KR100901392B1 - 캐리어 핵산에 의한 핵산 증폭 특이성의 증진 - Google Patents

캐리어 핵산에 의한 핵산 증폭 특이성의 증진 Download PDF

Info

Publication number
KR100901392B1
KR100901392B1 KR1020000005497A KR20000005497A KR100901392B1 KR 100901392 B1 KR100901392 B1 KR 100901392B1 KR 1020000005497 A KR1020000005497 A KR 1020000005497A KR 20000005497 A KR20000005497 A KR 20000005497A KR 100901392 B1 KR100901392 B1 KR 100901392B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
carrier
primer
amplification
mixture
Prior art date
Application number
KR1020000005497A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20000076606A (ko
Inventor
프레스턴그레고리엠
바쿠스존더블유
Original Assignee
오르토-클리니칼 다이아그노스틱스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 오르토-클리니칼 다이아그노스틱스, 인코포레이티드 filed Critical 오르토-클리니칼 다이아그노스틱스, 인코포레이티드
Publication of KR20000076606A publication Critical patent/KR20000076606A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100901392B1 publication Critical patent/KR100901392B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L9/00—Disinfection, sterilisation or deodorisation of air
    • A61L9/015—Disinfection, sterilisation or deodorisation of air using gaseous or vaporous substances, e.g. ozone
    • A61L9/04—Disinfection, sterilisation or deodorisation of air using gaseous or vaporous substances, e.g. ozone using substances evaporated in the air without heating
    • A61L9/12—Apparatus, e.g. holders, therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L9/00—Disinfection, sterilisation or deodorisation of air
    • A61L9/01—Deodorant compositions
    • A61L9/012—Deodorant compositions characterised by being in a special form, e.g. gels, emulsions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Abstract

본 발명은 핵산을 증폭시키는 개선된 방법을 기술한다. 본 방법은, 반응 시약이 표적 핵산에 특이적인 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 증폭 프라이머, 표적 핵산, 핵산 폴리머라제 및 하나 이상의 마그네슘 염을 포함하고, 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 증폭 프라이머 및 캐리어 핵산을 포함하는 프라이머/캐리어 혼합물을 제조하고, 프라이머/캐리어 혼합물을 표적 핵산, 하나 이상의 마그네슘 염 및 핵산 폴리머라제와 접촉시킴에 의해, 증폭 반응중 표적 핵산의 증폭 특이성을 증가시키는 방법을 포함한다.
올리고뉴클레오타이드 증폭 프라이머, 캐리어 핵산, 표적 핵산, 마그네슘 염, 핵산 폴리머라제

Description

캐리어 핵산에 의한 핵산 증폭 특이성의 증진{Enhancement of the specificity of nucleic acid amplification by carrier nucleic acid}
본 발명은, 특히 감염성 미생물에 대한 진단 시험에서, 핵산을 증폭시키는 방법에 관한 것이다.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용한 핵산 서열의 증폭은 표적 핵산 내의 상이한 서열과 하이브리드화하는 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드 증폭 프라이머들을 필요로 한다. 일반적으로, 그들의 3'말단에 상동성 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머들의 사용을 피하는 것이 바람직하다. 상동성의 3'말단을 갖는 프라이머들은 서로가 잠재적으로 하이브리드화하여 프라이머-이량체(dimers)를 포함한 다양한 증폭 인공물이 형성될 수 있다.
3' 말단 상보성을 갖는 프라이머의 하이브리드화는, 증폭 개시전에 PCR 반응 성분 모두가 일단 혼합되는 경우, 반응 혼합물중의 마그네슘 존재로 인해 낮은 온도에서 프라이머 하이브리드가 안정화됨으로써 발생할 수 있다. 프라이머-이량체의 형성은, DNA 폴리머라제에 의해 하이브리드화된 프라이머가 연장됨으로써 실온이하에서 발생할 수 있다. 생성된 프라이머-이량체 생성물은 PCR 동안에 증폭되어 프라이머 및 폴리머라제에 대해 표적 핵산과 경쟁하게 된다. 초기단계에서 프라이머-이량체 생성물이 충분히 형성되는 경우, 이러한 생성물의 후속적인 PCR 증폭은 지정된 표적 핵산을 능가하게 되어, (i) 잘못된 네거티브 결과, 예를 들면, 사실상 서열이 존재하는 경우에도 샘플에 그러한 특정 서열이 존재하지 않는 것으로 나타나거나, (ii) "비-시험" 결과, 예를 들면, 내부적인 포지티브 대조군으로부터 어떠한 시그날도 수득되지 않도록 한다.
프라이머 세트의 주요 서열 뿐만 아니라 프라이머-이량체 형성에 기여하는 주요 요소는 다음과 같다: 검정 특이적 마스터 혼합물(ASMM)내에 높은 몰 농도의 프라이머; 반응물 첨가 순서(예를 들면, ASMM에 이어서 MgCl2 용액을 첨가하고 이어서 표적/샘플을 첨가하는 경우 프라이머-이량체 형성이 증가된다); ASMM에 MgCl2을 첨가하고 표적 샘플을 첨가하는 시간 사이의 항온처리 시간; 예를 들면, 표적 및 폴리머라제를 포함한 증폭에 요구되는 모든 성분을 함유하는 완전한 증폭 반응 혼합물을 PCR 열주기 개시전에 항온처리하는 시간.
프라이머 및 폴리머라제의 핵산 증폭 혼합물내에서 프라이머-이량체 형성을 감소시키는 것으로 공지된 여러 방법들이 있다. 이들 방법은 다음과 같다:
1. 특정 반응 혼합물중 모든 다른 프라이머와 3'-말단 상동성이 최소화되도록 PCR 프라이머를 주의깊게 디자인 하는 방법. 그러나, 이러한 전략은 다중 복합 반응, 예를 들면, 상이한 표적 핵산 서열에 대한 여러 쌍의 증폭 프라이머를 포함하는 반응에서는 사용되기 어렵다. 추가로, 한쌍의 프라이머가 사용된다 하더라도 또 다른 제한 요소, 예를 들면, 동일 또는 보존 영역으로 인해 성취되기 어렵다.
2. 프라이머-이량체가 형성되는데 필요한 시간을 단축시키기 위해 검정-특이적 반응 혼합물을 제조한 후 즉시 열주기/증폭 반응을 수행하는 방법. 그러나 이러한 방법은 특히 다수의 샘플이 검색되어야만 하는 경우 실질적으로 사용하기 어렵다.
3. 잠재적인 프라이머-이량체를 불안정화시키기 위해 시약 첨가의 순서를 변화시키는 방법. 예를 들면, 최종 성분으로서 MgCl2를 첨가하여 프라이머-이량체 형성을 감소시킬 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 (i) 프라이머-이량체 형성을 제거하지 않고, (ii) 불편하며, (iii) 염화마그네슘 용액 샘플 기원의 표적을 오염시키기 때문에 바람직하지 못하다.
4. 프라이머-하이브리드가 형성될 수 있는 온도에서 폴리머라제 활성을 차단시키지만 고온에서는 불활성화되는 항-폴리머라제 항체인 "트리거링(triggering)" 항체를 사용하는 방법. 이로써, 폴리머라제는 프라이머-이량체가 형성되기에는 너무 높은 온도에서 활성화된다[참조: 미국 특허 제5,338,671호 및 제5,587,287호; 및 유럽 특허원 제0592035호]. 그러나, 항체/폴리머라제 결합은 평형화 과정이기때문에 모든 폴리머라제의 완전한 결합은 성취될 수 없다. 따라서, 항체-기본의 PCR 트리거링은, 특히 복합 증폭 반응에서 필연적으로 100% 효과적이지 못하다.
5. 핫 스타트(Hot Start) PCR을 수행하는 방법[참조: Chou et al., Nuc. Acids Res. 20:1717-1723, 1992]. 이러한 방법은 열 안정성 DNA 폴리머라제를 제외한 모든 성분을 반응 혼합물에 첨가하는 단계, 생성물 변성 단계로 반응을 개시하는 단계에 이어서 반응 튜브를 개방하는 단계 및 폴리머라제를 반응 혼합물에 첨가하는 단계를 포함한다. 상기 방법이 프라이머-이량체의 형성을 감소시키는데 효과적이다 할지라도 여러가지 이유때문에 실용적이지 못하다. 가장 주목할만한 것은 매우 번거롭고 앰프리콘이 케리오버(carryover)될 가능성이 상당히 증가한다.
6. 가열시까지 비교적 불활성화되는, 예를 들면 앰플리타크 골드(Amplitaq Gold)와 같은 열 안정성 DNA 폴리머라제를 사용하여 핫 스타트 PCR을 수행하는 방법[참조: 유럽 특허원 제624641호 및 미국 특허 제5,491,086호]. 그러나, 앰플리타크 골드는 낮은 온도에서 상당한 잔여 효소 활성을 유지하며, 따라서 여전히 부산물을 형성하기 쉬운 경향이 있다.
예측할 수 있듯이, 이들 방법중 어떠한 것도 프라이머-이량체 형성을 제거하는데 성공적이지 못하였다. 신중한 프라이머 디자인 및, 앰플리타크 골드 또는 Taq 폴리머라제와 배합된 트리거링 항체의 사용은 프라이머-이량체의 형성을 감소시킬 수 있지만, 이를 제거하지는 못한다. 따라서, 당해 기술분야에서는 PCR 반응에서, 특히 다중 복합 반응에서 프라이머-이량체의 형성을 추가로 감소시키거나 제거하기 위한 개선된 방법이 요구된다.
본 발명은 표적 핵산의 증폭 특이성을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 이는 표적에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 증폭 프라이머 및 핵산 폴리머라제를 필요로 하는 모든 반응에 적용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 증폭 반응에서 표적 핵산의 증폭 특이성을 증가시키는 방법에 관한 것이고, 이때 증폭 반응 혼합물은 표적에 대해 특이적인 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 증폭 프라이머, 핵산 폴리머라제 및 하나 이상의 마그네슘 염을 포함하며, 상기 방법은 하나 이상의 프라이머 및 캐리어 핵산을 함유하는 프라이머-캐리어 혼합물을 제조하고 이를 표적 핵산, 하나 이상의 마그네슘 염 및 폴리머라제와 접촉시킴을 포함한다.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 증폭 반응에서 표적 핵산의 증폭 특이성을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 이때 증폭 반응 혼합물은 표적 핵산에 대해 특이적인 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 증폭 프라이머, Taq 폴리머라제 및 염화마그네슘을 포함하고, 상기 방법은 하나 이상의 프라이머, 및 송아지 흉선 DNA를 포함하는 캐리어 핵산(이때, 캐리어 핵산의 농도는 증폭 반응 혼합물 1㎖당 약 1 내지 약 100 ㎍의 범위이다)을 포함하는 프라이머-캐리어 혼합물을 제조하고, 약 100℃ 이하의 온도에서 상기 프라이머-캐리어 혼합물을 표적 핵산, Taq 폴리머라제 및 염화마그네슘과 접촉시킴을 포함한다.
또다른 추가의 양태에 있어서, 본 발명은 표적 핵산의 증폭을 위한 반응에 있어 비-표적 핵산의 폴리머라제 연장을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 이때 증폭 반응 혼합물은 표적 핵산에 대해 특이적인 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 증폭 프라이머, 폴리머라제 및 하나 이상의 마그네슘 염을 포함하며, 상기 방법은 하나 이상의 증폭 프라이머 및 캐리어 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머-캐리어 핵산 혼합물을 제조하고 이를 표적 핵산, 폴리머라제 및 마그네슘 염과 접촉시킴을 포함한다.
네번째 양태에 있어서, 본 발명은 표적 핵산의 증폭을 위한 반응에 있어서 프라이머-이량체 또는 기타 비-특이적 핵산 증폭 생성물의 형성을 감소시키기 위한 방법에 관한 것으로서, 이때 증폭 반응 혼합물은 표적에 대해 특이적인 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 증폭 프라이머, 폴리머라제 및 하나 이상의 마그네슘 염을 포함하며, 상기 방법은 하나 이상의 프라이머 및 캐리어 핵산을 함유하는 프라이머-캐리어 핵산 혼합물을 제조하고 이를 표적 핵산, 폴리머라제 및 마그네슘 염과 접촉시킴을 포함한다.
캐리어 핵산으로서 DNA, RNA 및 단백질 핵산을 포함한 어떠한 핵산도 사용될 수 있다. 바람직하게는, 캐리어는 DNA이고, 가장 바람직하게는 송아지 흉선 DNA이다. 일반적으로, 캐리어를 가해 최종 증폭 반응 혼합물중의 농도가 약 1 내지 약 100㎍/ml, 바람직하게는 약 5 내지 약 75㎍/ml, 및 가장 바람직하게는 약 25 내지 약 50㎍/ml가 되도록 한다.
본 발명의 방법은 특히 증폭 검정 동안 비-표적 핵산의 폴리머라제 연장을 감소시키는데 유리하다. 당해 방법은 특히, 증폭 반응의 개시에 앞서 표적 핵산을 변성시키는데 요구되는 온도 이하(즉, 100℃ 이하)에서 증폭 반응 혼합물이 유지되는 경우 적용할 수 있다. 이와 같은 조건으로는 예를 들면 실온 또는 실온보다 약간 이하의 온도에서 약 1 내지 약 24 시간 동안 증폭 반응 혼합물을 유지하는 것을 포함한다.
본 발명은 핵산 증폭 혼합물에 캐리어 핵산을 가하는 것이 표적 핵산의 증폭 효율성 및 특이성을 상당히 증가시킨다는 발견을 근거로 한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 방법은 열주기 동안 증폭 혼합물의 온도를 증가시키기에 앞서 프라이머-이량체 형성량을 감소시킴으로써 증폭 검정 동안의 비-표적 핵산의 폴리머라제 연장의 감소를 초래하게 된다.
분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 단백질 생화학 분야에 있어 다수의 기술이 본 발명을 수행하는데 사용되며, 이들은 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M.L.Gait ed.); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); and Protein Purification; Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.)]에 예시되어 있는 것들이다.
본원중 사용된 용어 "증폭 반응 혼합물"은, 적어도 증폭 프라이머, 표적 핵산, 데옥시뉴클레오타이드, 폴리머라제, 하나 이상의 마그네슘 염 및 완충액이 핵산 증폭 반응이 진행되도록 충분량으로 존재하는 증폭-경쟁성(competent) 혼합물을 의미한다.
본원중 사용된 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 임의의 길이의 푸린- 및 피리미딘-함유 중합체로서, 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드 또는 혼합된 폴리리보-폴리데옥시리보 뉴클레오타이드를 의미하는 것이다. 여기에는 예를 들면, DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 하이브리드와 같은 일본쇄- 및 이본쇄-분자, 및 아미노산 주쇄에 염기를 결합시켜 형성된 "단백질 핵산" (PNA)이 포함된다. 이는 또한 변형된 염기를 함유하는 핵산도 포함한다.
본원중 사용된 핵산 서열의 "상보체"란 용어는 원래의 서열과 와트슨-크릭 염기쌍을 이루는데 관여하는 안티센스 서열을 의미한다.
본원중 사용된 용어 "프라이머"란 길이가 약 6 내지 약 50개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 길이 약 12 내지 약 25개 뉴클레오타이드 및 가장 바람직하게는 길이 약 12개 내지 약 18개 뉴클레오타이드로서, 특정의 일본쇄 핵산 서열과 이본체를 형성하여 예를 들면 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보성 쇄의 중합화를 허용하게 되는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "증폭"은 핵산이 복제되는 반복 과정을 나타낸다. 증폭을 위한 적합한 방법은 폴리머라제 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응, 쇄 대체 증폭, 핵산 단일 염기 증폭 및 전사 매개된 증폭을 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "표적 핵산"은 PCR 반응 동안 이의 서브 서열이 증폭되는 핵산 주형을 나타낸다.
내부 포지티브 대조군(IPC) 표적 핵산은 전형적으로 제한 엔도뉴클레아제의 작용에 의해 후속적으로 선형화되는 플라스미드 벡터 내로 클로닝된 합성 핵산 서열이다. IPC는 전형적으로 포괄적인 프로브-결합 영역을 둘러싼 다중 프라이머 결합 서열을 가지며, 핵산 증폭 반응에서 잘못된 네가티브 결과에 대한 일반적인 대조군으로서 작용한다.
바람직한 내부 포지티브 대조군 표적 DNA의 서열은 다음과 같다:
5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3'(서열 1).
본 발명은 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 표적 핵산과 항온 처리하여 표적 핵산에 하이브리드화시키고 표적 핵산의 효소적 복제를 개시하는, 모든 반응에 적용할 수 있다. 상기 반응은 예를 들면, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응, 쇄 대체 증폭, 핵산 단일 염기 증폭, 및 전사 매개된 증폭을 포함한다.
상기 반응에서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 완충액 및 염, 데옥시뉴클레오타이드, 및 임의의 기타 성분을 함유하는 검정-특이적 마스타 혼합물이 제형화된다. 이어서, 표적 핵산을 가하고 이어서 반응을 촉매하는 효소, 예를 들면 Taq 폴리머라제 및/또는 반응의 진행에 필수적인 마그네슘 염, 예를 들면 염화마그네슘을 가한다.
본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 기타 성분들은 저온에서 폴리머라제에 결합하여 폴리머라제를 불활성화시키지만, 그 자신은 고온에서 불활성화되어 고온에서 폴리머라제의 활성화를 가능하게 하는, 항-폴리머라제 항체를 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다. 엑소뉴클레아제 및 글리코실라제가 또한 반응 혼합물에 포함될 수 있다.
본 발명을 실시하는데 있어서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는, 표적 핵산, 폴리머라제, 또는 마그네슘 염과 혼합하기 전에, 캐리어 핵산과 접촉시킨다.
본 발명에 따른 캐리어 핵산은 원핵성 또는 진핵성 DNA 및/또는 RNA, 합성 DNA 및/또는 RNA, 랜덤 및/또는 특이적인 PNA(펩타이드 핵산)을 포함할 수 있지만 이로써 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 캐리어는 DNA를 포함하며, 가장 바람직하게는 송아지 흉선 DNA를 포함한다.
본 발명에 사용하기 위한 캐리어 핵산은 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, DNA 또는 RNA는 탈단백질 과정에 의해 세포로부터 분리시킬 수 있다. DNA는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법[참조: Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185], 문헌[참조: Yoo et al., 1989, J. Biol. Chem. 764: 17078]의 방법, 또는 기타 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 핵산은 또한 당해 분야에서 공지된 모든 방법으로 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예는 메틸화, "캡화", 하나 이상의 천연 발생적인 뉴클레오타이드의 동족체로의 치환, 및 예를 들면, 비하전된 결합(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 결합(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)과 같은 뉴클레오타이드간 변형을 포함한다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합적으로 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입체(intercalator)(예: 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사선 금속, 철, 산화 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 핵산은 메틸 또는 에틸 포스포트리에스테르 또는 알킬 포스포르아미데이트 결합의 형성에 의해 유도체화될 수 있다. 포스페이트 그룹의 하나 이상의 산소 원자가 황 원자로 대체되는 티올화된 증폭 프라이머는 예를 들면, 문헌[참조: Eckstein et al., Ann. Rev. Biochem. 54:367 (1985); Zon et al., Anticancer Drug Design 6: 539(1991); and Olson et al., PNAS 83: 1451 (1990)]에 기술된 방법으로 합성할 수 있다.
캐리어 핵산은, 증폭 반응 용적에서 캐리어 핵산의 최종 농도가 약 1 내지 약 100㎍/㎖, 바람직하게는 약 5 내지 약 75㎍/㎖, 및 가장 바람직하게는 약 25 내지 약 50㎍/㎖의 범위가 되기에 충분한 양으로 프라이머-함유 마스터 혼합물에 가한다. 반응물 중 프라이머의 전형적인 양은 약 0.1μM 내지 약 1μM의 농도이다. 캐리어의 최적량은 특정 검정으로 독자적으로 결정할 수 있다. 표준화된 마스터 혼합물에 캐리어 핵산의 증가량을 가하고, 표적 핵산 및 효소를 가한 후, 특이적 및 비-특이적 증폭 생성물의 수준을 모니터함으로써, 이같은 결정을 수행할 수 있다(실시예 1 참조).
캐리어 핵산은 바람직하게는, 표적 핵산을 첨가하기 전에, 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 혼합한다. 이어서, 프라이머-캐리어 혼합물과 표적 핵산, 증폭 반응을 촉매하는 폴리머라제, 및 폴리머라제의 효과적인 기능에 필수적인 마그네슘 염을 혼합한다. 전형적으로, 반응 혼합물은, 증폭 반응을 개시하기 전에, 약 90 내지 약 100℃ 이하의 온도에서 유지시킨다. 바람직하게는, 증폭은 열주기로 수행하며, 혼합물의 온도는 열주기를 개시하기 전에, 약 90 내지 약 100℃ 이하에서 유지시킨다. 가장 바람직하게는, 반응 혼합물은 증폭 반응을 개시하기 전에, 약 실온에서 유지시킨다.
이론에 구애되지 않고, 프라이머-이량체 형성의 감소는 여러가지 상이한 기작에 의해 발생하는 것으로 믿어진다. 우선, 폴리머라제는 캐리어 핵산에 결합한다. 이는 특히 항-폴리머라제 항체가 혼합물에 또한 존재하는 경우에 유리한데, 항-폴리머라제 항체에 의해 결합되지 않는 폴리머라제 분자는 캐리어 핵산에 결합하며, 결과적으로 존재할 수 있는 임의의 하이브리드화된 프라이머의 연장 가능성을 감소시키기 때문이다. 두 번째로, 캐리어 핵산은 프라이머가 또한 캐리어 DNA에 약하게 어닐링될 것이기 때문에, 혼합물 중의 하이브리드화된 프라이머의 수를 감소시키는 것으로 믿어진다. 캐리어 핵산에 대한 프라이머의 결합으로부터 형성되는 비-특이적인 연장 생성물은 PCR의 표적 증폭기 동안 증폭되지 않게 되며, 이러한 비-특이적인 부위에 대해 쌍을 이룬 프라이머가 존재하지 않기 때문이다. 따라서, 프라이머-이량체 형성(및 기타 비-특이적인 핵산 생성물의 형성)은 감소된다.
바람직한 양태의 설명
하기 실시예는 제한없이 본 발명을 설명하기 위하여 의도된다.
실시예 1: HIV 서열의 PCR 증폭에 대한 캐리어 핵산의 효과
하기 실험은 HIV 증폭 반응에 캐리어 핵산을 가한 효과를 모니터하기 위하여 수행하였다.
마스터 혼합물은 표 1에 나타난 11개의 프라이머, 트리스 완충액, dNTPs, 앰플리타크, 2개의 앰플리타크 트리거링 항체[참조: 미국 특허 제5,338,671호, 미국 특허 제5,587,287호; 유럽 특허 제0592035호]를 함유하여 제형화하였다. 마스터 혼합물은 송아지 흉선 DNA를 사용하지 않거나 사용하여(각각 그룹 I 및 그룹 II) 제조하였다.
프라이머 최종 농도 서열
IPC-F1 0.2 μM 5'-CGC CAG CGT GGA CCA TCA AGT AGT AA -3' <서열: 2>
IPC-R1 0.2 μM 5'-CAC GAT CCT GGA GCA GAC ACT GAA GA -3' <서열: 3>
JBPOL1 0.4 μM 5'-TCG GGT TTA TTA CAG GGA CAG CAG AGA -3' <서열: 4>
JBPOL3 0.4 μM 5'-CTT GTA TTA CTA CTG CCC CTT CAC CTT TCC A -3' <서열:5>
JBLTR4 0.4 μM 5'-CTG CTT AAG CCT CAA TAA AGC TTG CCT TGA -3' <서열: 6>
JBLTR6 0.4 μM 5'-GGG TCT GAG GGA TCT CTA GTT ACC AGA GT-3' <서열: 7>
JBLTR8 0.4 μM 5'-TGT TCG GGC GCC ACT GCT AGA GA -3' <서열: 8>
2ENV-F1 0.4 μM 5'-CCG GGA TAG TGC AGC AAC AGC AAC A -3' <서열: 9>
2ENV-R2 0.4 μM 5'-CCC AGA CGG TCA GTC GCA ACA -3' <서열: 10>
2LTRe 0.4 μM 5'-GGG AGG TTC TCT CCA GCA CTA GCA -3' <서열: 11>
2LTR-R1 0.4 μM 5'-GCG ACT AGG AGA GAT GGG AAC ACA CA -3' <서열: 12>
그룹 I 및 그룹 II 마스터 혼합물의 50㎕ 분취량 중에 16 mM MgCl2 25㎕를 가하고, 이어서 표적 혼합물(20 mM NaOH중 내부 포지티브 대조군 표적 핵산 13.3 복제물 함유) 25㎕를 가한다. 각각의 그룹을 위하여, 3개의 상이한 시험 프로토콜을 사용하고, 하기 표 2에 나타낸다.
그룹 첫번째 시약 추가 항온처리 두번째 시약 추가 항온처리
I-a ASMM-1, MgCl2, 표적 1 시간 -
I-b ASMM-1, MgCl2, 표적 42 시간 -
I-c ASMM-1, MgCl2 4 시간 표적 20 분
II-a ASMM-2, MgCl2, 표적 1 시간 -
II-b ASMM-2, MgCl2, 표적 42 시간 -
II-c ASMM-2, MgCl2 4 시간 표적 20 분
I(a,b,c) = 마스터 혼합물중 캐리어 DNA 없음.
II(a,b,c) = 마스터 혼합물중 캐리어(송아지 흉선) DNA
반응 혼합물의 첫번째 세트, 즉 A에서, IPC 프라이머는 티올화되지 않는데 반하여, 두번째 세트, 즉 B에서, IPC 프라이머는 티올화되었다.
모든 반응은 2회 수행된다. 혼합물의 75㎕ 분취량을 핵산 비함유 파우치(뉴욕주 로체스터 소재의 오르토 클리니칼 다이어그노스틱스사 제조)에 가한다. PCR 증폭 조건은 하기와 같다:
(1) 3분동안 96℃에서 DNA 및 앰플리타크 트리거링 항체를 완전하게 변성시킴;
(2) 5초동안 96℃에 이어서 40초동안 62℃로 5회 주기;
(3) 5초동안 96℃에 이어서 40초동안 68℃로 35회 주기.
증폭 생성물을 파우치로부터 제거하고 트리스-붕산 완충액중 4% 아가로스 겔상에서 전기영동시켜 분해시킨다. 증폭된 DNA 생성물을 에티듐 브로마이드 염색법을 사용하여 검출한다.
실험 결과는 겔 사진중 특이적 (IPC) 및 비-특이적 생성물(프라이머-이량체 및 기타 잘못된 프라이밍된 생성물)의 세기를 가시적으로 조사하여 평가된다(표 3). 특이적 및 비-특이적 생성물의 밴드 세기는 0 내지 10의 등급에서 가시적으로 평가되며, 여기서 0은 검출 가능한 밴드의 부재를 나타내고, '10'은 최대 세기를 나타낸다. NA는 검정되지 않음을 나타낸다.
파트 A: 비-티올화 IPC 프라이머 사용 파트 B: 티올화된 IPC 프라이머 사용
그룹 Rep # 특이적 생성물 밴드 세기 비-특이적 생성물 밴드 세기 특이적 생성물 밴드 세기 비-특이적 생성물 밴드 세기
I-a I-a I-b I-b I-c I-c 1 2 1 2 1 2 NA 6 5 6 0 1 NA 2 3 2 8 9 NA 7 7 7 1 0 NA 2 3 2 9 10
II-a II-a II-b II-b II-c II-c 1 2 1 2 1 2 8 7 7 7 6 6 0 1 2 1 3 3 7 8 9 9 8 8 0 1 1 0 3 1
모든 세개의 서브세트(a 내지 c)에서, 그룹 II 증폭 반응은 그룹 I과 비교하여 보다 강한 특이적 생성물 밴드 및 보다 약한 비-특이적 생성물 밴드를 생성하였다. 이것은 실험의 파트 A(비-티올화된 IPC 프라이머 사용) 및 실험의 파트 B(티올화된 IPC 프라이머 사용)에서 모두 사실이다. 모든 4개의 그룹에서, 혼합물이 열주기전에 실온에서 대략적으로 4시간동안 혼합물의 항온처리를 포함하여, 프라이머-이량체 형성에 증가적으로 우호적인 조건에 적용시킴에 따라(a 내지 c), 프라이머-이량체 생성물 수준은 증가되며, 특이적 생성물 수준은 감소한다. I-c에서, 유일한 가시적인 겔 밴드는 강한 프라이머-이량체 밴드였다. 대조적으로, 강렬한 생성물 밴드는 II-c 반응에서 프라이머-이량체 생성물이 거의 없이 나타났다. 마지막으로, 비록 IPC 프라이머 티올화(파트 B)가 특이적 생성물 합성을 약간 증가시키지만, 이것은 캐리어 핵산을 갖는 마스터 혼합물의 제형으로서 거의 이롭지는 못하다.
상기 언급된 모든 특허, 특허원, 문헌, 간행물 및 시험 방법은 전체로서 본원에서 참조로 인용된다.
본 발명의 많은 변형은 상기 상세한 설명에 비추어 본 기술 분야에 통상적인 지식을 가진 기술자들에게 자명할 것이다. 이와 같은 명백한 변형은 첨부된 청구 범위의 의도된 범위내에 포함된다.
본 발명은 표적 핵산의 증폭 특이성을 증가시키기 위한 방법을 제공한다.
<110> Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. <120> Enhancement of the specificity of nucleic acid amplification by carrier nucleic acid <130> 2094/1E288-US1 <150> US 60/118,495 <151> 1999-02-03 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 1 cgccagcgtg gaccatcaag tagtaatgaa cgcacggacg aggacatcat agagattaca 60 cctttatcca cagttctcgg tctaacgcag cagtcagtgt atcagcacca gcatccgtag 120 tgagtcttca gtgtctgctc caggatcgtg 150 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 2 cgccagcgtg gaccatcaag tagtaa 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 3 cacgatcctg gagcagacac tgaaga 26 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 4 tcgggtttat tacagggaca gcagaga 27 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 5 cttgtattac tactgcccct tcacctttcc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 6 ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga 30 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 7 gggtctgagg gatctctagt taccagagt 29 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 8 tgttcgggcg ccactgctag aga 23 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 9 ccgggatagt gcagcaacag caaca 25 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 10 cccagacggt cagtcgcaac a 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 11 gggaggttct ctccagcact agca 24 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 12 gcgactagga gagatgggaa cacaca 26

Claims (35)

  1. (a) 올리고뉴클레오타이드 증폭 프라이머와 캐리어 핵산을 접촉시켜, 프라이머/캐리어 혼합물을 형성시키고,
    (b) 상기 프라이머/캐리어 혼합물을 표적 핵산, 마그네슘 염 및 핵산 폴리머라제와 접촉시켜 표적 핵산을 증폭시킴을 포함하며, 이때 표적 핵산을 증폭시키기 전에 프라이머/캐리어 혼합물의 형성이 증폭 특이성을 증가시킴을 특징으로 하는, 증폭 반응에서 표적 핵산의 증폭 특이성을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 캐리어 핵산이 DNA, RNA 또는 펩티드 핵산(PNA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  3. 제2항에 있어서, DNA가 송아지 흉선 DNA인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 캐리어 핵산이 1 내지 100㎍/㎖ 범위의 농도로 증폭 반응물에 존재하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 캐리어 핵산이 5 내지 75㎍/㎖ 범위의 농도로 증폭 반응물에 존재하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 혼합물이 증폭 반응의 개시에 앞서 실온 내지 100℃의 온도에서 유지되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 열주기 개시 전에 실온 내지 100℃의 온도가 유지되는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 폴리머라제가 Taq 폴리머라제를 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 마그네슘 염이 염화마그네슘을 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 혼합물이 항-폴리머라제 항체, 엑소뉴클레아제, 글리코실라제 또는 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 성분을 추가로 포함하는 방법.
  11. (a) 프라이머와, 송아지 흉선 DNA를 포함하는 캐리어 핵산을 접촉시켜 프라이머-캐리어 혼합물을 형성시키고,
    (b) 상기 프라이머-캐리어 혼합물을 표적 핵산, Taq 폴리머라제 및 염화마그네슘과 접촉시켜 표적 핵산을 증폭시킴을 포함하고, 이때, 증폭 반응물 중의 캐리어 핵산의 농도가 증폭 반응 용적 ㎖당 1 내지 100㎍의 범위이고, 표적 핵산을 증폭시키기 전에 프라이머/캐리어 혼합물의 형성이 증폭 특이성을 증가시킴을 특징으로 하는, 증폭 반응에서 표적 핵산의 증폭 특이성을 증가시키는 방법.
  12. (a) 증폭 프라이머와 캐리어 핵산을 접촉시켜 프라이머-캐리어 핵산 혼합물을 형성시키고,
    (b) 상기 프라이머-캐리어 혼합물을 표적 핵산, 폴리머라제 및 마그네슘 염과 접촉시켜 표적 핵산을 증폭시킴을 포함하고, 이때 표적 핵산을 증폭시키기 전에 프라이머-캐리어 혼합물의 형성이 비-표적 핵산의 폴리머라제 연장을 감소시킴을 특징으로 하는, 표적 핵산의 증폭 반응에서 비-표적 핵산의 폴리머라제 연장을 감소시키는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 캐리어 핵산이 DNA, RNA 또는 펩티드 핵산(PNA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  14. 제13항에 있어서, DNA가 송아지 흉선 DNA인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 캐리어 핵산이 1 내지 100㎍/㎖ 범위의 농도로 증폭 반응물에 존재하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 캐리어 핵산이 5 내지 75㎍/㎖ 범위의 농도로 증폭 반응물에 존재하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 혼합물이 증폭 반응의 개시에 앞서 실온 내지 100℃의 온도에서 유지되는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 열주기 개시 전에 실온 내지 100℃의 온도가 유지되는 방법.
  19. 제12항에 있어서, 폴리머라제가 Taq 폴리머라제를 포함하는 방법.
  20. 제12항에 있어서, 마그네슘 염이 염화마그네슘을 포함하는 방법.
  21. 제12항에 있어서, 혼합물이 항-폴리머라제 항체, 엑소뉴클레아제, 글리코실라제 또는 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 성분을 추가로 포함하는 방법.
  22. (a) 프라이머와 캐리어 핵산을 접촉시켜 프라이머-캐리어 핵산 혼합물을 형성시키고,
    (b) 표적 핵산을 상기 프라이머-캐리어 혼합물과 접촉시킴을 포함하고, 이때, 프라이머를 폴리머라제, 마그네슘 염 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 성분과 접촉시키기 전에 프라이머-캐리어 혼합물을 제조하여 비-특이적 핵산 증폭 생성물의 형성을 감소시킴을 특징으로 하는, 표적 핵산의 증폭 반응에서 비-특이적 핵산 증폭 생성물의 형성을 감소시키는 방법.
  23. 청구항 23은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제22항에 있어서, 캐리어 핵산이 DNA, RNA 또는 펩티드 핵산(PNA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  24. 청구항 24은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제23항에 있어서, 캐리어 핵산이 DNA인 방법.
  25. 청구항 25은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제24항에 있어서, DNA가 송아지 흉선 DNA인 방법.
  26. 청구항 26은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제22항에 있어서, 캐리어 핵산이 1 내지 100㎍/㎖ 범위의 농도로 증폭 반응물에 존재하는 방법.
  27. 청구항 27은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제26항에 있어서, 캐리어 핵산이 5 내지 75㎍/㎖ 범위의 농도로 증폭 반응물에 존재하는 방법.
  28. 청구항 28은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제22항에 있어서, 혼합물이 증폭 반응의 개시에 앞서 실온 내지 100℃의 온도에서 유지되는 방법.
  29. 청구항 29은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제28항에 있어서, 열주기 개시 전에 실온 내지 100℃의 온도가 유지되는 방법.
  30. 청구항 30은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제22항에 있어서, 폴리머라제가 Taq 폴리머라제를 포함하는 방법.
  31. 청구항 31은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제22항에 있어서, 마그네슘 염이 염화마그네슘을 포함하는 방법.
  32. 청구항 32은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제22항에 있어서, 혼합물이 항-폴리머라제 항체, 완충액, 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트, 엑소뉴클레아제, 글리코실라제 또는 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 성분을 추가로 포함하는 방법.
  33. 청구항 33은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제6항에 있어서, 온도가 실온인 방법.
  34. 청구항 34은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제17항에 있어서, 온도가 실온인 방법.
  35. 청구항 35은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제28항에 있어서, 온도가 실온인 방법.
KR1020000005497A 1999-02-03 2000-02-03 캐리어 핵산에 의한 핵산 증폭 특이성의 증진 KR100901392B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11849599P 1999-02-03 1999-02-03
US60/118,495 1999-02-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20000076606A KR20000076606A (ko) 2000-12-26
KR100901392B1 true KR100901392B1 (ko) 2009-06-08

Family

ID=22378957

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020000005497A KR100901392B1 (ko) 1999-02-03 2000-02-03 캐리어 핵산에 의한 핵산 증폭 특이성의 증진

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6300075B1 (ko)
EP (1) EP1026261B1 (ko)
JP (2) JP2000279184A (ko)
KR (1) KR100901392B1 (ko)
CN (1) CN100379880C (ko)
AT (1) ATE440147T1 (ko)
AU (1) AU764914B2 (ko)
CA (1) CA2295942C (ko)
DE (1) DE60042767D1 (ko)
DK (1) DK1026261T3 (ko)
ES (1) ES2328443T3 (ko)
NO (1) NO327267B1 (ko)
PT (1) PT1026261E (ko)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE421999T1 (de) * 1999-07-09 2009-02-15 Gen Probe Inc Nachweis von hiv-1 durch amplifizierung von nukleinsäuren
WO2002022878A1 (en) 2000-09-14 2002-03-21 Caliper Technologies Corp. Microfluidic devices and methods for performing temperature mediated reactions
US6949368B2 (en) * 2001-01-30 2005-09-27 The Trustees Of Princeton University Compositions and methods for enhancing polynucleotide amplification reactions
EP1321532A1 (en) * 2001-12-19 2003-06-25 Boehringer Mannheim Gmbh Reagent for improved PCR
US7772383B2 (en) * 2002-01-25 2010-08-10 The Trustees Of Princeton University Chemical PCR: Compositions for enhancing polynucleotide amplification reactions
WO2004011666A2 (en) * 2002-07-26 2004-02-05 Applera Corporation Mg-mediated hot start biochemical reactions
US20040235032A1 (en) * 2003-05-19 2004-11-25 Canon Kabushiki Kaisha PCR amplification method, PCR primer set, PCR amplification product, and method for detection of nucleic acid using the amplification method
JP2007518425A (ja) 2004-01-23 2007-07-12 バイオメリュー・インコーポレイテッド Ｈｃｖ３’非翻訳領域を効率的に増幅および検出するためのプライマーおよびプローブの設計
EP1605060A1 (en) * 2004-06-10 2005-12-14 Biodynamics S.R.L. Methods and reaction mixture reagent for increasing the specificity and fidelity of polymerase reactions
US20070092899A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 The Regents Of The University Of California Multiple displacement amplification with blocker DNA
CA2662931C (en) * 2006-09-11 2013-05-14 Osaka University Trace mrna amplification method and use thereof
GB0701253D0 (en) 2007-01-23 2007-02-28 Diagnostics For The Real World Nucleic acid amplification and testing
WO2011046972A2 (en) * 2009-10-12 2011-04-21 Life Technologies Corporation Compositions and methods for suppressing primer interactions
KR101162422B1 (ko) 2009-11-30 2012-07-10 박수민 핵산 증폭용 조성물
US9689013B2 (en) 2012-01-31 2017-06-27 Takara Bio Inc. Method for improving nucleic acid synthesis reaction
UA117921C2 (uk) * 2012-10-22 2018-10-25 Байєр Кропсаєнс Нв Композиція, пристрій та спосіб ампліфікації нуклеїнових кислот

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5338671A (en) * 1992-10-07 1994-08-16 Eastman Kodak Company DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8918226D0 (en) * 1989-08-09 1989-09-20 Wellcome Found Dna assays
US5646019A (en) * 1989-10-24 1997-07-08 Stratagene Method for producing primed nucleic acid templates
US5567583A (en) * 1991-12-16 1996-10-22 Biotronics Corporation Methods for reducing non-specific priming in DNA detection
US5491086A (en) 1993-05-14 1996-02-13 Hoffmann-La Roche Inc. Purified thermostable nucleic acid polymerase and DNA coding sequences from pyrodictium species
CA2168712A1 (en) * 1995-02-07 1996-08-08 John William Henderson Sutherland Use of exonuclease and/or glycosylase as supplements to anti-polymerase antibody to increase specificity in polymerase chain reaction
JPH09168400A (ja) * 1995-12-20 1997-06-30 Sekisui Chem Co Ltd 核酸の定量方法
JP3082908B2 (ja) * 1996-07-12 2000-09-04 東洋紡績株式会社 リボ核酸の単離方法
CA2354184A1 (en) * 1999-01-29 2000-08-03 Bavarian Nordic Research Institute A/S Multiplex real-time pcr

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5338671A (en) * 1992-10-07 1994-08-16 Eastman Kodak Company DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Applied And Environmental Microbiology, 64, 2, 1998, 669-677 *
Applied And Environmental Microbiology, Vol.64(2), pp.669-677(1998) *
Applied And Environmental Microbiology, Vol.64(2), pp.669-677(1998)*
Nucleic Acids Research, 20, 7, 1992, 1717-1723 *
Nucleic Acids Research, Vol.20(7), pp.1717-1723(1992) *
Nucleic Acids Research, Vol.20(7), pp.1717-1723(1992)*
Nucleic Acids Research, Vol.25(6), pp.323235-323241(1997) *

Also Published As

Publication number Publication date
AU1487700A (en) 2000-08-10
EP1026261A3 (en) 2003-07-30
JP2000279184A (ja) 2000-10-10
KR20000076606A (ko) 2000-12-26
DE60042767D1 (de) 2009-10-01
NO327267B1 (no) 2009-05-25
ATE440147T1 (de) 2009-09-15
CN1271019A (zh) 2000-10-25
AU764914B2 (en) 2003-09-04
CA2295942C (en) 2009-01-27
CN100379880C (zh) 2008-04-09
DK1026261T3 (da) 2009-11-02
CA2295942A1 (en) 2000-08-03
EP1026261B1 (en) 2009-08-19
NO20000538L (no) 2000-08-04
NO20000538D0 (no) 2000-02-02
ES2328443T3 (es) 2009-11-13
JP2011120594A (ja) 2011-06-23
PT1026261E (pt) 2009-09-23
US6300075B1 (en) 2001-10-09
EP1026261A2 (en) 2000-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100901392B1 (ko) 캐리어 핵산에 의한 핵산 증폭 특이성의 증진
EP0676476B1 (en) Isothermal strand displacement nucleic acid amplification
EP1201768B1 (en) Amplification using modified primers
US7122355B2 (en) Composition and method for hot start nucleic acid amplification
JP4718493B2 (ja) 核酸増幅中のプライマー凝集体形成を減少させるためのｄＵＴＰに基づく組成物
EP0776981B1 (en) Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid
US5449603A (en) Method for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein
EP0379369A2 (en) Nucleic acid amplification using single primer
EP2644710A1 (en) RNase-H-based assays utilizing modified RNA monomers
JP3403405B2 (ja) 核酸伸長検定
WO2000070095A2 (en) Homogeneous isothermal amplification and detection of nucleic acids using a template switch oligonucleotide
AU2944200A (en) Method for amplifying nucleic acid sequence
JP2002527523A (ja) 機能付与したピリミジン誘導体
EP0639647A2 (en) Assay for detecting nucleic acid sequence
US5605824A (en) Composition for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein
CA2308368C (en) Specific and sensitive nucleic acid detection method
RU2729983C2 (ru) Способ амплификации днк на основе внедрения в цепь
EP2103693B1 (en) Nucleic acid amplification in the presence of modified randomers
JP2001512301A (ja) 核酸増幅のための内部陽性対照
WO1991006679A1 (en) An improved method for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein
CN101671672B (zh) 用于改进的核酸扩增的聚阴离子
JP4104657B2 (ja) ポリヌクレオチド増幅の陽性コントロール
US20030175769A1 (en) Reagents for improved PCR
WO2023118399A1 (en) Improved detection of lamp amplification products
EP1321532A1 (en) Reagent for improved PCR

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee