ES2254505T3 - Metodo para la amplificacion y caracterizacion opcional de acidos nucleicos. - Google Patents

Abstract

Un método para la amplificación de un ácido nucleico molde, que comprende llevar a cabo simultáneamente las etapas de: i) hacer reaccionar un cebador de ácido nucleico con dicho ácido nucleico molde, nucleótidos precursores de ADN normales, al menos un nucleótido precursor de ADN modificado y una ADN polimerasa para obtener un cebador de ácido nucleico elongado, y dicho cebador de ácido nucleico permanece unido a dicho molde; ii) escindir el cebador de ácido nucleico elongado que contiene la base modificada para generar un extremo 3''-OH libre que es elongable por dicha ADN polimerasa; y iii)repetir las etapas i) y ii) sobre los fragmentos de ADN así generados.

Description

Método para la amplificación y caracterización opcional de ácidos nucleicos.

Campo técnico

Esta invención se refiere a un método nuevo para amplificar y caracterizar ácidos nucleicos.

Técnica antecedente

La elongación de un cebador de ácido nucleico sobre un molde de ácido nucleico de interés es un proceso de gran importancia con múltiples aplicaciones, que incluyen la detección, diagnóstico y cuantificación de ácidos nucleicos. En particular, la elongación de un cebador sobre un molde es i) una prueba directa de que el cebador ha hibridado con el molde, ii) confirma la presencia de una secuencia complementaria para el cebador en ese molde, y por lo tanto iii) confirma la presencia de ese molde o ácido nucleico de interés. Mediante la utilización de cebadores estrechamente relacionados que se diferencian solamente en una única base, es posible distinguir de forma rutinaria entre ácidos nucleicos que se diferencian en su secuencia por una única base. La limitación clave al usar la elongación del cebador sobre un ácido nucleico molde como método de detección, diagnóstico y cuantificación de ácidos nucleicos es que, en una reacción de elongación típica, el cebador hibrida con el molde pero se elonga solamente una vez. Así, la cantidad de molde en una muestra determina la cantidad de cebador que se elonga. Para la mayoría de aplicaciones en la detección, diagnóstico y cuantificación de ácidos nucleicos, la cantidad de molde a menudo es demasiado pequeña para permitir la detección directa del cebador elongado si esa reacción de elongación no se repite o no se realiza de forma cíclica de alguna manera.

Los procesos de amplificación son necesarios para superar esta limitación clave. Se ha descrito una diversidad de estos procesos previamente, e implican esencialmente: a) condiciones de disociación cíclicas en las que el cebador elongado se disocia del molde usando calor, y por lo tanto se permite la hibridación y posterior elongación de un cebador nuevo, b) generación repetida de un cebador en el ADN por medio del uso de una enzima de restricción para introducir una mella en una cadena sin modificar de un sitio de reconocimiento de ADN semimodificado y la capacidad de una ADN polimerasa deficiente de exonucleasa 5'-3' para elongar el extremo 3' del ADN en la mella y desplazar la cadena de ADN de 3', c) en donde el ácido nucleico molde está circularizado, de forma que la elongación del cebador progresa de forma continua y/o d) en donde las copias del molde se producen mediante un método de transcripción que sirve como molde en las reacciones posteriores de elongación del cebador.

La amplificación de un ácido nucleico (que genera múltiples copias) hasta la concentración en la que se puede detectar y manipular tiene una gran utilidad. Tales procesos de amplificación, que generan cantidades suficientes de un ácido nucleico específico de interés son generalmente la primera etapa clave necesaria en la caracterización del ácido nucleico. La amplificación directa de una secuencia específica de ácido nucleico a partir de una muestra permite el diagnóstico de la presencia o ausencia de dicho ácido nucleico en esa muestra, y así tiene una gran utilidad en el diagnóstico de ADN/genético. La amplificación directa de un ácido nucleico a partir de una muestra y la caracterización posterior se pueden realizar con una diversidad de propósitos, que incluyen el diagnóstico de la presencia o ausencia de variaciones en el ADN, tales como mutaciones y polimorfismos, en un ácido nucleico específico. Los procesos de amplificación se pueden diseñar en muchos casos para permitir tanto la amplificación como la caracterización completa o parcial del fragmento amplificado de interés.

Los métodos conocidos actualmente para amplificar y caracterizar ácidos nucleicos tienen diferentes limitaciones, especialmente con respecto al proceso necesario para la disociación del cebador, generación del cebador, especificidad, versatilidad, generación de un ADN monocatenario y facilidad de amplificación múltiple y genotipado de alto rendimiento, especialmente genotipado de polimorfismos de nucleótido único (SNP), como se describe más adelante.

Elongación de cebadores

La elongación de cebadores per se sobre un molde está muy bien documentada en la bibliografía. Se puede conseguir hibridando un cebador con su secuencia complementaria sobre un molde o ácido nucleico de interés, seguido de incubación con una ADN polimerasa en presencia de precursores de ADN, típicamente dATP, dGTP, dCTP y dTTP, lo que da como resultado la elongación del cebador a partir de su extremo 3'-OH (hidroxi) en dirección 5' a 3' (con respecto al cebador) sobre la cadena molde, y produce una cadena de ADN recién sintetizada que es complementaria al molde original. La elongación del cebador puede ocurrir solamente si el cebador tiene un extremo 3'-OH libre. La amplificación de esta cadena complementaria a partir del molde mediante métodos de elongación del cebador necesita que a) la elongación del cebador ocurra más de una vez por molécula de cebador hibridada, b) se deje hibridar cebador nuevo repetidamente con el molde y se elongue y/o c) la cadena complementaria sirva como molde para la elongación posterior de un segundo cebador.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La amplificación de un molde de ácido nucleico se puede conseguir mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki, R. K. et al., Science. 239:487-491 (1988).

Típicamente, la amplificación de un segmento de interés de un molde de ácido nucleico mediante PCR se lleva a cabo usando cebadores de oligonucleótidos sintéticos apropiados en la PCR junto con una ADN polimerasa termoestable y precursores de ADN. Los múltiples ciclos de desnaturalización, hibridación y elongación de cebadores dan como resultado la amplificación exponencial del segmento de interés. Así, la detección del producto indica la presencia de una cierta secuencia en un locus específico. La longitud del producto amplificado se determina mediante la longitud combinada de los cebadores y la distancia entre sus extremos 3' sobre el molde, etc.

La PCR tiene una necesidad absoluta de una ADN polimerasa termoestable. También implica un proceso de termociclado, y por lo tanto la automatización de esta técnica requiere equipo especializado. Una reacción típica necesita normalmente dos cebadores para iniciar la reacción, y por lo tanto esto añade complejidad adicional a la reacción, especialmente cuando se quiere considerar realizar de forma múltiple varias reacciones de amplificación diferentes (es decir, en un tubo). Esto lleva a un número mayor de cebadores presentes en la reacción, y por lo tanto incrementa la posibilidad de amplificación falsa e inespecífica. Además, existe una complejidad mayor en el diseño y la optimización de la reacción de PCR, ya que la temperatura de hibridación de la reacción tiene que ser conveniente para ambos cebadores usados en la reacción. Esto se convierte en una desventaja adicional cuando se realizan de forma múltiple diferentes reacciones de amplificación, ya que una única temperatura de hibridación debe ser conveniente para todas las reacciones de amplificación que se realizan de forma múltiple.

Además, existe la posibilidad de contaminación por amplicones, ya que se producen múltiples copias del ácido nucleico molde durante la reacción para actuar como moldes posteriores.

Métodos de amplificación basados en la transcripción

La amplificación basada en la transcripción (Kwoh, D. Y. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 1173-1177; Guatelli, J. C. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 1874-1878; Compton, J. (1991) Nature 350 91-92) es un método de amplificación que depende de la elongación de cebadores sobre un ácido nucleico de interés, de forma que se crea un promotor de ARN polimerasa en dirección 5' de la región de interés a ser amplificada. Esencialmente, se incuban un par de cebadores que flanquean la secuencia de interés con un ácido nucleico molde. Uno de los cebadores tiene una secuencia promotora de ARN polimerasa en dirección 5' de una secuencia que es complementaria e hibrida con el molde. El otro cebador es complementario con un segmento de la cadena molde complementaria. El cebador con la secuencia promotora de ARN polimerasa se elonga sobre la cadena molde usando una polimerasa de ácido nucleico, tal como transcriptasa inversa, y precursores de ADN. Después de la desnaturalización térmica del ácido nucleico híbrido (la cadena molde y la cadena complementaria recién sintetizada) o de la degradación enzimática de la cadena molde, el segundo cebador hibrida con, y se elonga sobre, la cadena complementaria recién sintetizada. Esto da como resultado un producto que es bicatenario y tiene un promotor de ARN polimerasa unido a la secuencia de interés. La incubación de este producto con ARN polimerasa y precursores de ARN da como resultado la producción de numerosos transcritos de ARN de esa secuencia de interés. Cada transcrito de ARN sirve a cambio como molde para la producción de una cadena de ADN complementaria, y este proceso continúa de una forma cíclica automantenida en condiciones isotérmicas hasta que los componentes de la reacción se hacen limitantes o se inactivan. Esto da como resultado una gran amplificación de la secuencia de ácido nucleico de
interés.

Una desventaja importante es que estas técnicas tienen una dependencia absoluta del ARN, que es inherentemente más inestable que el ADN y es más susceptible a la degradación. Por lo tanto, la reacción es ultrasensible a ribonucleasas contaminantes. Típicamente, el método necesita ARN como molde, y no es adecuado u óptimo con un molde de ADN.

Además, el método requiere al menos dos cebadores para iniciar la reacción, en el que uno de los cebadores debe estar especialmente diseñado para incorporar un sitio de iniciación de la transcripción para una ARN polimerasa.

Además, existe la posibilidad de contaminación por amplicones, ya que se producen múltiples copias del ácido nucleico molde durante la reacción para actuar como moldes posteriores.

Estas técnicas no son adecuadas para la detección de mutaciones o polimorfismos sin la adición de etapas adicionales.

Amplificación por desplazamiento de cadena (SDA)

SDA es un método de amplificación basado en la capacidad de una enzima de restricción para introducir una mella en la cadena sin modificar de un ADN bicatenario semimodificado en un sitio de reconocimiento específico, y la capacidad de una ADN polimerasa deficiente de exonucleasa 5'-3' para elongar el extremo 3' en la mella resultante y, al hacerlo, desplazar la cadena de ADN de 3' (Walker, G. T. et al., PNAS 89:392-396 (1992)). La amplificación exponencial del ADN de interés se consigue acoplando reacciones sobre el molde en el que las cadenas desplazadas de la reacción sobre la cadena molde sirven como objetivo para la reacción sobre la cadena complementaria y viceversa. Esencialmente, la desnaturalización térmica de una muestra de ADN genera dos fragmentos de ADN monocatenarios (T1 y T2). Están presentes en exceso dos cebadores de amplificación de ADN (P1 y P2). El extremo 3' de P1 se une al extremo 3' de T1, lo que forma una molécula doble con dos salientes 5'. De forma similar, P2 se une a T2. Los salientes 5' de P1 y P2 contienen una secuencia de reconocimiento para una enzima de restricción tal como HincII. Una forma deficiente de exonucleasa 5'-3' de ADN polimerasa de E. coli elonga los extremos 3' de las moléculas dobles usando los precursores de ADN dGTP, dCTP, dTTP y el precursor modificado 5'-[alfa tio]-trifosfato de desoxiadenosina, que produce un sitio de reconocimiento de hemifosforotioato en P1T1 Y P2T2. HincII introduce mellas en las cadenas desprotegidas de los cebadores de los sitios de reconocimiento de hemifosforotioato, dejando intactas las cadenas complementarias modificadas. La ADN polimerasa elonga el extremo 3' en la mella de P1T1 y desplaza la cadena de 3' que es funcionalmente equivalente a T2. De forma similar, la extensión en la mella de P2T2 da como resultado el desplazamiento de una cadena de 3' que es funcionalmente equivalente a T1. Las etapas de introducción de mella y polimerización/desplazamiento se dan de forma cíclica continuamente en P1T1 y P2T2 porque la elongación en la mella genera un sitio de reconocimiento de HincII susceptible de ser mellado. La amplificación de interés es exponencial, porque las cadenas desplazadas de P1T1 sirven como objetivos para P2 y las cadenas desplazadas de P2T2 sirven como objetivo para P1.

Una desventaja importante de SDA es que se deben utilizar cebadores especialmente diseñados que incorporan un sitio para una enzima de restricción específica. Típicamente, se necesitan dos o más cebadores específicos de secuencia por amplicón para llevar a cabo la reacción. Además, los fragmentos amplificados producidos en esta reacción usando un único cebador no tienen fácilmente un extremo 3' definido. Esta también es una desventaja importante de SDA, ya que un extremo 3' definido en un fragmento desplazado permite que se cebe una reacción subsiguiente con este mismo fragmento.

El documento WO 97/03210 describe un método para detectar rápidamente la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico particular en un locus candidato en una muestra de ácido nucleico de interés, que comprende las etapas de: 1) introducir una base modificada que es un sustrato para una ADN glicosilasa en dicho locus candidato en una o más posiciones preseleccionadas; ii) cortar la base modificada por medio de dicha ADN glicosilasa para generar un sitio abásico; iii) escindir enlaces fosfato en los sitios abásicos generados en la etapa ii); y iv) analizar los productos de escisión de la etapa iii) para identificar en dicha secuencia de ácido nucleico de interés la presencia o ausencia de dicha secuencia de ácido nucleico particular en dicho locus candidato. El método tiene aplicación particular para detectar mutaciones específicas en una muestra de ADN, que incluye la detección de múltiples mutaciones conocidas en el ADN.

El documento WO 99/54501 describe un método para caracterizar moléculas de ácido nucleico que comprende las etapas de i) introducir una base modificada, por ejemplo uracilo, que es un sustrato para una ADN glicosilasa en una molécula de ADN; ii) cortar la base modificada por medio de dicha ADN glicosilasa para generar un sitio abásico; iii) escindir el ADN en el sitio abásico para generar un fragmento de ADN en 5' que puede ser elongado; y iv) incubar el fragmento de 5' elongable en presencia de una enzima, por ejemplo una polimerasa o una ligasa, y permitir su elongación, y un ácido nucleico molde, y analizar el/los fragmento(s) resultante(s). Sin embargo, en el caso del método descrito en el documento WO 99/54501 es crítica la escisión del ADN en el sitio en el que la base fue escindida.

En el caso del método como se ejemplifica en el documento WO 99/54501, la mezcla de reacción que alberga el ácido nucleico amplificado de interés se trató con exonucleasa I para digerir los cebadores no elongados en la etapa de amplificación y fosfatasa alcalina de camarón para digerir los dNTPs sin incorporar durante la etapa de amplificación. Por lo tanto, no se dio amplificación adicional del ácido nucleico molde, y el método se limitó a un único
ciclo.

Por lo tanto, es importante desarrollar un método mejorado para la amplificación y caracterización de ácidos nucleicos que sea más versátil, más específico, ofrezca un rendimiento superior, facilite la realización de la reacción de forma múltiple y permita la generación de ADN monocatenario.

Por lo tanto, la invención proporciona un método para la amplificación de un ácido nucleico molde, que comprende simultáneamente llevar a cabo las etapas de:

i)

hacer reaccionar un cebador de ácido nucleico con dicho ácido nucleico molde, nucleótidos precursores de ADN normales, al menos un precursor de ADN modificado y una ADN polimerasa para obtener un cebador de ácido nucleico elongado, y dicho cebador de ácido nucleico permanece unido a dicho molde;

ii)

escindir el cebador de ácido nucleico elongado que contiene la base modificada para generar un extremo 3'-OH libre que es elongable por dicha ADN polimerasa; y

iii)

repetir las etapas i) y ii) sobre los fragmentos de ADN así generados.

En una realización, el cebador de ácido nucleico elongado que contiene una base modificada se escinde mediante una 3'-endonucleasa.

En esta realización, preferiblemente, la 3'-endonucleasa es endonucleasa V de E. coli o sus homólogos que se encuentran en otros organismos.

En una realización alternativa, el método comprende las etapas de:

i)

hacer reaccionar un cebador de ácido nucleico con dicho ácido nucleico molde, nucleótidos precursores normales de ADN, al menos un precursor de ADN modificado que es un sustrato para una ADN glicosilasa y una ADN polimerasa, para obtener un cebador de ácido nucleico elongado, y dicho cebador de ácido nucleico permanece unido a dicho molde;

ii)

cortar la base modificada del nucleótido precursor de ADN modificado del cebador de ácido nucleico elongado por medio de una ADN glicosilasa para generar un sitio abásico;

iii)

escindir el cebador de ácido nucleico elongado en el sitio abásico para generar un extremo 3'-OH libre que es elongable por dicha ADN polimerasa; y

iv)

repetir las etapas i)-iii) sobre los fragmentos de ADN así generados.

El método según la invención tiene muchas ventajas específicas, como se expone más adelante. Sin embargo, de forma más general, el método según la invención tiene ventajas significativas sobre las técnicas existentes en cuanto a que es más versátil y más flexible con respecto a proporcionar un único proceso de alto rendimiento que se puede adaptar
fácilmente a múltiples formatos diferentes en los campos de la detección, cuantificación y caracterización de ADN.

La invención se describirá principalmente a continuación con referencia a la realización que implica el uso de una ADN glicosilasa. Se ha acuñado la expresión amplificación mediada por glicosilasa (GMA) para este método según la invención. Sin embargo, todas las realizaciones de la invención se denominan colectivamente aquí bajo el acrónimo GMA.

En el método según la invención, el precursor de ADN modificado puede ser así un sustrato para una ADN glicosilasa o reconocido por una 3'-endonucleasa como se describe aquí.

Típicamente, la cadena molde de ácido nucleico puede ser cualquier cadena de un ácido nucleico natural o sintetizado artificialmente.

Preferiblemente, el ácido nucleico molde es ADN.

El método según la invención es cebado/iniciado por el cebador de ácido nucleico. Por comodidad, el cebador responsable de iniciar la reacción se denomina aquí cebador iniciador (CI).

El CI puede ser cualquier ácido nucleico con un extremo 3'-OH libre que puede ser elongado por una ADN polimerasa. El CI se puede sintetizar artificialmente, por ejemplo un oligonucleótido sintético, o derivarse directa o indirectamente de un ácido nucleico natural.

En una realización, el cebador de ácido nucleico es un cebador de ADN.

Los nucleótidos precursores normales de ADN son los trifosfatos de desoxirribonucleótidos dATP, dCTP, dGTP, y dTTP. En ciertas circunstancias limitadas, también se pueden usar e incluir en la reacción trifosfatos de didesoxinucleótidos. Por lo tanto, los posibles precursores normales también incluyen ddATP, ddCTP, ddGTP y ddTTP.

Preferiblemente, los nucleótidos precursores de ADN se seleccionan de dATP, dCTP, dGTP y dTTP.

Se puede usar cualquiera de diversas polimerasas de ácidos nucleicos en la GMA. Cuando se usa un molde de ADN se usa una ADN polimerasa. Cuando se usa un molde de ARN es necesaria una ADN polimerasa que puede utilizar un molde de ARN, típicamente tal enzima es la transcriptasa inversa. Típicamente, se usan dos clases de ADN polimerasas, dependiendo de si es necesario el desplazamiento o la digestión del ácido nucleico en 3' del cebador que se elonga. Cuando es necesario el desplazamiento de la cadena, que genera por tanto fragmentos desplazados, se usa una ADN polimerasa que no tiene actividad de exonucleasa 5'-3'. Por contraste, cuando se usa una ADN polimerasa con actividad exonucleasa 5'-3', el ADN en dirección 3' es degradado en cada ciclo de la reacción GMA. Esto también conduce a la generación de un producto detectable, como se discute adicionalmente más adelante.

Existen varios nucleótidos precursores modificados conocidos que, cuando se incorporan al ADN, se convierten en un sustrato para una ADN glicosilasa y/o son reconocidos por una 3'-endonucleasa, según corresponda. En el segundo caso, el nucleótido precursor modificado dirige la escisión por una enzima 3'-endonucleasa en un enlace fosfodiéster en 3' del sitio de su incorporación.

En cada caso la escisión es dependiente de la presencia de la base modificada en el ADN, y es esto lo que impone la escisión del ADN e impone la localización de la escisión, en una de dos formas, a saber, 1) corte de la base modificada mediante la glicosilasa y escisión del subsiguiente sitio abásico o 2) escisión del cebador de ácido nucleico elongado en el segundo enlace fosfodiéster de la parte 3' del sitio de incorporación de la base modificada mediante una enzima 3'-endonucleasa. En una realización, el precursor de ácido nucleico modificado es dUTP.

El nucleótido precursor modificado dUTP es un fosfato de hidrato de carbono con base que comprende la base uracilo y un resto de fosfato de hidrato de carbono. La elongación del cebador sobre un molde usando los nucleótidos precursores dATP, dCTP, dGTP, y dUTP en lugar de dTTP, da como resultado ADN recién sintetizado complementario con el molde, en el que la timina está completamente sustituida por uracilo.

Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que se pueden usar también otros precursores modificados de ácidos nucleicos, tales como dITP y 8-OH dGTP.

El nucleótido precursor modificado dITP es un fosfato de hidrato de carbono con base que comprende la base hipoxantina y un resto de fosfato de hidrato de carbono. El nucleótido precursor modificado 8-OH dGTP es un fosfato de hidrato de carbono con base que comprende la base 8-OH guanina y un resto de fosfato de hidrato de carbono.

Cuando se incorporan los precursores de sustrato de glicosilasa dUTP, dITP y 8-OH dGTP en el ADN generan las bases sustrato de glicosilasa uracilo, hipoxantina y 8-OH guanina, respectivamente.

En una realización, la ADN glicosilasa es uracil ADN glicosilasa (UDG).

El uracilo en el ADN es reconocido específicamente por UDG y liberado del ADN. UDG también reconoce otras bases relacionadas con uracilo cuando están presentes en el ADN.

Se han descrito muchas ADN glicosilasas. Estas enzimas escinden el enlace N-glicosídico que conecta la base sustrato de la glicosilasa al esqueleto de ADN. Esto libera la base del ADN y genera un sitio abásico.

Otras ADN glicosilasas adecuadas incluyen alquilpurina ADN glicosilasas (ADG) o formamidopirimidina ADN glicosilasa (FPG).

La hipoxantina es reconocida de forma específica por alquilpurina ADN-glicosilasas (ADG) y liberada del ADN. Esta enzima también reconoce y libera N3 metiladenina, N3 metilguanina, O2 metilcitosina y O2 metiltimina cuando están presentes en el ADN. La 8-OH guanina es reconocida de forma específica por FPG ADN-glicosilasas y liberada del ADN. Esta enzima también reconoce y libera purinas de anillo abierto cuando están presentes en el ADN.

Se conocen diversos agentes que escinden los enlaces fosfodiéster en los ácidos nucleicos en sitios abásicos. La escisión del enlace puede ser en 5' del sitio abásico o en 3' del sitio. La escisión en 5' puede darse de forma proximal o distal al resto fosfato y generar un fragmento en 5' que tiene un extremo 3' con un grupo 3' OH libre o con un grupo 3'-fosfato, respectivamente. Los extremos 3'-OH son elongables por ADN polimerasas sobre un molde, mientras los extremos 3'-fosfato no son elongables. Tales extremos 3'-fosfato se pueden hacer elongables en general mediante tratamiento con una enzima fosfatasa, tal como polinucleótido quinasa de T4, que tiene una actividad 3' fosfatasa. Los agentes que escinden en 5' del resto fosfato y generan un extremo 3' con un 3'-OH libre son las enzimas con actividad AP endonucleasa, tales como AP endonucleasa IV de E. coli. Los agentes que escinden en 3' del resto de fosfato y generan un extremo 3' con un grupo 3'-P son los álcalis, calor y ciertas enzimas de reparación del ADN, tales como FPG y proteínas y péptidos básicos. Los agentes que escinden en 3' del sitio abásico incluyen calor, y enzimas reparadoras del ADN con actividad AP liasa, tales como endonucleasa III de E. coli. Tal extremo 3'-desoxirribofosfato (dRp) se puede hacer elongable en general mediante tratamiento con una AP endonucleasa. La FPG-ADN glicosilasa escinde tanto en 5' como en 3' del sitio abásico.

Preferiblemente, el ácido nucleico elongado se escinde en el sitio abásico por medio de una enzima que escinde en un sitio abásico de un ácido nucleico.

Además, preferiblemente, la enzima es una AP endonucleasa, especialmente AP endonucleasa IV, que escinde en 5' del sitio abásico y genera un extremo 3'OH libre.

Cuando el cebador elongado es escindido por una 3'-endonucleasa, la escisión del cebador elongado por tal enzima es dependiente de la presencia de una base modificada en el cebador elongado, y la escisión sucede en un enlace fosfodiéster en la parte 3' (es decir, en dirección 3') del sitio de incorporación de la base modificada. En contraste con la acción de la glicosilasa y la escisión del sitio AP, la escisión del cebador elongado por la 3'-endonucleasa no implica la escisión de la base modificada y no implica la creación de un sitio abásico. La escisión por la 3'-endonucleasa es dependiente de la presencia de una base modificada en el cebador elongado, y del reconocimiento de dicha base modificada por la enzima. La escisión sucede normalmente en el segundo enlace fosfodiéster del lado 3' de la base/nucleótido modificado. Esta escisión da como resultado la generación de una mella en la cadena de ADN, con la generación de un 3'-OH y un grupo 5'-fosforilo. La ADN polimerasa presente en la reacción puede elongar entonces a partir del grupo 3'OH libre. Como se mencionó anteriormente, la 3'-endonucleasa puede ser la endonucleasa V de Escherichia coli. La endonucleasa V reconoce diversas bases modificadas en el ADN, que incluyen residuos de uracilo, hipoxantina (inosina) y urea. Además de la escisión del ADN con bases modificadas, la endonucleasa V también puede escindir ADN que contiene sitios abásicos. Por lo tanto, en ciertas circunstancias, se podría usar endonucleasa V para escindir el cebador elongado en combinación con la acción de una ADN glicosilasa que genera un sitio abásico en el ADN.

En una realización, el nucleótido precursor modificado sustituye parcialmente a uno de los nucleótidos precursores normales.

Por ejemplo, la elongación del cebador sobre un molde usando los nucleótidos precursores dATP, dCTP, dGTP y dTTP además del nucleótido precursor modificado dUTP da como resultado ADN recién sintetizado complementario con el molde en el que la timina está sustituida aleatoriamente por uracilo. El uracilo se incorpora en la cadena de ADN recién sintetizada en posiciones complementarias a los residuos de adenina de la cadena de ADN molde durante el proceso de síntesis de ADN. Así, los fragmentos desplazados en dirección 3' están delimitados por la posición de la incorporación aleatoria de dUMP en el ADN recién sintetizado. Esto da como resultado la generación de fragmentos desplazados de tamaños múltiples según las permutaciones de incorporación de dUTP respecto de dTTP en la cadena complementaria frente a los residuos de A de la cadena de ácido nucleico molde.

Una aproximación similar que sustituye dITP por dGTP ó 8-OH dGTP por dGTP conduce a la sustitución de todo o parte del dGTP en el ADN recién sintetizado complementario al molde por hipoxantina ó 8-OH guanina, respectivamente, en posiciones complementarias a residuos de citosina de la cadena de ADN molde. La sustitución completa o parcial de uno o más de los precursores de ADN normales con uno o más nucleótidos terminadores didesoxi (un nucleótido que impide la elongación adicional de un cebador sobre un molde una vez que se incorpora) se puede usar para terminar la elongación del cebador por una ADN polimerasa cuando se desee. La sustitución de parte de uno o más de los precursores de ADN normales con uno o más nucleótidos terminadores didesoxi termina la elongación del cebador en múltiples posiciones diferentes sobre la cadena molde, y genera cebadores terminados de múltiples longitudes diferentes. La sustitución completa de uno o más de los precursores de ADN normales con uno o más nucleótidos terminadores didesoxi termina la elongación del cebador en posiciones específicas sobre la cadena molde, y genera cebadores terminados de longitudes específicas. Se puede usar más de un nucleótido precursor modificado en la GMA con una o más ADN glicosilasas. Se pueden usar dos ADN glicosilasas, de las que una libera una base modificada del cebador mientras la otra libera la base modificada una vez incorporada en el ADN recién sintetizado.

Las etapas i) y ii) o i)-iii), según corresponda al método según la invención, pueden continuar de manera cíclica hasta que uno de los reactivos se hace limitante.

El método según la invención se puede llevar a cabo en condiciones isotérmicas.

Por lo tanto, cuando el método es isotérmico, no es necesario el termociclado.

El método según la invención es la única reacción de amplificación isotérmica capaz de amplificar segmentos de ADN múltiples, recién sintetizados y discretos en una reacción de elongación de cebador usando un único cebador.

Se apreciará que el método según la invención puede dar como resultado la acumulación de fragmentos monocatenarios desplazados en dirección 3' de ácido nucleico especificados por las localizaciones de las bases modificadas en una cadena complementaria de ácido nucleico.

Así, el método según la invención proporciona un medio para generar múltiples copias de cebadores monocatenarios discretos en dirección 3' de un cebador iniciador. Esto ofrece una especificidad excepcional para su uso en detección, ya que los cebadores discretos de 3' se pueden generar solamente si el ácido nucleico molde de interés está presente. Así, para diagnóstico de ADN, GMA es una mejora significativa sobre cualquier método de amplificación previamente descrito con respecto a la especificidad.

La amplificación de múltiples segmentos de ADN a partir de una única muestra molde es sumamente deseable, y actualmente es una limitación para las técnicas de amplificación. Esta limitación surge en gran medida del hecho de que las técnicas existentes usan la amplificación exponencial y/o son más aparatosas y generan producto bicatenario o un producto monocatenario de gran tamaño.

El método según la invención ofrece ventajas significativas sobre los métodos existentes para la amplificación de forma múltiple de segmentos de ADN.

El método según la invención se puede usar para generar múltiples copias de cebadores monocatenarios discretos en dirección 3' de un cebador iniciador de ácido nucleico.

Los fragmentos desplazados de 3' se pueden elongar en una reacción secundaria.

Además, los fragmentos desplazados en 3' se pueden elongar sobre un ácido nucleico molde secundario.

Además, se pueden inmovilizar múltiples moldes secundarios sobre un chip de ADN.

Estos aspectos de la invención se describirán adicionalmente a continuación.

El método según la invención se puede usar en diagnóstico de detección. Así, por ejemplo, el método se puede usar en la detección de patógenos.

El método según la invención se puede usar también en la detección de la presencia o ausencia de mutaciones y en la detección de polimorfismos.

Se apreciará que el método según la invención se puede usar en la cuantificación de la concentración de un ácido nucleico en una muestra.

El método GMA según la invención se puede medir tanto cualitativamente como cuantitativamente por diversos medios. Por lo tanto, las características y la cantidad de un CI y/o su sitio complementario de hibridación sobre un ácido nucleico molde se puede analizar mediante la capacidad del CI para cebar una reacción GMA sobre ese molde. La resolución conseguida según la invención, si se desea, puede ser tan alta como para determinar diferencias en una única base entre CIs y/o el molde o el ácido nucleico de interés, y esto se basa en el cebado eficaz de una reacción GMA. Ya que el CI se puede derivar directa o indirectamente de un ácido nucleico natural, y la GMA permite la caracterización cualitativa y cuantitativa del CI, se puede usar la GMA para caracterizar cualitativamente y cuantitativamente ácidos nucleicos. Esto tiene gran utilidad en los campos de la detección, diagnóstico y cuantificación de ácidos nucleicos. Esto incluye, por ejemplo, la detección y cuantificación de microorganismos patógenos, como ciertas bacterias y virus, la detección de sus variantes, la detección de mutaciones causantes de enfermedades humanas, la detección de polimorfismos de nucleótido único y la cuantificación de la cantidad/título de especies de ARNm específicas en muestras de tejidos.

El método según la invención tiene ventajas significativas sobre las técnicas existentes en el área de la cuantificación. Como la cinética de GMA es lineal, la reacción GMA es más fácil de detectar y de medir/cuantificar que las técnicas de amplificación existentes con cinéticas exponenciales.

El método según la invención también tiene ventajas significativas sobre las técnicas existentes en el área del control de contaminaciones. La razón de esto es que, a diferencia de las técnicas existentes, GMA en su formato básico no sintetiza nuevos moldes para uso posterior por los cebadores iniciadores, y la cinética del proceso es
lineal.

El método según la invención también se puede usar en amplificación de señales de cualquier ácido nucleico que pueda funcionar como un cebador o molde.

El método según la invención tiene ventajas significativas sobre las técnicas existentes, ya que permite la amplificación de señales a partir de un cebador iniciador que usa un único molde lineal. La GMA no incorpora el cebador iniciador en los fragmentos desplazados de 3' amplificados. Esto ofrece la ventaja de que los fragmentos desplazados de 3' no tienen una cola 5' que es siempre el cebador iniciador. Además, esto significa que los fragmentos desplazados de 3' se pueden elongar en una reacción secundaria para producir fragmentos desplazados de 3' complementarios desprovistos de secuencias complementarias para el cebador iniciador.

El método según la invención es único en cuanto a que se puede llevar a cabo en un único recipiente de reacción, en el que la elongación de un CI sobre un molde genera y amplifica nuevos cebadores que son distintos del CI, y que posteriormente pueden servir como CIs sobre el mismo molde del que se derivaron o sobre un molde distinto.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama de flujo de una realización del método según la invención como se describe, entre otros, en el Ejemplo 1; y

La Fig. 2 es un diagrama de flujo de otra realización del método según la invención como se describe en el Ejemplo 4.

Una realización de la invención se ilustra con referencia a la Fig. 1 como sigue:

Evento 1

El cebador se une a una secuencia complementaria en el molde;

Evento 2

Una vez unido, el extremo 3'OH libre del cebador es elongado por la ADN polimerasa. Esto ocurre por medio de la polimerización de los nucleótidos precursores en el extremo 3'OH del cebador. Los nucleótidos precursores (dATP, dCTP, dGTP y/o dTTP) se incorporan en el cebador en elongación, además del nucleótido precursor modificado, según la secuencia del molde. El nucleótido precursor modificado sustituye normalmente de forma total o parcial a uno de los nucleótidos precursores normales. La cadena de ADN recién sintetizada es complementaria al molde inicial, y aquí se denomina cadena molde complementaria;

Evento 3

Una vez que el nucleótido precursor modificado se incorpora en el ADN recién sintetizado, ese ADN contiene entonces una base modificada que es un sustrato para la ADN glicosilasa específica. Por lo tanto, cada vez que aparece una base modificada en el ADN recién sintetizado, se libera del ADN mediante escisión del enlace N-glicosídico que une esa base al resto de desoxirribosa del ADN. Esto da como resultado la producción de un sitio abásico, que es esencialmente un resto de desoxirribosa unido al ADN flanqueante por medio de un enlace fosfodiéster en la parte proximal y distal (es decir, en 5' y 3' del resto de desoxirribosa, con el enlace de 5' que es el más cercano al cebador original); y

Evento 4

El sitio abásico es, por ejemplo, un sustrato para la enzima AP endonucleasa (APE). Por consiguiente, cada vez que aparece un sitio abásico, es escindido por APE. Esta enzima escinde el enlace fosfodiéster de 5' del resto de desoxirribosa y genera un extremo 3'OH libre en el segmento de ADN de 5' y un resto de desoxirribosa unido al extremo 5' del segmento de 3'.

Evento 5

La ADN polimerasa presente en la reacción sintetiza ADN nuevo a partir de este extremo 3'OH recién generado del fragmento de 5' cada vez que se crea, y al hacerlo, desplaza el ADN en dirección 3' de la polimerización como una cadena simple. Esto da como resultado la incorporación de nuevos nucleótidos precursores, que incluyen nucleótidos precursores modificados, en la cadena molde complementaria recién sintetizada, y la aparición de una nueva base modificada en cada posición de la cadena recién sintetizada opuesta a su base complementaria en el ácido nucleico molde.

Así, las etapas de reacción i) a iii), según esta realización, se dan de forma cíclica continuamente hasta que uno de los reactivos se hace limitante.

Cada extremo 3'OH libre creado en un ciclo de la reacción es elongado una vez en cada ciclo posterior de la reacción, con el desplazamiento concomitante de los segmentos de ADN de 3'. Como la reacción es continua, el resultado neto es la síntesis repetida de ADN nuevo a partir de cada extremo 3'OH creado, y la acumulación del ADN desplazado de 3' en forma de fragmentos monocatenarios discretos de tamaños discretos, denominados aquí fragmentos desplazados de 3', o fragmentos desplazados, delimitados por las localizaciones de las bases modificadas en la cadena complementaria y/o el extremo 3' debido a la terminación de la síntesis de ADN por la polimerasa.

Los cebadores que se elongan y se escinden pueden ser reelongados inmediatamente por la polimerasa mediante la incorporación de nucleótidos que incluyen nucleótidos precursores modificados. Ya que los nucleótidos precursores normales, los nucleótidos precursores modificados, la polimerasa, la glicosilasa y los agentes de escisión están todos presentes de forma simultánea en la misma reacción, un ciclo continuo de elongación y escisión da como resultado la amplificación de múltiples copias de fragmentos desplazados de 3'.

Cuando el nucleótido precursor modificado es dUTP, entonces la base modificada es uracilo y la ADN glicosilasa específica, en su caso, es uracil ADN glicosilasa. Por lo tanto, los fragmentos desplazados de 3' están delimitados o definidos por las localizaciones de uracilo en la cadena complementaria, y por lo tanto por la localización de las bases de adenina en el ácido nucleico molde, ya que uracilo forma un par de bases de Watson-Crick normal con
adenina.

Por lo tanto, brevemente, el cebador se une al molde y es elongado por la ADN polimerasa. Se incorporan desoxiATP, dCTP, dGTP, y dUTP al cebador en elongación. La uracil ADN glicosilasa corta después las bases de uracilo en la cadena recién sintetizada, y los sitios abásicos resultantes son escindidos por la enzima AP endonucleasa.

De forma alternativa, la 3'-endonucleasa reconoce uracilo en la cadena recién sintetizada y escinde la cadena en el segundo enlace fosfodiéster en 3' del resto de uracilo.

La ADN polimerasa comienza entonces a sintetizar nuevo ADN a partir de los extremos 3'OH recién sintetizados cada vez que se crean, y desplaza el ADN de 3' al avanzar la polimerización. Esto da como resultado otra vez la incorporación de más uracilo en el ADN recién sintetizado, que es posteriormente cortado y/o reconocido, el ADN se escinde y la polimerización se inicia a partir del nuevo extremo 3'OH.

La GMA puede llevarse a cabo a temperaturas mesófilas o termófilas. Se puede usar una ADN polimerasa tal como el fragmento Klenow exo^{-} de la ADN polimerasa de E. coli a temperaturas mesófilas (normalmente entre 25ºC y 42ºC, y típicamente a 37ºC), mientras a temperaturas termófilas (típicamente entre 50ºC y 80ºC, aunque pueden ser superiores) se puede usar las ADN polimerasas termoestables tales como una ADN polimerasa desplazante de cadena de Thermus aquaticus (fragmento Stoffel). Ambos tipos de polimerasa se pueden añadir conjuntamente o de forma secuencial a una reacción. Cuando es necesario un elevado grado de procesamiento, de forma que un cebador se elonga hasta una longitud considerable antes de que la polimerasa se disocie del ADN, se puede usar una polimerasa de gran capacidad de procesamiento. Por contraste, cuando es necesario un grado de procesamiento bajo, de forma que un cebador se elonga hasta una longitud corta antes de que la polimerasa se disocie del ADN, se puede usar una polimerasa de baja capacidad de procesamiento. Cuando se usa un molde de ARN se puede usar una transcriptasa inversa con actividad de desplazamiento de cadena para la reacción GMA.

En el caso más simple, se proporciona un cebador artificial o sintético como CI para cebar la reacción GMA sobre un molde o ácido nucleico de interés dado. El CI se elige de forma que hibrida con una secuencia específica de interés en el molde. Después de la hibridación del CI, la GMA se inicia y el CI elongado se elonga de forma repetida en la reacción cíclica, lo que da como resultado la amplificación de los fragmentos de ADN desplazados de 3'. Estos fragmentos desplazados se pueden caracterizar de forma cualitativa y cuantitativa mediante múltiples aproximaciones diferentes según procedimientos publicados.

La detección directa de los fragmentos desplazados se puede conseguir mediante una diversidad de medios, por ejemplo, se pueden marcar de forma adecuada.

El marcado de los fragmentos desplazados se puede realizar mediante una diversidad de medios, que incluyen la adición de un ligando radiactivo, fluorescente o detectable a los fragmentos durante o después de la síntesis. El uso de un nucleótido precursor marcado en cualquiera de las reacciones de extensión facilita la detección de estos fragmentos. Los métodos de tinción de ADN directos, tales como tinción con plata o bromuro de etidio, facilitan su detección después de la separación por tamaño basada en la movilidad electroforética. La hibridación de ácidos nucleicos complementarios o de prueba a estos fragmentos se puede usar para identificarlos, y tales ácidos nucleicos complementarios o de prueba pueden estar inmovilizados e hibridar directamente con los fragmentos desplazados. En este contexto, las macromatrices de ADN, micromatrices de ADN y chips de ADN son muy adecuados. De forma alternativa, los fragmentos desplazados pueden servir como una molécula de hibridación que actúa de puente, de forma que un ácido nucleico de prueba, que puede estar inmovilizado, se hibrida con parte de un fragmento desplazado y un segundo ácido nucleico de prueba o indicador hibrida con el resto del fragmento desplazado. Una vez más, las macromatrices de ADN y las micromatrices de ADN son también muy adecuadas en este contexto.

Los ácidos nucleicos complementarios o de prueba se pueden marcar de forma adecuada mediante cualquiera de una diversidad de aproximaciones de marcado directas o indirectas, tales como métodos de tinción fluorescente indicador-apagador. Ya que los fragmentos desplazados son monocatenarios, la hibridación con moléculas complementarias creará ácidos nucleicos bicatenarios que se pueden detectar usando sondas específicas de moléculas bicatenarias, tales como SYBR Green. Esto se puede conseguir en la reacción GMA según la invención incluyendo ADN complementario a los fragmentos desplazados además del reactivo SYBR Green, que se une específicamente a ADN bicatenario.

La secuencia de los fragmentos desplazados y, en particular, su extremo 3' se puede determinar por su capacidad para funcionar como cebadores iniciadores en una reacción GMA posterior o en la misma. Esencialmente, tal determinación se basa en la capacidad de estos fragmentos, y particularmente de su extremo 3', para hibridar con una secuencia complementaria seleccionada sobre un molde en condiciones seleccionadas, y para funcionar como un CI en una reacción GMA secundaria. Se apreciará que existen múltiples posibilidades para la selección de las secuencias complementarias en un molde y en las propias moléculas molde. Sin embargo, la capacidad de un fragmento desplazado para funcionar como un CI por sí mismo en una reacción GMA es una medida de su hibridación, o falta de hibridación, con una secuencia de interés seleccionada, y así la determinación de la naturaleza de la secuencia de todo o parte del fragmento desplazado se basa en esto.

La detección del fragmento desplazado es sumamente ventajosa desde el punto de vista de la especificidad, ya que su generación es dependiente de a) la hibridación satisfactoria del CI con el molde de interés y b) el cebado de una reacción GMA sobre el molde correcto. Así, la detección del fragmento desplazado anticipado es la prueba de que el CI ha hibridado con la región correcta sobre el molde correcto.

La identidad o secuencia del fragmento desplazado se puede determinar usando una diversidad de aproximaciones, que incluyen la hibridación, medida de masas, y su capacidad para ligarse directamente a un ácido nucleico o su capacidad para actuar como la cadena complementaria necesaria para la ligadura de una o más moléculas de ácido nucleico. Por ejemplo, se puede detectar y caracterizar analizando su capacidad para servir como una molécula de hibridación que actúa de puente para la ligadura del extremo 5' y 3' de un ADN lineal de prueba para formar un círculo. El fragmento desplazado hibridado, o un cebador adicional, puede servir entonces como un CI para una reacción GMA sobre el nuevo molde circular, que da como resultado la amplificación del ADN mediante un mecanismo de replicación por círculo rodante (RCR).

También se debería notar que, además de actuar como un CI, un fragmento desplazado en 3' puede actuar también como molde en una reacción GMA posterior.

Existen muchos métodos mediante los cuales se puede generar un CI. En todos los casos el CI aportado o generado debe tener un extremo 3'OH libre, de forma que puede cebar la etapa posterior de polimerización de ADN.

La síntesis artificial de un CI permite numerosas posibilidades con respecto a la síntesis, diseño y modificación del CI. Se han descrito previamente muchas modificaciones diferentes de cebadores sintetizados de forma artificial. Estos incluyen modificaciones de la base, hidrato de carbono y enlace fosfodiéster, e incluyen aquellas por las que se incorporan en el cebador bases sustrato para la glicosilasa tales como uracilo, hipoxantina y 8-hidroxiguanina.

Típicamente, se sintetiza un CI estándar o modificado para emparejar específicamente todo o parte de su secuencia complementaria sobre el ácido nucleico molde. Está bien establecido que la complementariedad entre las bases en el extremo 3' de un cebador potencialmente elongable y el molde es uno de los parámetros clave que determina si el CI se elongará sobre ese molde. Un CI que es totalmente complementario a una sección del molde puede ser elongado por una ADN polimerasa, mientras un CI que es totalmente complementario a una sección del molde excepto por la base de su extremo 3' no es elongado en condiciones rigurosas. Así, se apreciará que la elongación de un CI sobre un molde se puede usar para diferenciar entre CIs estrechamente relacionados que se diferencian solamente por una única base. De forma similar, se apreciará que se puede usar la elongación de un CI sobre un molde para diferenciar entre moldes estrechamente relacionados que se diferencian solamente por una única base. Esta aproximación es de particular importancia en el campo de la genética humana, en el que permite la detección de mutaciones y polimorfismos tales como los polimorfismos de nucleótido único (SNPs).

Está bien establecido que la rigurosidad de las condiciones de hibridación entre el CI y un molde se pueden variar de forma considerable. Las condiciones de baja rigurosidad permiten la hibridación poco específica entre las moléculas de ADN. Así, en condiciones de baja rigurosidad, las moléculas de ADN que son parcialmente complementarias pueden hibridar entre sí. Por lo tanto, en tales condiciones un CI parcialmente complementario podría hibridar con un molde. En tales condiciones, un único CI puede hibridar y ser elongado en uno o más sitios parcialmente complementarios sobre un ácido nucleico molde. Cuando las condiciones de rigurosidad son tan bajas que el cebado ocurre en múltiples sitios, el proceso se denomina cebado aleatorio (aunque el cebado no es enteramente aleatorio, ya que normalmente es necesario un emparejamiento significativo entre las cinco bases más hacia 3' del CI y el molde). Al incrementarse la rigurosidad, la hibridación se hace cada vez más específica, y se pueden hallar fácilmente las condiciones de hibridación que permiten solamente la hibridación de un cebador completamente complementario, pero que excluyen la hibridación de un cebador parcialmente complementario incluso si solamente se diferencia por una única base. Durante la hibridación, hay varios parámetros mediante los cuales se puede alterar la rigurosidad de la hibridación, tales como la temperatura. Al incrementar la temperatura, la rigurosidad de la hibridación se incrementa. Por lo tanto, en procesos enzimáticos que son dependientes de la hibridación entre moléculas de ADN, se puede conseguir una especificidad superior a temperaturas superiores. Sin embargo, el proceso enzimático a la temperatura superior necesita normalmente enzimas termoestables.

El CI se puede generar después de la escisión de un cebador sintetizado artificialmente o de un ácido nucleico natural de forma que se produce un nuevo extremo 3'OH libre. La escisión puede ser dependiente de estructura monocatenaria o bicatenaria, dependiente de la presencia de una base modificada en el contexto de una estructura monocatenaria o bicatenaria, dependiente de la secuencia, dependiente de la presencia de un emparejamiento incorrecto de bases, o dependiente de la presencia de una estructura específica. Así, se puede generar un cebador por medio de la escisión mediada por glicosilasa de una sonda que alberga una base modificada que es reconocida por una glicosilasa específica en el contexto de una estructura monocatenaria o bicatenaria. También se puede generar un CI mediante escisión de una sonda que alberga una base emparejada de forma incorrecta que es reconocida por una endonucleasa o glicosilasa específica de emparejamientos incorrectos en el contexto de una estructura bicatenaria, por ejemplo cuando la sonda se hibrida al ácido nucleico molde. Esto se puede conseguir diseñando el cebador de forma que se crea un emparejamiento incorrecto de bases entre el cebador y el molde en uno o más lugares en el segmento hibridado e incubando con una o más de una diversidad de endonucleasas o ADN glicosilasas que previamente se ha demostrado que escinden específicamente en emparejamientos incorrectos de bases en ácidos nucleicos bicatenarios. Estas incluyen endonucleasa I de T7, MutY ADN glicosilasa, ADN glicosilasa de emparejamientos incorrectos de timina y endonucleasa V.

Se puede generar también un CI por medio de la escisión de un complejo formado mediante la hibridación de sondas de oligonucleótidos solapantes usando una enzima específica de estructura, tal como una cleavasa.

Se puede sintetizar un cebador con un extremo 3' bloqueado de forma que la elongación del cebador no es posible a menos que el grupo bloqueante se libere por medio de la escisión del cebador. Tal cebador se denomina aquí cebador bloqueado en 3'. Un extremo 3' bloqueado de un cebador se puede conseguir mediante varios métodos, que incluyen fosforilación en 3', incorporación de un didesoxi nucleótido en el extremo 3', sintetizar el cebador con un grupo 3'-amina o 3'-tiol, sintetizar el cebador con uno o más nucleótidos invertidos en el extremo 3', o escindir un sitio abásico con una ADN liasa.

Por lo tanto, en una realización de la invención, se puede sintetizar un cebador con un extremo 3' no complementario (es decir, no complementario para el molde en su extremo 3') de forma que la elongación del cebador no es posible a menos que se libere el extremo 3' por medio de la escisión del cebador.

Se puede sintetizar un cebador con un extremo 5' no complementario, de forma que la escisión provoca la disociación del cebador del ácido nucleico molde. El cebador disociado puede servir entonces como un CI en una reacción GMA sobre un molde diferente.

La escisión de un cebador de forma que se desbloquee un cebador bloqueado en 3', y que se libere un extremo 3' no complementario o un extremo 5' no complementario, se puede hacer dependiente de la hibridación del cebador en todo o en parte de un ácido nucleico molde de forma que después de la escisión se crea un nuevo CI con un nuevo extremo 3'OH libre, lo que permite la elongación del CI sobre el mismo molde o sobre uno distinto. La escisión del cebador hibridado en este caso, de forma que se puede elongar sobre un molde, necesita que el cebador se escinda en uno o más lugares en el segmento hibridado de ese cebador. Esto se puede conseguir diseñando un cebador que contiene la base modificada hipoxantina, que es un sustrato para la 3-alquilpurina ADN glicosilasa (p.ej. AlkA).

En una realización adicional de la invención, que usa agentes de escisión termoestables, es posible escindir un cebador hibridado en una base modificada o emparejada de forma incorrecta de manera que una vez que la sonda se ha escindido, los dos o más fragmentos se hacen inestables térmicamente y se eliminan del ácido nucleico de interés, permitiendo por ello que otro cebador de tamaño completo hibride. Este proceso oscilante amplifica la señal (generación incrementada del cebador escindido). El producto escindido con un extremo 3'OH puede servir entonces como un CI en una reacción GMA posterior o acoplada.

También se puede generar un CI mediante escisión de un cebador en una base modificada, en el que tal escisión es dependiente de la elongación del cebador sobre un molde. Esto permite la generación de un CI más pequeño que el cebador original y que se puede caracterizar de diversas maneras. Por ejemplo, la uracil ADN glicosilasa de E. coli no liberará uracilo de la última o penúltima posición en 3' de un cebador. Sin embargo, si el cebador se extiende sobre un molde, el uracilo que estaba en la última o penúltima posición en 3' del cebador está entonces más lejos del extremo 3' del ácido nucleico recién sintetizado, y por lo tanto será liberado. Así, se genera un cebador con un extremo 3'OH libre y una o dos bases más corto que el cebador original, y por lo tanto es un CI para una reacción GMA posterior.

Se puede generar un CI a partir de un ácido nucleico natural o amplificado mediante escisión enzimática o química total o parcial con agentes de escisión de ADN o ARN, tales como ADNasas, ARNasas, endonucleasas de restricción, ADN glicosilasas después de la conversión de una base de ADN normal a una base sustrato de glicosilasa o la incorporación de dicha base durante la amplificación, AP endonucleasas después de la despurinación o despirimidinación parcial o total del ADN, enzimas que escinden ARN o ADN en híbridos ARN:ADN, tales como ARNasa H y enzimas que escinden en emparejamientos incorrectos del ADN formados después de la desnaturalización y rehibridación de moléculas híbridas de ácido nucleico, tales como híbridos ARN:ADN e híbridos ADN:ADN. La escisión enzimática o química del ADN o del ARN puede generar extremos 3' que no son elongables por ADN polimerasas. Tales extremos 3' se pueden hacer elongables en general mediante tratamiento con una o más enzimas, tales como AP endonucleasa IV o polinucleótido quinasa de T4 que tiene una actividad de 3' fosfatasa. Está bien establecido que los agentes de escisión pueden ser específicos de estructura bicatenaria, monocatenaria o de secuencia. Un ácido nucleico bicatenario o monocatenario puede escindirse en fragmentos pequeños bicatenarios o monocatenarios, respectivamente, usando uno o más agentes de escisión antes de GMA. Esto proporciona un medio para restringir el tamaño de los fragmentos desplazados.

La escisión o la formación de mella en una cadena de una molécula doble proporciona una sección de ácido nucleico con un extremo 3'OH libre que puede funcionar directamente como un CI sobre el molde en el que está hibridado o sobre un molde distinto en una reacción GMA. La escisión o formación de mella en una cadena de una molécula doble se puede conseguir usando ciertos agentes de escisión. El ácido nucleico se puede mellar de forma inespecífica con una pequeña cantidad de enzima nucleasa tal como ADNasa, lo que conduce a la generación de múltiples fragmentos desplazados en 3' diferentes a partir de múltiples localizaciones sobre el molde de ácido nucleico.

El ácido nucleico se puede mellar con más agentes específicos, tales como la enzima de restricción N.BstNB I, que mella el ADN cuatro bases en dirección 3' desde la parte 3' de la secuencia de reconocimiento GAGTC. De forma alternativa, el ácido nucleico se puede mellar con una enzima de restricción, por ejemplo HincII o BsoBI, que mella la cadena sin modificar de un ADN bicatenario semimodificado en un sitio de reconocimiento específico, y genera por tanto un extremo 3'OH libre. El ARN se puede escindir de forma inespecífica con ciertas ARNasas, y más específicamente con ARNasas específicas de secuencia o estructura tales como ribozimas. La ARNasaH escinde ARN en un híbrido ARN:ADN. Así, el ARN se puede escindir mediante ARNasaH después de la síntesis de un cADN sobre el híbrido de ARN mediante transcriptasa inversa. El ARN se puede escindir de forma específica mediante ARNasaH después de la hibridación de moléculas de ADN oligonucleotídicas a una o más secuencias sobre el ARN.

En particular, la adición de oligo/poli dT proporciona un medio para hacer bicatenaria la cola de poliA de 3' de las especies de ARNm. La adición de ARNasaH da como resultado la digestión de la cadena de poliA y proporciona un extremo 3' único para cada especie de ARNm. Este método proporciona un medio por el cual cada especie de ARNm en una muestra puede actuar potencialmente como un CI en una GMA.

Se puede escindir un ácido nucleico bicatenario para dejar al descubierto su extremo 3'OH libre, lo que posibilita que el ADN escindido funcione como un CI en una GMA. Por ejemplo, un ADN bicatenario se puede desnaturalizar térmicamente. De forma alternativa, se puede tratar con la exonucleasa del gen 6 de T7 que hidroliza el ADN doble en una reacción por etapas sin deslizamiento desde el extremo 5'. La enzima no es activa sobre un ADN monocatenario, y así se detiene cuando ya no hay presentes regiones dobles.

De forma importante, la escisión específica de una cadena de una molécula doble en un emparejamiento incorrecto genera un fragmento de ácido nucleico con un extremo 3'OH que puede funcionar directamente como un CI sobre el molde al cual está hibridado o sobre un molde diferente. Esto proporciona un medio para identificar mutaciones y polimorfismos en ácidos nucleicos.

A este respecto, la presente invención posibilita investigar la presencia o ausencia de una mutación o polimorfismo en un lugar específico en un ácido nucleico (locus candidato) de la siguiente manera: hibridar un cebador bloqueado en 3' al ácido nucleico de interés de forma que se genera un emparejamiento incorrecto en el locus candidato. El emparejamiento incorrecto se localiza típicamente de forma interna con respecto al cebador, es decir, que la base que crea el emparejamiento incorrecto con la base del locus candidato sobre el molde no es el residuo de base del nucleótido del extremo 5' o del extremo 3' del cebador. Al escindir el cebador en la posición del emparejamiento incorrecto con una glicosilasa específica de emparejamientos incorrectos y un agente de escisión de sitios abásicos, la sección escindida de 5' del cebador tiene un extremo 3'OH, y es por lo tanto un CI que puede iniciar entonces una reacción GMA sobre ese mismo molde o sobre un molde alternativo. Por lo tanto, la GMA resultante es indicativa de la presencia o ausencia de la mutación, lo cual depende de si se formó un emparejamiento incorrecto o no por la unión del cebador al molde y viceversa.

Además, las moléculas híbridas de ácido nucleico rehibridadas se pueden tratar con enzimas específicas de emparejamientos incorrectos tales como endonucleasa I de T7, MutY ADN glicosilasa, ADN glicosilasa de emparejamientos incorrectos de timina o endonucleasa V. Las combinaciones de amplificación génica mediante métodos de PCR, seguidos de rehibridación y escisión de ADN en emparejamientos incorrectos con una enzima de reparación específica de emparejamientos incorrectos, genera extremos 3'OH libres que pueden servir como CIs en una reacción GMA posterior sobre un molde distinto después de la disociación de su cadena complementaria.

Alternativamente, la elongación del extremo 3'OH generado en el sitio de emparejamiento incorrecto usando una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena en una reacción de desplazamiento de cadena "única" estándar, o en una reacción GMA, produce un fragmento desplazado que puede servir como CI en una reacción GMA posterior. Ya que la generación del CI es dependiente de la presencia de un emparejamiento incorrecto, el cebado de una reacción GMA es indicativo de un emparejamiento incorrecto. Cuando se usa un método de amplificación genómica completa con esta aproximación con múltiples sondas y/o múltiples moldes para la detección de fragmentos desplazados, se puede analizar la presencia de emparejamientos incorrectos en muchos productos de amplificación. Al usar sondas seleccionadas y/o moldes seleccionados, es posible localizar los emparejamientos incorrectos. Usando una matriz de sondas, esto se puede aplicar a una búsqueda genómica o a una búsqueda de múltiples ácidos nucleicos amplificados simultáneamente.

El uso de un CI degenerado en una reacción GMA proporciona un medio para cebar la GMA en múltiples sitios del molde. La degeneración del CI puede ser muy elevada y por lo tanto se puede conseguir el cebado aleatorio de un molde. En tal caso, se usa un CI tal como un hexámero aleatorio, o un cebador más largo con un hexámero aleatorio en su secuencia de 3', típicamente con un molde tal como ADN genómico. Se puede conseguir un cebado múltiple más específico con un CI con un grado inferior de degeneración.

El método según la invención se puede usar como un nuevo método de amplificación de señal proporcionado por la GMA. El CI elongado y los fragmentos desplazados creados en una reacción GMA tienen un extremo 3'OH libre y pueden funcionar como cebadores que pueden ser elongados. Usando una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena, los fragmentos desplazados producidos durante la GMA sobre un molde pueden funcionar como CIs en una reacción GMA secundaria, si está disponible un molde adecuado. Se puede proporcionar un molde en la misma reacción o en una reacción sin acoplar como medio para la amplificación de la señal. El molde proporcionado para el uso en la amplificación de señal se denomina aquí molde de amplificación de señal o molde potenciador. Esto es especialmente importante cuando la cantidad del molde original es baja, que a menudo es el caso cuando se usa ADN genómico como molde o ácido nucleico de interés en la GMA inicial. El molde potenciador se sintetiza de forma que tiene una secuencia intrínseca complementaria a cualquier cebador iniciador de interés, denominado aquí "sitio de unión de CI". Típicamente, esta secuencia es complementaria al cebador iniciador elongado o a un fragmento desplazado producido durante una reacción GMA. Típicamente, el sitio de unión del CI está en el extremo 3' del molde potenciador (el molde potenciador se lee en dirección 3' a 5' por la polimerasa que polimeriza y elonga el CI en dirección 5' a 3'). Una o más bases están presentes en dirección 5' del sitio de unión del CI en el molde potenciador que son complementarias a la base modificada usada en la reacción GMA. Típicamente, esta base es un residuo de adenina. Esto da como resultado la incorporación de una base modificada, típicamente un U, en esta posición en el CI en elongación durante la reacción GMA. La secuencia que sigue a esta posición (en 5'), denominada aquí secuencia potenciadora, está desprovista de bases complementarias con la base modificada usada en la GMA inicial. La secuencia potenciadora puede variar en tamaño y es típicamente más larga de 18 nucleótidos. Típicamente, la secuencia potenciadora tiene una modificación en 3', tal como un nucleótido invertido, para evitar el auto-cebado falso. También se puede incluir un bloqueante de síntesis de ADN en el molde potenciador en la región complementaria para el CI para evitar el auto-cebado falso. Cuando un cebador de iniciación ceba una GMA sobre el molde potenciador, genera un complemento de la secuencia potenciadora, denominado aquí secuencia potenciadora complementaria. El efecto neto de este procedimiento es que la secuencia potenciadora complementaria se copia/amplifica en gran medida, ya que el molde potenciador es típicamente no limitante, y cada CI generado puede servir potencialmente para cebar cualquier molde potenciador sin cebar en la reacción GMA. La secuencia potenciadora complementaria puede servir también como un indicador universal para uso en detección.

Para conseguir un nivel muy elevado de amplificación de señal, la secuencia potenciadora (es decir, SP#1) puede ir seguida de una o más bases que son complementarias para la base modificada en la reacción GMA. Esta secuencia potenciadora va seguida a cambio por una segunda secuencia potenciadora (SP#2). SP#2 es típicamente idéntica a SP#1. Cuando un CI ceba una reacción GMA sobre el molde potenciador, genera el complemento de SP#1 y SP#2, denominado aquí secuencia potenciadora complementaria #1 (cSP#1) y secuencia potenciadora complementaria #2 (cSP#2). cSP#1 y cSP#2 son idénticos y funcionan como CIs que ceban el molde potenciador de SP#1. También se unen a SP#2 pero son desplazados en cada ciclo de la reacción GMA. El efecto neto de esto es que cSP#2 se puede amplificar a nivel elevado y el molde potenciador es típicamente no limitante, y cada cSP#1 y cSP#2 puede servir potencialmente como cebadores iniciadores para cualquier molde potenciador sin cebar en la reacción GMA.

Hay muchas posibilidades para el diseño del molde potenciador. Si se genera cSP#1 en la reacción GMA primaria, entonces es necesario un molde potenciador solamente con las secuencias SP#1 y SP#2, separadas por una base complementaria a la base modificada, ya que la cSP#1 sirve como cebador iniciador. Se puede diseñar un molde potenciador con varios sitios de unión de CI diferentes, es decir, que permite que muchos CIs secuenciados de forma diferente se unan y ceben, seguidos por unidades de secuencias potenciadoras idénticas o distintas.

Una posibilidad adicional para detectar o monitorizar la progresión de la reacción GMA iniciada es monitorizar la actividad de ADN polimerasa. Ya que la GMA da como resultado la reextensión continua (es decir, polimerización) de fragmentos de ADN sobre un molde, hay una incorporación continua de dNMP en el ADN recién sintetizado y liberación de un resto de pirofosfato (PPi) por cada monofosfato de nucleótido incorporado. Por lo tanto, se puede usar un análisis de detección de PPi (Nyren, P. (1987) Analytical Biochemistry, 167, 235-238) para detectar o monitorizar indirectamente la actividad de GMA.

En una reacción GMA que usa los nucleótidos precursores dATP, dCTP, dGTP, dTTP además de un nucleótido precursor modificado tal como dUTP, los fragmentos desplazados que se generan son de múltiples tamaños, según las permutaciones de la incorporación de dUTP respecto de dTTP en la cadena complementaria recién sintetizada opuestos a los residuos de A de la cadena molde. Un sitio de unión de CI adecuado sobre un molde potenciador en tal caso es una secuencia que es idéntica a una sección del molde inicial que está en 5' (con respecto al molde) de donde el CI cebó inicialmente. En una secuencia de ADN, se esperaría que un dUTP o un dTTP se incorporase como media cada cuatro bases, ya que se esperaría que existiera un residuo de A en cualquier posición dada en el molde con una frecuencia de 0,25. Así, el tamaño medio esperado de un fragmento desplazado en una reacción GMA, usando dUTP en lugar de dTTP, sería de tres nucleótidos. Mientras, usando una proporción de dUTP respecto de dTTP en la que la ADN polimerasa inserta uno de los dos dNTPs con una probabilidad del 0,5, el tamaño de los fragmentos desplazados generados oscilará de un tamaño mínimo de tres nucleótidos a tamaños mayores en los que la frecuencia de generación de cualquier fragmento desplazado disminuye al hacerse mayor el tamaño del fragmento desplazado. Sin embargo, cuanto mayor es el fragmento desplazado, más rigurosa puede ser la hibridación entre el fragmento desplazado que actúa como CI y el sitio de unión del CI. Así, es deseable un sitio de unión de CI sobre el molde potenciador que es idéntico a una secuencia en 5' del sitio de unión del CI sobre el ácido nucleico molde original. Por ejemplo, si se selecciona un fragmento desplazado de forma que tiene 10 posiciones dentro de un segmento de 40 nucleótidos en el que se podría incorporar un dUTP o dTTP, es adecuado un sitio de unión de CI sobre el molde potenciador, complementario a los 40 nucleótidos del ADN desplazado.

Para la detección de SNPs o mutaciones, el CI que ceba el ácido nucleico molde se puede colocar en 3' respecto de la localización de los SNPs elegidos con respecto a la cadena molde, de forma que una permutación del fragmento desplazado generado tiene su extremo 3' definido por el sitio del SNP. En tal caso, la presencia del SNP sobre el ácido nucleico molde lleva a la generación de un fragmento desplazado con un único extremo 3'OH que no se crea si el sitio de SNP está ausente. El CI se puede elegir de forma que en una reacción GMA, usando una mezcla de un precursor normal y modificado tal como dTTP y dUTP, se genera un fragmento desplazado de un tamaño adecuado para permitir su hibridación con el sitio de unión de CI sobre el molde potenciador en condiciones restrictivas. Además, el sitio de unión de CI sobre el molde potenciador se puede diseñar de forma que solamente puede ser cebado por ese fragmento desplazado con el único extremo 3'OH definido por el sitio de SNP y el estado de ese sitio. Esto se puede conseguir diseñando el molde potenciador de forma que el residuo de adenina clave que mantiene la GMA está localizado en 5' lo suficientemente cerca sobre el molde potenciador, de forma que el extremo 3' del fragmento desplazado generado con un extremo 3'OH definido por la siguiente posición de incorporación de dUTP después del sitio de SNP sobre el molde original, está opuesto o en 5' del residuo de adenina clave del molde potenciador. Bajo condiciones de hibridación rigurosas, los fragmentos desplazados, en los que el extremo 3'OH se genera a partir de un sitio en 5' del sitio de SNP (con respecto al complemento de esa cadena que actúa como molde), no cebarán el molde potenciador, ya que no hibridarán al sitio de unión de CI.

Según una realización adicional de la invención, se puede degenerar un sitio de unión de CI de forma que puede servir como un sitio de unión para muchos cebadores iniciadores diferentes. Se pueden incluir dos o más moldes potenciadores en una reacción de GMA, de forma que la cSP generada a partir del primer molde potenciador puede servir como un cebador iniciador para el segundo molde potenciador. Esto tiene la ventaja añadida de que el segundo molde potenciador puede ser idéntico para múltiples reacciones GMA diferentes, y así puede servir como una secuencia potenciadora universal. Esto facilita un proceso optimizado único para la detección y amplificación de señal usando un único molde potenciador de punto final. Típicamente, el molde potenciador de punto final se diseñará y se sintetizará de forma que sirve directa o indirectamente como indicador para la GMA.

El CI en una reacción GMA puede desplazar un cebador elongado en dirección 3' que sirve como un CI en una reacción GMA posterior. Esto tiene usos importantes para la detección de SNP y mutaciones. Se puede colocar un cebador suficientemente cerca del sitio de SNP de forma que el primer precursor modificado incorporado está en, o distal de, el sitio de SNP. Así, el cebador se elonga hasta una longitud diferente dependiendo de si hay presente un SNP o no en el sitio. Es deseable generar múltiples copias del cebador elongado de forma diferencial para la caracterización posterior mediante cualquiera de diversos medios, que incluyen su capacidad para funcionar como un CI en una GMA posterior sobre un molde potenciador. Se pueden obtener múltiples copias del cebador elongado de forma diferencial mediante un proceso de termociclado como se describió para la reacción en cadena de la polimerasa. De forma alternativa, el cebador elongado de forma diferencial se puede desplazar de forma repetida iniciando una reacción GMA en 5' de este cebador (es decir, más hacia 3' en la cadena molde). Esto se puede conseguir usando un CI que hibrida en 5' del cebador localizado de forma proximal respecto del sitio de SNP y este CI inicia una reacción GMA. El cebador en 3' será elongado en la misma reacción en cada ciclo, pero también será desplazado en cada ciclo. Una vez desplazado, puede hibridar cebador nuevo y ser elongado.

Los fragmentos desplazados generados a partir de ácidos nucleicos molde y las secuencias potenciadoras complementarias generadas a partir del molde potenciador se pueden detectar en un análisis de 5’ nucleasa. Típicamente, el análisis de 5' nucleasa es un análisis que detecta un ácido nucleico específico mediante su capacidad de servir como un cebador iniciador para la síntesis de ADN sobre un molde usando una ADN polimerasa con una actividad exonucleasa 5'-3', que lleva a la degradación de una sonda que está hibridada en 3' sobre el molde. Esta degradación se basa en la presencia de una actividad exonucleasa 5'-3' en la polimerasa usada en la reacción. La sonda típica es un oligonucleótido que alberga tanto una tinción fluorescente indicadora como una tinción apagadora en estrecha proximidad. Se da un incremento en la intensidad de fluorescencia cuando el indicador y el apagador se separan/desprenden entre sí debido a la degradación de la sonda. Así, un incremento en la fluorescencia indica que la sonda ha hibridado al molde y ha sido degradada por la actividad exonucleasa de 5' a 3' de la ADN polimerasa, al elongar ésta el cebador iniciador sobre el ácido nucleico molde.

Una variación de este análisis usa una aproximación por la que la sonda es parte del molde, pero es complementaria a una sección del molde. Esto da como resultado que forme un tallo con parte del molde mediante emparejamiento de bases con su complementario sobre el ácido nucleico molde, produciendo de forma efectiva un tallo bicatenario con un extremo 5' libre y un extremo en bucle.

De forma alternativa, se puede usar una sonda autocomplementaria con un indicador en un extremo y un apagador en el otro. En este caso, la sonda forma un tallo y un bucle por medio del emparejamiento de bases que lleva al indicador cerca del apagador, de forma que la fluorescencia se apaga. La desnaturalización de la estructura del tallo y bucle en presencia de un fragmento desplazado total o parcialmente complementario o cSP permite la hibridación entre la sonda y el fragmento desplazado o cSP. Esto convierte a la sonda en bicatenaria e incrementa la distancia entre el indicador y el apagador, lo que provoca un incremento en la intensidad de fluorescencia.

La adaptación de la GMA para uso con un indicador-apagador unido proporciona un molde potenciador único que permite la detección de CI y amplificación de señal simultánea. Esencialmente, el molde potenciador se diseña con un sitio de unión de CI seguido por una secuencia autocomplementaria que pone a un indicador y un apagador unidos en estrecha proximidad a través de la formación de una estructura en tallo y bucle bicatenaria. El sitio de unión de CI y la secuencia que forma la estructura tallo - bucle están desprovistos de la complementariedad de bases para la base modificada en la reacción GMA. El sitio de unión de CI está en 3' de la secuencia tallo - bucle, y puede comprender una secuencia que es complementaria a un cebador iniciador y/o a una secuencia que es complementaria a una cSP. Una o más bases complementarias a la base modificada en la reacción GMA están presentes en 5' del tallo - bucle y van seguidas por otra secuencia complementaria a una cSP. Cuando se elonga el cebador iniciador sobre el molde potenciador indicador - apagador, el efecto neto es que el sitio de unión de CI y la sección tallo - bucle del molde potenciador se linealiza y se hace bicatenario durante la GMA por medio del desplazamiento de cadena y permanece bicatenario. La señal se amplifica por medio de la síntesis de cPSs adicionales en el extremo 5' del molde potenciador, que a cambio sirve como cebador iniciador para cualquier molde potenciador sin cebar en la reacción GMA. Cuando se linealiza el tallo-bucle y se hace bicatenario, la intensidad de fluorescencia se incrementa, y la medida de las fluorescencias funciona como una medida de la concentración de CI en la reacción.

Un método alternativo de detección de señal de acuerdo con la invención implica diseñar el molde potenciador de forma que todo o parte del fragmento desplazado es autocomplementario consigo mismo o entre otras copias de sí mismo y forma ADN bicatenario. El ADN bicatenario se puede detectar entonces fácilmente mediante la unión de sondas específicas de estructura bicatenaria, tales como SYBR Green.

El molde potenciador puede ser circular. Tal molde potenciador circular proporciona un medio para que la ADN polimerasa en elongación actúe continuamente en un formato de replicación por círculo rodante. Hay múltiples variaciones que se pueden usar con un molde potenciador circular. En su forma más simple, el molde potenciador circular puede servir como un molde para la amplificación por círculo rodante en la que un CI puede servir como iniciador de la replicación del ADN en el círculo. En tal caso, se sintetiza continuamente ADN hasta que la polimerasa o los precursores de ADN se hacen limitantes. La inclusión de tal molde potenciador en una reacción GMA necesita que el molde potenciador se diseñe de forma que no contenga ningún residuo complementario con el nucleótido precursor modificado en la reacción GMA.

Alternativamente, el molde potenciador se puede diseñar con uno o más sitios de unión de CI seguidos por un residuo que posibilita la incorporación de un precursor modificado en el CI en elongación durante la GMA. Esto puede ir seguido adicionalmente por una o más secuencias potenciadoras. Las secuencias potenciadoras pueden ir precedidas y seguidas por una o más bases que son complementarias para la base modificada en la reacción GMA. El complemento de la secuencia potenciadora, cuando se genera, sirve como un CI para cualquier molde potenciador sin cebar. El cebado de moldes potenciadores posteriores proporciona CI adicional para moldes potenciadores sin cebar adicionales, y la reacción continúa hasta que todos los moldes potenciadores se ceban y la replicación continúa hasta que uno de los reactivos se hace limitante. El efecto neto de este método es que se genera una copia lineal de todo o parte del molde potenciador en cada ciclo. La inclusión de un segundo molde potenciador complementario con una secuencia potenciadora autocebadora proporciona un medio para generar múltiples copias lineales del molde potenciador. Las copias lineales de los dos moldes potenciadores hibridarán después entre sí y generarán ADN bicatenario que se puede detectar mediante varios métodos, que incluyen agentes de unión a ADN bicatenario específicos tales como SYBR Green.

También se puede diseñar un único molde potenciador de forma que produce cSPs que emparejan sus bases entre sí, lo que genera ADN bicatenario. El molde potenciador es particularmente adecuado para esta aplicación, ya que las regiones de autocomplementariedad dentro de un círculo de ADN se pueden cebar sin la desnaturalización de los CIs que hibridan en los sitios de unión de CI que no están en la región de autocomplementariedad. Por contraste, la desnaturalización de ADN complementario lineal totalmente bicatenario es necesaria para permitir que un CI acceda a un sitio de unión de CI.

En otra realización de la presente invención, el molde potenciador o secundario se puede inmovilizar en un soporte sólido, por ejemplo, en una micro- o macro-matriz o "chip" de ADN. Se pueden movilizar múltiples moldes potenciadores o secundarios diferentes en un chip de ADN que se puede usar después para caracterizar múltiples ácidos nucleicos diferentes y múltiples reacciones GMA diferentes de una manera de alto rendimiento. En una realización preferida, se unen los moldes secundarios por medio de sus extremos 3'. Esto hace inaccesible el grupo 3'OH que de otra forma sería reactivo, y por lo tanto no puede ser elongado por una polimerasa y actúa solamente como un molde, reduciendo por ello cualquier elongación inespecífica de fondo.

Otra realización de la presente invención proporciona el uso de GMA en computación ADN. Cada vez se aprecia más que el ADN, debido a sus propiedades físicas y químicas intrínsecas, puede proporcionar una vía para la computación de soluciones para tareas matemáticas difíciles. Se apreciará que diseñando cebadores iniciadores, moldes y/o moldes potenciadores para actuar como fragmentos de información individuales o combinados, sean problemas y/o soluciones, las soluciones a problemas matemáticos se pueden computar usando la reacción GMA. Preferiblemente, los CIs y los moldes se sintetizan de forma artificial. También se apreciará que el uso de GMA en computación ADN permite operaciones simultáneas y búsquedas paralelas, y puede dar origen a un grupo completo de soluciones potenciales.

Por lo tanto, la invención proporciona el uso de un método como se describió anteriormente en computación ADN y/o como una "herramienta" en la computación ADN, denominada aquí colectivamente computación ADN.

La invención se ilustrará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Modos para llevar a cabo la invención

Se usaron diversas enzimas en los siguientes ejemplos. Algunas de estas enzimas estaban disponibles comercialmente, mientras otras se purificaron a partir de la sobreexpresión en cepas de E. coli como se describe más adelante.

UDG de Thermotoga maritima (TmaUDG)

Se amplificó el marco de lectura abierto para la proteína TmaUDG a partir de ADN genómico de T. maritima mediante PCR. El producto de PCR se insertó en el vector de sobreexpresión pBAD-TOPO según las instrucciones del fabricante (InVitrogen). Después se transformaron E. coli TOP-10 competentes (InVitrogen) con la construcción mediante choque térmico, según las instrucciones del fabricante. Las células que contenían la construcción pBAD-TOPO/TmaUDG se cultivaron hasta una DO_{600} de 0,6 (1000 ml) y se indujo la sobreexpresión mediante arabinosa añadida a una concentración final del 0,2%. Después de la incubación a 37ºC durante 4 horas, las células se lisaron y se purificó la proteína de fusión mediante cromatografía de afinidad con metal inmovilizado usando resina ProBond (InVitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se recogió una fracción de 15 ml que contenía la proteína eluida, como se consideró mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. La fracción se purificó después adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico usando resina Mono-S, y se recogieron y se almacenaron 0,5 ml de la fracción proteica eluida más concentrada después de la adición de glicerol hasta el 50% a -20ºC hasta que se necesitó.

Endonucleasa IV de Thermotoga maritima (TmaEndoIV)

Se amplificó el marco de lectura abierto para la proteína TmaEndoIV a partir de ADN genómico de T. maritima mediante PCR. El producto de PCR se insertó en el vector de sobreexpresión pBAD-TOPO según las instrucciones del fabricante (InVitrogen). Después se transformaron E. coli TOP-10 competentes (InVitrogen) con la construcción mediante choque térmico, según las instrucciones del fabricante. Las células que contenían la construcción pBAD-TOPO/TmaEndoIV se cultivaron hasta una DO_{600} de 0,6 (1000 ml), y se indujo la sobreexpresión mediante arabinosa añadida a una concentración final del 0,2%. Después de la incubación a 37ºC durante 4 horas, las células se lisaron y se purificó la proteína de fusión mediante cromatografía de afinidad con metal inmovilizado usando resina ProBond (InVitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se recogió una fracción de 15 ml que contenía la proteína eluida, como se consideró mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. La fracción se purificó después adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico usando resina Mono-S, y se recogieron y se almacenaron 0,5 ml de la fracción proteica eluida más concentrada después de la adición de glicerol hasta el 50% a -20ºC hasta que se necesitó.

Endonucleasa V de Thermotoga maritima (TmaEndoV)

Se amplificó el marco de lectura abierto para la proteína TmaEndoV a partir de ADN genómico de T. maritima mediante PCR. El producto de PCR se insertó en el vector de sobreexpresión pBAD-TOPO según las instrucciones del fabricante (InVitrogen). Después se transformaron E. coli TOP-10 competentes (InVitrogen) con la construcción mediante choque térmico, según las instrucciones del fabricante. Las células que contenían la construcción pBAD-TOPO/TmaEndoV se cultivaron hasta una DO_{600} de 0,5 (1000 ml) y se indujo la sobreexpresión mediante arabinosa añadida a una concentración final del 0,2%. Después de la incubación a 37ºC durante 8 horas, las células se lisaron y se purificó la proteína de fusión mediante cromatografía de afinidad con metal inmovilizado usando resina ProBond (InVitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se recogieron y se mezclaron 15 fracciones de 1 ml que contenían la proteína eluida, como se consideró mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Las fracciones mezcladas se purificaron después adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico usando resina Mono-S, y se recogieron y se almacenaron 0,5 ml de la fracción proteica eluida más concentrada después de la adición de glicerol hasta el 50% a -20ºC hasta que se necesitó.

Endonucleasa IV de E. coli (EcoEndoIV)

Se amplificó el marco de lectura abierto para la proteína EcoEndoIV a partir de ADN genómico de E. coli mediante PCR. El producto de PCR se insertó en el vector de sobreexpresión pBAD-TOPO según las instrucciones del fabricante (InVitrogen). Después se transformaron E. coli TOP-10 competentes (InVitrogen) con la construcción mediante choque térmico, según las instrucciones del fabricante. Las células que contenían la construcción pBAD-TOPO/TmaEndoIV se cultivaron hasta una DO_{600} de 0,6 (1000 ml) y se indujo la sobreexpresión mediante arabinosa añadida a una concentración final del 0,2%.

Después de la incubación a 37ºC durante 4 horas, las células se lisaron y se purificó la proteína de fusión mediante cromatografía de afinidad con metal inmovilizado usando resina ProBond (InVitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se recogió una fracción de 15 ml que contenía la proteína eluida, como se consideró mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Las fracciones mezcladas se purificaron después adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico usando resina Mono-S, y se recogieron 0,5 ml de la fracción proteica eluida más concentrada y se almacenó después de la adición de glicerol hasta el 50% a -20ºC hasta que se necesitó.

UDG-Tioredoxina de Archaeoglobus fulgidus (AfUDG-Tio)

Se amplificó el marco de lectura abierto para la proteína AfUDG a partir de ADN genómico de A. fulgidus mediante PCR. El producto de PCR se insertó en el vector de sobreexpresión pBAD-TOPO ThioFusion según las instrucciones del fabricante (InVitrogen). Después se transformaron E. coli TOP-10 competentes (InVitrogen) con la construcción mediante choque térmico, según las instrucciones del fabricante. Las células que contenían la construcción pBAD-TOPO ThioFusion/AfUDG se cultivaron hasta una DO_{600} de 0,6 (2000 ml) y se indujo la sobreexpresión mediante arabinosa añadida a una concentración final del 0,2%. Después de la incubación a 37ºC durante 4 horas, las células se lisaron y se purificó la proteína de fusión mediante cromatografía de afinidad con metal inmovilizado usando resina ProBond (InVitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se recogió una fracción de 15 ml que contenía la proteína eluida, como se consideró mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, y se almacenó a 4ºC hasta que se necesitó.

Ejemplo 1

Se usó el método según la invención para elongar cíclicamente un oligonucleótido de 25 unidades monoméricas (Cebador Iniciador, CI), que era complementario a una región de un oligonucleótido de 80 unidades monoméricas (ácido nucleico molde) que sirvió como molde para la reacción de polimerización. La región complementaria se extendía desde 10 bases desde el extremo 3' de las 80 unidades monoméricas hasta 35 bases desde el extremo 3' de las 80 unidades monoméricas. La región de 5' de las 80 unidades monoméricas para esta región complementaria de CI (sitio de unión de CI) se diseñó para que contuviera un número de residuos de A que en la elongación cíclica de las 25 unidades monoméricas llevaría a la producción de fragmentos de ADN de tamaños discretos después de la reacción GMA. Las 80 unidades monoméricas también se diseñaron de forma que un número específico de residuos de G estuvieran presentes entre cada residuo de A. Esto era para permitir el marcado, mediante la incorporación de \alpha^{32}P-dCTP, de los fragmentos de ADN desplazados de 3' producidos durante la reacción. Se muestra un diagrama de flujo del método en la Fig. 1. Ambos oligonucleótidos se sintetizaron de forma artificial y se purificaron mediante escisión de un gel de poliacrilamida después de la electroforesis. El objetivo era determinar si las 25 unidades monoméricas hibridaron con las 80 unidades monoméricas y si podrían ser elongadas de forma cíclica/repetida mediante el método según la invención,
lo que produciría múltiples copias de fragmentos de ADN monocatenarios marcados (fragmentos desplazados).

Antes de la adición de las enzimas, las mezclas de reacción contenían 100 fmoles de cada uno de los oligonucleótidos, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 5 mM, ditiotreitol 7 mM, 0,2 mM de cada uno de dATP, dGTP y dUTP, dCTP 0,02 mM y 0,2 \mul de \alpha^{32}P-dCTP (10 mCi/ml, \sim800 Ci/mmol) en un total de 17 \mul. Esta mezcla se cubrió con aceite mineral y se calentó a 95ºC durante 2 min. La temperatura de reacción se bajó después a 37ºC y se mantuvo a esta temperatura. Después se añadieron cinco unidades de fragmento Klenow (3' \rightarrow 5' exo^{-}), 1 unidad de uracil ADN glicosilasa de E. coli y o bien 2 unidades de endonucleasa IV de E. coli o 2 \mul de endonucleasa IV de Thermotoga maritima, por ese orden, llevando el volumen final de reacción a 20 \mul. En el caso de las reacciones de control que no contenían endonucleasa IV, y las reacciones de control que no contenían ni endonucleasa IV ni uracil ADN glicosilasa, se añadió agua para llevar el volumen final a 20 \mul. Se tomaron muestras de 5 \mul de las reacciones a intervalos de 30 min después de la adición de la endonucleasa IV. Se añadió NaOH a las muestras hasta una concentración final de 50 mM y después se calentó a 95ºC durante 15 min. Después se añadió un volumen igual de tinción de carga de formamida (98% de formamida, 0,025% de azul de bromofenol, 0,025% de xileno cianol). Después se cargaron las muestras en un gel de poliacrilamida desnaturalizante del 20% (urea 7 M) y se llevó a cabo la electroforesis para el análisis del tamaño de los fragmentos de ADN. Después de la electroforesis, el gel se expuso a una pantalla de fósforo y se escaneó la imagen posteriormente mediante un Storm (marca registrada) 860.

El análisis de la imagen demostró que las reacciones que contenían endonucleasa IV contenían un número de fragmentos de ADN marcados de diferentes tamaños más cortos de 70 bases, que se incrementaron en número con el tiempo, y que no aparecían en las reacciones de control que carecían de endonucleasa IV, o en la reacción de control que carecía tanto de endonucleasa IV como de uracil ADN glicosilasa.

Se notó que las preparaciones de endonucleasa IV de Thermotoga maritima contenían una actividad intrínseca y/o contaminante de exonucleasa 3' a 5'. Esto llevó a la amplificación de fondo inespecífica durante una reacción GMA. Para eliminar esta actividad y la amplificación inespecífica, la enzima endonucleasa IV se trató térmicamente antes de su uso en la reacción GMA. La reserva de enzima endonucleasa IV se calentó a 90ºC durante 10 min, después se puso en hielo durante \geq 5 min y posteriormente se centrifugó durante \geq 5 min. También se observó que las preparaciones de endonucleasa IV de E. coli contenían dicha actividad y las preparaciones también necesitaron la inactivación de la actividad exonucleasa antes del uso.

Ejemplo 2

El método según la invención se usó para elongar cíclicamente un oligonucleótido de 41 unidades monoméricas (Cebador Iniciador, CI) que era autocomplementario en su extremo 3', es decir palindrómico, y por lo tanto sirvió como molde para sí mismo para la reacción GMA. La región complementaria se extendía a lo largo de 20 bases desde el extremo 3' de las 41 unidades monoméricas, y esta sección del oligonucleótido actuó esencialmente como el CI. La región de 5' de las 41 unidades monoméricas para esta región complementaria de CI (sitio de unión de CI) se diseñó para contener un residuo de A después del sitio de unión de CI, que en la elongación cíclica de las 41 unidades monoméricas llevaría a la producción de un fragmento de ADN discreto de 20 nucleótidos después de la reacción GMA. Las 41 unidades monoméricas se diseñaron de forma que contenían varios residuos de G. Esto era para permitir el marcado, mediante la incorporación de \alpha^{32}P-dCTP, de los fragmentos de ADN desplazados de 3' producidos durante la reacción (20 unidades monoméricas). El oligonucleótido se sintetizó artificialmente y se purificó mediante escisión de un gel de poliacrilamida después de la electroforesis. El objetivo era determinar si las 41 unidades monoméricas hibridaron consigo mismas y se podrían elongar de forma cíclica/repetida mediante el método según la invención, produciendo múltiples copias del fragmento de ADN monocatenario de 20 unidades monoméricas marcado (fragmento desplazado).

Antes de la adición de las enzimas, las mezclas de reacción contenían 100 fmoles de cada uno de los oligonucleótidos de 41 unidades monoméricas, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 5 mM, ditiotreitol 7 mM, 0,2 mM de cada uno de dATP, dGTP y dUTP, dCTP 0,02 mM y 0,2 \mul de \alpha^{32}P-dCTP (10 mCi/ml, \sim800 Ci/mmol) en un total de 17 \mul. Esta mezcla se cubrió con aceite mineral y se calentó a 95ºC durante 2 min. La temperatura de reacción se bajó después a 37ºC y se mantuvo a esta temperatura. Después se añadieron cinco unidades de fragmento Klenow
(3' \rightarrow 5' exo^{-}), 1 unidad de uracil ADN glicosilasa de E. coli y, o bien 2 unidades de endonucleasa IV de E. coli, o 2 \mul de endonucleasa IV de Thermotoga maritima, llevando el volumen final de reacción a 20 \mul. En el caso de las reacciones de control que no contenían endonucleasa IV, y las reacciones de control que no contenían ni endonucleasa IV ni uracil ADN glicosilasa, se añadió agua para llevar el volumen final a 20 \mul. La reacción se dejó continuar durante 30 min o más. Se añadió EDTA hasta una concentración final de 10 mM para parar la reacción. Después se añadió un volumen igual de tinción de carga de formamida (98% de formamida, 0,025% de azul de bromofenol, 0,025% de xileno cianol). Después se cargaron las muestras en un gel de poliacrilamida desnaturalizante del 20% (urea 7 M) y se llevó a cabo la electroforesis para el análisis del tamaño de los fragmentos de ADN. Después de la electroforesis, el gel se expuso a una pantalla de fósforo y se escaneó la imagen posteriormente mediante un Storm 860 (Storm es una marca registrada).

El análisis de la imagen demostró que se produjo una cantidad detectable del oligonucleótido de 20 unidades monoméricas marcado y amplificado en cada reacción de prueba, pero no en las reacciones de control.

Ejemplo 3

El método según la invención se llevó a cabo como se describió en el Ejemplo 2 con algunas modificaciones, como sigue:

Antes de la adición de las enzimas, la mezcla de reacción contenía 100 fmoles del oligonucleótido palindrómico de 41 unidades monoméricas, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 10 mM, MgCl_{2} 3 mM, 0,2 mM de cada uno de dATP, dUTP y dGTP, dCTP 0,02 mM y \alpha^{32}P-dCTP en un volumen total de 20 \mul. Esta mezcla se cubrió con aceite mineral y se calentó a 95ºC durante 2 min. La temperatura de reacción se bajó después a 60ºC y se mantuvo ahí. Se añadieron 10 unidades de fragmento Stoffel de ADN polimerasa AmpliTaq (marca comercial), 2 unidades de UDG de Thermotoga maritima y 4 unidades de endonucleasa IV de E. coli (o agua en el caso de la reacción de control que no contenía endonucleasa IV) por ese orden, para llevar el volumen final de reacción a 25 \mul. Se tomaron muestras de 5 \mul de las reacciones a intervalos de 30 minutos después de la adición de la endonucleasa IV. Estas muestras se llevaron a una concentración final de EDTA de 10 mM. Después se añadió un volumen igual de tinción de carga de formamida (98% de formamida, 0,025% de azul de bromofenol, 0,025% de xileno cianol). Se llevó a cabo el análisis de las muestras de ADN como en el Ejemplo 1.

El análisis de la imagen demostró que las reacciones que contenían exonucleasa IV contenían grandes cantidades de ADN marcado, que estaba ausente en las reacciones de control que carecían de endonucleasa IV. La cantidad de ADN en las reacciones de prueba se incrementó con el tiempo alcanzando un máximo a los 90 min de la adición de la endonucleasa IV.

Ejemplo 4

El método según la invención se llevó a cabo como se describió en el Ejemplo 2 con algunas modificaciones, como sigue:

Antes de la adición de las enzimas, la mezcla de reacción contenía 100 fmoles del oligonucleótido de 41 unidades monoméricas, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 10 mM, MgCl_{2} 3 mM, 0,2 mM de cada uno de dATP, dUTP y dGTP, dCTP 0,02 mM y 0,2 \mul de \alpha^{32}P-dCTP (10 mCi/ml, \sim800 Ci/mmol) en un volumen de 20 \mul. Esta mezcla se cubrió con aceite mineral y se calentó a 95ºC durante 2 min. La temperatura se bajó después a 70ºC y se mantuvo ahí. Se añadieron 10 unidades de fragmento Stoffel de ADN polimerasa AmpliTaq, 2 \mul de AfUDG-Tio y 2 \mul de EcoEndoIV (o agua en el caso de la reacción de control que no contenía endonucleasa IV) a la mezcla de reacción por ese orden, para llevar el volumen final a 25 \mul. La reacción se finalizó después de 60 min mediante la adición de EDTA a una concentración final de 10 mM. Después se añadió un volumen igual de tinción de carga de formamida (98% de formamida, 0,025% de azul de bromofenol, 0,025% de xileno cianol). Se llevó a cabo el análisis de los tamaños de las muestras de ADN como en el Ejemplo 1. Después de la electroforesis, el gel se expuso a una pantalla de fósforo y la imagen se detectó usando un aparato de análisis de imagen Storm 860 (marca comercial).

El análisis de la imagen demostró que las reacciones que contenían endonucleasa IV contenían grandes cantidades del oligonucleótido esperado de 20 unidades monoméricas marcado, y en menor medida algunos fragmentos menores que estaban ausentes en las reacciones de control en ausencia de endonucleasa IV añadida.

Ejemplo 5

El método según la invención se usó para detectar la elongación de cebadores a partir de cantidades attomolares del oligonucleótido palindrómico de 41 unidades monoméricas. La digestión con uracil ADN glicosilasa seguida por digestión con endonucleasa IV del producto formado por la elongación catalizada por la polimerasa del oligonucleótido de 41 unidades monoméricas usándose a sí mismo como molde produce como uno de sus productos un oligonucleótido monocatenario de 20 unidades monoméricas (es decir, fragmento desplazado que puede posteriormente actuar como un CI). Este oligonucleótido actúa como un cebador secundario. En este ejemplo, el método según la invención permite la detección de la elongación cíclica del oligonucleótido de 20 unidades monoméricas por medio de una reacción en bucle retroalimentada. Se diseñó un oligonucleótido de 42 unidades monoméricas (molde potenciador) como se representó esquemáticamente en la Fig. 2. La secuencia complementaria del fragmento cebador/desplazado secundario de 20 unidades monoméricas está repetida dos veces en este oligonucleótido de 42 unidades monoméricas. Las secuencias repetidas están separadas (leyendo de 5' a 3') por una secuencia AT. Este oligonucleótido se sintetizó y se purificó de la misma manera que el oligonucleótido palindrómico de 41 unidades monoméricas. Este oligonucleótido de 42 unidades monoméricas se incluyó en gran exceso en la reacción. Una vez que el cebador secundario de 20 unidades monoméricas se ha producido como se describió anteriormente, puede hibridar entonces con el oligonucleótido de 42 unidades monoméricas y, mediante el método según la invención, ser él mismo elongado cíclicamente, lo que produce como resultado numerosas copias de sí mismo. Estos cebadores secundarios de 20 unidades monoméricas recién producidos pueden entonces hibridar ellos mismos con otras copias del oligonucleótido de 42 unidades monoméricas, lo que inicia nuevos ciclos de elongación cíclica, y así sucesivamente. El objetivo fue detectar cantidades del oligonucleótido palindrómico de 41 unidades monoméricas, normalmente demasiado pequeñas para ser detectadas como se describió en el Ejemplo 2, mediante la producción de cantidades detectables del cebador secundario de 20 unidades monoméricas por medio de la aplicación del bucle retroalimentado del método según la invención como se describió anteriormente.

Las reacciones descritas en el Ejemplo 2 se repitieron por triplicado excepto por las siguientes modificaciones. El oligonucleótido de 42 unidades monoméricas descrito anteriormente se incluyó en cada reacción hasta concentraciones finales de 40 ng/reacción. La concentración del oligonucleótido palindrómico de 41 unidades monoméricas fue 1,0 fmoles, 10^{-2} fmoles ó 10^{-4} fmoles por reacción en los diferentes grupos de control (sin endonucleasa IV incluida en la reacción) y en las reacciones de prueba (endonucleasa IV incluida en la reacción). Las reacciones se dejaron proseguir durante 2 horas antes de la adición de NaOH hasta una concentración final de 50 mM. El contenido en fragmento de ADN marcado de las reacciones se analizó mediante análisis del equivalente de 5 \mul de las reacciones originales (antes de la adición de NaOH y tinción de carga de formamida) como se describió en el Ejemplo 1.

El análisis de la imagen demostró que se produjo una cantidad detectable del oligonucleótido de 20 unidades monoméricas marcado en cada reacción de prueba, pero no en las reacciones de control.

Se observó un resultado similar cuando el experimento anterior se repitió usando las enzimas termoestables, fragmento de ADN Stoffel, UDG de Thermotoga maritima y endonucleasa IV de Thermotoga maritima. Para evitar cualquier amplificación inespecífica que surgiera del autocebado del molde potenciador, el extremo 3' del potenciador contiene normalmente un grupo bloqueante que evita la elongación por la ADN polimerasa. El grupo bloqueante usado en el potenciador de 42 unidades monoméricas descrito anteriormente fue un nucleótido de didesoxicitosina.

Ejemplo 6

Se usó el método según la invención para elongar cíclicamente un oligonucleótido de 41 unidades monoméricas autohibridado. Esta reacción produjo un oligonucleótido de 20 unidades monoméricas que pudo actuar entonces como un cebador iniciador sobre un oligonucleótido de 42 unidades monoméricas (potenciador) con un extremo 3' bloqueado (el bloqueante usado fue un nucleótido de citidina invertido). El potenciador se diseñó de forma que esta reacción secundaria produciría también el mismo oligonucleótido de 20 unidades monoméricas mediante elongación cíclica (véase la Fig. 2). Estos oligonucleótidos de 20 unidades monoméricas podrían después cebar la elongación adicional sobre otras moléculas potenciadoras, lo que amplifica la señal de la reacción original sobre el oligonucleótido de 41 unidades monoméricas. Los oligonucleótidos potenciadores de 41 y 42 unidades monoméricas se diseñaron para permitir la incorporación de \alpha^{32}P-dCTP radiomarcado. Las reacciones contenían o bien (1) 100 fmoles del oligonucleótido de 41 unidades monoméricas, (2) 1 fmol del oligonucleótido de 41 unidades monoméricas, (3) 100 fmoles del potenciador o (4) 1 fmol del oligonucleótido de 41 unidades monoméricas, y 100 fmoles de un potenciador en tampón de fragmento Taq Stoffel (Tris-HCl 10 mM, KCl 10 mM, pH 8,3) complementado con MgCl_{2} 3 mM, dATP 0,2 mM, dGTP 0,2 mM, dUTP 0,2 mM y 0,2 \mul de \alpha^{32}P-dCTP 0,02 mM (10 mCi/ml, \sim800 Ci/mM). Esta mezcla de reacción se cubrió con aceite mineral y se incubó a 95ºC durante 2 min antes de llevarse a 70ºC y mantenerse ahí. Se añadieron 10 U de fragmento Taq Stoffel, 2 \mul de AfUDG-Tio y 2 \mul de EcoEndoIV por ese orden, para llevar el volumen final de reacción a 25 \mul. La reacción se incubó a 70ºC durante 60 min y después se terminó mediante la adición de EDTA a una concentración final de 10 mM. Después se añadió un volumen igual de tinción de carga de formamida del 98% (que contenía 0,025% de azul de bromofenol, 0,025% de xileno cianol) y las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante del 20%. Después de la electroforesis, el gel se expuso a una pantalla de fósforo y la imagen se detectó usando un aparato de análisis de imagen Storm 860 (marca comercial).

El análisis de la imagen demostró que en la reacción (1) hubo producción de un producto de ADN marcado de 20 unidades monoméricas, y en menor medida un oligonucleótido de \sim60 unidades monoméricas y varios productos más pequeños del de 20 unidades monoméricas. El mismo producto se produjo en la reacción (2) pero en mucha menor medida. No hubo producto de reacción marcado en la reacción (3), mientras en la reacción (4) se produjo un oligonucleótido de 20 unidades monoméricas marcado que fue más intenso que el producido en la reacción (2), así como en menor medida varios productos marcados menores que el oligonucleótido de 20 unidades monoméricas. Se observó que el uso de nucleótidos invertidos como bloqueantes del extremo 3' fue más efectivo que el uso de didesoxinucleótidos como bloqueantes terminales.

Ejemplo 7

Se usó el método según la invención para elongar cíclicamente un oligonucleótido de 41 unidades monoméricas (Cebador Iniciador-CI), que era autocomplementario en su extremo 3', es decir, palindrómico, y por lo tanto sirvió como molde para sí mismo para la reacción GMA. La región complementaria se extendía a lo largo de 20 bases desde el extremo 3' del oligonucleótido de 41 unidades monoméricas, y esta sección del oligonucleótido actuó esencialmente como el CI. La región de 5' del oligonucleótido de 41 unidades monoméricas para esta región complementaria de CI (sitio de unión de CI) se diseñó para contener un residuo de A después del sitio de unión de CI, que en la elongación cíclica del oligonucleótido de 41 unidades monoméricas llevaría a la producción de un fragmento de ADN discreto de 20 nucleótidos después de la reacción GMA. El oligonucleótido de 41 unidades monoméricas también se diseñó de forma que contuviera varios residuos de G. Esto era para permitir el marcado, mediante la incorporación de \alpha^{32}P-dCTP, de los fragmentos de ADN desplazados de 3' producidos durante la reacción (oligonucleótidos de 20 unidades monoméricas). El oligonucleótido se sintetizó artificialmente y se purificó mediante escisión de un gel de poliacrilamida después de la electroforesis. El objetivo era determinar si el oligonucleótido de 41 unidades monoméricas hibridó consigo mismo y se podía elongar cíclicamente/repetidamente mediante el método según la invención con exonucleasa III de E. coli en lugar de endonucleasa IV de E. coli, lo que produciría múltiples copias del fragmento de ADN monocatenario marcado de 20 unidades monoméricas (fragmento desplazado). Antes de la adición de las enzimas, las reacciones contenían 100 fmoles del oligonucleótido de 41 unidades monoméricas, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 5 mM, ditiotreitol 7 mM, 0,2 mM de cada uno de dATP, dGTP y dUTP, dCTP 0,02 mM y 0,2 \mul de \alpha^{32}P-dCTP (10 mCi/ml, \sim800 Ci/mmol) en un total de 22 \mul. Esta mezcla se cubrió con aceite mineral y se calentó a 95ºC durante 2 min. La temperatura de reacción se bajó después a 37ºC y se mantuvo a esta temperatura. Después se añadieron cinco unidades de fragmento Klenow (3' \rightarrow 5' exo^{-}), 10 unidades de uracil ADN glicosilasa de E. coli y 0,1 unidades de exonucleasa III de E. coli, y se llevó el volumen final de reacción a 25 \mul. En el caso de reacciones de control, que no contenían exonucleasa III, se añadió agua para llevar el volumen final a 25 \mul. La reacción se dejó continuar durante 30 min o más. Se añadió EDTA hasta una concentración final de 10 mM para parar la reacción. Después se añadió un volumen igual de tinción de carga de formamida (98% de formamida, 0,025% de azul de bromofenol, 0,025% de xileno cianol). Después se cargaron las muestras en un gel de poliacrilamida desnaturalizante del 20% (urea 7 M) y se llevó a cabo la electroforesis para el análisis del tamaño de los fragmentos de ADN. Después de la electroforesis, el gel se expuso a una pantalla de fósforo y se detectó la imagen posteriormente mediante un aparato de análisis de imagen Storm 860 (marca registrada).

El análisis de la imagen demostró una cantidad detectable del oligonucleótido de 20 unidades monoméricas marcado en cada reacción de prueba, pero no en las reacciones de control.

Ejemplo 8

Se usó el método según la invención para elongar cíclicamente un oligonucleótido de 21 unidades monoméricas (Cebador Iniciador-CI), que era complementario a una región de un oligonucleótido de 40 unidades monoméricas (ácido nucleico molde) que sirvió como molde para la reacción de polimerización. La región complementaria se extendía desde el extremo 3' del oligonucleótido de 40 unidades monoméricas. La región de 5' del oligonucleótido de 40 unidades monoméricas para esta región complementaria de CI (sitio de unión de CI) se diseñó para contener varios residuos de C que después de la elongación cíclica del oligonucleótido de 21 unidades monoméricas elongado llevaría a la producción de fragmentos de ADN de tamaños discretos después de la reacción GMA. El oligonucleótido de 40 unidades monoméricas también se diseñó de forma que contuviera varios residuos de G entre cada residuo de A. Esto era para permitir el marcado, mediante la incorporación de \alpha^{32}P-dCTP, de los fragmentos de ADN desplazados de 3' producidos durante la reacción. Ambos oligonucleótidos se sintetizaron artificialmente y se purificaron mediante escisión de un gel de poliacrilamida después de la electroforesis. El objetivo era determinar si el oligonucleótido de 21 unidades monoméricas hibridó con el oligonucleótido de 40 unidades monoméricas y se podía elongar cíclicamente/repetidamente mediante el método según la invención, lo que produciría múltiples copias de fragmentos de ADN monocatenarios marcados (fragmentos desplazados). Antes de la adición de las enzimas, las reacciones contenían 100 fmoles de cada uno de los oligonucleótidos, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 6 mM, KCl 10 mM, 0,2 mM de cada uno de dATP, dITP y dTTP, dCTP 0,02 mM y 0,2 \mul de \alpha^{32}P-dCTP (10 mCi/ml, \sim800 Ci/mmol) en un total de 22 \mul. Esta mezcla se cubrió con aceite mineral y se calentó a 95ºC durante 2 min. La temperatura de reacción se bajó después a 70ºC y se mantuvo a esta temperatura. Después se añadieron diez unidades de fragmento Stoffel de Taq polimerasa, y después se añadieron 800 pg de TmaEndoV, por ese orden, llevando el volumen final de reacción a 25 \mul. En el caso de las reacciones de control, que no contenían endonucleasa V, se añadió agua para llevar el volumen final a 25 \mul. Las reacciones se terminaron mediante la adición de EDTA hasta una concentración final de 10 mM. Después se añadió medio volumen de tinción de carga de formamida (98% de formamida, 0,025% de azul de bromofenol, 0,025% de xileno cianol) y los productos de reacción se desnaturalizaron calentando a 95ºC durante 5 min. Después se cargaron las muestras en un gel de poliacrilamida desnaturalizante del 20% (urea 7 M) y se llevó a cabo electroforesis para el análisis del tamaño de los fragmentos de ADN. Después de la electroforesis, el gel se expuso a una pantalla de fósforo y se detectó la imagen usando un aparato de análisis de imagen Storm 860 (marca registrada).

El análisis de la imagen demostró que las reacciones que contenían endonucleasa V contenían varios fragmentos de ADN marcados de diferentes tamaños que estaban definidos por la posición relevante de la incorporación de dITP en la elongación, y que se incrementaron en número con el tiempo, y que no aparecieron en las reacciones de control que carecían de endonucleasa V.

Claims (28)

1. Un método para la amplificación de un ácido nucleico molde, que comprende llevar a cabo simultáneamente las etapas de:

i)

hacer reaccionar un cebador de ácido nucleico con dicho ácido nucleico molde, nucleótidos precursores de ADN normales, al menos un nucleótido precursor de ADN modificado y una ADN polimerasa para obtener un cebador de ácido nucleico elongado, y dicho cebador de ácido nucleico permanece unido a dicho molde;

ii)

escindir el cebador de ácido nucleico elongado que contiene la base modificada para generar un extremo 3'-OH libre que es elongable por dicha ADN polimerasa; y

iii)

repetir las etapas i) y ii) sobre los fragmentos de ADN así generados.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que el cebador de ácido nucleico elongado que contiene la base modificada se escinde mediante una 3'-endonucleasa.

3. Un método según la reivindicación 2, en el que la 3'-endonucleasa es endonucleasa V de E. coli.

4. Un método según la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

i)

hacer reaccionar un cebador de ácido nucleico con dicho ácido nucleico molde, nucleótidos precursores de ADN normales, al menos un nucleótido precursor de ADN modificado que es un sustrato para una ADN glicosilasa, y una ADN polimerasa para obtener un cebador de ácido nucleico elongado, y dicho cebador de ácido nucleico permanece unido a dicho molde;

ii)

cortar la base modificada del nucleótido precursor de ADN modificado del cebador de ácido nucleico elongado por medio de una ADN glicosilasa para generar un sitio abásico;

iii)

escindir el cebador de ácido nucleico elongado en el sitio abásico para generar un extremo 3'-OH que es elongable por dicha ADN polimerasa; y

iv)

repetir las etapas i)-iii) sobre los fragmentos de ADN así generados.

5. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que el ácido nucleico molde es ADN.

6. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que el cebador de ácido nucleico es un cebador de ADN.

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que los nucleótidos precursores de ADN se seleccionan de dATP, dCTP, dGTP y dTTP.

8. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que la ADN polimerasa tiene actividad de desplazamiento de cadena.

9. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que el precursor de ácido nucleico modificado es dUTP.

10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 4-9, en el que la ADN glicosilasa es uracil ADN glicosilasa (UDG).

11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 4-10, en el que el ácido nucleico elongado se escinde en el sitio abásico por medio de una enzima que escinde en un sitio abásico del ácido nucleico.

12. Un método según la reivindicación 11, en el que la enzima es una AP endonucleasa.

13. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que el nucleótido precursor modificado sustituye parcialmente a uno de los nucleótidos precursores normales.

14. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 5-9 y 13, en el que las etapas i) y ii) continúan de manera cíclica hasta que uno de los reactivos se hace limitante.

15. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 4-13, en el que las etapas i)-iii) continúan de manera cíclica hasta que uno de los reactivos se hace limitante.

16. Un método según cualquier reivindicación precedente, que se lleva a cabo en condiciones isotérmicas.

17. Un método según cualquier reivindicación precedente, que da como resultado la acumulación de los fragmentos monocatenarios desplazados de 3' de ácido nucleico especificados por las localizaciones de las bases modificadas en una cadena de ácido nucleico complementaria.

18. Un método según cualquier reivindicación precedente para generar múltiples copias de cebadores monocatenarios discretos en dirección 3' de un cebador de ácido nucleico iniciador.

19. Un método según la reivindicación 17 ó 18, en el que los fragmentos desplazados de 3' son elongados en una reacción secundaria.

20. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 17-19, en el que los fragmentos desplazados de 3' son elongados sobre un ácido nucleico molde secundario.

21. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 17-20, en el que se inmovilizan múltiples moldes secundarios sobre un chip de ADN.

22. Un método según cualquier reivindicación precedente para uso en el diagnóstico de detección.

23. Un método según la reivindicación 22, que se usa en la detección de patógenos.

24. Un método según la reivindicación 22, que se usa en la detección de la presencia o ausencia de mutaciones.

25. Un método según la reivindicación 22, que se usa en la detección de polimorfismos.

26. Un método según cualquier reivindicación precedente para la cuantificación de la concentración de un ácido nucleico en una muestra.

27. Un método según cualquier reivindicación precedente para uso en la amplificación de señal de cualquier ácido nucleico que puede funcionar como cebador o molde.

28. Un método según cualquier reivindicación precedente para uso en la computación ADN.