を抑制するための
方法がいくつか知られている。それらの方法には以下の
ものが含まれる。 １．個別具体的な反応混合物において各ＰＣＲプライマ
ーを他のすべてのプライマーとの３’端の相同性が最も
低くなるように注意して設計する方法。しかしながら、
この方法は、多重反応、すなわち異なる標的核酸配列に
向けた数種類の増幅プライマー対を含む反応においては
困難となる。さらに、プライマー対が単一の場合でも、
例えば、同定領域又は保存領域のような別の拘束因子に
より達成が困難となる場合もある。
合物におけるプライマー二量体の形成を抑制するための
方法がいくつか知られている。それらの方法には以下の
ものが含まれる。 １．個別具体的な反応混合物において各ＰＣＲプライマ
ーを他のすべてのプライマーとの３’端の相同性が最も
低くなるように注意して設計する方法。しかしながら、
この方法は、多重反応、すなわち異なる標的核酸配列に
向けた数種類の増幅プライマー対を含む反応においては
困難となる。さらに、プライマー対が単一の場合でも、
例えば、同定領域又は保存領域のような別の拘束因子に
より達成が困難となる場合もある。
【０００６】２．プライマー二量体の形成に利用され得
る時間を短縮するため、アッセイ特異的反応混合物を調
製した後すぐに熱サイクル／増幅反応を実行する方法。
しかしながら、実用上、特に多数の試料をスクリーニン
グする場合には、この方法では困難な場合がある。 ３．潜在的なプライマー二量体を不安定化するために試
薬の添加順序を変更する方法。例えば、ＭｇＣｌ2 を最
後の成分として添加すると、プライマー二量体の形成を
抑制することができる。しかしながら、この方法は、
（１）プライマー二量体の形成を排除するものではな
い、（２）不便である、そして（３）試料の標的で塩化
マグネシウム溶液が汚染される可能性がある、という理
由で望ましくはない。
る時間を短縮するため、アッセイ特異的反応混合物を調
製した後すぐに熱サイクル／増幅反応を実行する方法。
しかしながら、実用上、特に多数の試料をスクリーニン
グする場合には、この方法では困難な場合がある。 ３．潜在的なプライマー二量体を不安定化するために試
薬の添加順序を変更する方法。例えば、ＭｇＣｌ2 を最
後の成分として添加すると、プライマー二量体の形成を
抑制することができる。しかしながら、この方法は、
（１）プライマー二量体の形成を排除するものではな
い、（２）不便である、そして（３）試料の標的で塩化
マグネシウム溶液が汚染される可能性がある、という理
由で望ましくはない。
【０００７】４．プライマー対合体が形成し得る温度に
おいてポリメラーゼ活性を阻害するが高温では不活化さ
れる抗ポリメラーゼ抗体である「引き金」抗体を使用す
る方法。したがって、ポリメラーゼは、プライマー二量
体が形成できないような高温においてのみ活性化される
（米国特許第５，３３８，６７１号及び同第５，５８
７，２８７号並びに欧州特許出願第０５９２０３５号参
照）。しかしながら、抗体／ポリメラーゼの結合は平衡
過程であるため、すべてのポリメラーゼを完全に結合さ
せることはできない。このため、抗体系のＰＣＲ制御
は、特に複雑な増幅反応においては、必ずしも１００％
有効であるものではない。
おいてポリメラーゼ活性を阻害するが高温では不活化さ
れる抗ポリメラーゼ抗体である「引き金」抗体を使用す
る方法。したがって、ポリメラーゼは、プライマー二量
体が形成できないような高温においてのみ活性化される
（米国特許第５，３３８，６７１号及び同第５，５８
７，２８７号並びに欧州特許出願第０５９２０３５号参
照）。しかしながら、抗体／ポリメラーゼの結合は平衡
過程であるため、すべてのポリメラーゼを完全に結合さ
せることはできない。このため、抗体系のＰＣＲ制御
は、特に複雑な増幅反応においては、必ずしも１００％
有効であるものではない。
【０００８】５．高温開始型ＰＣＲを実施する方法（Ch
ouら、Nuc. Acids Res. 20:1717-1723, 1992）。この方
法は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを除く全成分を反応混
合物に添加し、産物変性工程で反応を開始し、その後に
反応管を開けて当該ポリメラーゼを反応混合物に添加す
るというものである。この方法は、プライマー二量体の
形成を抑制する点では有効であるが、いくつかの理由か
ら実用的ではない。最も顕著な理由として、取扱いが非
常に煩わしく、アンプリコンのキャリオーバーの可能性
を著しく増大させてしまうことが挙げられる。
ouら、Nuc. Acids Res. 20:1717-1723, 1992）。この方
法は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを除く全成分を反応混
合物に添加し、産物変性工程で反応を開始し、その後に
反応管を開けて当該ポリメラーゼを反応混合物に添加す
るというものである。この方法は、プライマー二量体の
形成を抑制する点では有効であるが、いくつかの理由か
ら実用的ではない。最も顕著な理由として、取扱いが非
常に煩わしく、アンプリコンのキャリオーバーの可能性
を著しく増大させてしまうことが挙げられる。
【０００９】６．加熱されるまでは比較的不活性である
AmpliTaq Gold のような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用
いて高温開始型ＰＣＲを実施する方法（欧州特許出願第
６２４６４１号及び米国特許第５，４９１，０８６号参
照）。しかしながら、AmpliTaq Gold は低温において有
意な残存酵素活性を保持するため、なおも副産物を生じ
る可能性がある。
AmpliTaq Gold のような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用
いて高温開始型ＰＣＲを実施する方法（欧州特許出願第
６２４６４１号及び米国特許第５，４９１，０８６号参
照）。しかしながら、AmpliTaq Gold は低温において有
意な残存酵素活性を保持するため、なおも副産物を生じ
る可能性がある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】これらの方法の中に、
プライマー二量体の形成を成功裏に排除することが予測
できるものはない。プライマーを慎重に設計し、Ｔａｑ
ポリメラーゼとの組合せで引き金抗体又はAmpliTaq Gol
d を使用することで、プライマー二量体の形成を抑制す
ることはできても、これを排除することはない。このよ
うに、当該技術分野では、ＰＣＲ反応、特に多重反応に
おいて、プライマー二量体の形成を一層抑制し、或いは
排除するための改良法が必要とされている。
プライマー二量体の形成を成功裏に排除することが予測
できるものはない。プライマーを慎重に設計し、Ｔａｑ
ポリメラーゼとの組合せで引き金抗体又はAmpliTaq Gol
d を使用することで、プライマー二量体の形成を抑制す
ることはできても、これを排除することはない。このよ
うに、当該技術分野では、ＰＣＲ反応、特に多重反応に
おいて、プライマー二量体の形成を一層抑制し、或いは
排除するための改良法が必要とされている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、標的核酸の増
幅の特異性を高めるための方法を提供するものである。
本発明は、標的に特異的なオリゴヌクレオチド増幅プラ
イマーと核酸ポリメラーゼを要する反応のすべてに適用
可能である。本発明は、一側面として、増幅反応混合物
として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌ
クレオチド増幅プライマーと、核酸ポリメラーゼと、一
種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる増幅反応
において標的核酸の増幅特異性を高めるための方法であ
って、一種又は二種以上のプライマーと担体核酸とを含
むプライマー／担体混合物を調製し、そして当該プライ
マー／担体混合物に、標的核酸、一種又は二種以上のマ
グネシウム塩及びポリメラーゼを接触させることを特徴
とする方法に関する。
幅の特異性を高めるための方法を提供するものである。
本発明は、標的に特異的なオリゴヌクレオチド増幅プラ
イマーと核酸ポリメラーゼを要する反応のすべてに適用
可能である。本発明は、一側面として、増幅反応混合物
として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌ
クレオチド増幅プライマーと、核酸ポリメラーゼと、一
種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる増幅反応
において標的核酸の増幅特異性を高めるための方法であ
って、一種又は二種以上のプライマーと担体核酸とを含
むプライマー／担体混合物を調製し、そして当該プライ
マー／担体混合物に、標的核酸、一種又は二種以上のマ
グネシウム塩及びポリメラーゼを接触させることを特徴
とする方法に関する。
【００１２】別の側面として、本発明は、増幅反応混合
物として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴ
ヌクレオチド増幅プライマーと、Ｔａｑポリメラーゼ
と、塩化マグネシウムとが含まれる増幅反応において標
的核酸の増幅特異性を高めるための方法であって、一種
又は二種以上のプライマーとウシ胸腺ＤＮＡを含む担体
核酸とを含むプライマー／担体混合物を調製し、その際
に当該担体核酸の濃度を増幅反応混合物１ｍＬ当たり約
１〜約１００μｇの範囲とし、そして当該プライマー／
担体混合物に、約１００℃未満の温度で、標的核酸、Ｔ
ａｑポリメラーゼ及び塩化マグネシウムを接触させるこ
とを特徴とする方法に関する。
物として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴ
ヌクレオチド増幅プライマーと、Ｔａｑポリメラーゼ
と、塩化マグネシウムとが含まれる増幅反応において標
的核酸の増幅特異性を高めるための方法であって、一種
又は二種以上のプライマーとウシ胸腺ＤＮＡを含む担体
核酸とを含むプライマー／担体混合物を調製し、その際
に当該担体核酸の濃度を増幅反応混合物１ｍＬ当たり約
１〜約１００μｇの範囲とし、そして当該プライマー／
担体混合物に、約１００℃未満の温度で、標的核酸、Ｔ
ａｑポリメラーゼ及び塩化マグネシウムを接触させるこ
とを特徴とする方法に関する。
【００１３】また別の側面として、本発明は、増幅反応
混合物として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオ
リゴヌクレオチド増幅プライマーと、ポリメラーゼと、
一種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる、標的
核酸を増幅するための反応において非標的核酸のポリメ
ラーゼ伸長を抑制するための方法であって、一種又は二
種以上の増幅プライマーと担体核酸とを含むオリゴヌク
レオチドプライマー／担体核酸混合物を調製し、そして
当該プライマー／担体混合物に、標的核酸、ポリメラー
ゼ及びマグネシウム塩を接触させることを特徴とする方
法に関する。
混合物として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオ
リゴヌクレオチド増幅プライマーと、ポリメラーゼと、
一種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる、標的
核酸を増幅するための反応において非標的核酸のポリメ
ラーゼ伸長を抑制するための方法であって、一種又は二
種以上の増幅プライマーと担体核酸とを含むオリゴヌク
レオチドプライマー／担体核酸混合物を調製し、そして
当該プライマー／担体混合物に、標的核酸、ポリメラー
ゼ及びマグネシウム塩を接触させることを特徴とする方
法に関する。
【００１４】第四の側面として、本発明は、増幅反応混
合物として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリ
ゴヌクレオチド増幅プライマーと、ポリメラーゼと、一
種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる、標的核
酸を増幅するための反応においてプライマー二量体その
他の非特異的核酸増幅産物の形成を抑制するための方法
であって、一種又は二種以上のプライマーと担体核酸と
を含むプライマー／担体核酸混合物を調製し、そして当
該プライマー／担体混合物に標的核酸、ポリメラーゼ及
びマグネシウム塩を接触させることを特徴とする方法に
関する。
合物として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリ
ゴヌクレオチド増幅プライマーと、ポリメラーゼと、一
種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる、標的核
酸を増幅するための反応においてプライマー二量体その
他の非特異的核酸増幅産物の形成を抑制するための方法
であって、一種又は二種以上のプライマーと担体核酸と
を含むプライマー／担体核酸混合物を調製し、そして当
該プライマー／担体混合物に標的核酸、ポリメラーゼ及
びマグネシウム塩を接触させることを特徴とする方法に
関する。
【００１５】担体核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタ
ンパク核酸をはじめとし、どのような核酸でも使用する
ことができる。当該担体をＤＮＡとすることが好まし
く、そしてこれをウシ胸腺ＤＮＡとすることが最も好ま
しい。典型的には、最終増幅反応混合物中での濃度が約
１〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜約７５μｇ
／ｍＬ、最も好ましくは約２５〜約５０μｇ／ｍＬの範
囲となるように、担体を添加する。
ンパク核酸をはじめとし、どのような核酸でも使用する
ことができる。当該担体をＤＮＡとすることが好まし
く、そしてこれをウシ胸腺ＤＮＡとすることが最も好ま
しい。典型的には、最終増幅反応混合物中での濃度が約
１〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜約７５μｇ
／ｍＬ、最も好ましくは約２５〜約５０μｇ／ｍＬの範
囲となるように、担体を添加する。
【００１６】本発明の方法は、増幅アッセイ中の非標的
核酸のポリメラーゼ伸長を抑制する点で特に有利であ
る。本法は、特に、増幅反応混合物を、増幅反応の開始
前に、標的核酸を変性させるのに要する温度よりも低い
温度（すなわち、１００℃未満）において維持する場合
に適用することができる。このような条件には、例え
ば、増幅反応混合物を、室温又は室温よりも若干低い温
度において約１〜約２４時間維持するという場合が含ま
れる。
核酸のポリメラーゼ伸長を抑制する点で特に有利であ
る。本法は、特に、増幅反応混合物を、増幅反応の開始
前に、標的核酸を変性させるのに要する温度よりも低い
温度（すなわち、１００℃未満）において維持する場合
に適用することができる。このような条件には、例え
ば、増幅反応混合物を、室温又は室温よりも若干低い温
度において約１〜約２４時間維持するという場合が含ま
れる。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明は、核酸増幅混合物に担体
核酸を添加すると、標的核酸の増幅の効率及び特異性が
相当に高くなるという発見に基づくものである。具体的
には、本発明の方法は、熱サイクル工程において増幅混
合物の温度を高める前のプライマー二量体の形成量を減
少させることにより、増幅アッセイに際して非標的核酸
のポリメラーゼ伸長を抑制することとなる。
核酸を添加すると、標的核酸の増幅の効率及び特異性が
相当に高くなるという発見に基づくものである。具体的
には、本発明の方法は、熱サイクル工程において増幅混
合物の温度を高める前のプライマー二量体の形成量を減
少させることにより、増幅アッセイに際して非標的核酸
のポリメラーゼ伸長を抑制することとなる。
【００１８】本発明の実施には、分子生物学、微生物
学、組換えＤＮＡ及びタンパク生化学における多くの技
術が使用され、例えば、Sambrook et al., 1989, Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approac
h, Volumes I and II, 1985 (D.N. Glover ed.); Oligo
nucleotide Synthesis,1984, (M.L. Gait ed.); Transc
ription and Translation, 1984 (Hames and Higgins e
ds.); A Practical Guide to Molecular Cloning; the
series, Methodsin Enzymology (Academic Press, In
c.);及び Protein Purification: Principles and Prac
tice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.)に説明
がある。
学、組換えＤＮＡ及びタンパク生化学における多くの技
術が使用され、例えば、Sambrook et al., 1989, Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approac
h, Volumes I and II, 1985 (D.N. Glover ed.); Oligo
nucleotide Synthesis,1984, (M.L. Gait ed.); Transc
ription and Translation, 1984 (Hames and Higgins e
ds.); A Practical Guide to Molecular Cloning; the
series, Methodsin Enzymology (Academic Press, In
c.);及び Protein Purification: Principles and Prac
tice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.)に説明
がある。
【００１９】本明細書中の用語「増幅反応混合物」は、
少なくとも増幅プライマーと、標的核酸と、デオキシヌ
クレオチドと、ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマ
グネシウム塩と、緩衝液とを、核酸増幅反応を進行させ
るに十分な量で含む増幅に十分な混合物をさす。本明細
書中の用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、ポリ
リボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチ
ド又はポリリボ／ポリデオキシリボ混合型ヌクレオチド
からなる任意の長さのプリン及びピリミジン含有ポリマ
ーをさす。これには一本鎖及び二本鎖の分子、例えば、
ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡの
各バイブリッド、並びにアミノ酸骨格に塩基を複合化し
て形成される「タンパク核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。
また、変性塩基を含有する核酸も含まれる。
少なくとも増幅プライマーと、標的核酸と、デオキシヌ
クレオチドと、ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマ
グネシウム塩と、緩衝液とを、核酸増幅反応を進行させ
るに十分な量で含む増幅に十分な混合物をさす。本明細
書中の用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、ポリ
リボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチ
ド又はポリリボ／ポリデオキシリボ混合型ヌクレオチド
からなる任意の長さのプリン及びピリミジン含有ポリマ
ーをさす。これには一本鎖及び二本鎖の分子、例えば、
ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡの
各バイブリッド、並びにアミノ酸骨格に塩基を複合化し
て形成される「タンパク核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。
また、変性塩基を含有する核酸も含まれる。
【００２０】本明細書中の用語である「相補的な」核酸
配列は、元の配列とのワトソン−クリック型塩基対合に
関与するアンチセンス配列をさす。本明細書中の用語
「プライマー」は、目的の一本鎖核酸配列と二本鎖を形
成し且つ、例えば、逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼ
の使用により相補鎖の重合を可能ならしめるオリゴヌク
レオチドであって、長さがヌクレオチド数で約６〜約５
０、好ましくは約１２〜約２５、最も好ましくは約１２
〜約１８の範囲にあるものをさす。
配列は、元の配列とのワトソン−クリック型塩基対合に
関与するアンチセンス配列をさす。本明細書中の用語
「プライマー」は、目的の一本鎖核酸配列と二本鎖を形
成し且つ、例えば、逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼ
の使用により相補鎖の重合を可能ならしめるオリゴヌク
レオチドであって、長さがヌクレオチド数で約６〜約５
０、好ましくは約１２〜約２５、最も好ましくは約１２
〜約１８の範囲にあるものをさす。
【００２１】本明細書中の用語「増幅」は、核酸を複製
するための反復工程をさす。好適な増幅法には、ポリメ
ラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅法、核
酸単一塩基増幅法及び転写介在型増幅法が含まれるが、
これらに限定されない。本明細書中の用語「標的核酸」
は、そのサブ配列がＰＣＲ反応において増幅される核酸
鋳型をさす。
するための反復工程をさす。好適な増幅法には、ポリメ
ラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅法、核
酸単一塩基増幅法及び転写介在型増幅法が含まれるが、
これらに限定されない。本明細書中の用語「標的核酸」
は、そのサブ配列がＰＣＲ反応において増幅される核酸
鋳型をさす。
【００２２】内部陽性対照（ＩＰＣ）標的核酸は、プラ
スミドベクター中にクローン化され、その後典型的には
制限エンドヌクレアーゼの作用で線状化された合成核酸
配列である。ＩＰＣは、典型的には、ジェネリックなプ
ローブ結合領域を取り囲む複数のプライマー結合配列を
有し、核酸増幅反応において偽陰性結果に対するジェネ
リックな対照として働く。好適な内部陽性対照標的ＤＮ
Ａの配列は以下の通りである。
スミドベクター中にクローン化され、その後典型的には
制限エンドヌクレアーゼの作用で線状化された合成核酸
配列である。ＩＰＣは、典型的には、ジェネリックなプ
ローブ結合領域を取り囲む複数のプライマー結合配列を
有し、核酸増幅反応において偽陰性結果に対するジェネ
リックな対照として働く。好適な内部陽性対照標的ＤＮ
Ａの配列は以下の通りである。
【００２３】
【化１】
【００２４】本発明は、標的核酸にハイブリダイズし、
標的核酸の酵素的複製を開始するために標的核酸と共に
一種又は二種以上のオリゴヌクレオチドをインキュベー
トする反応であればいずれのものに対しても適用するこ
とができる。このような反応には、例えば、ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅
法、核酸単一塩基増幅法及び転写介在型増幅法が含まれ
る。これらの反応では、オリゴヌクレオチドプライマ
ー、緩衝液及び塩、デオキシヌクレオチド並びにその他
の任意成分を含有するアッセイ特異的マスター混合物を
処方する。次いで、標的核酸を添加し、その後、反応を
触媒する酵素、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、及び／又
は反応の進行に必要なマグネシウム塩、例えば、塩化マ
グネシウム、を添加する。
標的核酸の酵素的複製を開始するために標的核酸と共に
一種又は二種以上のオリゴヌクレオチドをインキュベー
トする反応であればいずれのものに対しても適用するこ
とができる。このような反応には、例えば、ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅
法、核酸単一塩基増幅法及び転写介在型増幅法が含まれ
る。これらの反応では、オリゴヌクレオチドプライマ
ー、緩衝液及び塩、デオキシヌクレオチド並びにその他
の任意成分を含有するアッセイ特異的マスター混合物を
処方する。次いで、標的核酸を添加し、その後、反応を
触媒する酵素、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、及び／又
は反応の進行に必要なマグネシウム塩、例えば、塩化マ
グネシウム、を添加する。
【００２５】本発明の方法に用いるのに適した他の成分
として、低温においてポリメラーゼに結合しこれを不活
化するが、高温では自身が不活化されてポリメラーゼを
活性化させることになる抗ポリメラーゼ抗体が含まれる
が、これに限定されない。また、反応混合物にエキソヌ
クレアーゼやグリコシラーゼを含めてもよい。本発明を
実施する際、標的核酸、ポリメラーゼ又はマグネシウム
塩との混合前に、オリゴヌクレオチドプライマーと担体
核酸とを接触させる。本発明による担体核酸は、原核生
物又は真核生物のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、合成ＤＮＡ
及び／又はＲＮＡ、又はランダム及び／又は特異的なＰ
ＮＡ（ペプチド核酸）をはじめとする（これらに限定さ
れない）任意の核酸を含むことができる。好ましくは、
担体はＤＮＡ、最も好ましくはウシ胸腺ＤＮＡを含む。
として、低温においてポリメラーゼに結合しこれを不活
化するが、高温では自身が不活化されてポリメラーゼを
活性化させることになる抗ポリメラーゼ抗体が含まれる
が、これに限定されない。また、反応混合物にエキソヌ
クレアーゼやグリコシラーゼを含めてもよい。本発明を
実施する際、標的核酸、ポリメラーゼ又はマグネシウム
塩との混合前に、オリゴヌクレオチドプライマーと担体
核酸とを接触させる。本発明による担体核酸は、原核生
物又は真核生物のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、合成ＤＮＡ
及び／又はＲＮＡ、又はランダム及び／又は特異的なＰ
ＮＡ（ペプチド核酸）をはじめとする（これらに限定さ
れない）任意の核酸を含むことができる。好ましくは、
担体はＤＮＡ、最も好ましくはウシ胸腺ＤＮＡを含む。
【００２６】本発明で使用するための担体核酸は常用方
法により調製することができる。例えば、ＤＮＡ又はＲ
ＮＡは除タンパク処理により単離することができる。Ｄ
ＮＡは、例えば、Matteucci et al., 1981, J. Am. Che
m. Soc. 103:3185に記載のホスホルアミダイト固相担体
法、Yoo et al., 1989, J. Biol. Chem. 764:17078に記
載の方法、その他の周知方法を用いて化学合成すること
ができる。本発明に用いられる核酸は、当該技術分野で
知られている任意の手段により修飾することもできる。
このような修飾の例として、メチル化、「キャップ」、
天然ヌクレオチドの一又は二以上を類似体で置換するこ
と、ヌクレオチド間修飾、例えば、無荷電結合（例、メ
チルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミ
デート、カルバメート、等）又は荷電結合（例、ホスホ
ロチオエート、ホスホロジチオエート、等）で修飾した
もの、が挙げられるが、これらに限定されない。核酸
は、一又は二以上の追加的な共有結合された部分、例え
ば、タンパク質（例、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、
シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン、等）、挿入体
（例、アクリジン、プソラレン、等）、キレート剤
（例、金属、放射性金属、鉄、酸化性金属、等）及びア
ルキル化剤を含むことができる。核酸は、メチルもしく
はエチルホスホトリエステル又はアルキルホスホルアミ
デート結合の形成により誘導体化されることができる。
リン酸基の酸素原子の一又は二以上を硫黄原子に置き換
えたチオール化増幅プライマーを、例えば、Eckstein e
t al., Ann, Rev. Biochem. 54:367 (1985); Zon et a
l., Anticancer Drug Design 6:539 (1991); 及びOlson
et al., PNAS 83:1451 (1990) に記載の方法により合
成することができる。
法により調製することができる。例えば、ＤＮＡ又はＲ
ＮＡは除タンパク処理により単離することができる。Ｄ
ＮＡは、例えば、Matteucci et al., 1981, J. Am. Che
m. Soc. 103:3185に記載のホスホルアミダイト固相担体
法、Yoo et al., 1989, J. Biol. Chem. 764:17078に記
載の方法、その他の周知方法を用いて化学合成すること
ができる。本発明に用いられる核酸は、当該技術分野で
知られている任意の手段により修飾することもできる。
このような修飾の例として、メチル化、「キャップ」、
天然ヌクレオチドの一又は二以上を類似体で置換するこ
と、ヌクレオチド間修飾、例えば、無荷電結合（例、メ
チルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミ
デート、カルバメート、等）又は荷電結合（例、ホスホ
ロチオエート、ホスホロジチオエート、等）で修飾した
もの、が挙げられるが、これらに限定されない。核酸
は、一又は二以上の追加的な共有結合された部分、例え
ば、タンパク質（例、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、
シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン、等）、挿入体
（例、アクリジン、プソラレン、等）、キレート剤
（例、金属、放射性金属、鉄、酸化性金属、等）及びア
ルキル化剤を含むことができる。核酸は、メチルもしく
はエチルホスホトリエステル又はアルキルホスホルアミ
デート結合の形成により誘導体化されることができる。
リン酸基の酸素原子の一又は二以上を硫黄原子に置き換
えたチオール化増幅プライマーを、例えば、Eckstein e
t al., Ann, Rev. Biochem. 54:367 (1985); Zon et a
l., Anticancer Drug Design 6:539 (1991); 及びOlson
et al., PNAS 83:1451 (1990) に記載の方法により合
成することができる。
【００２７】増幅反応体積における担体核酸の最終濃度
が約１〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜約７５
μｇ／ｍＬ、最も好ましくは約２５〜約５０μｇ／ｍＬ
の範囲となるに十分な量の担体核酸をプライマー含有マ
スター混合物に添加する。当該反応におけるプライマー
の典型量は約０．１Ｍ〜約１Ｍの範囲の濃度である。担
体の最適量は具体的なアッセイについて個別に決定する
ことができる。この決定は、標準化されたマスター混合
物への担体核酸の添加量を増加させていき、標的核酸及
び酵素を添加し、そして反応に引き続き、特異的増幅産
物と非特異的増幅産物の量を監視することにより行うこ
とができる（例えば、後述の例１を参照のこと）。
が約１〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜約７５
μｇ／ｍＬ、最も好ましくは約２５〜約５０μｇ／ｍＬ
の範囲となるに十分な量の担体核酸をプライマー含有マ
スター混合物に添加する。当該反応におけるプライマー
の典型量は約０．１Ｍ〜約１Ｍの範囲の濃度である。担
体の最適量は具体的なアッセイについて個別に決定する
ことができる。この決定は、標準化されたマスター混合
物への担体核酸の添加量を増加させていき、標的核酸及
び酵素を添加し、そして反応に引き続き、特異的増幅産
物と非特異的増幅産物の量を監視することにより行うこ
とができる（例えば、後述の例１を参照のこと）。
【００２８】担体核酸は、標的核酸の添加前にオリゴヌ
クレオチドプライマーと混合することが好ましい。次い
で、そのプライマー／担体混合物を標的核酸、当該増幅
反応を触媒するポリメラーゼ及び当該ポリメラーゼの効
率的作用に欠かせないマグネシウム塩と混合する。典型
的には、その反応混合物を、増幅反応の開始前に約９０
〜約１００℃未満の温度に維持する。好ましくは、増幅
を熱サイクルにより行い、そして混合物の温度を熱サイ
クルの開始前に約９０〜約１００℃未満の温度に維持す
る。最も好ましくは、当該反応混合物を増幅反応の開始
前にほぼ室温において維持する。
クレオチドプライマーと混合することが好ましい。次い
で、そのプライマー／担体混合物を標的核酸、当該増幅
反応を触媒するポリメラーゼ及び当該ポリメラーゼの効
率的作用に欠かせないマグネシウム塩と混合する。典型
的には、その反応混合物を、増幅反応の開始前に約９０
〜約１００℃未満の温度に維持する。好ましくは、増幅
を熱サイクルにより行い、そして混合物の温度を熱サイ
クルの開始前に約９０〜約１００℃未満の温度に維持す
る。最も好ましくは、当該反応混合物を増幅反応の開始
前にほぼ室温において維持する。
【００２９】理論に拘束されることを望むものではない
が、プライマー二量体の形成が抑制されるメカニズムと
して異なるいくつかのものが考えられる。第一は、ポリ
メラーゼが担体核酸に結合するというものである。この
ことは、混合物にさらに抗ポリメラーゼ抗体を存在させ
る場合に特に有益である。抗ポリメラーゼ抗体が結合し
ていないポリメラーゼ分子が担体核酸に結合されること
により、存在するかもしれない対合したプライマーが伸
長する可能性を一層低くするからである。第二に、担体
核酸は混合物中の対合したプライマーの数を減らすと考
えられる。プライマーは担体ＤＮＡにも弱くアニールす
るためである。プライマーが担体核酸に結合することに
より形成された非特異的伸長産物は、これらの非特異的
部位のための対合プライマーが存在しないため、ＰＣＲ
の標的増幅段階において増幅されない。このため、プラ
イマー二量体の形成（その他の非特異的核酸産物の形
成）が抑制される。
が、プライマー二量体の形成が抑制されるメカニズムと
して異なるいくつかのものが考えられる。第一は、ポリ
メラーゼが担体核酸に結合するというものである。この
ことは、混合物にさらに抗ポリメラーゼ抗体を存在させ
る場合に特に有益である。抗ポリメラーゼ抗体が結合し
ていないポリメラーゼ分子が担体核酸に結合されること
により、存在するかもしれない対合したプライマーが伸
長する可能性を一層低くするからである。第二に、担体
核酸は混合物中の対合したプライマーの数を減らすと考
えられる。プライマーは担体ＤＮＡにも弱くアニールす
るためである。プライマーが担体核酸に結合することに
より形成された非特異的伸長産物は、これらの非特異的
部位のための対合プライマーが存在しないため、ＰＣＲ
の標的増幅段階において増幅されない。このため、プラ
イマー二量体の形成（その他の非特異的核酸産物の形
成）が抑制される。
【００３０】
【実施例】以下の実施例は本発明を限定することなく説
明するものである。例１ ：ＨＩＶ配列のＰＣＲ増幅に対する担体核酸の効果 ＨＩＶ増幅反応に担体核酸を添加した効果を監視するた
めに以下の実験を実施した。表１に示した１１種のプラ
イマー、トリス緩衝液、ｄＮＴＰ、AmpliTaq、及び二種
のAmpliTaq引き金抗体（米国特許第５，３３８，６７１
号及び同第５，５８７，２８７号；欧州特許第０５９２
０３５号）を含有するマスター混合物を配合した。マス
ター混合物は、ウシ胸腺ＤＮＡを含まないものと含むも
のとを調製した（それぞれ第Ｉグループ、第IIグルー
プ）。
明するものである。例１ ：ＨＩＶ配列のＰＣＲ増幅に対する担体核酸の効果 ＨＩＶ増幅反応に担体核酸を添加した効果を監視するた
めに以下の実験を実施した。表１に示した１１種のプラ
イマー、トリス緩衝液、ｄＮＴＰ、AmpliTaq、及び二種
のAmpliTaq引き金抗体（米国特許第５，３３８，６７１
号及び同第５，５８７，２８７号；欧州特許第０５９２
０３５号）を含有するマスター混合物を配合した。マス
ター混合物は、ウシ胸腺ＤＮＡを含まないものと含むも
のとを調製した（それぞれ第Ｉグループ、第IIグルー
プ）。
【００３１】
【表１】
【００３２】第Ｉグループ、第IIグループのアリコート
各５０μＬに、２５μＬの１６ｍＭＭｇＣｌ2 を添加
し、続いて２５μＬの標的混合物（２０ｍＭ ＮａＯＨ
に１３．３コピーの内部陽性対照標的核酸を含む）を添
加した。各グループにつき、３種類の実験プロトコルを
採用した。これを以下の表２に示す。
各５０μＬに、２５μＬの１６ｍＭＭｇＣｌ2 を添加
し、続いて２５μＬの標的混合物（２０ｍＭ ＮａＯＨ
に１３．３コピーの内部陽性対照標的核酸を含む）を添
加した。各グループにつき、３種類の実験プロトコルを
採用した。これを以下の表２に示す。
【００３３】
【表２】 Ｉ（ａ，ｂ，ｃ）＝マスター混合物中に担体ＤＮＡは含
まない II（ａ，ｂ，ｃ）＝マスター混合物中に担体（ウシ胸
腺）ＤＮＡを含む
まない II（ａ，ｂ，ｃ）＝マスター混合物中に担体（ウシ胸
腺）ＤＮＡを含む
【００３４】反応混合物の一組（記号Ａで表す）では、
ＩＰＣプライマーはチオール化されていないが、第二の
組（記号Ｂで表す）では、ＩＰＣプライマーはチオール
化されている。すべての反応は２回繰り返した。混合物
の７５μＬのアリコートをブランクの核酸パウチ（Orth
o Clinical Diagnostics, Rochester, NY)に添加した。
ＰＣＲ増幅反応の条件は以下の通りとした。 （１）ＤＮＡ及びAmpliTaq引き金抗体を完全変性させる
ため９６℃３分間； （２）９６℃５秒間に続く６２℃４０秒間を５サイク
ル； （３）９６℃５秒間に続く６８℃４０秒間を３５サイク
ル。 増幅産物をパウチから取り出し、トリス−ホウ酸緩衝液
中で４％アガロースゲル電気泳動法により分離した。増
幅ＤＮＡ産物を臭化エチジウム染色法により検出した。
ＩＰＣプライマーはチオール化されていないが、第二の
組（記号Ｂで表す）では、ＩＰＣプライマーはチオール
化されている。すべての反応は２回繰り返した。混合物
の７５μＬのアリコートをブランクの核酸パウチ（Orth
o Clinical Diagnostics, Rochester, NY)に添加した。
ＰＣＲ増幅反応の条件は以下の通りとした。 （１）ＤＮＡ及びAmpliTaq引き金抗体を完全変性させる
ため９６℃３分間； （２）９６℃５秒間に続く６２℃４０秒間を５サイク
ル； （３）９６℃５秒間に続く６８℃４０秒間を３５サイク
ル。 増幅産物をパウチから取り出し、トリス−ホウ酸緩衝液
中で４％アガロースゲル電気泳動法により分離した。増
幅ＤＮＡ産物を臭化エチジウム染色法により検出した。
【００３５】実験結果は、ゲルの写真において特異的
（ＩＰＣ）産物及び非特異的産物（プライマー二量体そ
の他の正しくないプライミング産物）の強度を目視検査
することにより評価した（表３）。特異的及び非特異的
な産物のバンド強度を０〜１０のスケールで目視評価し
た。ここで０は検出できるバンドが存在しないことを、
そして１０は最大強度をそれぞれ表す。ＮＡは評価され
なかったことを表す。
（ＩＰＣ）産物及び非特異的産物（プライマー二量体そ
の他の正しくないプライミング産物）の強度を目視検査
することにより評価した（表３）。特異的及び非特異的
な産物のバンド強度を０〜１０のスケールで目視評価し
た。ここで０は検出できるバンドが存在しないことを、
そして１０は最大強度をそれぞれ表す。ＮＡは評価され
なかったことを表す。
【００３６】
【表３】
【００３７】３種のサブセット（ａ〜ｃ）のすべてにお
いて、第IIグループの増幅反応は、第Ｉグループと比較
して、特異的産物のバンドは強く、非特異的産物のバン
ドは弱くなった。このことは、実験のＡ部（非チオール
化ＩＰＣプライマーを使用）についても、実験のＢ部
（チオール化ＩＰＣプライマーを使用）についても当て
はまった。４種類のグループのすべてにおいて、熱サイ
クル工程の前に約４時間室温で混合物をインキュベーシ
ョンすることを含み、プライマー二量体の形成により有
利な条件を混合物に適用するほど（ａ〜ｃ）、プライマ
ー二量体産物の量は増加し、そして特異的産物の量は減
少した。Ｉ−ｃでは、唯一の可視ゲルバンドは強いプラ
イマー二量体のバンドであった。対照的に、II−ｃの反
応では、強い産物バンドが認められ、これに釣り合うよ
うにプライマー二量体産物は非常に少なくなった。最後
に、ＩＰＣプライマーのチオール化（Ｂ部）は、特異的
産物の合成を若干増加させることとなったが、これは担
体核酸を含むマスター混合物の配合によるほどの利益で
はなかった。
いて、第IIグループの増幅反応は、第Ｉグループと比較
して、特異的産物のバンドは強く、非特異的産物のバン
ドは弱くなった。このことは、実験のＡ部（非チオール
化ＩＰＣプライマーを使用）についても、実験のＢ部
（チオール化ＩＰＣプライマーを使用）についても当て
はまった。４種類のグループのすべてにおいて、熱サイ
クル工程の前に約４時間室温で混合物をインキュベーシ
ョンすることを含み、プライマー二量体の形成により有
利な条件を混合物に適用するほど（ａ〜ｃ）、プライマ
ー二量体産物の量は増加し、そして特異的産物の量は減
少した。Ｉ−ｃでは、唯一の可視ゲルバンドは強いプラ
イマー二量体のバンドであった。対照的に、II−ｃの反
応では、強い産物バンドが認められ、これに釣り合うよ
うにプライマー二量体産物は非常に少なくなった。最後
に、ＩＰＣプライマーのチオール化（Ｂ部）は、特異的
産物の合成を若干増加させることとなったが、これは担
体核酸を含むマスター混合物の配合によるほどの利益で
はなかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョン ダブリュ．バックス アメリカ合衆国，ミズーリ 63021，ボー ルウィン，キャリエージ ブリッジ トレ イルズ 1438
Claims (35)
- 【請求項１】 増幅反応試薬として標的核酸に特異的な
一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマー
と、標的核酸と、核酸ポリメラーゼと、一種又は二種以
上のマグネシウム塩とが含まれる増幅反応において標的
核酸の増幅特異性を高めるための方法であって、 （ａ）一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プラ
イマーと担体核酸とを含むプライマー／担体混合物を調
製し、そして（ｂ）前記プライマー／担体混合物に、標
的核酸、一種又は二種以上のマグネシウム塩及び核酸ポ
リメラーゼを接触させることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記担体核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びペ
プチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選択される、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記ＤＮＡがウシ胸腺ＤＮＡである、請
求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記担体核酸の前記増幅反応における存
在濃度が１ｍＬ当たり１〜１００μｇの範囲である、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記担体核酸の前記増幅反応における存
在濃度が１ｍＬ当たり５〜７５μｇの範囲である、請求
項４に記載の方法。 - 【請求項６】 前記混合物を、前記増幅反応の開始前に
９０〜１００℃未満の温度で維持する、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項７】 前記温度を熱サイクルの開始前に維持す
る、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 前記ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼ
を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 前記マグネシウム塩が塩化マグネシウム
を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記混合物がさらに、抗ポリメラーゼ
抗体、エキソヌクレアーゼ及びグリコシラーゼからなる
群より選択された成分又はこれらの任意の組合せを含
む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 増幅反応試薬として標的核酸に特異的
な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマ
ーと、Ｔａｑポリメラーゼと、塩化マグネシウムとが含
まれる増幅反応において標的核酸の増幅特異性を高める
ための方法であって、 （ａ）一種又は二種以上のプライマーとウシ胸腺ＤＮＡ
を含む担体核酸とを含むプライマー／担体混合物を調製
し、そして（ｂ）前記プライマー／担体混合物に、標的
核酸、Ｔａｑポリメラーゼ及び塩化マグネシウムを接触
させ、さらに、前記増幅反応における担体核酸の濃度を
増幅反応体積１ｍＬ当たり１〜１００μｇの範囲とする
ことを特徴とする方法。 - 【請求項１２】 増幅反応試薬として標的核酸に特異的
な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマ
ーと、ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウ
ム塩とが含まれる、標的核酸を増幅するための反応にお
いて非標的核酸のポリメラーゼ伸長を抑制するための方
法であって、 （ａ）一種又は二種以上の増幅プライマーと担体核酸と
を含むオリゴヌクレオチドプライマー／担体核酸混合物
を調製し、そして（ｂ）前記プライマー／担体混合物
に、標的核酸、ポリメラーゼ及び一種又は二種以上のマ
グネシウム塩を接触させることを特徴とする方法。 - 【請求項１３】 前記担体核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び
ペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選択される、請
求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記ＤＮＡがウシ胸腺ＤＮＡである、
請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記担体核酸の前記増幅反応における
存在濃度が１ｍＬ当たり１〜１００μｇの範囲である、
請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１６】 前記担体核酸の前記増幅反応における
存在濃度が１ｍＬ当たり５〜７５μｇの範囲である、請
求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記混合物を、前記増幅反応の開始前
に９０〜１００℃未満の温度で維持する、請求項１６に
記載の方法。 - 【請求項１８】 前記温度を熱サイクルの開始前に維持
する、請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 前記ポリメラーゼがＴａｑポリメラー
ゼを含む、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項２０】 前記マグネシウム塩が塩化マグネシウ
ムを含む、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項２１】 前記混合物がさらに、抗ポリメラーゼ
抗体、エキソヌクレアーゼ及びグリコシラーゼからなる
群より選択された成分又はこれらの任意の組合せを含
む、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項２２】 増幅反応試薬として標的核酸に特異的
な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマ
ーと、ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウ
ム塩とが含まれる、標的核酸を増幅するための反応にお
いてプライマー二量体その他の非特異的核酸増幅産物の
形成を抑制するための方法であって、 （ａ）一種又は二種以上のプライマーと担体核酸とを含
むプライマー／担体核酸混合物を調製し、そして（ｂ）
前記プライマー／担体混合物に前記標的核酸を接触さ
せ、さらに前記プライマー／担体混合物の調製後に、前
記プライマーと、ポリメラーゼ、一種又は二種以上のマ
グネシウム塩及びこれらの混合物からなる群より選ばれ
た成分とを接触させることを特徴とする方法。 - 【請求項２３】 前記担体核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び
ペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選択される、請
求項２２に記載の方法。 - 【請求項２４】 前記担体核酸がＤＮＡである、請求項
２３に記載の方法。 - 【請求項２５】 前記ＤＮＡがウシ胸腺ＤＮＡである、
請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２６】 前記担体核酸の前記増幅反応における
存在濃度が１ｍＬ当たり１〜１００μｇの範囲である、
請求項２２に記載の方法。 - 【請求項２７】 前記担体核酸の前記増幅反応における
存在濃度が１ｍＬ当たり５〜７５μｇの範囲である、請
求項２６に記載の方法。 - 【請求項２８】 前記混合物を、前記増幅反応の開始前
に９０〜１００℃未満の温度で維持する、請求項２２に
記載の方法。 - 【請求項２９】 前記温度を熱サイクルの開始前に維持
する、請求項２８に記載の方法。 - 【請求項３０】 前記ポリメラーゼがＴａｑポリメラー
ゼを含む、請求項２２に記載の方法。 - 【請求項３１】 前記マグネシウム塩が塩化マグネシウ
ムを含む、請求項２２に記載の方法。 - 【請求項３２】 前記混合物がさらに、抗ポリメラーゼ
抗体、緩衝剤、デオキシヌクレオチドトリホスフェー
ト、エキソヌクレアーゼ及びグリコシラーゼからなる群
より選択された成分又はこれらの任意の組合せを含む、
請求項２２に記載の方法。 - 【請求項３３】 前記温度が室温である、請求項６に記
載の方法。 - 【請求項３４】 前記温度が室温である、請求項１７に
記載の方法。 - 【請求項３５】 前記温度が室温である、請求項２８に
記載の方法。
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