PT1026261E - Aumento da especificidade da amplificação de ácido nucleico através de um ácido nucleico veiculo - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "AUMENTO DA ESPECIFICIDADE DA AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO ATRAVÉS DE UM ÁCIDO NUCLEICO VEICULO"

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se a métodos para amplificar ácidos nucleicos, particularmente em testes de diagnóstico para microrganismos infecciosos . Antecedentes da Invenção A amplificação de sequências de ácido nucleico utilizando a reacção em cadeia pela polimerase (PCR) requer, pelo menos, dois iniciadores oligonucleotidicos de amplificação que hibridem com sequências diferentes no ácido nucleico alvo. Em geral, é desejável evitar a utilização de iniciadores oligonucleotidicos que possuam sequências homólogas nas suas extremidades 3'. Os iniciadores com extremidades 3' homólogas podem hibridar potencialmente um com o outro, resultando numa variedade de artefactos de amplificação, incluindo dimeros de iniciadores. A hibridação de iniciadores que possuem complementaridade da extremidade 3' pode ocorrer assim que todos os componentes da reacção de PCR tenham sido misturados, mas antes do inicio da amplificação, através da estabilização de híbridos de iniciador a temperaturas baixas, devido à presença de magnésio na mistura de reacção. A formação de dimeros de iniciadores ocorre à 1 temperatura ambiente ou inferior, através da extensão dos iniciadores hibridados, pela polimerase de ADN. 0 produto de dímero de iniciador resultante irá amplificar durante a PCR, competindo com o ácido nucleico alvo para os iniciadores e a polimerase. Se for formado produto de dímero de iniciadores suficiente na fase inicial, a subsequente amplificação por PCR deste produto pode superar competitivamente o alvo designado, conduzindo a um de (i) um resultado falso negativo, i. e., a amostra parece não possuir uma sequência particular quando, de facto, a sequência está presente ou (ii) um resultado de "não teste", i. e., não é obtido sinal a partir de um controlo interno positivo.

Adicionalmente à sequência primária dos conjuntos de iniciadores, os principais contribuintes para a formação de dímeros de iniciadores são: um nível molar elevado de iniciadores na mistura principal específica do ensaio (ASMM); a ordem de adição dos reagentes (por exemplo, adicionar a ASMM, depois solução de MgCl2, depois o alvo/amostra irá aumentar a formação de dímeros de iniciadores); o período de incubação entre a adição de MgCl2 à ASMM e a adição de alvo; e o período de tempo durante o qual a mistura de reacção de amplificação completa, í. e., compreendendo todos os componentes necessários para a amplificação, incluindo o alvo e a polimerase, incuba antes da iniciação da termociclagem da PCR. São conhecidas várias abordagens para reduzir a formação de dímeros de iniciadores numa mistura de amplificação de ácido nucleico de iniciadores e polimerase. Estas abordagens incluem: 1. Conceber cuidadosamente os iniciadores de PCR para minimizar as homologias da extremidade 3' com todos os 2 outros iniciadores numa mistura de reacção particular. Contudo, esta estratégia é difícil numa reacção em multiplex, í. e., uma reacção contendo vários pares de iniciadores de amplificação dirigidos a diferentes sequências de ácido nucleico alvo. Para além disso, mesmo com um único par de iniciadores, isto pode ser difícil de atingir, devido a outras restrições, tais como, e. g., regiões de identidade ou conservação. 2. Realizar a reacção de ciclagem térmica/amplificação logo após preparar uma mistura de reacção específica para o ensaio para reduzir a quantidade de tempo disponível para a formação de dímeros de iniciadores. Contudo, isto pode ser difícil na prática, particularmente se for necessário o rastreio de números elevados de amostras. 3. Alterar a ordem da adição dos reagentes para desestabilizar potenciais dímeros de iniciadores. Por exemplo, adicionar MgCl2 como o último componente pode reduzir a formação de iniciadores de dímeros. Esta abordagem, todavia, não é desejável porque (i) não elimina a formação de dímeros de iniciadores, (ii) é inconveniente, e (iii) pode resultar na contaminação da solução de cloreto de magnésio com o alvo de uma amostra. 4. Utilizando anticorpos "desencadeadores", que são anticorpos anti -polimerase que bloqueiam a actividade de polimerase a temperaturas às quais os híbridos de iniciadores se podem formar, mas que são inactivados a temperaturas elevadas. Assim, a polimerase é apenas activada a temperaturas elevadas que são demasiado elevadas para que se formem dímeros de iniciadores. (Ver, Patentes U.S. 3 Ν° 5338671 e 5587287; e Pedido de Patente Europeia N° 0592035) . Contudo, uma vez que a ligação anticorpo/polimerase é um processo de equilíbrio, a ligação completa de toda a polimerase não pode ser conseguida. Assim, o desencadear da PCR à base de anticorpos não é necessariamente 100% eficaz, particularmente em reacções de amplificação complexas. 5. Realizar PCR de Início a Quente (Chou et al., Nuc. Acids Res. 20:1717-1723, 1992). isto envolve adicionar tudo, excepto a polimerase de ADN termoestável à mistura de reacção, iniciando a reacção com um passo de desnaturação do produto, seguido por a abertura dos tubos de reacção e adição da polimerase à mistura de reacção. Embora este método seja eficaz na redução da formação de dímeros de iniciadores, não é prática por várias razões. Muito principalmente, é muito trabalhosa e aumenta significativamente a probabilidade de transporte de amplicões. 6. Realizar PCR de Início a Quente utilizando uma polimerase de ADN termoestável, tal como AmpliTaq Gold, que é relativamente inactiva até ao aquecimento (Ver, Pedido de Patente Europeia N° 624641 e Patente U.S. N° 5491086). Contudo, a AmpliTaq Gold retém actividade enzimática residual significativa a baixas temperaturas e, assim, é ainda susceptível à criação de produtos secundários.

Nenhuma destas abordagens é previsivelmente bem sucedida na eliminação da formação de dímeros de iniciadores. O cuidado na concepção dos iniciadores e a utilização de AmpliTaq Gold ou anticorpos desencadeadores em combinação com Taq Polimerase pode 4 reduzir a formação de dímeros de iniciadores, mas não a elimina. Assim, há uma necessidade na técnica para métodos melhorados para reduzir ainda mais ou eliminar a formação de dimeros de iniciadores em reacções de PCR, particularmente em reacções de multiplex.

Sumário da Invenção A presente invenção proporciona métodos para aumentar a especificidade da amplificação do ácido nucleico alvo. Pode ser aplicada a todas as reacções que necessitem de iniciadores de amplificação oligonucleotidicos específicos para o alvo e uma polimerase de ácido nucleico. Assim, num aspecto a invenção é dirigida a um método para aumentar a especificidade da amplificação de um ácido nucleico alvo numa reacção de amplificação, em que a mistura de reacção de amplificação compreende um ou mais iniciadores de amplificação oligonucleotidicos específicos para o alvo, uma polimerase de ácido nucleico e um ou mais sais de magnésio, compreendendo preparar uma mistura de iniciador-veículo contendo um ou mais iniciadores e ácido nucleico veículo e contactar a mistura de iniciador-veículo com o ácido nucleico alvo, um ou mais sais de magnésio e polimerase.

Noutro aspecto, a invenção é dirigida a um método para aumentar a especificidade de amplificação de um ácido nucleico alvo numa reacção de amplificação, em que a mistura de reacção de amplificação compreende um ou mais iniciadores de amplificação oligonucleotidicos específicos para o ácido nucleico alvo, Taq polimerase e cloreto de magnésio, compreendendo preparar uma mistura de iniciador-veículo 5 incluindo um ou mais iniciadores e ácido nucleico veiculo, incluindo ADN de timo de vitela, em que a concentração do ácido nucleico veículo variará desde cerca de 1 até cerca de 100 microgramas/mL de mistura de reacção de amplificação e, contactar a uma temperatura inferior a cerca de 100 °C, a mistura de iniciador-veículo com o ácido nucleico alvo, Taq polimerase; e cloreto de magnésio.

Ainda noutro aspecto, a invenção é dirigida a um método para reduzir a extensão de polimerização de ácidos nucleicos não alvo numa reacção para a amplificação de um ácido nucleico alvo, em que a mistura de reacção de amplificação compreende um ou mais iniciadores de amplificação oligonucleotídicos específicos para o ácido nucleico alvo, polimerase e um ou mais sais de magnésio, compreendendo preparar uma mistura de iniciador oligonucleotídico-ácido nucleico veículo, contendo um ou mais iniciadores de amplificação e ácido nucleico veículo, e contactar a mistura iniciador-veículo com o ácido nucleico alvo, polimerase e sais de magnésio.

Num quarto aspecto, a invenção é dirigida a um método para reduzir a formação de dímeros de iniciadores ou outros produtos de amplificação de ácido nucleico não específico, numa reacção para a amplificação de um ácido nucleico alvo, em que a mistura de reacção de amplificação compreende um ou mais iniciadores de amplificação oligonucleotídicos específicos para o alvo, polimerase e um ou mais sais de magnésio, compreendendo preparar uma mistura de iniciador-ácido nucleico veículo contendo um de mais iniciadores e ácido nucleico veículo, e contactar a mistura iniciador-veículo com ácido nucleico alvo, polimerase e sais de magnésio. 6

Qualquer ácido nucleico pode ser utilizado como um ácido nucleico veiculo, incluindo ADN, ARN e ácido nucleico de proteína. De um modo preferido, o veículo é ADN e, de um modo muito preferido, ADN de timo de vitela. Tipicamente, o veículo é adicionado de modo a que a concentração na mistura final de reacção de amplificação esteja entre cerca de 1 e cerca de 100 pg/mL, de um modo preferido, entre cerca de 5 e cerca de 75 pg/mL e, de um modo muito preferido, entre cerca de 25 e cerca de 50 pg/mL.

Os métodos da presente invenção são particularmente vantajosos na redução da extensão pela polimerase de ácido nucleico não alvo durante ensaios de amplificação. O método é particularmente aplicável quando uma mistura de reacção de amplificação é mantida a temperaturas inferiores às necessárias para desnaturar o ácido nucleico alvo (í. e., inferior a 100 °C) antes da iniciação da reacção de amplificação. Essas condições incluem, e. g., manutenção das misturas de reacção de amplificação à temperatura ambiente ou ligeiramente abaixo da temperatura ambiente desde cerca de 1 até cerca de 24 horas.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção é baseada na observação de que adicionar ácido nucleico veículo a uma mistura de amplificação de ácido nucleico aumenta consideravelmente o aumento da eficiência e especificidade da amplificação do ácido nucleico alvo. Especificamente, o método da invenção resulta numa redução na extensão pela polimerase de ácidos nucleicos não alvo durante ensaios de amplificação através de uma redução na quantidade da formação de dímeros de iniciadores antes de aumentar a 7 temperatura da mistura de amplificação durante a ciclagem térmica. São utilizadas muitas técnicas em biologia molecular, microbiologia, ADN recombinante e bioquímica de proteína na prática da presente invenção, tais como aquelas explicadas em, por exemplo, Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edição, Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II, 1985 (D.N. Glover ed.); "Oligonucleotide Synthesis", 1984, (M.L. Gait ed.); "Transcription and Translation", 1984 (Hames e Higgins eds.); "A Practical Guide to Molecular Cloning"; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); e "Protein Purification: Principies and Practice", Segunda Edição (Springer-Verlag, N.I . ) .

Mistura de reacção de amplificação, como aqui utilizado refere-se à mistura competente para amplificação de, pelo menos, iniciadores de amplificação, ácido nucleico alvo, desoxinucleótidos, polimerase, um ou mais sais de magnésio e tampões, em quantidades suficientes para permitir que uma reacção de amplificação de ácido nucleico prossiga. "Ácido nucleico" ou "polinucleótido", como aqui utilizados referem-se a polímeros contendo purina e pirimidina de qualquer comprimento, quer polirribonucleótidos ou polidesoxirribonucleótidos ou polirribo polidesoxirribo-nucleótidos mistos. Isto inclui moléculas de cadeia simples ou dupla, tais como, por exemplo, híbridos de ADN-ADN, ADN-ADN e ARN-ARN, assim como "ácidos nucleicos de proteína" (PNA) formados pela conjugação de bases com uma estrutura de aminoácidos. Isto também inclui ácidos nucleicos contendo bases modificadas.

Um "complemento" de uma sequência de ácido nucleico, como aqui utilizado, refere-se à sequência anti-sentido que participa no emparelhamento de bases de Watson-Crick com a sequência original.

Um "iniciador", como aqui utilizado é um oligonucleótido entre cerca de 6 e cerca de 50 nucleótidos em comprimento, de um modo preferido, entre cerca de 12 e cerca de 25 nucleótidos em comprimento e, de um modo muito preferido, entre cerca de 12 e cerca de 18 nucleótidos em comprimento, que forma um duplex com uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples de interesse e permite a polimerização de uma cadeia complementar utilizando, e. g., transcriptase reversa ou polimerase de ADN.

Amplificação, como aqui utilizado refere-se a um processo iterativo através do qual um ácido nucleico é copiado. Métodos adequados para amplificação incluem, sem limitação, reacção em cadeia pela polimerase, reacção em cadeia pela ligase, amplificação por deslocamento de cadeia, amplificação de base única de ácido nucleico e amplificação mediada por transcrição.

Um "ácido nucleico alvo", como aqui utilizado, refere-se a um molde de ácido nucleico, uma subsequência do qual é amplificada durante uma reacção de PCR.

Um ácido nucleico alvo de controlo interno positivo (IPC) é uma sequência de ácido nucleico sintético clonada num vector plasmidico que é subsequentemente linearizado, tipicamente pela acção de uma endonuclease de restrição. Um IPC irá tipicamente 9 possuir múltiplas sequências de ligação ao iniciador que rodeiam uma região genérica de ligação à sonda e actua como um controlo genérico contra resultados falso negativos em reacções de amplificação de ácido nucleico. A sequência de um ADN alvo de controlo interno positivo preferido é: 5'-

CGCC AGCGT GGACC ATCAAGTAGT AATGAACGCACGG ACGAGGACAT CA TAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTG TATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGT G-3'<SEQ IDNO.: 1>. A presente invenção pode ser aplicada a qualquer reacção em que um ou mais oligonucleótidos são incubados com um ácido nucleico alvo de modo a hibridar com o ácido nucleico alvo e iniciar a replicação enzimática do ácido nucleico alvo. Essas reacções incluem, e. g., reacção em cadeia pela polimerase (PCR), reacção em cadeia pela ligase, amplificação por deslocamento da cadeia, amplificação de uma base única de ácido nucleico e amplificação mediada pela transcrição.

Nestas reacções, é formulada uma mistura principal especifica para o ensaio, contendo os iniciadores oligonucleotidicos, tampões e sais, desoxinucleótidos e, opcionalmente, outros componentes. 0 ácido nucleico alvo é então adicionado, seguido pela enzima, e. g., Taq polimerase, que 10 catalisa a reacção e/ou um sal de magnésio, e. g., cloreto de magnésio que é essencial para a progressão da reacção.

Outros componentes adequados para utilização nos métodos da presente invenção incluem, sem limitação, anticorpos antipolimerase que se ligam, e inactivam, a polimerase a baixas temperaturas, mas que são elas próprias inactivadas a temperaturas elevadas, permitindo assim a activação da polimerase a temperaturas elevadas. Exonucleases e glicosilases podem também estar incluídas na mistura de reacção.

Na prática da presente invenção os iniciadores oligonucleotidicos são colocados em contacto com ácido nucleico veiculo antes de serem misturados com o ácido nucleico alvo, polimerase ou sais de magnésio. Ácido nucleico veiculo, de acordo com a invenção pode compreender qualquer ácido nucleico, incluindo, sem limitação, ADN e/ou ARN procariótico ou eucariótico, ADN e/ou ARN sintético ou PNA aleatório e/ou especifico (ácido nucleico de péptido). De um modo preferido, o veiculo compreende ADN e, de um modo muito preferido, ADN de timo de vitela.

Os ácidos nucleicos veículos para utilização na invenção podem ser preparados por métodos convencionais. Por exemplo, o ADN ou ARN podem ser isolados das células por desproteinização. 0 ADN pode ser sintetizado quimicamente utilizando, e. g., o método da fosforamidite em suporte sólido de Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103:3185, o método de Yoo et al., 1989, J. Biol. Chem. 764:17078 ou outros métodos bem conhecidos. Os ácidos nucleicos utilizados na invenção podem também ser modificados através de quaisquer meios conhecidos na técnica. 11

Exemplos não limitantes dessas modificações incluem metilação, "capas", substituição de um ou mais dos nucleótidos que ocorrem naturalmente por um análogo e modificações internucleótido, tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (e. g., fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.) ou ligantes carregados (e. g., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.). Os ácidos nucleicos podem conter adicionalmente uma ou mais unidades covalentemente ligadas, tal como, por exemplo, proteínas (e. g., nucleases, toxinas, anticorpos, péptidos sinal, poli-Lisina, etc.), intercalantes (e. g., acridina, psoraleno, etc.), quelantes (e. g., metais, metais radioactivos, ferro, metais oxidativos, etc.), e alquilantes. 0 ácido nucleico pode ser derivado pela formação de um fosfotriéster de metilo ou etilo ou uma ligação de fosforamidato de alquilo. Iniciadores de amplificação tiolados, em que um ou mais átomos de oxigénio de um grupo fosfato são substituídos com um átomo de enxofre, podem ser sintetizados por, e. g., métodos descritos por Eckstein et al., Ann. Rev. Biochem. 54: 367 (1985); Zon et al., Anticancer Drug Design 6:539 (1991); e Olson et al., PNAS 83:1451 (1990). O ácido nucleico veículo é adicionado à mistura principal contendo o iniciador numa quantidade suficiente de modo a que a concentração final de ácido nucleico veículo no volume da reacção de amplificação varia entre cerca de 1 e cerca de 100 pg/mL, de um modo preferido, entre cerca de 5 e cerca de 75 pg/mL e, de um modo muito preferido, cerca de 25 até cerca de 50 pg/mL. Quantidades típicas de iniciador na reacção são concentrações que variam desde cerca de 0,1 pM a cerca de 1 pM. A quantidade óptima de veículo pode ser determinada independentemente para um ensaio particular. Esta determinação pode ser conseguida adicionando quantidades crescentes de um 12 ácido nucleico veículo a uma mistura principal padronizada, adicionando o ácido nucleico alvo e enzima e, após a reacção, monitorizar o nível de produtos de amplificação específicos e não específicos. (Ver, e. g., Exemplo 1 abaixo). 0 ácido nucleico veículo é, de um modo preferido, misturado com os iniciadores oligonucleotídicos antes da adição do ácido nucleico alvo. A mistura iniciador-veículo é então misturada com o ácido nucleico alvo, polimerase que catalisa a reacção de amplificação e um sal de magnésio que é essencial para a função eficiente da polimerase. Tipicamente, a mistura de reacção é mantida a uma temperatura inferior a cerca de 90 a cerca de 100 °C antes da iniciação da reacção de amplificação. De um modo preferido, a amplificação é conduzida por ciclagem térmica e a temperatura da mistura é mantida a menos do que cerca de 90 a cerca de 100 °C, antes da ciclagem térmica de iniciação. De um modo muito preferido, a mistura de reacção é mantida próximo da temperatura ambiente antes da iniciação da reacção de amplificação.

Sem desejar estar limitado pela teoria, crê-se que a redução da formação de dímeros de iniciadores ocorre através de vários mecanismos diferentes. Primeiro, a polimerase liga-se ao ácido nucleico veículo. Isto é particularmente benéfico quando os anticorpos anti-polimerase estão também presentes na mistura, como moléculas de polimerase que não estão ligadas por anticorpos anti-polimerase estão ligados ao ácido nucleico veículo, reduzindo assim ainda mais a probabilidade de extensão de quaisquer iniciadores hibridados que possam estar presentes. Em segundo lugar, crê-se que o ácido nucleico veículo reduz o número de iniciadores hibridados na mistura, uma vez que os iniciadores irão também emparelhar fracamente como o ADN 13 veículo. Produtos de extensão não específicos formados por ligação dos iniciadores como o ácido nucleico veículo não serão amplificados durante a fase de amplificação do alvo da PCR, na medida em que os iniciadores emparelhados nestes sítios não específicos não estão presentes. Assim, a formação de dímeros de iniciadores (e a formação de outro produto de ácido nucleico não específico) é reduzida.

Descrição das Formas de Realização Preferidas

Os exemplos seguintes pretendem ilustrar a presente invenção sem limitação.

Exemplo 1: Efeito de Ácido Nucleico Veículo na Amplificação por PCR de Sequências de HIV

As seguintes experiências foram realizadas para monitorizar o efeito de adicionar ácido nucleico veiculo a uma reacção de amplificação de HIV.

Foi formulada uma mistura principal que continha os onze iniciadores mostrados na Tabela 1, tampão Tris, dNTP, AmpliTaq e dois anticorpos desencadeadores de AmpliTaq (Documentos US 5338671 e 5587287; Patente Europeia N° 0592035). As misturas principais foram preparadas sem e com ADN de timo de vitela (grupo I e grupo II, respectivamente). 14 TABELA 1 Iniciador Concentração Final Sequência IPC-F1 0,2 pM 5' -CGC CAG CGT GGA CCA TCA AGT AGT AA-3'<SEQ ID N°: 2>. Iniciador Concentração Final Sequência IPC-Rl 0,2 pM 5' -CAC GAT CCT GGA GCA GAC ACT GAA GA-3'<SEQ ID N°: 3>. JBPOL1 0,4 pM 5' -TCG GGT TTA TTA CAG GGA CAG CAG AGA - 3' <SEQ ID N°:4>. JBPOL3 0,2 pM 5' -CTT GTA TTA CTA CTG CCC CTT CAC CTT TCC A - 3' <SEQ ID N°: 5>. JBLTR4 0,4 pM 5'-CTG CTT AAG CCT CAA TAA AGC TTG CCT TGA - 3' <SEQ ID N°:6> JBLTR6 0,4 pM 5' -GGG TCT GAG GGA TCT CTA GTT ACC AGA GT - 3' <SEQ ID N°:7> JBLTR8 0,4 pM 5' -TGT TCG GGC GCC ACT GCT AGA GA-3' <SEQ ID N°:8>. 2ENV-F1 0, 4 pM 5' -CCG GGA TAG TGC AGC AAC AGC AAC A-3' <SEQ ID N°: 9>. 2ENV-R1 0,4 pM 5'-CCC AGA CGG TCA GTC GCA ACA-3' <SEQ ID N°: 10>. 2LTRe 0,4 pM 5'-GGG AGG TTC TCT CCA GCA CTA GCA-3' <SEQ ID N° 11>. 2LTR-R1 0,4 pM 5' -GCG ACT AGG AGA GAT GGG AAC ACA CA-3' <SEQ ID N°: 12>. A fracções de 50 pL de misturas principais do Grupo I e Grupo II foi adicionado 25 pL de MgCl2 a 16mM seguido por mistura alvo de 25 pL (contendo 13,3 cópias de ácido nucleico alvo de 15 controlo interno positivo em NaOH a 20 mM) . Para cada grupo, foram empregues três protocolos experimentais diferentes, que são mostrados na Tabela 2 abaixo. TABELA 2 Grupo Ia adição de reagente Incubação 2a adição de reagente Incubação I-a ASMM-1, MgCl2, Alvo 1 hora & 1 H ASMM-1, MgCl2, Alvo 4 horas 20 minutos i-c ASMM-1, MgCl2 4 horas Alvo 20 min. Il-a ASMM-1, MgCl2, Alvo 1 hora n-b ASMM-1, MgCl2, Alvo 4 horas 20 minutos II-C ASMM-1, MgCl2 4 horas Alvo 20 min. I (a,b,c) = Sem ADN veículo na mistura principal ll(a,b,c) =ADN (timo de vitela) veículo na mistura principal

Num conjunto de misturas de reacção, designado A, os iniciadores de IPC foram não tiolados, enquanto que num segundo conjunto, designado B, os iniciadores de IPC foram tiolados.

Todas as reacções foram realizadas em duplicado. Foram adicionadas fracções de 75 pL das misturas aos tubos de branco do ácido nucleico (Ortho Clinicai Diagnostics, Rochester, NI) . As condições de amplificação por PCR foram como se segue: 16 (1) 9 6 °C durante 3 min para desnaturar completamente o ADN e os anticorpos desencadeadores de AmpliTaq;

(2) 5 ciclos de 96 °C durante 5 seg seguido por 62 °C durante 40 seg;

(3) 35 ciclos de 96 °C durante 5 seg, seguido por 68 °C durante 40 seg. Os produtos de amplificação foram removidos dos tubos e analisados por electroforese em géis de agarose a 4% em tampão Tris-ácido bórico. O produto de ADN amplificado foi detectado utilizando coloração com brometo de etidio.

Os resultados da experiência foram avaliados por inspecção visual da intensidade de ambos os produtos específicos (IPC) e não específicos (dímeros de iniciadores e outros produtos de falsa iniciação) em fotografias dos géis (Tabela 3) . As intensidades de banda de produtos específicos e não específicos foram avaliados visualmente numa escala de 0-10, em que 0 representa a ausência de uma banda detectável e um '10' representa a intensidade máxima. NA, não ensaiado. 17 TABELA 3 Parte A: com iniciadores de IPC não Tio. Parte B: com iniciadores de IPC Iolados. Grupo Rep Produto Produto não Produto Produto não N° específico específico específico específico Intensidade da Intensidade da Intensidade da Intensidade da banda banda banda banda i-a 1 NA NA NA NA I-a 2 6 2 7 2 I-b 1 5 3 7 3 i-b 2 6 2 7 2 i-c 1 0 8 1 9 I-C 2 1 9 0 10 n-a 1 8 0 7 0 n-a 2 7 1 8 1 n-b 1 7 2 9 1 Il-b 2 7 1 9 0 II-C 1 6 3 8 3 n-c 2 6 3 8 1

Em todos os três subconjuntos (a-c), as reacções de amplificação do grupo II produziram bandas de produto específico mais fortes e bandas de produto não específico mais fracas, em comparação com o grupo I. Isto foi verdade para a parte A da experiência (que empregou iniciadores de IPC não tiolados), bem como na parte B da experiência (que empregou iniciadores de IPC tiolados). Em todos os quatro grupos, os níveis de produto de dímeros de iniciadores aumentou e os níveis de produto específico diminuíram, à medida que a mistura foi submetida a condições crescentemente favoráveis à formação de dímeros de iniciadores (a-c), incluindo incubação da mistura à temperatura ambiente durante aproximadamente 4 horas antes da termociclagem. 18

Em I-c, as únicas bandas visíveis no gel foram bandas intensas de dímeros de iniciadores. Em contraste, foram observadas bandas intensas de produto nas reacções Il-c com, proporcionalmente, muito pouco produto de dímeros de iniciadores. Finalmente, embora a tiolação dos iniciadores de IPC (parte B) tenha resultado num ligeiro aumento da síntese do produto específico, isto não foi nem de perto tão benéfico como uma formulação de mistura principal com ácido nucleico veículo.

Muitas variações da presente invenção irão surgir aos especialistas na técnica, à luz da descrição acima detalhada. Essas variações óbvias estão dentro do âmbito global das reivindicações em anexo. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> ORTHO-CLINICAL DIAGNOSTICS, INC.

<120> AUMENTO DA ESPECIFICIDADE DA AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO ATRAVÉS DE UM ÁCIDO NUCLEICO VEÍCULO

<130> P023841EP: AJF <140> 00300790.3 <141> 01.02.00 <150> US 60/118495 <151> 03.02.99 <16 0> 12 19 < 17Ο> SeqWin99

< 210 > 1 <211> 150 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> INICIADOR DE IPC <400> 1 60 120 150 cgccagcgtg gaccatcaag tagtaatgaa cgcacggacg aggacatcat agagattaca cctttatcca cagttctcgg tctaacgcag cagtcagtgt atcagcacca gcatccgtag tgagtcttca gtgtctgctc caggatcgtg

<210> 2 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> INICIADOR <400> 2 cgccagcgtg gaccatcaag tagtaa 26 <210> 3

<211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial 20 <220> <223> INICIADOR < 4 0 0 > 3

cacgatcctg gagcagacac tgaaga 26 <210> 4 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> INICIADOR <400> 4

tcgggtttat tacagggaca gcagaga 27 <210> 5 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> INICIADOR <400> 5 cttgtattac tactgcccct tcacctttcc 30 <210> 6 <211> 30 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> INICIADOR <400> 6 ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga 30 <210> 7 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> INICIADOR <400> 7 gggtctgagg gatctctagt taccagagt 29

<210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> INICIADOR <400> 8 tgttcgggcg ccactgctag aga 23 22

< 210 > 9 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> INICIADOR < 4 0 0 > 9 ccgggatagt gcagcaacag caaca 25

<210> 10 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> INICIADOR <400> 10 cccagacggt cagtcgcaac a 21

<210> 11 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> INICIADOR 23 < 4 Ο Ο > 11 gggaggttct ctccagcact agca 24

<210> 12 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> INICIADOR <400> 12 gcgactagga gagatgggaa cacaca 26

Lisboa, 16 de Setembro de 2009 24

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para aumentar a especificidade da amplificação de um ácido nucleico alvo numa reacção de amplificação, em que os reagentes da reacção de amplificação compreendem um ou mais iniciadores de amplificação oligonucleotidicos específicos para o ácido nucleico alvo, um ácido nucleico alvo, uma polimerase de ácido nucleico e um ou mais sais de magnésio, compreendendo o referido método: (a) preparar uma mistura de iniciador/veiculo compreendendo um ou mais iniciadores de amplificação oligonucleotidicos e ácido nucleico veiculo; e (b) colocar em contacto a referida mistura de iniciador/veiculo com ácido nucleico alvo, um ou mais sais de magnésio e polimerase de ácido nucleico, em que a mistura de iniciador/veiculo é formada antes da adição do ácido nucleico alvo.
2. 2. Método como definido na reivindicação 1, em que o referido ácido nucleico veiculo é seleccionado do grupo consistindo em ADN, ARN e ácido nucleico péptidico (PNA).
3. 3. Método como definido na reivindicação 2, em que o referido ADN é ADN de timo de vitela.
4. 4. Método como definido na reivindicação 1, em que o referido ácido nucleico veiculo está presente na referida reacção de 1 amplificação a uma concentração que varia desde 1 a 100 microgramas por mL.
5. 5. Método como definido na reivindicação 4, em que o referido ácido nucleico veiculo está presente na referida reacção de amplificação a uma concentração que varia desde 5 a 75 microgramas por mL.
6. 6. Método como definido na reivindicação 1, em que a referida mistura é mantida a uma temperatura inferior a 90 a 100 °C antes da iniciação da reacção de amplificação.
7. 7. Método como definido na reivindicação 6, em que a referida temperatura é mantida antes de iniciar a ciclagem térmica.
8. 8. Método como definido na reivindicação 1, em que a referida polimerase compreende Taq polimerase.
9. 9. Método como definido na reivindicação 1, em que os referidos sais de magnésio compreendem cloreto de magnésio.
10. 10. Método como definido na reivindicação 1, em que a referida mistura compreende ainda um elemento seleccionado do grupo consistindo no anticorpo anti-polimerase, uma exonuclease, uma glicosilase ou qualquer sua combinação
11. 11. Método como definido na reivindicação 1, em que o ácido nucleico veículo é ADN de timo de vitela, a concentração do ácido nucleico veículo na referida reacção de amplificação varia desde 1 a 100 microgramas/mL de volume de reacção de amplificação e o sal de magnésio é cloreto de magnésio. 2
12. 12. Método como definido na reivindicação 6, em que a referida temperatura é próxima da temperatura ambiente. Lisboa, 16 de Setembro de 2009 3