ES2328443T3 - Mejora de la especificidad de la amplificacion de acidos nucleicos mediante un acido nucleico portador. - Google Patents
Mejora de la especificidad de la amplificacion de acidos nucleicos mediante un acido nucleico portador. Download PDFInfo
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Abstract
Método para incrementar la especificidad de la amplificación de un ácido nucleico diana en una reacción de amplificación, en el que los reactivos de la reacción de amplificación comprenden uno o más cebadores oligonucleótidos de amplificación específicos del ácido nucleico diana, un ácido nucleico diana, una polimerasa de ácido nucleico y una o más sales de magnesio, comprendiendo dicho método: (a) preparar una mezcla cebador/portador que comprende uno o más cebadores de amplificación con oligonucleótidos y ácido nucleico portador; y (b) poner en contacto dicha mezcla cebador/portador con ácido nucleico diana, una o más sales de magnesio y polimerasa de ácido nucleico. en el que la mezcla cebador/portador es formada previamente a la adición del ácido nucleico diana.
Description
Mejora de la especificidad de la amplificación
de ácidos nucleicos mediante un ácido nucleico portador.
La presente invención se refiere a métodos de
amplificación de ácidos nucleicos, particularmente en ensayos de
diagnosis para microorganismos infecciosos.
La amplificación de secuencias de ácidos
nucleicos usando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
requiere al menos dos cebadores oligonucleótidos de amplificación
que se hibridizan con secuencias diferentes en el ácido nucleico
diana. En general, es deseable evitar el uso de cebadores
oligonucleótidos que tengan secuencias homólogas en sus extremos
3'. Los cebadores con extremos 3' homólogos pueden hibridarse
potencialmente entre sí, resultando en una variedad de artefactos
de amplificación, incluyendo dímeros de cebadores.
La hibridación de cebadores que tienen
complementaridad de los extremos 3' puede ocurrir una vez que todos
los componentes de la reacción PCR han sido mezclados, pero antes
del inicio de la amplificación, mediante la estabilización de los
híbridos de cebador a bajas temperaturas debido a la presencia de
magnesio en la mezcla de reacción. La formación de dímero de
cebadores ocurre a una temperatura igual o inferior a la temperatura
ambiente mediante la extensión de los cebadores hibridados mediante
una ADN polimerasa. El producto dímero de cebadores resultante se
amplificará durante la PCR, compitiendo con el ácido nucleico diana
por los cebadores y la polimerasa. Si se forma suficiente producto
dímero de cebadores en la fase inicial, la amplificación PCR
subsiguiente de este producto puede dejar fuera de competencia la
diana designada, llevando a (i) un resultado falso negativo; es
decir, la muestra parece carecer de una secuencia particular cuando
en realidad la secuencia está presente o (ii) resultados "no
ensayo", es decir, no se obtiene señal de un control positivo
interno.
Además de la secuencia primaria de los conjuntos
de cebadores, los principales contribuidores a la formación de
dímero de cebadores son: un alto nivel molar de cebadores en la
mezcla maestra específica del ensayo (ASMM); el orden de adición de
los reactivos (por ejemplo, añadiendo el ASMM, a continuación una
solución MgCl_{2}, a continuación la diana/muestra incrementará
la formación de dímero de cebadores); el periodo de incubación
entre la adición de MgCl_{2} al ASMM y la adición de diana; y el
periodo de tiempo durante el cual una mezcla de reacción de
amplificación completa, es decir, que comprende todos los
componentes requeridos para la amplificación, incluyendo diana y
polimerasa, incuba previamente al inicio del termociclado de
PCR.
Se conocen varios enfoques para reducir la
formación de dímero de cebadores en una mezcla de cebadores y
polimerasa para la amplificación de ácido nucleico. Estos enfoques
incluyen:
- 1.
- Diseñar cuidadosamente los cebadores de PCR para minimizar homologías de los extremos 3' con todos los otros cebadores en una mezcla de reacción particular. Sin embargo, esta estrategia es difícil en una reacción "múltiplex", es decir, una reacción que contiene varios pares de cebadores de amplificación dirigidos a diferentes secuencias de ácidos nucleicos diana. Además, incluso con un solo par de cebadores, esto puede ser difícil de conseguir, debido a otras restricciones, tales como, por ejemplo, regiones de identidad o de conservación.
- 2.
- Realizar el ciclado térmico/reacción de amplificación poco después de preparar una mezcla de reacción específica para el ensayo para reducir la cantidad de tiempo disponible para la formación de dímero de cebadores. Sin embargo, esto puede ser difícil en la práctica, particularmente si deben cribarse grandes cantidades de muestras.
- 3.
- Cambiar el orden de la adición de reactivos para desestabilizar los dímeros de cebadores potenciales. Por ejemplo, la adición de MgCl_{2} como el último componente puede reducir la formación de dímero de cebadores. Esta aproximación, sin embargo, no es deseable porque (i) no elimina la formación de dímero de cebadores, (ii) es inconveniente, y (iii) puede resultar en la contaminación de la solución de cloruro de magnesio con la diana desde una muestra.
- 4.
- Usar anticuerpos "desencadenantes", que son anticuerpos antipolimerasa que bloquean la actividad polimerasa a temperaturas a las que pueden formarse híbridos de cebadores, pero que son inactivados a altas temperaturas. De esta manera, la polimerasa es activada solo a temperaturas que son demasiado altas para la formación de dímeros de cebadores. (véanse las patentes US Nos 5.338.671 y 5.587.287 y la solicitud de patente europea No. 0592035). Sin embargo, debido a que la unión anticuerpo/polimerasa es un proceso de equilibrio, no puede conseguirse una unión completa de toda la polimerasa. De esta manera, el desencadenamiento de la PCR basada en anticuerpos no es necesariamente efectivo al 100%, particularmente en reacciones de amplificación compleja.
- 5.
- Realizar una PCR de comienzo en caliente (Chou et. al., Nuc. Acids Res. 20:1717-1723, 1992). Esto implica añadir todo excepto la ADN polimerasa termoestable a la mezcla de reacción, iniciar la reacción con una etapa de desnaturalización del producto, seguido por la apertura de los tubos de reacción y la adición de la polimerasa a la mezcla de reacción. Aunque este método es efectivo reduciendo la formación de dímero de cebadores, no es práctico por una serie de razones. Principalmente, es muy engorroso e incrementa considerablemente la probabilidad de una contaminación cruzada (carryover) de amplicones.
- 6.
- Realizar una PCR de comienzo en caliente usando una ADN polimerasa termoestable, tal como AmpliTaq Gold, que es relativamente inactiva hasta que se calienta (véase la solicitud de patente europea No. 624641 y la patente US No. 5.491.086). Sin embargo, AmpliTaq Gold retiene una actividad enzimática residual considerable a bajas temperaturas, y de esta manera, todavía es propensa a generar productos secundarios.
Ninguno de estos enfoques es tan exitoso como
era de esperar eliminando la formación de dímero de cebadores. Un
cuidadoso diseño de los cebadores y el uso de AmpliTaq Gold o
anticuerpos desencadenantes en combinación con Taq polimerasa puede
reducir la formación de dímero de cebadores, pero no la elimina. De
esta manera, hay una necesidad en la técnica de métodos mejorados
para reducir adicionalmente o eliminar la formación de dímero de
cebadores en las reacciones PCR, particularmente en las reacciones
"múltiplex".
La presente invención proporciona métodos para
incrementar la especificidad de la amplificación de un ácido
nucleico diana. Puede aplicarse a todas las reacciones que requieran
de cebadores oligonucleótidos de amplificación específicos de la
diana y una polimerasa de ácido nucleico. De esta manera, en un
aspecto, la invención se refiere a un método para incrementar la
especificidad de la amplificación de un ácido nucleico diana en una
reacción de amplificación, en la que la mezcla de la reacción de
amplificación comprende uno o más cebadores oligonucleótidos de
amplificación específicos de la diana, una polimerasa de ácido
nucleico, y una o mas sales de magnesio, que comprende preparar una
mezcla portador-cebador que contiene uno o más
cebadores y ácido nucleico del portador, y contactar la mezcla
portador-cebador con el ácido nucleico diana, una o
más sales de magnesio y la polime-
rasa.
rasa.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para incrementar la especificidad de la amplificación de un
ácido nucleico diana en una reacción de amplificación, en la que la
mezcla de reacción de amplificación comprende uno o más cebadores
oligonucleótidos de amplificación específicos al ácido nucleico
diana, Taq polimerasa, y cloruro de magnesio, que comprende
preparar una mezcla cebador-portador que incluye uno
o más cebadores y un ácido nucleico portador que incluye ADN de
timo de ternera, en la que la concentración del ácido nucleico
portador estará en el intervalo de aproximadamente 1 a
aproximadamente 100 microgramos/ml de la mezcla de reacción de
amplificación, y contactar, a una temperatura inferior a
aproximadamente 100ºC, la mezcla cebador-portador
con el ácido nucleico diana, la Taq polimerasa; y el cloruro de
magnesio.
En todavía otro aspecto, la invención se refiere
a un método para reducir la extensión de polimerasa de ácido
nucleicos no diana en una reacción para la amplificación de un ácido
nucleico diana, en el que la mezcla de la reacción de amplificación
comprende un o más cebadores oligonucleótidos de amplificación
específicos al ácido nucleico diana, polimerasa, y una o más sales
de magnesio, que comprende preparar una mezcla ácido nucleico
cebador-portador oligonucleótido que contiene uno o
más cebadores para la amplificación y ácido nucleico portador, y
contactar la mezcla cebador-portador con el ácido
nucleico diana, la polimerasa y las sales de magnesio.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a
un método para reducir la formación de dímero de cebadores u otros
productos de la amplificación de ácido nucleico no específicos en
una reacción para la amplificación de un ácido nucleico diana, en
el que la mezcla de reacción de amplificación comprende uno o más
cebadores oligonucleótidos de amplificación específicos de la
diana, polimerasa, y una o más sales de magnesio, que comprende
preparar una mezcla cebador-portador ácido nucleico
que contiene uno o más cebadores y ácido nucleico portador, y
contactar la mezcla cebador-portador con el ácido
nucleico diana, la polimerasa y las sales de magnesio.
Puede usarse cualquier ácido nucleico como ácido
nucleico portador, incluyendo ADN, ARN y ácido nucleico proteínico.
Preferentemente, el portador es ADN, y más preferentemente, ADN de
timo de ternera. Típicamente, el portador es añadido de manera que
la concentración en la mezcla de reacción de amplificación final se
encuentre entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 \mug/ml,
preferentemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 75
\mug/ml, y más preferentemente entre aproximadamente 25 y
aproximadamente 50 \mug/ml.
Los métodos de la presente invención son
particularmente ventajosos reduciendo la extensión de polimerasa de
ácido nucleico no diana durante los ensayos de amplificación. El
método es particularmente aplicable cuando una mezcla de reacción
de amplificación es mantenida a temperaturas inferiores a las
requeridas para desnaturalizar el ácido nucleico diana (es decir,
inferior a 100ºC) previamente al inicio de la reacción de
amplificación. Dichas condiciones incluyen, por ejemplo, mantener
las mezclas de reacción de amplificación a temperatura ambiente o
ligeramente por debajo de la temperatura ambiente desde
aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que añadiendo ácido nucleico portador a una mezcla
de amplificación de ácido nucleico incrementa considerablemente la
eficiencia y la especificidad de la amplificación del ácido
nucleico diana. Específicamente, el método de la invención resulta
en una reducción de la extensión de polimerasa de ácidos nucleicos
no diana durante los ensayos de amplificación mediante una reducción
en la cantidad de formación de dímero de cebadores previamente a
elevar la temperatura de la mezcla de amplificación durante el
ciclado térmico.
Se usan muchas técnicas en biología molecular,
microbiología, ADN recombinante y bioquímica de proteínas en la
práctica de la presente invención, tales como los expuestos en, por
ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical
Approach, Volúmenes I y II, 1985 (D.N. Glover ed.); Oligonucleotide
Synthesis, 1984, (M.L. Gait ed.); Transcription and Translation,
1984 (Hames and Higgins eds.); A Practical Guide to Molecular
Cloning; las series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); y
Protein Purification: Principles and Practice, Segunda Edición
(Springer- Verlag, N.Y.).
La expresión "mezcla de reacción de
amplificación", tal como se usa en la presente memoria, se
refiere a la mezcla con capacidad de amplificación de al menos
cebadores de amplificación, ácido nucleico diana, desoxinucleótidos,
polimerasa, una o más sales de magnesio, y tampones, en cantidades
suficiente para permitir que se produzca una reacción de
amplificación de ácidos nucleicos.
Los términos "ácido nucleico" y
"polinucleótido", tal como se usan en la presente memoria, se
refieren a polímeros que contienen purina y pirimidina de cualquier
longitud, bien polirribonucleótidos o polidesoxirribonucleótidos o
polirribo-polidesoxirribo nucleótidos mezclados.
Esto incluye moléculas de cadena simple o doble, tales como, por
ejemplo, híbridos de ADN-ADN,
ADN-ARN y ARN-ARN, así como
"ácidos nucleicos proteínicos" (PNA) formados conjugando bases
a un esqueleto de aminoácidos. Esto incluye también ácidos que
contienen bases modificadas.
Un "complemento" de una secuencia de ácido
nucleico, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una
secuencia antisentido que participa en el emparejamiento de bases
Watson-Crick con la secuencia original.
Un "cebador", tal como se usa en la
presente memoria, es un oligonucleótido de entre aproximadamente 6 y
aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, preferentemente de
entre aproximadamente 12 y aproximadamente 25 nucleótidos de
longitud y más preferentemente de entre aproximadamente 12 y
aproximadamente 18 nucleótidos de longitud, que forma un dúplex con
una secuencia de ácido nucleico de cadena simple de interés y
permite la polimerización de una cadena complementaria usando, por
ejemplo, transcriptasa inversa o ADN polimerasa.
El término "amplificación", tal como se usa
en la presente memoria, se refiere a un procedimiento iterativo
mediante el cual se copia un ácido nucleico. Los métodos adecuados
para la amplificación incluyen, sin limitación, reacción en cadena
de la polimerasa, reacción en cadena de la ligasa, amplificación por
desplazamiento de cadena, amplificación de una única base de ácido
nucleico y amplificación mediada por transcripción.
Un "ácido nucleico diana", tal como se usa
en la presente memoria, se refiere a una plantilla de ácido
nucleico, una subsecuencia de la cual es amplificada durante una
reacción PCR.
Un ácido nucleico diana de un control positivo
interno (IPC) es una secuencia sintética de ácido nucleico clonada
en un vector plásmido que es linearizada subsecuentemente,
típicamente mediante la acción de un endonucleasa de restricción.
Un IPC tendrá típicamente múltiples secuencias de unión a cebador
rodeando una región genérica de unión a sonda, y actúa como un
control genérico contra resultados negativos falsos en las
reacciones de amplificación de ácidos nucleicos.
La secuencia de un AND diana de un control
positivo interno es:
La presente invención puede ser aplicada a
cualquier reacción en la que uno o más oligonucleótidos son
incubados con un ácido nucleico diana con el fin de hibridarse al
ácido nucleico diana y cebar la replicación enzimática del ácido
nucleico diana. Dichas reacciones incluyen, por ejemplo reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa,
amplificación por desplazamiento de cadena, amplificación de una
única base de ácido nucleico y amplificación mediada por
transcripción.
En estas reacciones, se formula una mezcla
maestra específica del ensayo, que contiene los cebadores
oligonucleótidos, tampones y sales, desoxinucleótidos, y,
opcionalmente, otros componentes. A continuación se añade el ácido
nucleico diana, seguido de la enzima, por ejemplo, Taq polimerasa,
que cataliza la reacción y/o una sal de magnesio, por ejemplo,
cloruro de magnesio, que es esencial para la progresión de la
reacción.
Otros componentes adecuados para el uso en los
métodos de la presente invención incluyen, sin limitación,
anticuerpos antipolimerasa que se unen a la polimerasa y la
inactivan a bajas temperaturas, pero que ellos mismos se inactivan
a altas temperaturas, permitiendo de esta manera la activación de la
polimerasa a altas temperaturas. Pueden incluirse también
exonucleasas y glicosilasas en la mezcla de reacción.
En la práctica de la presente invención, los
cebadores oligonucleótidos son contactados con ácido nucleico
portador previamente a la mezcla con el ácido nucleico diana, la
polimerasa o las sales de magnesio.
El ácido nucleico portador según la invención
puede comprender cualquier ácido nucleico, incluyendo, sin
limitación, ADN y/o ARN procariota o eucariota, ADN y/o ARN
sintético o PNA (ácido nucleico péptido) aleatorio y/o específico.
Preferentemente, el portador comprende ADN, y más preferentemente
ADN de timo de ternera.
Los ácidos nucleicos portadores para el uso de
la invención pueden ser preparados mediante métodos convencionales.
Por ejemplo, El ADN o el ARN pueden ser seleccionados a partir de
células mediante desproteinización. El ADN puede ser sintetizado
químicamente usando, por ejemplo, el método de soporte sólido de
fosforamidita de Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Soc.
103:3185, el método de Yoo et al., 1989, J. Biol. Chem.
764:17078 u otros métodos bien conocidos. Los ácidos nucleicos
utilizados en la invención pueden ser modificados también mediante
cualquier medio conocido en la técnica. Ejemplos no limitativos de
dichas modificaciones incluyen metilación, "caps", sustitución
de uno o más nucleótidos naturales por un análogo, y modificaciones
internucleótidos tales como, por ejemplo, los que tienen uniones
sin carga (por ejemplo, metil fosfanatos, fosfotriésteres,
fosforoamidatos, carbamatos, etc.) o uniones con carga (por
ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.). Los ácidos
nucleicos pueden contener una o más fracciones unidas
covalentemente, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo,
nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal,
poli-L-lisina, etc.), intercaladores
(por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), quelantes (por ejemplo,
metales, metales radioactivos, hierro, metales oxidativos, etc.) y
alquilantes. El ácido nucleico puede ser derivado mediante la
formación de una unión metil o etil fosfotriéster o alquil
fosforamidato. Los cebadores de amplificación tiolados, en los que
uno o más átomos de oxígeno de un grupo fosfato son remplazados por
un átomo de azufre, pueden ser sintetizados mediante, por ejemplo,
los métodos descritos por Eckstein et al., Ann. Rev.
Biochem. 54: 367 (1985); Zon et al., Anticancer Drug Design
6:539 (1991); y Olson et al., PNAS 83:1451
(1990).
(1990).
El ácido nucleico portador es añadido a la
mezcla maestra que contiene el cebador en una cantidad suficiente
de manera que la concentración final de ácido nucleico portador en
el volumen de la reacción de amplificación esté en el intervalo
entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 \mug/ml,
preferentemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 75
\mug/ml, y más preferentemente entre aproximadamente 25 y
aproximadamente 50 \mug/ml. Las cantidades típicas de cebador en
la reacción son concentraciones que están en el intervalo entre
aproximadamente 0,1 \muM y aproximadamente 1 \muM. La cantidad
óptima de portador puede ser determinada independientemente para un
ensayo particular. Esta determinación puede conseguirse añadiendo
cantidades crecientes de un ácido nucleico portador a una mezcla
maestra estandarizada, añadiendo el ácido nucleico diana y enzima, y
después de la reacción, monitorizando el nivel de productos
específicos y no específicos de la amplificación (véase, por
ejemplo, el Ejemplo 1, más adelante).
Preferentemente, el ácido nucleico portador es
mezclado con los cebadores oligonucleótidos previamente a la
adición del ácido nucleico diana. A continuación, la mezcla
cebador-portador es mezclada con ácido nucleico
diana, polimerasa que cataliza la reacción de amplificación y una
sal de magnesio que es esencial para la función eficiente de la
polimerasa. Típicamente, la mezcla de reacción se mantiene a una
temperatura inferior a aproximadamente 90 a aproximadamente 100ºC
previamente al inicio de la reacción de amplificación.
Preferentemente, la amplificación se realiza mediante ciclado
térmico, y la temperatura de la mezcla se mantiene a una temperatura
inferior a aproximadamente 90 a aproximadamente 100ºC previamente
al inicio del ciclado térmico. Más preferentemente, la mezcla de
reacción se mantiene aproximadamente a temperatura ambiente
previamente al inicio de la reacción de
amplificación.
amplificación.
Sin querer quedar ligado por la teoría, se cree
que la reducción de la formación de dímero de cebadores ocurre
mediante varios mecanismos diferentes. Primero, la polimerasa se une
al ácido nucleico portador. Esto es particularmente beneficioso
cuando hay también anticuerpos anti-polimerasa
presentes en la mezcla, ya que las moléculas de polimerasa que no
se unen a los anticuerpos anti-polimerasa se unen al
ácido nucleico portador, reduciendo de esta manera adicionalmente
la probabilidad de extensión de cualquier cebador hibridado que
pueda haber presente. Segundo, se cree que el ácido nucleico
portador reduce el número de cebadores hibridados en la mezcla ya
que los cebadores también se aparearán levemente al ADN portador.
Los productos de extensión no específicos formados a partir de la
unión de cebadores al ácido nucleico portador no serán amplificados
durante la fase de amplificación de la diana de la PCR, ya que no
los cebadores emparejados para estos sitios no específicos no están
presentes. De esta manera, se reduce la formación de dímero de
cebadores (y la formación de otros productos de ácido nucleico
no
específicos).
específicos).
Los ejemplos siguientes pretenden ilustrar la
presente invención sin limitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Los experimentos siguientes fueron realizados
para monitorizar el efecto de añadir ácido nucleico portador a una
reacción de amplificación de HIV.
Se formuló una mezcla maestra que contenía los
once cebadores mostrados en la Tabla 1, tampón Tris, dNTPs,
AmpliTaq y dos anticuerpos desencadenadores de AmpliTaq (US
5.338.761 y 5.587.287; patente europea No. 0592035). Las mezclas
maestras fueron preparadas sin y con ADN de timo de ternera (grupo I
y grupo II, respectivamente).
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
A alícuotas de 50 \mul de dos mezclas maestras
del Grupo I y Grupo II se añadieron 25 \mul de 16 mM MgCl_{2}
seguido por 25 \mul de mezcla diana (que contenía 13,3 copias de
ácido nucleico diana del control positivo interno en 20 mM NaOH).
Para cada grupo se emplearon tres diferentes protocolos
experimentales, que se muestran en la Tabla 2, a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En un conjunto de las mezclas de reacción,
designado A, los cebadores IPC eran no-tiolados,
mientras que en un segundo conjunto, designado B, los cebadores IPC
eran tiolados.
Todas las reacciones fueron realizadas por
duplicado. Se añadieron alícuotas de 75 \mul de las mezclas a
envases (pouches) de ácido nucleico "blank" (Ortho Clinical
Diagnostics, Rochester, NY). Las condiciones de la amplificación de
la PCR eran las siguientes:
- (1)
- 96ºC durante 3 minutos para desnaturalizar completamente el ADN y los anticuerpos desencadenantes de AmpliTaq;
- (2)
- 5 ciclos de 96ºC durante 5 segundos seguido de 62ºC durante 40 segundos;
- (3)
- 35 ciclos de 96ºC durante 5 segundos seguido de 68ºC durante 40 segundos. Los productos de la amplificación fueron retirados de los envases (pouches) y fueron analizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 4% en tampón de Tris-ácido bórico. El producto ADN amplificado fue detectado usando tinción con bromuro de etidio.
Los resultados del experimento fueron valorados
mediante inspección visual de la intensidad de los productos
específicos (IPC) y no específicos (dímero de cebadores y otros
productos cebadores falsos) en fotografías de los geles (Tabla 3).
Las intensidades de las bandas de los productos específicos y no
específicos fueron valoradas visualmente en una escala de
0-10, en la que 0 representa la ausencia de una
banda detectable, y un "10" representa la intensidad máxima.
NA representa no valorado.
En la totalidad de los tres subconjuntos
(a-c), las reacciones de amplificación del grupo II
produjeron bandas de producto específico más fuertes y bandas de
producto no específico más débiles en comparación con el grupo I.
Esto se cumplía para la parte A del experimento (que empleó
cebadores IPC no tiolados) así como en la parte B del experimento
(que empleó cebadores IPC tiolados). En la totalidad de los 4
grupos, los niveles de producto dímero de cebadores se
incrementaron y los niveles de producto específico decrecieron
conforme la mezcla fue sometida a condiciones cada vez más
favorables a la formación de dímero de cebadores
(a-c), incluyendo la incubación de la mezcla a
temperatura ambiente durante aproximadamente 4 horas previamente al
termociclado. En I-c, las únicas bandas de gel
visibles fueron bandas de dímero de cebadores intensas. Por el
contrario, se observaron intensas bandas de producto en las
reacciones II-c con proporcionalmente muy poco
producto dímero de cebadores. Finalmente, aunque la tiolación del
cebador IPC (parte B) resultó en una síntesis de producto
específico ligeramente incrementada, esto no era ni mucho menos tan
beneficioso como una formulación de mezcla maestra con ácido
nucleico portador.
Muchas variaciones de la presente invención
serán evidentes para las personas con conocimientos en la materia a
la luz de la descripción detallada anterior. Dichas variaciones
obvias se encuentran dentro del completo alcance objetivo de las
reivindicaciones adjuntas.
<110> ORTHO-CLINICAL
DIAGNOSTICS, INC.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MEJORA DE LA ESPECIFICIDAD DE LA
AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS MEDIANTE ÁCIDO NUCLEICO
PORTADOR
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<130> P023841EP: AJF
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<141> 01.02.00
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<150> US 60/118495
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<160> 12
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<170> SeqWin99
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<210> 1
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> CEBADOR IPC
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<400> 1
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\hskip0,8cm
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<210> 2
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> CEBADOR
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<400> 2
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\hfill26
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<210> 3
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<211> 26
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<212> ADN
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<220>
\newpage
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipcacgatcctg gagcagacac tgaaga
\hfill26
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\hskip-.1em\dddseqskiptcgggtttat tacagggaca gcagaga
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\hfill29
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\hfill25
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<211> 24
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\hfill24
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\hskip-.1em\dddseqskipgcgactagga gagatgggaa cacaca
\hfill26
Claims (12)
1. Método para incrementar la especificidad de
la amplificación de un ácido nucleico diana en una reacción de
amplificación, en el que los reactivos de la reacción de
amplificación comprenden uno o más cebadores oligonucleótidos de
amplificación específicos del ácido nucleico diana, un ácido
nucleico diana, una polimerasa de ácido nucleico y una o más sales
de magnesio, comprendiendo dicho método:
- (a)
- preparar una mezcla cebador/portador que comprende uno o más cebadores de amplificación con oligonucleótidos y ácido nucleico portador; y
- (b)
- poner en contacto dicha mezcla cebador/portador con ácido nucleico diana, una o más sales de magnesio y polimerasa de ácido nucleico.
en el que la mezcla
cebador/portador es formada previamente a la adición del ácido
nucleico
diana.
2. Método según se define en la reivindicación
1, en el que dicho ácido nucleico portador es seleccionado de entre
el grupo constituido por ADN, ARN y ácido nucleico péptido
(PNA).
3. Método según se define en la reivindicación
2, en el que dicho ADN es ADN de timo de ternera.
4. Método según se define en la reivindicación
1, en el que dicho ácido nucleico portador está presente en dicha
reacción de amplificación en una concentración en el intervalo de 1
a 100 microgramos por ml.
5. Método según se define en la reivindicación
4, en el que dicho ácido nucleico portador está presente en dicha
reacción de amplificación en una concentración en el intervalo de 5
a 75 microgramos por ml.
6. Método según se define en la reivindicación
1, en el que dicha mezcla se mantiene a una temperatura inferior a
90 a 100ºC previamente al inicio de la reacción de
amplificación.
7. Método según se define en la reivindicación
6, en el que dicha temperatura se mantiene previamente al inicio
del ciclado térmico.
8. Método según se define en la reivindicación
1, en el que dicha polimerasa comprende Taq polimerasa.
9. Método según se define en la reivindicación
1, en el que dichas sales de magnesio comprenden cloruro de
magnesio.
10. Método según se define en la reivindicación
1, en el que dicha mezcla comprende además un miembro seleccionado
de entre el grupo que comprende anticuerpo antipolimerasa, una
exonucleasa, una glicosilasa o cualquier combinación de los
mismos.
11. Método según se define en la reivindicación
1, en el que dicho ácido nucleico portador en ADN de timo de
ternera, la concentración de ácido nucleico portador en dicha
reacción de amplificación está en el intervalo de 1 a 100
microgramos/ml de volumen de reacción de amplificación, y la sal de
magnesio es cloruro de magnesio.
12. Método según se define en la reivindicación
6, en el que dicha temperatura es aproximadamente la temperatura
ambiente.
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