JP2004512843A - 核酸の増幅および任意のキャラクタリゼーションの方法 - Google Patents
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Abstract
テンプレート核酸の増幅のための方法は、以下の工程を同時に実施することを含む：核酸プライマーを該テンプレート核酸、標準的なＤＮＡ前駆体ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたＤＮＡ前駆体ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼと反応させ、伸長された核酸プライマーを得る（該核酸プライマーは該テンプレートに結合したままである）；修飾された塩基を含有する伸長された核酸プライマーを開裂して、該ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能な遊離の３’−ＯＨ末端を生成する；そして、それによって生成されたＤＮＡフラグメント上で工程ｉ）およびｉｉ）を反復する。修飾されたＤＮＡ前駆体ヌクレオチドはＤＮＡグリコシラーゼの基質であるか、または３’−エンドヌクレアーゼによって認識され、それによってＤＮＡの開裂および開裂部位をを測定してもよい。方法は既存の技術にまさる重要な利点を有し、単一のハイスループットプロセスを提供するという点でより多目的に利用でき、より適応性が高く、ＤＮＡの検出、定量、およびキャラクタリゼーションの分野において多くの異なるフォーマットに容易に適合できる。
Description
【０００１】
技術分野
本発明は核酸の増幅およびキャラクタリゼーションのための新規の方法に関する。
【０００２】
発明の背景
標的核酸テンプレート上での核酸プライマーの伸長は非常に重要な過程であり、核酸の検出、診断、および定量を含む多様な適用がある。特に、テンプレート上でのプライマーの伸長は、ｉ）プライマーがテンプレートにアニールしたことの直接的な証拠であり、ｉｉ）そのテンプレート上にプライマーに相補的な配列が存在することを確証し、従ってｉｉｉ）そのテンプレートまたは標的核酸の存在を確証する。わずか１塩基だけが異なる密接に関係するプライマーを使用して、配列中の１塩基が異なる核酸を区別することが慣例的に可能である。核酸の検出、診断、および定量の方法としてテンプレート核酸上でのプライマーの伸長を使用する際の重大な制限は、典型的な伸長反応においてプライマーはテンプレートにアニール（ハイブリダイズ）するが、１度しか伸長されないことである。従って、サンプル中のテンプレート量が伸長されるプライマーの量を決定する。核酸の検出、診断、および定量の分野における適用の大半では、もし伸長反応が何らかの様式で反復または循環されなければ、しばしばテンプレートの量が少なすぎるために伸長されたプライマーを直接検出することができない。
【０００３】
この重大な制限を克服するために増幅過程が必要である。種々のこれらの過程がこれまでに報告されており、それらは本質的に以下のいずれかを伴う：ａ）伸長されたプライマーを熱を使用してテンプレートから解離させ、それによって新たなプライマーのアニーリングおよびそれに続く伸長が可能となるような周期的な解離条件；ｂ）一方の鎖だけが修飾された（ｈｅｍｉ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＤＮＡ認識部位の未修飾鎖にニックを生成するための制限酵素、およびニックで３’ＤＮＡ末端を伸長し、下流ＤＮＡ鎖を置換する５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼの能力を使用することによるＤＮＡにおけるプライマーの反復生成；ｃ）プライマー伸長が連続的に進行するようなテンプレート核酸の循環；および／またはｄ）転写法によるテンプレートのコピーの生成（これが後のプライマー伸長反応においてテンプレートとなる）。
【０００４】
検出および操作できるようなレベルまで核酸を増幅する（複数のコピーを生成する）ことは非常に有用である。特定の標的核酸の十分量を生成するそれらの増幅過程は一般に、核酸のキャラクタリゼーションに必要とされる最初の重要な工程である。サンプルから特定の核酸配列を直接増幅することによって同サンプル中の該核酸の存在または不在の診断が可能となり、従ってＤＮＡ／遺伝子診断において非常に有用である。サンプルからの核酸の直接増幅およびその後のキャラクタリゼーションは種々の目的のために実施することができ、それらには、特定の核酸における変異および多形のようなＤＮＡ変異の存在または不在の診断がある。増幅過程は多くの場合、増幅および増幅した標的の完全な、または部分的なキャラクタリゼーションが共に可能となるように設計できる。
【０００５】
現在知られている核酸の増幅およびキャラクタリゼーションの方法は、特に以下に関して種々の制限を受ける：プライマーの解離、プライマーの生成、特異性、可変性、１本鎖ＤＮＡの生成、および多重性（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）の促進のために必要な過程、およびハイスループット・ゲノタイピング、特に単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）のゲノタイピング（下記）。
【０００６】
プライマーの伸長
テンプレート上でのプライマーの伸長そのものは文献に十分記録されている。これは、テンプレートまたは標的核酸上でプライマーをそれに相補的な配列にさせた後、ＤＮＡ前駆体（一般にｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）の存在下でＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートすることによって行うことができ、それによってテンプレート鎖上で（プライマーに関して）５’から３’方向に、３’−ＯＨ（ヒドロキシ）末端からプライマーが伸長され、元のテンプレートに相補的な、新たに合成されたＤＮＡ鎖が生成される。プライマーの伸長は、プライマーが遊離の３’−ＯＨ末端を有する場合にのみ起こる。プライマー伸長法によるテンプレートからのこの相補鎖の増幅は以下を必要とする：ａ）プライマー伸長が、アニールしたプライマー分子ごとに１回より多く起こる、ｂ）新たなプライマーは反復してテンプレートにアニールし、伸長される、そして／またはｃ）相補鎖はその後の第２のプライマーの伸長のテンプレートとなる。
【０００７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
核酸テンプレートの増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行うことができる（Ｓａｉｋｉ， Ｒ． Ｋ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１（１９８８））。
【０００８】
一般に、ＰＣＲによる核酸テンプレートの標的セグメントの増幅は、ＰＣＲで好適な合成オリゴヌクレオチドプライマーを耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ前駆体と共に使用して実施する。変性、アニーリング、およびプライマー伸長の複数回の循環によって標的セグメントが指数的に増幅される。従って生成物の検出は、特定の遺伝子座の一定の配列の存在を示す。増幅産物の長さはプライマーの長さを合わせたもの、およびテンプレート上のそれらの３’末端間の長さなどによって決定できる。
【０００９】
ＰＣＲには耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが必ず必要である。それは熱サイクル過程を含むため、この技術の自動化には特殊な装置が必要である。典型的な反応は、通常、反応を開始するために２つのプライマーを必要とし、従って、特にいくつかの異なる増幅反応の多重化（すなわち１本の試験管で）を考慮したい場合、このことで反応は更に複雑になる。これによってより多くのプライマーが反応中に存在することになり、そのため誤った、非特異的な増幅の可能性が増す。更に、反応のアニール温度は反応に使用する両方のプライマーに好適でなければならないため、ＰＣＲ反応の設計および最適化がより複雑になる。このことは、異なる増幅反応の多重化の場合、１つのアニール温度が多重化される全ての増幅反応に適合しなければならないため、更なる不利益となる。
【００１０】
また、反応の際にテンプレート核酸の複数のコピーが生成してその後のテンプレートとして作用するため、増幅子のコンタミネーションの可能性がある。
【００１１】
転写に基づく増幅法
転写に基づく増幅法（Ｋｗｏｈ， Ｄ． Ｙ．ら， （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６ １１７３−１１７７；Ｇｕａｔｅｌｌｉら， Ｊ． Ｃ．ら， （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７ １８７４−１８７８；Ｃｏｍｐｔｏｎら， Ｊ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５０ ９１−９２）は標的核酸上でのプライマーの伸長に依存する増幅方法であり、それによってＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターが増幅されるべき標的領域の上流に生成される。本質的に、標的配列に隣接する１対のプライマーをテンプレート核酸と共にインキュベートする。プライマーの一方はテンプレートに相補的でしれにアニールする配列の上流（５’）にＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター配列を有する。他方のプライマーはテンプレートの相補鎖のセグメントに相補的である。ＲＮＡプロモーター配列を有するプライマーを、核酸ポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）およびＤＮＡ前駆体を使用してテンプレート鎖上で伸長させる。ハイブリッド核酸（テンプレート鎖および新たに合成された相補鎖）の熱変性またはテンプレート鎖の酵素的変性の後、第２のプライマーを新たに合成された相補鎖とアニールさせ、同鎖上で伸長させる。これによって２本鎖で、標的配列に結合したＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを有する産物が得られる。この産物をＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ前駆体と共にインキューベートすることによってその標的配列の多くのＲＮＡ転写物が生成される。それぞれのＲＮＡ転写物は今度は相補的ＤＮＡ鎖生成のためのテンプレートとなり、この過程は等温条件下で反応成分が限界となるか、または不活性化されるまで、自己持続型循環様式で継続する。これによって標的核酸配列が大きく増幅される。
【００１２】
１つの重大な不利益は、これらの技術が、本質的にＤＮＡより不安定でより分解されやすいＲＮＡにこれらの技術が完全に依存していることである。このため反応はリボヌクレアーゼのコンタミネーションに極度に高い感受性を有する。一般に方法はテンプレートとしてＲＮＡを必要とし、ＤＮＡテンプレートには適さない、または最適でない。
【００１３】
また反応は、反応の開始のために少なくとも２つのプライマーを必要とし、プライマーの１つはＲＮＡポリメラーゼのための転写開始部位を導入するように特別に設計しなければならない。
【００１４】
更にまた、反応の際にテンプレート核酸の複数のコピーが生成してその後のテンプレートとして作用するため、増幅子のコンタミネーションの可能性がある。
【００１５】
これらの技術は更なる工程を加えなければ変異または多形の検出に好適でない。
【００１６】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）
ＳＤＡは、制限酵素が、一方の鎖だけが修飾された２本鎖ＤＮＡの未修飾鎖の特定の認識部位にニックを生成する能力、および５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡが得られたニックで３’末端を伸長し、そうすることで下流ＤＮＡ鎖を置換する能力に基づく増幅法である（Ｗａｌｋｅｒ， Ｇ． Ｔ．ら， ＰＮＡＳ ８９：３９２−３９６ （１９９２））。テンプレート上でのカップリング反応によって標的ＤＮＡが指数的に増幅されるが、そこではテンプレート鎖上での反応から置換された鎖が相補鎖上の反応の標的となり、また逆も同様である。本質的にＤＮＡサンプルの熱変性によって２つの１本鎖ＤＮＡフラグメント（Ｔ１およびＴ２）が生成される。２つのＤＮＡ増幅プライマー（Ｐ１およびＰ２）は過剰に存在する。Ｐ１の３’末端はＴ１の３’末端に結合し、５’側が突き出た（ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）デュプレックスを形成する。同様に、Ｐ２はＴ２と結合する。Ｐ１およびＰ２の５’側の突出部分はＨｉｎｃＩＩのような制限酵素の認識配列を含む。５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損型のＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ前駆体であるｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、および修飾型前駆体であるデオキシアデノシン５’−［アルファチオ］トリホスフェートを使用してデュプレックスの３’末端が伸長され、これによってＰ１Ｔ１およびＰ２Ｔ２上にヘミホスホロチオエート認識部位が生成される。ＨｉｎｃＩＩはヘミホスホロチオエート認識部位の保護されていないプライマー鎖にニックを生成し、修飾された相補鎖は無傷のままである。ＤＮＡポリメラーゼはＰ１Ｔ１上のニックで３’末端を伸長し、下流鎖を置換し、これはＴ２と機能的に同等である。同様に、Ｐ２Ｔ２上のニックでの伸長により下流鎖が置換され、これはＴ１と機能的に同等である。ニックでの伸長によってニック生成が可能なＨｉｎｃＩＩ認識部位が再生されるので、ニック生成および重合化／置換工程はＰ１Ｔ１およびＰ２Ｔ２上で連続的に循環する。Ｐ１Ｔ１から置換された鎖はＰ２の標的となり、Ｐ２Ｔ２から置換された鎖はＰ１の標的となるので、標的の増幅は指数的である。
【００１７】
ＳＤＡの主な不利益は特定の制限酵素のための部位を導入するように特別に設計されたプライマーを使用しなければならないことである。一般に、反応を実施するためにアンプリコンごとに２つ以上の配列特異的プライマーが必要とされる。更に、この反応で１つのプライマーを使用して生成される増幅されたフラグメントが所定の３’末端を有するのは容易ではない。置換されたフラグメント上の所定の３’末端によってその後のこの同じフラグメントとの反応が起動されるので、これもまたＳＤＡの重要な不利益である。
【００１８】
国際特許ＷＯ９７／０３２１０号は、標的核酸サンプル中の候補となる遺伝子座における特定の核酸配列の存在または不在を迅速に検出するための方法を開示しており、方法は以下の工程を含む：ｉ）該候補遺伝子座の１つ以上のあらかじめ選択した位置にＤＮＡグリコシラーゼの基質である修飾された塩基を導入し；ｉｉ）該ＤＮＡグリコシラーゼを用いて修飾された塩基を切り出して無塩基（ａｂａｓｉｃ）部位を生成し；ｉｉｉ）工程ｉｉ）で生成された無塩基部位でリン酸結合を開裂し；そしてｉｖ）工程ｉｉｉ）の開裂産物を分析して該標的核酸配列中の該候補遺伝子座における該特定の核酸配列の存在または不在を確認する。方法は特に、ＤＮＡサンプル中の特定の変異の検出（ＤＮＡ中の複数の既知の変異の検出を含む）に適用される。
【００１９】
国際特許ＷＯ９９／５４５０１号は核酸分子のキャラクタリゼーションの方法を開示しており、方法は以下の工程を含む：ｉ）修飾された塩基、例えばウラシル（ＤＮＡグリコシラーゼの基質である）をＤＮＡ分子に導入し；ｉｉ）該ＤＮＡグリコシラーゼを用いて修飾された塩基を切り出して無塩基部位を生成し；ｉｉｉ）無塩基部位でＤＮＡを開裂して伸長可能な上流ＤＮＡフラグメントを生成し；そしてｉｖ）伸長可能な上流フラグメントを、その伸長を可能とする酵素（例えばポリメラーゼまたはリガーゼ）およびテンプレート核酸の存在下でインキュベートし、得られるフラグメントを分析する。しかしながら、国際特許ＷＯ９９／５４５０１号に記載されるＤＮＡの開裂方法では、塩基が切り出された位置が重要である。
【００２０】
国際特許ＷＯ９９／５４５０１号に例証される方法では、増幅された標的核酸を含有する反応混液を、増幅工程で伸長しなかったプライマーを消化するためのエキソヌクレアーゼＩ、および増幅工程で導入されなかったｄＮＴＰを消化するためのエビ・アルカリホスファターゼで処理した。従ってテンプレート核酸の更なる増幅は起こらず、方法は１サイクルだけに限定された。
【００２１】
従って、より多目的に使用でき、より特異的で、情報処理量がより高く、反応の多重化を容易にし、そして１本鎖ＤＮＡの生成を可能とするような、核酸の増幅およびキャラクタリゼーションの改善された方法を開発することが重要である。
【００２２】
従って本発明はテンプレート核酸の増幅のための方法を提供し、方法は以下の工程を同時に実施することを含む：
ｉ）核酸プライマーを該テンプレート核酸、標準的なＤＮＡ前駆体ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたＤＮＡ前駆体ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼと反応させ、伸長された核酸プライマーを得る（該核酸プライマーは該テンプレートに結合したままである）；
ｉｉ）修飾された塩基を含有する伸長された核酸プライマーを開裂して、該ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能な遊離の３’−ＯＨ末端を生成する；そして
ｉｉｉ）それによって生成されたＤＮＡフラグメント上で工程ｉ）およびｉｉ）を反復する。
【００２３】
ある態様では、修飾された塩基を含有する伸長された核酸プライマーを３’−エンドヌクレアーゼによって開裂する。
【００２４】
この態様では、好ましくは３’−エンドヌクレアーゼはＥ． ｃｏｌｉ由来のエンドヌクレアーゼＶまたは他の生物で見られるその同族体である。
【００２５】
別の態様では、方法は以下の工程を含む：
ｉ）核酸プライマーを該テンプレート核酸、標準的なＤＮＡ前駆体ヌクレオチド、少なくとも１つの、ＤＮＡグリコシラーゼの基質である修飾されたＤＮＡ前駆体ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼと反応させ、伸長された核酸プライマーを得る（該核酸プライマーは該テンプレートに結合したままである）；
ｉｉ）ＤＮＡグリコシラーゼを用いて伸長された核酸プライマーから修飾された前駆体ヌクレオチドの修飾された塩基を切り出して無塩基部位を生成する；
ｉｉｉ）伸長された核酸プライマーを無塩基部位で開裂し、該ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できる遊離の３’−ＯＨ末端を生成する；そして
ｉｉｉ）それによって生成されたＤＮＡフラグメント上で工程ｉ）−ｉｉｉ）を反復する。
【００２６】
本発明にかかる方法は以下に記載するような多くの特有の利点を有する。しかしながら、より一般的には本発明にかかる方法は既存の技術にまさる重要な利点を有し、単一のハイスループットプロセスを提供するという点でより多目的に利用でき、より適応性が高く、ＤＮＡの検出、定量、およびキャラクタリゼーションの分野において多くの異なるフォーマットに容易に適合できる。
【００２７】
本発明について、主にＤＮＡグリコシラーゼの使用を伴う態様を参照にして以下に記載する。出願人は本発明にかかるこの方法に関して、グリコシラーゼ介在型増幅（ＧＭＡ）という用語を造った。しかしながら、ここでは本発明の全ての態様はＧＭＡという頭字語で集合的に表わされる。
【００２８】
従って、本発明にかかる方法では、修飾されたＤＮＡ前駆体ヌクレオチドはここに記載するようにＤＮＡグリコシラーゼの基質であるか、または３’−エンドヌクレアーゼによって認識される。
【００２９】
一般に、核酸テンプレート鎖は天然の、または人工的に合成した核酸由来のいずれの鎖であってもよい。
【００３０】
好ましくは、テンプレート核酸はＤＮＡである。
【００３１】
本発明にかかる方法は核酸プライマーによって起動／開始される。便宜上、反応の開始の原因となるプライマーをここでは開始プライマー（ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ：ＩＰ）と呼ぶ。
【００３２】
ＩＰはＤＮＡポリメラーゼによる伸長が可能な遊離の３’ＯＨ末端を有するいずれの核酸でもよい。ＩＰは人工的に合成された、例えば合成オリゴヌクレオチドであるか、または天然に存在する核酸から直接的に、または間接的に誘導してもよい。
【００３３】
ある態様では、核酸プライマーはＤＮＡプライマーである。
【００３４】
標準的なＤＮＡ前駆体ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド３リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰである。ある限定された状況では、ジデオキシヌクレオチド３リン酸を使用し、反応に含めてもよい。従って、可能な標準的な前駆体にはｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＴＴＰも含まれる。
【００３５】
好ましくはＤＮＡ前駆体ヌクレオチドはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰから選択される。
【００３６】
いくつかの核酸ポリメラーゼのうちの１つをＧＭＡに使用してもよい。ＤＮＡテンプレートを使用する場合はＤＮＡポリメラーゼを使用する。ＲＮＡテンプレートを使用する場合はＲＮＡテンプレートを利用できるＤＮＡポリメラーゼが必要であり、一般にそれらの酵素は逆転写酵素である。通常、伸長プライマーの下流の核酸の置換または消化のいずれが必要かによって、２つのクラスのＤＮＡポリメラーゼを使用する。置換されたフラグメントを生成するために鎖の置換を必要とする場合、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを使用する。反対に５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、下流ＤＮＡはＧＭＡ反応の各サイクルで分解される。これによって以下に更に検討するような検出可能な産物が生成される。
【００３７】
ＤＮＡに導入する場合に必要によってＤＮＡグリコシラーゼの基質となる、そして／または３’−エンドヌクレアーゼによって認識されるような修飾された前駆体ヌクレオチドがいくつか知られている。後者の場合、修飾された前駆体ヌクレオチドによって、３’−エンドヌクレアーゼ酵素による開裂がその導入部位の３’側のホスホジエステル結合に向けられる。
【００３８】
それぞれの場合で開裂はＤＮＡ中の修飾された塩基の存在に依存し、それが以下の２つの方法のいずれかでＤＮＡの開裂を指図し、開裂の位置を指図する：すなわち１）グリコシラーゼによる修飾された塩基の切り出しおよびそれに続く無塩基部位の開裂、または２）伸長された核酸プライマーの３’−エンドヌクレアーゼ酵素による、修飾された塩基の導入部位の３’側にある第２のホスホジエステル結合での開裂。ある態様では、修飾された核酸前駆体はｄＵＴＰである。
【００３９】
修飾された前駆体ヌクレオチドｄＵＴＰはウラシル塩基および糖リン酸部分を含有する塩基糖リン酸である。前駆体ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＵＴＰ（ｄＴＴＰの代わりに）を使用したテンプレート上でのプライマー伸長により、チミンが完全にウラシルで置換された、テンプレートに相補的な新たに合成されたＤＮＡが得られる。
【００４０】
しかしながら、当業者に認識されるように他の修飾された核酸前駆体、例えばｄＩＴＰおよび８−ＯＨ ｄＧＴＰを使用することもできる。
【００４１】
修飾された前駆体ヌクレオチドｄＩＴＰはヒポキサンチン塩基および糖リン酸部分を含有する塩基糖リン酸である。修飾された前駆体ヌクレオチド８−ＯＨ ｄＧＴＰは８−ＯＨグアニン塩基および糖リン酸部分を含有する塩基糖リン酸である。
【００４２】
グリコシラーゼ基質前駆体ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、および８−ＯＨ ｄＧＴＰはＤＮＡに導入すると、それぞれグリコシラーゼ基質塩基ウラシル、ヒポキサンチン、および８−ＯＨグアニンを生成する。
【００４３】
ある態様では、ＤＮＡグリコシラーゼはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）である。
【００４４】
ＤＮＡ中のウラシルはＵＤＧによって特異的に認識され、ＤＮＡから遊離される。ＤＮＡ中に存在する場合、ＵＤＧは他のウラシル関連塩基も認識する。
【００４５】
多くのＤＮＡグリコシラーゼが報告されている。これらの酵素は、グリコシラーゼ基質塩基をＤＮＡバックボーンに結合させるＮ−グリコシド結合を開裂する。これによってＤＮＡから塩基が遊離し、無塩基部位が生成される。
【００４６】
他の好適なＤＮＡグリコシラーゼにはアルキルプリンＤＮＡグリコシラーゼ（ＡＤＧ）またはホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧ）ＤＮＡグリコシラーゼがある。
【００４７】
ヒポキサンチンはアルキルプリンＤＮＡグリコシラーゼ（ＡＤＧ）によって特異的に認識され、ＤＮＡから遊離される。この酵素はＤＮＡ中に存在する場合、Ｎ３メチルアデニン、Ｎ３メチルグアニン、Ｏ２メチルシトシン、およびＯ２メチルチミジンも認識および遊離する。８−ＯＨグアニンはＦＰＧ ＤＮＡグリコシラーゼによって特異的に認識され、ＤＮＡから遊離される。この酵素はＤＮＡ中に存在する場合、開環したプリンも認識および遊離する。
【００４８】
核酸の無塩基部位でホスホジエステル結合を開裂するいくつかの物質が知られている。結合の開裂は無塩基部位の５’または同部位の３’であってもよい。５’開裂はリン酸部分の近接部または末端部で起こってもよく、それぞれ遊離の３’ＯＨ基または３’リン酸基を有する３’末端を持つ上流フラグメントを生成する。３’−ＯＨ末端はテンプレート上でのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が可能であり、一方３’−リン酸末端は伸長不能である。それらの３’−リン酸末端は一般に、３’ホスファターゼ活性を有するＴ４ポリヌクレオチドキナーゼのようなホスファターゼ酵素で処理することによって伸長可能となる。リン酸部分の５’側を開裂し、遊離の３’ＯＨを有する３’末端を生成する物質はＡＰエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素、例えばＥ． ｃｏｌｉ由来のＡＰエンドヌクレアーゼＩＶである。リン酸部分の３’側を開裂し、遊離の３’−Ｐ基を有する３’末端を生成する物質はアルカリ、熱、およびある種のＤＮＡ修復酵素（例えばＦＰＧ）および塩基性タンパク質およびペプチドである。無塩基部位の３’側を開裂する物質には熱、およびＡＰリアーゼ活性を有するある種のＤＮＡ修復酵素、例えばＥ． ｃｏｌｉ由来のエンドヌクレアーゼＩＩＩがある。それらの３’−デオキシリボホスフェート（ｄＲｐ）末端は一般に、ＡＰエンドヌクレアーゼでの処理によって伸長可能となる。ＦＰＧ−ＤＮＡグリコシラーゼは無塩基部位の５’および３’側の両方を開裂する。
【００４９】
好ましくは、伸長された核酸を、核酸の無塩基部位で開裂する酵素を用いて無塩基部位で開裂する。
【００５０】
更に、好ましくは酵素は無塩基部位の５’側を開裂し、遊離の３’ＯＨ末端を生成するＡＰエンドヌクレアーゼ、特にＡＰエンドヌクレアーゼＩＶである。
【００５１】
伸長されたプライマーを３’−エンドヌクレアーゼで開裂する場合、それらの酵素による伸長されたプライマーの開裂は伸長されたプライマー中の修飾された塩基の存在に依存し、開裂は修飾された塩基の導入部位の３’側（すなわち下流）のホスホジエステル結合で起こる。グリコシラーゼおよびＡＰの部位開裂の作用とは対照的に、３’−エンドヌクレアーゼによる伸長されたプライマーの開裂は修飾された塩基の切り出しを伴わず、無塩基部位の生成を伴わない。３’−エンドヌクレアーゼによる開裂は伸長されたプライマー中の修飾された塩基の存在、および酵素による該修飾された塩基の認識に依存する。開裂は通常、修飾された塩基／ヌクレオチドの３’側にある第２のホスホジエステル結合で起こる。この開裂事象によってＤＮＡ鎖にニックが生成され、３’−ＯＨおよび５’−ホスホリル基が生成される。次いで反応に存在するＤＮＡポリメラーゼは遊離の３’ＯＨ基から伸長できる。上記のように、３’エンドヌクレアーゼはＥ． ｃｏｌｉ由来のエンドヌクレアーゼＶであってもよい。エンドヌクレアーゼＶはＤＮＡ中のいくつかの修飾された塩基（ウラシル、ヒポキサンチン（イノシン）、および尿素残基を含む）を認識する。修飾された塩基を有するＤＮＡの開裂に加え、エンドヌクレアーゼＶは無塩基部位を含有するＤＮＡも開裂する。従って一定の状況では、エンドヌクレアーゼＶを使用し、ＤＮＡ中に無塩基部位を生成するＤＮＡグリコシラーゼの作用と組み合わせて、伸長されたプライマーを開裂することができる。
【００５２】
ある態様では、標準的な前駆体ヌクレオチドの１つが修飾された前駆体ヌクレオチドで部分的に置換される。
【００５３】
例えば、修飾された前駆体ヌクレオチドｄＵＴＰに加えて前駆体ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰを使用するテンプレート上でのプライマー伸長によって、チミンがランダムにウラシルで置換された、テンプレートに相補的な新たに合成されたＤＮＡが得られる。ＤＮＡ合成過程で、テンプレートＤＮＡ鎖中のアデニン残基に相補的な位置でウラシルが新たに合成されたＤＮＡに導入される。従って置換された下流フラグメントは、新たに合成されたＤＮＡ中のｄＵＭＰのランダムな導入位置によって制限される。これによって、テンプレート核酸鎖中のＡ残基の反対側の相補鎖中へのｄＵＴＰ対ｄＴＴＰ導入の組み合わせ（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）に従って複数のサイズの置換されたフラグメントが生成される。
【００５４】
同様の方法でｄＧＴＰをｄＩＴＰで、またはｄＧＴＰを８−ＯＨ ｄＧＴＰで置換することにより、テンプレートに相補的な新たに合成されたＤＮＡ中のｄＧＴＰの全部または一部が、テンプレートＤＮＡ鎖中のシトシン残基に相補的な位置で、それぞれヒポキサンチンまたは８−ＯＨグアニンで置換される。１つ以上の標準的なＤＮＡ前駆体の全部または一部を１つ以上のジデオキシ停止ヌクレオチド（一度導入されるとテンプレート上でのプライマーの更なる伸長を不可能とするヌクレオチド）で置換することを使用して、必要によってＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長を停止させることができる。１つ以上の標準的なＤＮＡ前駆体の一部を１つ以上のジデオキシ停止ヌクレオチドで置換すると、テンプレート鎖上の多くの異なる位置でプライマーの伸長が停止し、多くの異なる長さの停止されたプライマーが生成される。１つ以上の標準的なＤＮＡ前駆体の全部を１つ以上のジデオキシ停止ヌクレオチドで置換すると、テンプレート鎖上の特定の位置でプライマーの伸長が停止し、特定の長さの停止されたプライマーが生成される。１つ以上の修飾された前駆体ヌクレオチドを、１つ以上のＤＮＡグリコシラーゼと共にＧＭＡに使用してもよい。２つのＤＮＡグリコシラーゼを使用してもよく、これによって一方は修飾された塩基をプライマーから遊離させ、他方は新たに合成されたＤＮＡに導入されると修飾された塩基を遊離する。
【００５５】
必要により、本発明にかかる方法の工程ｉ）およびｉｉ）またはｉ）−ｉｉｉ）を、試薬の１つが限界となるまで循環させて継続することができる。
【００５６】
本発明にかかる方法は等温条件下で実施することができる。
【００５７】
従って、方法が等温である場合、熱サイクルは必要ではない。
【００５８】
本発明にかかる方法は、１つのプライマーを使用するプライマー伸長反応において複数の、新たに合成された、別々のＤＮＡセグメントを増幅できる、唯一の等温増幅反応である。
【００５９】
認識されるように、本発明にかかる方法によって核酸相補鎖中の修飾された塩基の位置によって特定された核酸の置換された１本鎖下流フラグメントが蓄積する。
【００６０】
従って、本発明にかかる方法によって開始プロモーターの下流に異なる１本鎖プライマーの複数のコピーを生成する方法が提供される。個別の下流プライマーは標的テンプレート核酸が存在する時にのみ生成されるので、これによって検出目的のための他に例を見ないような特異性が得られる。従ってＤＮＡ診断に関して、ＧＭＡは特異性の点で、これまでに報告された増幅方法より著しく改善されたものである。
【００６１】
１つのテンプレートサンプルからの複数のＤＮＡセグメントの増幅が強く求められているが、現在の増幅技術では限界がある。この限界は、既存の技術が指数的な増幅を使用しており、そして／または、より扱いにくく、２本鎖産物もしくは大きいサイズの１本鎖産物を生成する、という事実に起因する。
【００６２】
本発明にかかる方法はＤＮＡセグメントの多重増幅のための既存の方法にまさる著しい利点を有する。
【００６３】
本発明にかかる方法を使用して、開始核酸プライマーの下流の個別の１本鎖プライマーの複数のコピーを生成することができる。
【００６４】
置換された下流フラグメントは第２の反応で伸長できる。
【００６５】
更に、置換された下流フラグメントを第２のテンプレート核酸上で伸長することができる。
【００６６】
また複数の第２のテンプレートをＤＮＡチップ上に固定することができる。
【００６７】
本発明のこれらの観点について更に以下に記載する。
【００６８】
本発明にかかる方法を検出診断に使用することができる。従って、例えば方法を病原体の検出に使用できる。
【００６９】
本発明にかかる方法を変異の存在または不在の検出、および多形の検出に使用することもできる。
【００７０】
認識されるように、本発明にかかる方法をサンプル中の核酸レベルの定量に使用することができる。
【００７１】
本発明にかかるＧＭＡ法はいくつかの方法を用いて定性および定量の両方を行うことができる。従って、ＩＰおよび／またはテンプレート核酸上のその相補的アニーリング部位の特性および量を、テンプレート上でＧＭＡ反応を起動するＩＰの能力によって評価することができる。本発明に従って得られる分解能は、必要により、ＩＰおよび／またはテンプレートもしくは標的核酸間の１個の塩基の違いを確認できるほど高くすることができ、これはＧＭＡ反応をうまく起動させられることに基づく。ＩＰは天然に存在する核酸から直接または間接的に誘導してもよく、ＧＭＡによってＩＰの定性的および定量的キャラクタリゼーションが可能となるため、ＧＭＡを使用して核酸の定性的および定量的キャラクタリゼーションを行うことができる。これは核酸の検出、診断、および定量の分野で非常に有用である。これには例えば、組織サンプル中のある種の細菌およびウィルスのような病原性微生物の検出および定量、その中の変異体の検出、ヒトの疾病の原因となる変異の検出、１個のヌクレオチド多形の検出、および特定のｍＲＮＡ種の量／力価の定量がある。
【００７２】
本発明にかかる方法は定量の分野で既存の技術をはるかに越えた利点を有する。ＧＭＡの反応速度論は直線であるため、ＧＭＡ反応は、指数関数的速度論を有する既存の増幅技術より測定／定量が容易である。
【００７３】
本発明にかかる方法はコンタミネーション制御の領域でも既存の技術をはるかに越えた利点を有する。この理由は、既存の技術と異なり、基本的なフォーマットのＧＭＡは開始プライマーがその後に使用するための新たなテンプレートを合成せず、この過程の反応論が直線であることである。
【００７４】
本発明にかかる方法をプライマーまたはテンプレートとして機能できる核酸からのシグナル増幅に使用することもできる。
【００７５】
本発明にかかる方法は既存の技術よりはるかに優れており、１個の直線テンプレートを使用して、開始プライマーからのシグナル増幅が可能となる。ＧＭＡでは増幅された置換型の下流フラグメントに開始プライマーが導入されない。これによって、置換された下流フラグメントは常に開始プライマーである５’尾部を有さないという利点が与えられる。更にこれは置換された下流フラグメントが第２の反応で伸長されて、開始プライマーに相補的な配列の無い、相補的置換型下流フラグメントを生成できることを意味する。
【００７６】
本発明にかかる方法は特有のものであり、１つの反応容器内で実施でき、テンプレート上でのＩＰの伸長によってＩＰとは異なる新たなプライマーが生成および増幅され、このプライマーはその後、それが誘導された同じテンプレートまたは別のテンプレート上でＩＰとして作用する。
【００７７】
本発明のある態様について、図１に関連して以下のように例証する：
事象１ プライマーがテンプレート上の相補的配列に結合する；
事象２ 結合後、プライマーの遊離３’ＯＨ末端がＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。これはプライマーの３’ＯＨ末端への前駆体ヌクレオチドの重合化によって起こる。テンプレートの配列に従って、前駆体ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および／またはｄＴＴＰ）が修飾された前駆体ヌクレオチドに加えて伸長プライマーに導入される。修飾された前駆体ヌクレオチドは一般に、標準的な前駆体ヌクレオチドの１つを完全に、または部分的に置換する。新たに合成されたＤＮＡ鎖は最初のテンプレートに相補的であり、ここでは相補的テンプレート鎖と呼ぶ；
事象３ 修飾された前駆体ヌクレオチドが新たに合成されたＤＮＡに導入されると、そのＤＮＡは特定のＤＮＡグリコシラーゼの基質である修飾された塩基を含有する。その結果として、修飾された塩基が新たに合成されたＤＮＡに現れるたびに、ＤＮＡ中のデオキシリボース部分にその塩基を結合させるＮ−グリコシラーゼ結合の開裂によってそれがＤＮＡから遊離される。これによって無塩基部位が生成されるが、これは本質的に、近接側および末端側（すなわちデオキシリボース部分の５’および３’（ ５’結合が元のプライマーに最も近い））でホスホジエステル結合によって隣接するＤＮＡに結合するデオキシリボース部分である；そして
事象４ 無塩基部位は例えばＡＰエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ）酵素の基質である。その結果として、無塩基部位が現れるたびにＡＰＥによって開裂される。この酵素はデオキシリボース部分の５’側のホスホジエステル結合を開裂し、上流ＤＮＡセグメント上に遊離３’ＯＨ末端および下流セグメントの５’末端に結合するデオキシリボース部分を生成する。
【００７８】
事象５ 反応中に存在するＤＮＡポリメラーゼは、上流フラグメントが新たに生成されるたびに、その３’ＯＨ末端から新たなＤＮＡを合成し、その間に重合化の下流ＤＮＡを１本鎖として置換する。これによって新たな前駆体ヌクレオチド（修飾された前駆体ヌクレオチドを含む）が新たに合成された相補的テンプレート鎖に導入され、テンプレート核酸中のその相補的塩基の反対側の新たに合成された鎖の各位置に新しい修飾された塩基が出現する。
【００７９】
従って、この態様にかかる反応工程ｉ）からｉｉｉ）は、試薬の１つが限界となるまで連続的に循環する。
【００８０】
反応のサイクルで生成されたそれぞれの遊離３’ＯＨ末端はその後の反応サイクル毎に１回伸長され、下流ＤＮＡセグメントがそれに付随して置換される。反応は連続的であるため、正味の結果は、生成された各３’ＯＨ末端からの新たなＤＮＡの反復合成、および個別のサイズの個別の１本鎖フラグメントとしての置換された下流ＤＮＡ（ここでは置換された下流フラグメント、または置換されたフラグメントと呼ぶ）の蓄積であり、これはポリメラーゼによるＤＮＡ合成の停止のため、相補鎖および／または３’末端中の修飾された塩基の位置によって規定される。
【００８１】
伸長および開裂されたプライマーはポリメラーゼによるヌクレオチド（修飾された前駆体ヌクレオチドを含む）の導入により、直ちに再び伸長される。標準的な前駆体ヌクレオチド、修飾された前駆体ヌクレオチド、ポリメラーゼ、グリコシラーゼ、および開裂物質は全て、同じ反応中に同時に存在するので、伸長および開裂の連続的サイクルによって置換された下流フラグメントの多数のコピーが増幅される。
【００８２】
修飾された前駆体ヌクレオチドがｄＵＴＰの場合、修飾された塩基はウラシルであり、これを使用する場合、特異的ＤＮＡグリコシラーゼはウラシルＤＮＡグリコシラーゼである。それゆえ、置換された下流フラグメントは相補鎖中のウラシルの位置、従ってテンプレート核酸中のアデニン塩基の位置によって限定または規定されるが、これはウラシルがアデニンと通常のワトソン・クリック塩基対を形成するためである。
【００８３】
従って、手短に言えば、プライマーがテンプレートに結合し、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。デオキシＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＵＴＰが伸長プライマーに取り込まれる。次いで、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼが新たに合成された鎖中のウラシル塩基を切り出し、得られる無塩基部位がＡＰエンドヌクレアーゼ酵素によって開裂される。
【００８４】
あるいはまた、３’エンドヌクレアーゼは新たに合成された鎖中のウラシルを認識し、ウラシル部分の３’側にある第２のホスホジエステルで鎖を開裂する。
【００８５】
次いで、ＤＮＡポリメラーゼは新たに生成された３’ＯＨ末端から、それらが生成されるたびに新たなＤＮＡを合成し始め、重合化が進行するにつれて３’または下流ＤＮＡを置換する。ここでも、これによって更なるウラシルが新たに合成されたＤＮＡに導入され、その後これが切り出され、そして／または認識され、ＤＮＡが開裂され、新たな３’ＯＨ末端から重合化が開始される。
【００８６】
ＧＭＡは中温または高温で実施してもよい。ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントｅｘｏを中温（通常２５℃から４２℃の間。一般的には３７℃）で使用してもよく、あるいは高温で（一般的には５０℃から８０℃の間であるが、より高くてもよい）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（シュトッフェルフラグメント）由来の鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ）を使用してもよい。両タイプのポリメラーゼを合わせて、または連続的に反応に加えてもよい。ポリメラーゼがＤＮＡから分離する前にかなりの長さまでプライマーを伸長させることができるような高い加工性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）が必要とされる場合は、加工性の高いポリメラーゼを使用することができる。対照してみると、ポリメラーゼがＤＮＡから解離する前にプライマーが短い長さまで伸長されるように低い加工性が必要とされる場合、低加工性ポリメラーゼを使用できる。ＲＮＡテンプレートを使用する場合、鎖置換活性を有する逆転写酵素をＧＭＡ反応に使用してもよい。
【００８７】
最も単純な場合には、人工または合成のプライマーをＩＰとして提供し、所定のテンプレートまたは標的核酸上でＧＭＡ反応を起動する。ＩＰは、テンプレート中の特定の標的配列にハイブリダイズするように選択する。ＩＰのハイブリダイゼーションに次いで、ＧＭＡが開始され、伸長されたＩＰは循環反応で反復して伸長され、置換された下流ＤＮＡフラグメントが増幅される。これらの置換されたフラグメントは、公表されている方法に従って多くの異なるアプローチで定性的および定量的にキャラクタライズすることができる。
【００８８】
置換されたフラグメントの直接検出は種々の方法で行うことができ、例えばそれらを好適に標識してもよい。
【００８９】
置換されたフラグメントの標識は種々の方法によって行うことができ、それらには、合成の際、または後の、放射性リガンド、蛍光リガンド、または検出可能なリガンドのフラグメントへの付加がある。標識された前駆体ヌクレオチドを伸長反応において使用することによって、これらのフラグメントの検出が容易になる。銀または臭化エチジウム染色のような直接的なＤＮＡ染色法によって、電気泳動移動度に基づくサイズ分離後のそれらの検出が容易となる。それらのフラグメントへの相補または試験核酸のハイブリダイゼーションを使用してそれらを同定してもよく、そのような相補または試験核酸を置換されたフラグメントに直接固定化およびハイブリダイズさせてもよい。この点では、ＤＮＡマクロアレイ、ＤＮＡマイクロアレイ、およびＤＮＡチップは非常に好適である。あるいはまた、置換されたフラグメントが架橋ハイブリダイゼーション分子として作用し、１つの試験核酸（固定化してもよい）が置換されたフラグメントの一部にハイブリダイズし、第２の試験またはレポーター核酸が置換されたフラグメントの残部にハイブリダイズするようにしてもよい。ここでも、ＤＮＡマクロアレイおよびＤＮＡマイクロアレイはこれに関して非常に好適である。
【００９０】
相補または試験核酸は、種々の直接的または間接的な標識方法（例えばレポーター−クエンチャー蛍光色素法）によって好適に標識してもよい。置換されたフラグメントは１本鎖なので、相補的な分子へのハイブリダイゼーションによって２本鎖核酸が生成され、これを２本鎖特異的プローブ（例えばＳＹＢＲグリーン）を使用して検出してもよい。これは本発明にかかるＧＭＡ反応で、２本鎖ＤＮＡに特異的に結合するＳＹＢＲグリーン試薬に加え、置換されたフラグメントに相補的なＤＮＡを含めることによって行ってもよい。
【００９１】
置換されたフラグメント、特にその３’末端の配列は、その後の反応または同じＧＭＡ反応において開始プライマーとして機能するその能力によって測定することができる。本質的にそれらの測定は、それらのフラグメントおよび特にその３’末端が選択された条件下でテンプレート上の選択された相補的配列にハイブリダイズし、第２のＧＭＡ反応においてＩＰとして機能する能力に基づく。認識されるように、テンプレート上の相補的配列およびテンプレート分子そのものの選択には多くの可能性がある。それでもなお、置換されたフラグメントがＧＭＡ反応において自身の力でＩＰとして機能する能力は選択した標的配列へのハイブリダイゼーション、またはそれへのハイブリダイゼーションの欠如の基準であり、従って置換されたフラグメントの一部または全部の配列の特性の測定はこの基準に基づく。
【００９２】
置換されたフラグメントの検出は特異性の観点から非常に有利である。なぜならその生成は以下に依存するためである：ａ）標的テンプレートにＩＰがうまくハイブリダイズすること、そしてｂ）正しいテンプレート上でＧＭＡ反応が起動されること。従って、予想される置換されたフラグメントが検出されるということは、ＩＰが正しいテンプレート上の正しい領域にハイブリダイズしたという証拠である。
【００９３】
置換されたフラグメントの同定または配列は種々の方法を使用して確認することができ、それらにはハイブリダイゼーション、質量測定、そして核酸に直接ライゲートするその能力または１つ以上の核酸分子のライゲーションに必要とされる相補鎖として作用するその能力がある。例えば直鎖の試験ＤＮＡの５’および３’末端をライゲートさせて環を形成するための架橋ハイブリダイゼーション分子としての役割を果たすその能力を評価することによって検出およびキャラクタライズすることができる。その後、ハイブリダイズした置換されたフラグメント、または更なるプライマーは新たな環状テンプレート上でのＧＭＡ反応のＩＰの役割をし、ローリングサークル複製（ＲＣＲ）機構によってＤＮＡが増幅される。
【００９４】
留意すべきことに、置換された下流フラグメントはＩＰとして作用することに加え、その後のＧＭＡ反応のテンプレートとしても作用する。
【００９５】
ＩＰを生成できる多くの方法がある。いずれの場合にも供給または生成されるＩＰは、その後のＤＮＡ重合化工程を起動できるように遊離の３’ＯＨ末端を有さなければならない。
【００９６】
ＩＰを人工的に合成することによって、ＩＰの合成、設計、および修飾の点で多くの可能性が与えられる。人工的に合成されたプライマーの多くの異なる修飾が既に報告されている。それらには塩基、糖、およびホスホジエステル結合の修飾があり、また、グリコシラーゼの基質塩基（例えばウラシル、ヒポキサンチン、および８−ヒドロキシグアニン）をプライマーに導入するためのものがある。
【００９７】
一般に、標準的な、または修飾されたＩＰはテンプレート核酸上のその相補的配列の全部または一部と特異的に対合するように合成される。十分確立されているところによれば、伸長できる可能性のあるプライマーの３’末端およびテンプレートの塩基間の相補性はＩＰがそのテンプレート上で伸長されるかどうかを決定する重要なパラメーターの１つである。テンプレートの一部に完全に相補的であるＩＰはＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能であるが、テンプレートの一部に、その３’末端の塩基を除いて完全に相補的であるＩＰはストリンジェントな条件下で伸長されない。従って、認識されるように、テンプレート上でのＩＰの伸長を使用して、１塩基だけが異なるような近い関係にあるＩＰ間の識別をすることができる。同様に、認識されるように、テンプレート上でのＩＰの伸長を使用して、１塩基だけが異なるような近い関係にあるテンプレート間の識別をすることができる。この方法はヒト遺伝学の分野で特に重要なものであり、これによって変異および単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）のような多形の検出をすることができる。
【００９８】
ＩＰおよびテンプレート間のハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーはかなり変化させられることが十分確立されている。低ストリンジェンシー条件によってＤＮＡ分子間の低特異性ハイブリダイゼーションが可能となる。従って低ストリンジェンシー条件下では、部分的に相補的なＤＮＡ分子が互いにハイブリダイズできる。そのため、それらの条件下では部分的に相補的なＩＰがテンプレートにハイブリダイズする。それらの条件下では、１つのＩＰがテンプレート核酸上の部分的に相補的な１つ以上の部位でハイブリダイズおよび伸長されうる。ストリンジェンシー条件が非常に低くて複数の部位でプライミングが起こる場合、工程はランダム・プライミングと呼ばれる（ただしプライミングは完全にランダムなのではなく、ＩＰの一番３’側の５塩基とテンプレート間十分対合していることが一般に必要とされる）。ストリンジェンシーが高くなるにつれ、ハイブリダイゼーションの特異性が高くなり、完全に相補的なプライマーのハイブリダイゼーションだけが起こり、部分的に相補的なプライマーは、たとえそれが１つの塩基が異なるだけであっても、ハイブリダイズしないようなハイブリダイゼーション条件は容易に確認できる。ハイブリダイゼーションの際、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが変更されうるような多くのパラメーターがある（例えば温度）。温度が高くなるほどハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは高くなる。その結果として、ＤＮＡ分子間のハイブリダイゼーションに依存する酵素過程において、より高い温度でより高い特異性が得られる。しかしながら、より高い温度での酵素過程では、通常、熱安定酵素が必要とされる。
【００９９】
人工的に合成されたプライマーまたは天然の核酸の開裂後にＩＰを生成させ、新たな遊離３’ＯＨ末端が生成されるようにしてもよい。開裂は１本鎖もしくは２本鎖に依存する、１本鎖もしくは２本鎖の状況に置ける修飾された塩基の存在に依存する、配列に依存する、不対合の存在に依存する、または特定の構造の存在に依存する、のいずれかであってもよい。従って、１本鎖または２本鎖の状況で特異的グリコシラーゼによって認識される修飾された塩基を有するプローブのグリコシラーゼ介在型開裂を通してプライマーを生成してもよい。ＩＰの生成は、例えばプローブがテンプレート核酸にアニールする場合、２本鎖の状況で不対合特異的エンドヌクレアーゼまたはグリコシラーゼによって認識される不対合塩基を有するプローブの開裂によって行ってもよい。これは塩基の不対合がプライマーとテンプレート間のハイブリダイズしたセグメントの１つ以上の位置で生成されるようにプライマーを設計し、２本鎖核酸の不対合塩基で特異的に開裂することが既に明らかになっている１つ以上の種々のエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡグリコシラーゼと共にインキュベートすることによって行うことができる。これらにはＴ７エンドヌクレアーゼＩ、ＭｕｔＹ、ＤＮＡグリコシラーゼ、チミン不対合ＤＮＡグリコシラーゼ、およびエンドヌクレアーゼＶがある。
【０１００】
ＩＰは、開裂酵素（ｃｌｅａｖａｓｅ）のような構造特異的酵素を使用し、重複オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによって生成された複合体を開裂することによって生成してもよい。
【０１０１】
プライマーは３’末端をブロッキングして合成し、プライマーの開裂によって保護基を遊離させない限りプライマーが伸長されないようにしてもよい。それらのプライマーをここでは３’−保護プライマーと呼ぶ。プライマーの保護された３’末端はいくつかの方法で得ることができ、それらには３’リン酸エステル化、３’末端におけるジデオキシヌクレオチドの導入、３’アミンまたは３’チオール基を有するプライマーの合成、３’末端に１つ以上の逆向き（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ヌクレオチドを有するプライマーの合成、またはＤＮＡリアーゼによる無塩基部位の開裂がある。
【０１０２】
従って本発明のある態様では、非相補的な３’末端を有するように（すなわちその３’末端がテンプレートに相補的でないように）プライマーを合成し、３’末端がプライマーの開裂によって遊離されない限りプライマーが伸長されないようにしてもよい。
【０１０３】
非相補的な５’末端を有するようにプライマーを合成し、開裂によってテンプレート核酸からプライマーが解離するようにしてもよい。その後、解離したプライマーは別のテンプレート上でのＧＭＡ反応においてＩＰとしての役割を果たす。
【０１０４】
３’保護プライマー脱保護し、非相補的３’末端または非相補的５’末端を遊離させるためのプライマーの開裂は、テンプレート核酸の全部または一部へのプライマーのハイブリダイゼーションによって行ってもよく、これによって開裂に次いで、新たな遊離３’ＯＨ末端を有するＩＰが生成され、同一の、または別のテンプレート上でＩＰが伸長されるようになる。この場合のテンプレート上で伸長できるようになるためのハイブリダイズしたプライマーの開裂には、そのプライマーのハイブリダイズしたセグメントにおける１つ以上の位置でプライマーが開裂される必要がある。これは、プライマーが３−アルキルプリンＤＮＡグリコシラーゼ（例えばＡｌｋＡ）の基質である修飾された塩基、ヒポキサンチンを含有するように設計することによって行うことができる。
【０１０５】
本発明の更なる態様では、熱安定性開裂物質を使用して、ハイブリダイズしたプライマーを修飾された塩基または不対合塩基で開裂し、プローブが開裂されると２つ以上のフラグメントが熱的に不安定となり、標的核酸から解離し、それによって別の完全長のプライマーがハイブリダイズできるようになる。この往復過程がシグナル（開裂されたプライマーの生成の増加）を増幅する。その後、３’ＯＨ末端を有する開裂された産物はその後の、または合わせた（ｃｏｕｐｌｅｄ）ＧＭＡ反応においてＩＰとしての役割を果たすことができる。
【０１０６】
ＩＰは、修飾された塩基でプライマーを開裂することによって生成してもよく、それらの開裂はテンプレート上のプライマーの伸長に依存する。これによって元のプライマーより小さいＩＰの生成が可能となり、これは種々の方法でキャラクタライズできる。例えば、Ｅ． ｃｏｌｉのウラシルＤＮＡグリコシラーゼはプライマーの３’位の最末端または末端から２番目からウラシルを遊離しない。しかしながら、プライマーがテンプレート上で伸長されれば、プライマーの３’位の最末端または末端から２番目にあったウラシルは新たに伸長された核酸の３’末端から更に離れた位置となり、従って遊離される。このように遊離３’ＯＨ末端を有し、元のプライマーより１または２塩基短いプライマーが生成され、その後のＧＭＡ反応のＩＰとなる。
【０１０７】
ＩＰは以下のようなＤＮＡまたはＲＮＡ開裂物質を用いた完全または部分的な酵素的または化学的な開裂によって天然に存在する、または増幅した核酸から生成してもよい：増幅の際の通常のＤＮＡ塩基のグリコシラーゼ基質塩基への変換またはそれらの塩基の導入に次ぐＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、ＤＮＡの部分的または完全な脱プリンまたは脱ピリミジン後のＡＰエンドヌクレアーゼ、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドにおいてＲＮＡまたはＤＮＡを開裂する酵素（例えばＲＮアーゼＨ）、および核酸ハイブリッド分子（例えばＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよびＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド）の変性および再アニーリング後に生成されたＤＮＡ不対合で開裂する酵素。ＤＮＡまたはＲＮＡの酵素的または化学的開裂は、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されない３’末端を生成しうる。それらの３’末端は一般に、３’ホスファターゼ活性を有するＡＰエンドヌクレアーゼＩＶまたはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼのような１つ以上の酵素で処理することによって伸長可能にすることができる。開裂物質が２本鎖、１本鎖、または配列特異的であってもよいことは十分確立されている。２本鎖または１本鎖核酸を、それぞれ１つ以上の開裂物質を使用して開裂して小さな２本鎖または１本鎖フラグメントとし、その後ＧＭＡを行ってもよい。これによって置換されたフラグメントのサイズを制限する方法が提供される。
【０１０８】
デュプレックス分子の１本鎖の開裂またはニック生成によって遊離３’ＯＨ末端を有する核酸断片が得られ、これはＧＭＡ反応においてそれがハイブリダイズするテンプレート上で、または別のテンプレート上で、ＩＰとして直接機能できる。デュプレックス分子の１つの鎖の開裂またはニック生成はある種の開裂物質を使用して行うことができる。少量のヌクレアーゼ酵素（例えばＤＮアーゼ）で非特異的に核酸にニックを生成することができ、これによって核酸テンプレート上の多くの位置から多くの異なる置換された下流フラグメントが生成される。
【０１０９】
より特異的な物質、例えば制限酵素Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ（ＤＮＡの認識配列ＧＡＧＴＣの３’側の４塩基下流にニックを生成する）を用いて核酸にニックを生成することができる。あるいはまた、制限酵素、例えばＨｉｎｃＩＩまたはＢｓｏＢＩを用いて核酸にニックを生成することができるが、これは一方の鎖だけが修飾された２本鎖ＤＮＡの未修飾鎖に特異的認識部位でニックを生成し、それによって遊離３’ＯＨ末端を生成する。ＲＮＡをある種のＲＮアーゼ、より特定して言えば配列または構造特異的ＲＮアーゼ（例えばリボザイム）で非特異に開裂してもよい。ＲＮアーゼＨはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを開裂する。従って、逆転写酵素によるＲＮＡテンプレート上でのｃＤＮＡの合成の後、ＲＮＡをＲＮアーゼＨで開裂することができる。オリゴヌクレオチドＤＮＡ分子をＲＮＡ上の１つ以上の配列にさせた後、ＲＮアーゼＨによってＲＮＡを特異的に開裂することができる。
【０１１０】
特に、オリゴ／ポリｄＴの添加によってｍＲＮＡ種の２本鎖の３’ポリＡ尾部を生成する方法が提供される。ＲＮアーゼＨの添加によってポリＡ尾部が消化され、各ｍＲＮＡ種に独自の３’末端が提供される。この方法によってサンプル中の各ｍＲＮＡ種がＧＭＡでＩＰとして作用できる可能性がありうるような方法が提供される。
【０１１１】
２本鎖核酸を開裂してその遊離３’ＯＨ末端を露出させ、開裂したＤＮＡがＧＭＡにおいてＩＰとして機能できるようにしてもよい。例えば２本鎖ＤＮＡを熱によって変性させてもよい。あるいはまた、デュプレックスＤＮＡを５’末端から段階的な非加工性の（ｎｏｎ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）反応で加水分解するＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼで処理してもよい。この酵素は１本鎖ＤＮＡ上では不活性であり、従ってデュプレックス領域がもはや存在しない場合、停止する。
【０１１２】
重要なことに、デュプレックス分子の１本鎖の不対合での特異的開裂によって３’ＯＨ末端を有する核酸フラグメントが生成され、これは、それがハイブリダイズするテンプレートまたは別のテンプレート上でＩＰとして直接的に機能できる。これによって核酸における変異および多形を同定する方法が提供される。
【０１１３】
この観点では、本発明によって、以下のような方法で核酸中の特定の位置（候補となる遺伝子座）での変異または多形の存在または不在を調査することが可能となる：３’が保護されたプライマーを標的核酸にアニールさせ、候補となる遺伝子座に不対合を生成させる。不対合は一般にプライマーに関して内部に位置する。すなわち、テンプレート上で候補となる遺伝子座の塩基と不対合を生じる塩基はプライマーの５’末端または３’末端ヌクレオチドの塩基残基ではない。不対合特異的グリコシラーゼおよび無塩基部位開裂物質を用いた不対合位置でのプライマーの開裂に際し、プライマーの５’側の開裂断片は３’ＯＨ末端を有し、従ってその同じテンプレートまたは別のテンプレート上でＧＭＡ反応を開始できる。従って得られるＧＭＡは、プライマーのテンプレートへの（逆も同様）結合によって不対合が生じたか生じなかったかによって変異の存在または不在を示す。
【０１１４】
更に、再アニールした核酸ハイブリッド分子を不対合特異的酵素、例えばＴ７エンドヌクレアーゼＩ、ＭｕｔＹ ＤＮＡグリコシラーゼ、チミン不対合ＤＮＡグリコシラーゼ、またはエンドヌクレアーゼＶで処理することができる。ＰＣＲ法による遺伝子増幅とその後の再アニールおよび不対合でのＤＮＡの開裂を不対合特異的修復酵素と組み合わせることによって遊離３’ＯＨ末端が生じ、これはその後のＧＭＡ反応においてその相補鎖からの解離後、異なるテンプレート上でＩＰとしての役割を果たすことができる。
【０１１５】
あるいはまた、標準的な“一度で終わる（ｏｎｃｅ ｏｆｆ）”鎖置換反応またはＧＭＡ反応において鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用して不対合部位に生成された３’ＯＨ末端からの伸長によって置換されたフラグメントが生成され、これはその後のＧＭＡ反応においてＩＰとしての役割を果たす。ＩＰの生成は不対合の存在に依存するので、ＧＭＡ反応の起動は不対合を示す。ゲノム全体を増幅する方法をこの方法と併用し、複数のプローブおよび／または複数のテンプレートを使用して置換されたフラグメントを検出する場合、多くの増幅産物を不対合の存在について試験することができる。選択されたプローブおよび／または選択されたテンプレートを使用して不対合を配することができる。プローブのアレイを使用して、これを広範なゲノム探索または複数の増幅された核酸の同時探索に適用することができる。
【０１１６】
ＧＭＡ反応における変性ＩＰの使用によって、テンプレート上の複数の部位でＧＭＡを起動する方法が提供される。ＩＰの変性を非常に高度にし、それによってテンプレートのランダムな起動をさせてもよい。そのような場合、一般に、ランダムヘキサマーのようなＩＰ、またはその３’配列としてランダムヘキサマーを有するようなより長いプライマーをゲノムＤＮＡのようなテンプレートと共に使用する。より特異的な複数の起動を、低レベルの変性を有するＩＰで行ってもよい。
【０１１７】
本発明にかかる方法を、ＧＭＡによって提供される新規のシグナル増幅法として使用することができる。ＧＭＡ反応で生成される伸長されたＩＰおよび置換されたフラグメントは遊離の３’ＯＨ末端を有し、伸長可能なプライマーとして機能することができる。鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用して、テンプレート上でのＧＭＡの際に生成される置換されたフラグメントは、好適なテンプレートがあれば、第２のＧＭＡ反応でＩＰとして自由に機能できる。テンプレートは同一の反応で、またはシグナル増幅の方法として別の反応で提供してもよい。シグナル増幅に使用するために提供するテンプレートをここではシグナル増幅テンプレートまたはブースターテンプレートと呼ぶ。これは元のテンプレートの量が少ない場合（これは最初のＧＭＡでゲノムＤＮＡをテンプレートまたは標的核酸として使用する場合にしばしば起こる）、特に重要である。ブースターテンプレートは、興味の開始プライマーに相補的な内在性配列（ここでは‘ＩＰ結合部位’と呼ぶ）を有するように合成する。一般にこの配列は、ＧＭＡ反応の際に生成される伸長された開始プライマーまたは置換されたフラグメントに相補的である。一般に、ＩＰ結合部位はブースターテンプレートの３’末端にある（ブースターテンプレートは、ＩＰを５’から３’方向に重合化および伸長するポリメラーゼによって３’から５’方向に読まれる）。１つ以上の塩基がブースターテンプレート上のＩＰ結合部位の上流（５’）に存在し、これはＧＭＡ反応で使用される修飾された塩基に相補的である。一般にこの塩基はアデニン残基である。これによってＧＭＡ反応の際、修飾された塩基（一般にＵ）がこの位置で伸長するＩＰに導入される。この位置に続く（上流の）配列（ここではブースター配列と呼ぶ）には、最初のＧＭＡ反応で使用される修飾された塩基に相補的な塩基が存在しない。ブースター配列は種々のサイズが可能であり、一般に１８ヌクレオチドより長い。一般に、ブースター配列は偽自己プライミングを防止するために逆向きヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のような３’修飾を有する。ＤＮＡ合成ブロックがブースターテンプレートのＩＰに相補的な領域に含まれて偽自己プライミングを防止してもよい。開始プライマーがブースターテンプレート上でＧＭＡを起動するとブースター配列の相補配列が生成され、ここではこれを相補的ブースター配列と呼ぶ。この手順の正味の効果は、一般にブースターテンプレートが無制限にあるために相補的ブースター配列が高レベルまでコピー／増幅され、生成されるどのＩＰもＧＭＡ反応で起動されていないブースターテンプレートを起動する役割を果たしうることである。相補的ブースター配列は検出目的のための万能レポーターとしての役割を果たすことができる。
【０１１８】
非常に高レベルのシグナル増幅を達成するために、ＧＭＡ反応において修飾された塩基に相補的な１つ以上の塩基がブースター配列（すなわちＢＳ＃１）に続くことも可能である。今度はこのブースター配列に第２のブースター配列（ＢＳ＃２）が続く。ＢＳ＃２は一般にＢＳ＃１と同一である。ＩＰがブースターテンプレート上でＧＭＡ反応を起動する場合、ＢＳ＃１およびＢＳ＃２の相補配列（ここでは相補的ブースター配列＃１（ｃＢＳ＃１）および相補的ブースター配列＃２（ｃＢＳ２）と呼ぶ）が生成される。ｃＢＳ＃１およびｃＢＳ＃２は同一であり、ＢＳ＃１からブースターテンプレートを起動するＩＰとして機能する。それらはＢＳ＃２にも結合するが、ＧＭＡ反応の各サイクルで置換される。この正味の効果は、ブースターテンプレートは一般に無制限にあるためにｃＢＳ＃２を高レベルまで増幅することができ、どのｃＢＳ＃１およびｃＢＳ＃２もＧＭＡ反応で起動されていないブースターテンプレートの開始プライマーとしての役割を果たしうるこりである。
【０１１９】
ブースターテンプレートの設計には多くの可能性がある。ｃＢＳ＃１が最初のＧＭＡ反応で生成されるなら、ｃＢＳ＃１が開始プライマーとして作用するので、ＢＳ＃１およびＢＳ＃２配列のみを有し、それらが修飾された塩基に相補的な１個の塩基で分離されているブースターテンプレートが必要とされる。ブースターテンプレートを、いくつかの異なるＩＰ結合部位（すなわち多くの異なる配列のＩＰの結合および起動を可能とする）、およびそれに続く同一の、または異なるブースター配列ユニットを有するように設計することができる。
【０１２０】
開始されたＧＭＡ反応の進行を検出またはモニタリングするための更なる可能性は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のモニタリングによるものである。ＧＭＡによってテンプレート上でＤＮＡフラグメントの連続的な再伸長（すなわち重合化）が起こるので、新たに合成されたＤＮＡにｄＮＭＰが連続的に導入され、それぞれの導入されたヌクレオチド１リン酸毎にピロリン酸部分（ＰＰｉ）が遊離される。従ってＰＰｉ検出アッセイ（Ｎｙｒｅｎ， Ｐ． （１９８７） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １６７， ２３５−２３８）を使用してＧＭＡ活性を間接的に検出またはモニタリングすることができる。
【０１２１】
前駆体ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰに加えて修飾された前駆体ヌクレオチド（例えばｄＵＴＰ）を使用するＧＭＡ反応では、生成される置換されたフラグメントは、テンプレート鎖中のＡ残基の反対側の新たに合成された相補鎖へのｄＵＴＰ対ｄＴＴＰ導入の組み合わせに従って多くのサイズとなる。そのような場合のブースターテンプレート上の好適なＩＰ結合部位は、ＩＰが最初に起動されたところの５’（テンプレートに関して）側にある最初のテンプレートの部分と同一の配列である。ＤＮＡの配列中で、Ａ残基はテンプレート中の所定の位置に０．２５の頻度で存在すると期待されるので、ｄＵＴＰまたはｄＴＴＰは平均４塩基毎に導入されると期待される。従って、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを使用するＧＭＡ反応では、置換されたフラグメントの期待されるサイズの平均は３ヌクレオチドである。ところが、ＤＮＡポリメラーゼが２つのｄＮＴＰのいずれかを０．５の確率で挿入する場合のｄＵＴＰとｄＴＴＰの割合を使用すると、生成する置換されたフラグメントのサイズは最小３ヌクレオチドから最大サイズの範囲に及び、置換されたフラグメントのサイズが大きくなるほど置換されたフラグメントの生成頻度は低下する。しかしながら、置換されたフラグメントが大きいほどＩＰとして作用する置換されたフラグメントおよびＩＰ結合部位間のハイブリダイゼーションがよりストリンジェントになりうる。従って元のテンプレート核酸上のＩＰ結合部位の５’側の配列と同一であるブースターテンプレート上のＩＰ結合部位が望ましい。例えば、４０ヌクレオチドセグメント内にｄＵＴＰまたはｄＴＴＰが導入されうる位置を１０箇所有するように置換されたフラグメントを選択する場合、置換されたＤＮＡの４０ヌクレオチドに相補的であるブースターテンプレート上のＩＰ結合部位が好適である。
【０１２２】
ＳＮＰまたは変異の検出では、テンプレート核酸を起動するＩＰが、選択されたＳＮＰの位置からテンプレート鎖に関して３’側に位置し、生成される置換されたフラグメントの１つの組み合わせがＳＮＰ部位で規定される３’末端を有するようにしてもよい。そのようなケースでは、テンプレート核酸上のＳＮＰの存在によって、ＳＮＰ部位が存在しなければ生成されない独自の３’ＯＨ末端を有する置換されたフラグメントが生成される。ＧＭＡ反応において標準的な前駆体および修飾された前駆体（例えばｄＴＴＰおよびｄＵＴＰ）の混合物を使用して、置換されたフラグメンが好適なサイズで生成されるようにすることができ、それによってＩＰストリンジェントな条件下でブースターテンプレート上でＩＰ結合部位にハイブリダイズすることが可能となる。更に、ブースターテンプレート上のＩＰ結合部位を、ＳＮＰ部位およびその部位の状態によって規定される独自の３’ＯＨ末端を有する置換されたフラグメントでしか起動されないように設計することができる。これはＧＭＡを支持するキーとなるアデニン残基がブースターテンプレート上の５’の十分近くに位置するようにブースターテンプレートを設計することによって行うことができ、それによって元のテンプレート上のＳＮＰ部位を越えた次のｄＵＴＰ導入位置で規定される３’ＯＨ末端で生成された置換されたフラグメントの３’末端がブースターテンプレート上のキーとなるアデニン残基の反対側または５’側となるようにする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、３’ＯＨ末端がＳＮＰ部位の上流部位（テンプレートとして作用するその鎖の相補鎖に関して）から生成される置換されたフラグメントは、ＩＰ結合部位にハイブリダイズしないため、ブースターテンプレートを起動しない。
【０１２３】
本発明の更なる態様によれば、ＩＰ結合部位を変性させ、多くの異なる開始プライマーの結合部位として作用できるようにしてもよい。２つ以上のブースターテンプレートをＧＭＡ反応に含め、第１のブースターテンプレートから生成されるｃＢＳが第２のブースターテンプレートの開始プライマーとして作用するようにすることができる。これには、第２のブースターテンプレートが多くの異なるＧＭＡ反応で同一であり、そのため万能ブースター配列として役立つという更なる利点がある。これによって１個の終点（ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ）ブースターテンプレートを使用する、検出およびシグナル増幅のための１本化された（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅｄ）工程が容易になる。一般に終点ブースターテンプレートは直接または間接的にＧＭＡのレポーターとしての役割を果たすように設計および合成される。
【０１２４】
ＧＭＡ反応におけるＩＰによって下流の伸長されたプライマーが置換され、これはその後のＧＭＡ反応においてＩＰとしての役割を果たす。これはＳＮＰおよび変異の検出に使用するのに重要である。プライマーをＳＮＰ部位の十分近くに配置して、導入される最初の修飾された前駆体がＳＮＰ部位に、またはその近くに存在するようにしてもよい。従ってプライマーはＳＮＰがその位置に存在するかしないかによって、異なる長さまで伸長される。いくつかの方法（ブースターテンプレート上でのその後のＧＭＡでＩＰとして機能する能力を含む）のいずれかによって、その後のキャラクタリゼーションのために異なって伸長されたプライマーの多くのコピーを生成するのが好ましい。異なって伸長されたプライマーの多くのコピーは、ポリメラーゼ連鎖反応に関して報告されている熱サイクル過程によって得てもよい。あるいはまた、異なって伸長されたプライマーを、このプライマーの５’側（すなわちテンプレート鎖の３’側）でＧＭＡ反応を開始することによって反復して置換してもよい。これはＳＮＰ部位の近傍に位置するプライマーの５’にハイブリダイズするＩＰを使用して行い、このＩＰはＧＭＡを開始する。下流プライマーは同じ反応の各サイクルで伸長されるが、各サイクルで置換もされる。一度置換されると、新たなプライマーがハイブリダイズし、伸長される。
【０１２５】
テンプレート核酸から生成される置換されたフラグメント、およびブースターテンプレートから生成される相補的ブースター配列を５’ヌクレアーゼアッセイで検出してもよい。一般に、５’ヌクレアーゼアッセイは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（テンプレートの下流にアニールするプローブの分解を誘引する）を使用するテンプレート上でのＤＮＡ合成の開始プライマーとして作用するその能力によって、特定の核酸を検出するアッセイである。この変性は反応に使用するポリメラーゼ中の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の存在に基づく。典型的なプローブはレポーター蛍光色素およびクエンチャー色素の両方を近接して有するオリゴヌクレオチドである。プローブの分解によってレポーターとクエンチャーが互いに隔離／分離すると、蛍光強度が上昇する。従って、蛍光の増加は、プローブがテンプレートにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって、それがテンプレート核酸上で開始プライマーを伸長する際、分解されたことを示す。
【０１２６】
このアッセイの変法は、プローブがテンプレートの一部であるが、テンプレートのある部分に相補的であるようなアプローチを使用する。これによって、プローブがテンプレート核酸上の相補配列との塩基対合によってテンプレートの一部とステム（ｓｔｅｍ）を形成し、これによって効率的に、１つの遊離５’末端と１つのループ末端を有する２本鎖ステムが生成される。
【０１２７】
あるいはまた、一方の末端にレポーターを有し、他方の末端にクエンチャーを有する自己相補的プローブを使用してもよい。この場合、プローブが塩基の対合によってステムおよびループを形成してレポーターがクエンチャーに近づき、これによって蛍光がクエンチングされる。完全または部分的に相補的な置換されたフラグメントまたはｃＢＳの存在下でステム・ループ構造を変性させることにより、プローブと置換されたフラグメントまたはｃＢＳ間のハイブリダイゼーションが可能となる。これによってプローブが２本鎖となり、レポーターおよびクエンチャー間の距離が増加し、蛍光強度が上昇する。
【０１２８】
結合したレポーター−クエンチャーとの併用にＧＭＡを適合させることによって独自のブースターテンプレートが提供され、これによってＩＰ検出およびシグナル増幅が同時に行えるようになる。本質的に、ブースターテンプレートはＩＰ結合部位、およびそれに続く自己相補配列（２本鎖ステム・ループ構造の形成によって、結合したレポーター−クエンチャーを近づける）を有するように設計する。ＩＰ結合部位およびステム・ループ構造を形成する配列には、ＧＭＡ反応において修飾された塩基に相補的な塩基が存在しない。ＩＰ結合部位はステム・ループ配列の３’側であり、開始プライマーに相補的な配列および／またはｃＢＳに相補的な配列を含有しうる。ＧＭＡ反応において修飾された塩基に相補的な１つ以上の塩基がステム・ループの５’に存在し、別のｃＢＳに相補的な配列がそれに続く。開始プライマーがレポーター・クエンチャー・ブースターテンプレート上で伸長される場合、正味の効果はブースターテンプレートのＩＰ結合部位およびステム・ループ部分が直線化され、ＧＭＡの際、鎖置換によって２本鎖となり、２本鎖のままである。ブースターテンプレートの５’末端で更なるｃＢＳが合成され、これが今度はＧＭＡ反応において起動していないブースターテンプレートの開始プライマーとして作用することによって、シグナルが増幅される。ステム・ループが直線化され、２本鎖になると、蛍光強度が上昇し、蛍光の測定値が反応におけるＩＰのレベルの基準としての役割を果たす。
【０１２９】
本発明にかかる別のシグナル検出法は、置換されたフラグメントの一部または全部がそれ自体の内部、またはそれ自体の他のコピーとの間のいずれかで、自己相補的であって、２本鎖ＤＮＡを形成するようにブースターテンプレートを設計することを伴う。その後、ＳＹＢＲグリーンのような２本鎖特異的プローブの結合によって２本鎖ＤＮＡを容易に検出できる。
【０１３０】
ブースターテンプレートは環状であってもよい。それらの環状ブースターテンプレートによって、伸長ＤＮＡポリメラーゼを回転環状（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ）複製方式で連続的に進行させる方法が提供される。環状ブースターテンプレートと共に使用できる多くの変法がある。最も単純な形態では、環状ブースターテンプレートが回転環状増幅のテンプレートとしての役割を果たし、ＩＰが環上でのＤＮＡ複製のイニシエーターとして作用してもよい。それらの場合、ＤＮＡはポリメラーゼまたはＤＮＡ前駆体が限界となるまで連続的に合成される。それらのブースターテンプレートをＧＭＡ反応に含めるには、ブースターテンプレートを、ＧＭＡ反応において修飾された前駆体ヌクレオチドに相補的な残基を含有しないように設計する必要がある。
【０１３１】
あるいはまた、１つ以上のＩＰ結合部位、およびそれに続く、ＧＭＡの際に伸長ＩＰへの修飾された前駆体の導入をサポートする残基を有するようにブースターテンプレートを設計してもよい。更にこれに１つ以上のブースター配列が続いてもよい。ＧＭＡ反応において、ブースター配列が先行し、修飾された塩基に相補的な１つ以上の塩基がそれに続いてもよい。ブースター配列の相補配列は、生成されると、起動されていないブースターテンプレートのＩＰとして作用する。その後のブースターテンプレートの起動によって更なる未起動のブースターテンプレートの更なるＩＰが提供され、全てのブースターテンプレートが起動されるまで反応が継続し、試薬の１つが限界となるまで複製が継続される。この方法の正味の効果はブースターテンプレートの全てまたは一部の線状コピーが各サイクルで生成されることである。自己起動ブースター配列を有する第２の相補的ブースターテンプレートを含めることによって、ブースターテンプレートの多くの線状コピーを生成する方法が提供される。その後、２つのブースターテンプレートの線状コピーを互いにハイブリダイズさせて２本鎖ＤＮＡを生成し、これはいくつかの方法（例えばＳＹＢＲグリーンのような２本鎖特異的ＤＮＡ結合物質を含む）によって検出することができる。
【０１３２】
１つのブースターテンプレートを、互いに塩基対を作って２本鎖ＤＮＡを生成するｃＢＳを生成するように設計してもよい。ブースターテンプレートはこの適用に特に好適である。なぜならＤＮＡ環内の自己相補的領域は自己相補的領域内にないＩＰ結合部位にハイブリダイズするＩＰによって、変性を行わずに起動できるためである。対照的に、ＩＰをＩＰ結合部位へ接近させるには完全な２本鎖線状相補ＤＮＡの変性が必要である。
【０１３３】
本発明の別の態様では、ブースターまたは第２テンプレートを固相支持体、例えばミクロ−もしくはマクロ−アレイまたはＤＮＡ‘チップ’に固定化することができる。多くの異なるブースターまたは第２テンプレートをＤＮＡチップに固定化し、次いでこれを使用して多くの異なる核酸および多くの異なるＧＭＡ反応を高情報処理でキャラクタライズすることができる。好ましい態様では、１つがその３’末端を介して第２テンプレートに結合する。これによって、他の反応性を有する３’ＯＨ基が接近できなくなり、従ってポリメラーゼによって伸長されずにテンプレートとしてのみ作用し、それによってバックグラウンド非特異的伸長が低減する。
【０１３４】
本発明の別の態様では、ＤＮＡ算定（ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）におけるＧＭＡの使用を提供する。現在いよいよ認識されているところによれば、固有の物理的および化学的特性によって、ＤＮＡは難解な数学的作業への解決を評価するための方法を提供してもよい。認識されるように、開始プライマー、テンプレート、および／またはブースターテンプレートを情報の個々の、または合わせた断片として作用するように設計することによって、それが問題および／または解決となろうと、数学的な問題の解決は、ＧＭＡ反応を使用して算定することができる。好ましくはＩＰおよびテンプレートは人工的に合成する。また、認識されるようにＤＮＡ算定においてＧＭＡを使用することによって同時操作および並行探索が可能となり、完全な一連の可能性のある解決が引き出される。
【０１３５】
本発明によれば、ここに記載するようなＤＮＡ算定における、および／またはＤＮＡ算定の“手段”としての方法（ここでは集合的にＤＮＡ算定という）の使用を提供する。
【０１３６】
本発明について、以下の実施例によって更に例証する。
【０１３７】
発明の実施の形態
種々の酵素を以下の実施例に使用した。以下に記載するように、これらの酵素には市販のものもあり、またＥ． ｃｏｌｉ株における過剰発現から精製したものもあった。
【０１３８】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＵＤＧ（ＴｍａＵＤＧ）
ＴｍａＵＤＧタンパク質のオープンリーディングフレームをＰＣＲによってＴ． ｍａｒｉｔｉｍａゲノムＤＮＡから増幅した。製造者の説明書（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＰＣＲ産物をｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ過剰発現ベクターに挿入した。次いで製造者の説明書に従って、熱ショックによってコンピテントＴＯＰ−１０ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコンストラクトでトランスフォームした。ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ／ＴｍａＵＤＧコンストラクトを含有する細胞をＯＤ６００が０．６（１０００ｍＬ）となるまで増殖させ、アラビノースを最終濃度０．２％まで添加して過剰発現を誘導した。３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を溶解し、融合タンパク質の精製を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者の説明書に従って行った。溶出したタンパク質を含有する１５ｍＬの画分（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で判定）を回収した。次いでＭｏｎｏ−Ｓ樹脂を使用したイオン交換クロマトグラフィーによって画分を更に精製し、最も濃度の高いタンパク質溶出画分０．５ｍＬを回収し、５０％までグリセロールを添加した後、必要時まで−２０℃で保存した。
【０１３９】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ エンドヌクレアーゼ ＩＶ （ＴｍａＥｎｄｏ ＩＶ ）
ＴｍａＥｎｄｏＩＶタンパク質のオープンリーディングフレームをＰＣＲによってＴ． ｍａｒｉｔｉｍａゲノムＤＮＡから増幅した。製造者の説明書（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＰＣＲ産物をｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ過剰発現ベクターに挿入した。次いで製造者の説明書に従って、熱ショックによってコンピテントＴＯＰ−１０ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコンストラクトでトランスフォームした。ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ／ＴｍａＥｎｄｏＩＶコンストラクトを含有する細胞をＯＤ６００が０．６（１０００ｍＬ）となるまで増殖させ、アラビノースを最終濃度０．２％まで添加して過剰発現を誘導した。３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を溶解し、融合タンパク質の精製を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者の説明書に従って行った。溶出したタンパク質を含有する１５ｍＬの画分（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で判定）を回収した。次いでＭｏｎｏ−Ｓ樹脂を使用したイオン交換クロマトグラフィーによって画分を更に精製し、最も濃度の高いタンパク質溶出画分０．５ｍＬを回収し、５０％までグリセロールを添加した後、必要時まで−２０℃で保存した。
【０１４０】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ エンドヌクレアーゼ Ｖ （ＴｍａＥｎｄｏ Ｖ ）
ＴｍａＥｎｄｏＶタンパク質のオープンリーディングフレームをＰＣＲによってＴ． ｍａｒｉｔｉｍａゲノムＤＮＡから増幅した。製造者の説明書（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＰＣＲ産物をｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ過剰発現ベクターに挿入した。次いで製造者の説明書に従って、熱ショックによってコンピテントＴＯＰ−１０ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコンストラクトでトランスフォームした。ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ／ＴｍａＥｎｄｏＶコンストラクトを含有する細胞をＯＤ６００が０．５（１０００ｍＬ）となるまで増殖させ、アラビノースを最終濃度０．２％まで添加して過剰発現を誘導した。３７℃で８時間インキュベートした後、細胞を溶解し、融合タンパク質の精製を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者の説明書に従って行った。溶出したタンパク質を含有する１５ｘ１ｍＬの画分（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で判定）を回収およびプールした。次いでＭｏｎｏ−Ｓ樹脂を使用したイオン交換クロマトグラフィーによってプールした画分を更に精製し、最も濃度の高いタンパク質溶出画分０．５ｍＬを回収し、５０％までグリセロールを添加した後、必要時まで−２０℃で保存した。
【０１４１】
Ｅ． ｃｏｌｉ エンドヌクレアーゼ ＩＶ （ＥｃｏＥｎｄｏ ＩＶ ）
ＥｃｏＥｎｄｏＩＶタンパク質のオープンリーディングフレームをＰＣＲによってＥ． ｃｏｌｉゲノムＤＮＡから増幅した。製造者の説明書（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＰＣＲ産物をｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ過剰発現ベクターに挿入した。次いで製造者の説明書に従って、熱ショックによってコンピテントＴＯＰ−１０ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコンストラクトでトランスフォームした。ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ／ＥｃｏＥｎｄｏＩＶコンストラクトを含有する細胞をＯＤ６００が０．６となるまで増殖させ（１０００ｍＬ）、アラビノースを最終濃度０．２％まで添加して過剰発現を誘導した。
【０１４２】
３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を溶解し、融合タンパク質の精製を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者の説明書に従って行った。溶出したタンパク質を含有する１５ｍＬの画分（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で判定）を回収した。次いでＭｏｎｏ−Ｓ樹脂を使用したイオン交換クロマトグラフィーによって、プールした画分を更に精製し、最も濃度の高いタンパク質溶出画分０．５ｍＬを回収し、５０％までグリセロールを添加した後、必要時まで−２０℃で保存した。
【０１４３】
Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ ＵＤＧ − チオレドキシン（ＡｆＵＤＧ − Ｔｈｉｏ）
ＡｆＵＤＧタンパク質のオープンリーディングフレームをＰＣＲによってＡ． ｆｕｌｇｉｄｕｓゲノムＤＮＡから増幅した。製造者の説明書（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＰＣＲ産物をｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ ＴｈｉｏＦｕｓｉｏｎ過剰発現ベクターに挿入した。次いで製造者の説明書に従って、熱ショックによってコンピテントＴＯＰ−１０ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコンストラクトでトランスフォームした。ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ−ＴｈｉｏＦｕｓｉｏｎ／ＡｆＵＤＧコンストラクトを含有する細胞をＯＤ６００が０．６（２０００ｍＬ）となるまで増殖させ、アラビノースを最終濃度０．２％まで添加して過剰発現を誘導した。３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を溶解し、融合タンパク質の精製を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者の説明書に従って行った。溶出したタンパク質を含有する１５ｍＬの画分（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で判定）を回収し、必要時まで４℃で保存した。
【０１４４】
実施例１
本発明にかかる方法を使用して２５量体オリゴヌクレオチド（開始プライマー−ＩＰ）を循環的に伸長させたが、これは重合化反応のテンプレートとしての役割を果たす８０量体オリゴヌクレオチド（テンプレート核酸）のある領域に相補的である。相補的領域は８０量体の３’末端から１０塩基目から、８０量体の３’末端から３５塩基目まで伸長した。８０量体の、このＩＰに相補的な領域（ＩＰ結合部位）の５’側の領域を多数のＡ残基を含有するように設計したが、これによって２５量体の循環的伸長の際、ＧＭＡ反応に次いで別々のサイズのＤＮＡフラグメントが生成される。また、特定の数のＧ残基がそれぞれのＡ残基の間に存在するように８０量体を設計した。これによって、α３２Ｐ−ｄＣＴＰの導入により、反応の際に生成される置換された下流ＤＮＡフラグメントを標識することができた。方法のフローチャートを図１に示す。どちらのオリゴヌクレオチドも人工的に合成し、電気泳動後にポリアクリルアミドゲルから切り出して精製した。目的は、本発明にかかる方法によって２５量体が８０量体にアニールし、循環的／反復的に伸長され、標識された１本鎖ＤＮＡフラグメント（置換されたフラグメント）の多数のコピーを生成するかどうかを確認することであった。
【０１４５】
酵素を添加する前に、反応液には以下を含有させた：１００ｆｍｏｌの各オリゴヌクレオチド、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、７ｍＭ ジチオトレイトール、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＵＴＰ、０．０２ｍＭ ｄＣＴＰ、および０．２μＬ α３２Ｐ−ｄＣＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍｌ、約８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（総量１７μＬ）。この混合液に鉱油を積層し、９５℃で２分間加熱した。その後反応温度を３７℃まで低下させ、この温度で保持した。次いで５ユニットのクレノウフラグメント（３’→５’ｅｘｏ）、１ユニットのＥ． ｃｏｌｉウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、および２ユニットのＥ． ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶまたは２μＬのＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａエンドヌクレアーゼＩＶのいずれかをこの順番で添加し、反応液の最終容量を２０μＬとした。エンドヌクレアーゼＩＶを含有しないコントロール反応、およびエンドヌクレアーゼＩＶもウラシルＤＮＡグリコシラーゼも含有しないコントロール反応の場合は、水を添加して最終容量２０μＬとした。エンドヌクレアーゼＩＶの添加後、３０分間隔で反応液から５μＬのサンプルを採取した。ＮａＯＨを最終濃度５０ｍＭまでサンプルに添加した後、９５℃で１５分間加熱した。その後、等量のホルムアミド負荷色素（９８％ホルムアミド、０．０２５％ ブロモフェノールブルー、０．０２５％ キシレンシアノール）を添加した。次いでサンプルを２０％ 変性（７Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、電気泳動を実施してＤＮＡフラグメントのサイズ分析を行った。電気泳動後、ゲルをホスホル・スクリーンに暴露し、次いでイメージをＳｔｏｒｍ（商標）８６０でスキャンした。
【０１４６】
イメージ分析から明らかになったところによれば、エンドヌクレアーゼＩＶを含有する反応液は多くの７０塩基より短い種々のサイズの標識されたＤＮＡフラグメントを含有し、これは時間と共に数が増加し、エンドヌクレアーゼＩＶを含有しないコントロール反応、またはエンドヌクレアーゼＩＶおよびウラシルＤＮＡグリコシラーゼのどちらも含有しないコントロール反応では見られなかった。
【０１４７】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａエンドヌクレアーゼＩＶ標品は内在性および／または混入３’−５’エンドヌクレアーゼ活性を含有した。これはＧＭＡ反応の際、非特異的なバックグラウンド増幅を誘引する。この活性および非特異的増幅を回避するために、エンドヌクレアーゼＩＶ酵素を熱処理した後、ＧＭＡ反応に使用した。エンドヌクレアーゼＩＶ酵素のストックを９０℃で１０分間加熱した後、氷上に５分間以上放置し、次いで５分間以上遠心分離した。Ｅ． ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶ標品はそれらの活性を含有することが観察され、標品は使用前にエキソヌクレアーゼ活性の不活性化も必要であった。
【０１４８】
実施例２
本発明にかかる方法を使用して４１量体オリゴヌクレオチド（開始プライマー−ＩＰ）を循環的に伸長させたが、これはその３’末端で自己相補的、すなわちパリンドローム（ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ）であり、従ってＧＭＡ反応のそれ自体のテンプレートとしての役割を果たす。相補的領域は４１量体の３’末端から２０塩基伸長し、オリゴヌクレオチドのこの部分は本質的にＩＰとして作用する。４１量体の、このＩＰに相補的な領域（ＩＰ結合部位）の５’側の領域をＩＰ結合部位に続いて１個のＡ残基を含有するように設計したが、これによって４１量体の循環的伸長の際、ＧＭＡ反応に次いで別々の２０ヌクレオチドのＤＮＡフラグメントが生成される。また、多くのＧ残基を含有するように４１量体を設計した。これによって、α３２Ｐ−ｄＣＴＰの導入により、反応の際に生成される置換された下流ＤＮＡフラグメント（２０量体）を標識することができた。オリゴヌクレオチドは人工的に合成し、電気泳動後にポリアクリルアミドゲルから切り出して精製した。目的は、本発明にかかる方法によって４１量体がそれ自体にアニールし、循環的／反復的に伸長され、標識された１本鎖２０量体ＤＮＡフラグメント（置換されたフラグメント）の多数のコピーを生成するかどうかを確認することであった。
【０１４９】
酵素を添加する前に、反応液には以下を含有させた：１００ｆｍｏｌの４１量体オリゴヌクレオチド、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、７ｍＭ ジチオトレイトール、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＵＴＰ、０．０２ｍＭ ｄＣＴＰ、および０．２μＬ α３２Ｐ−ｄＣＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍｌ、約８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（総量１７μＬ）。この混合液に鉱油を積層し、９５℃で２分間加熱した。その後反応温度を３７℃まで低下させ、この温度で保持した。次いで５ユニットのクレノウフラグメント（３’→５’ｅｘｏ）、１ユニットのＥ． ｃｏｌｉウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、および２ユニットのＥ． ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶまたは２μＬのＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａエンドヌクレアーゼＩＶのいずれかを添加し、反応液の最終容量を２０μＬとした。エンドヌクレアーゼＩＶを含有しないコントロール反応、およびエンドヌクレアーゼＩＶもウラシルＤＮＡグリコシラーゼも含有しないコントロール反応の場合は、水を添加して最終容量２０μＬとした。３０分間以上、反応を進行させた。ＥＤＴＡを最終濃度１０ｍＭまで添加して反応を停止させた。その後、等量のホルムアミド負荷色素（９８％ホルムアミド、０．０２５％ ブロモフェノールブルー、０．０２５％ キシレンシアノール）を添加した。次いでサンプルを２０％ 変性（７Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、電気泳動を実施してＤＮＡフラグメントのサイズ分析を行った。電気泳動後、ゲルをホスホル・スクリーンに暴露し、次いでイメージをＳｔｏｒｍ（商標）８６０でスキャンした。
【０１５０】
イメージ分析から明らかになったところによれば、検出可能な量の標識および増幅された２０量体オリゴヌクレオチドが各試験反応で生成され、コントロール反応ではされなかった。
【０１５１】
実施例３
本発明にかかる方法を実施例２に記載するようにして、以下のようないくつかの変更を加えて行った：
酵素を添加する前に、反応液には以下を含有させた：１００ｆｍｏｌの４１量体パリンドローム・オリゴヌクレオチド、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＧＴＰ、０．０２ｍＭ ｄＣＴＰ、およびα３２Ｐ−ｄＣＴＰ（容量２０μＬ）。この混合液に鉱油を積層し、９５℃で２分間加熱した。その後温度を６０℃まで低下させ、そのまま保持した。１０ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ・シュトッフェルフラグメント、２μＬユニットのＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａＵＤＧ、および４ユニットのＥ． ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶ（またはエンドヌクレアーゼＩＶを含有しないコントロール反応の場合は水）をこの順番で反応液に添加し、反応液の最終容量を２５μＬとした。エンドヌクレアーゼＩＶの添加後、３０分間隔で反応液から５μＬのサンプルを採取した。これらのサンプルを１０ｍＭ ＥＤＴＡの最終濃度とした。その後、等量のホルムアミド負荷色素（９８％ホルムアミド、０．０２５％ ブロモフェノールブルー、０．０２５％ キシレンシアノール）を添加した。実施例１のようにＤＮＡサンプルのサイズ分析を行った。
【０１５２】
イメージ分析から明らかになったところによれば、エンドヌクレアーゼＩＶを含有する反応液は多量の標識されたＤＮＡを含有し、これはエンドヌクレアーゼＩＶを含有しないコントロール反応では見られなかった。試験反応液中のＤＮＡの量は時間と共に増加し、エンドヌクレアーゼＩＶの添加から９０分間でピークに達した。
【０１５３】
実施例４
本発明にかかる方法を実施例２に記載するようにして、以下のようないくつかの変更を加えて行った：
酵素を添加する前に、反応液には以下を含有させた：１００ｆｍｏｌの４１量体オリゴヌクレオチド、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＧＴＰ、０．０２ｍＭ ｄＣＴＰ、および０．２μＬ α３２Ｐ−ｄＣＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍｌ、約８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（容量２０μＬ）。この混合液に鉱油を積層し、９５℃で２分間加熱した。その後温度を７０℃まで低下させ、そのまま保持した。１０ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ・シュトッフェルフラグメント、２μＬ ＡｆＵＤＧ−Ｔｈｉｏ、および２μＬ ＥｃｏＥｎｄｏＩＶ（またはエンドヌクレアーゼＩＶを含有しないコントロール反応の場合は水）をこの順番で反応液に添加し、反応液の最終容量を２５μＬとした。６０分後、ＥＤＴＡを最終濃度１０ｍＭまで添加して反応を終了させた。その後、等量のホルムアミド負荷色素（９８％ホルムアミド、０．０２５％ ブロモフェノールブルー、０．０２５％ キシレンシアノール）を添加した。実施例１のようにＤＮＡサンプルのサイズ分析を行った。電気泳動後、ゲルをホスホル・スクリーンに暴露し、イメージをＳｔｏｒｍ（商標）８６０ホスホイメージャーを使用して検出した。
【０１５４】
イメージ分析から明らかになったところによれば、エンドヌクレアーゼＩＶを含有する反応液は多量の予期される標識された２０量体およびより小さいフラグメントをより少ない量で含有し、それらはエンドヌクレアーゼＩＶを添加していないコントロール反応では見られなかった。
【０１５５】
実施例５
本発明にかかる方法を使用して、アトモル量の４１量体パリンドローム・オリゴヌクレオチドからのプライマーの伸長を検出した。４１量体オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ触媒型伸長により、それ自体をテンプレートとして使用して生成された産物のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ消化、およびその後のエンドヌクレアーゼＩＶ消化により、その産物の１つとして２０量体１本鎖オリゴヌクレオチド（すなわちその後にＩＰとして作用できる置換されたフラグメント）を生成した。このオリゴヌクレオチドは第２のプライマーとして作用する。この例では、本発明にかかる方法により、フィードバック・ループ反応によって２０量体オリゴヌクレオチドの循環的伸長の検出が可能となる。４２量体オリゴヌクレオチド（ブースターテンプレート）を図２に図式で示すように設計した。２０量体の第２プライマー／置換されたフラグメントの相補配列がこの４２量体中に２回反復される。反復配列は（５’から３’に読んで）ＡＴ配列で分離されている。このオリゴヌクレオチドは４１量体パリンドローム・オリゴヌクレオチドと同様に合成および精製した。この４２量体は反応液中に大過剰量で含有させた。２０量体の第２プライマーを上記のように生成すれば、これはその後、本発明にかかる方法によって４２量体オリゴヌクレオチドにアニールし、それ自体が循環的に伸長され、結果としてその多量のコピーが生成される。その後、これらの新たに生成した２０量体の第２プライマーをそれ自体、４２量体オリゴヌクレオチドの他のコピーにアニールさせ、新たな周期の循環的伸長などを開始することができる。目的は、実施例２に示すように通常、少なすぎて検出できないような４１量体パリンドローム・オリゴヌクレオチドの量を検出することであり、これは上記の本発明にかかる方法のフィードバック・ループ適用によって検出可能な量の２０量体の第２プライマーを生成することによる。
【０１５６】
実施例２に記載する反応を、以下の変更を除いて、３回反復した。上記の４２量体を最終濃度４０ｎｇ／反応液で、各反応液中に含有させた。４１量体パリンドローム・オリゴヌクレオチドの濃度は、異なる組のコントロール（反応にエンドヌクレアーゼＩＶが含有されていない）および試験反応（反応にエンドヌクレアーゼＩＶが含有されている）において反応液毎に１．０ｆｍｏｌ、１０−２ｆｍｏｌ、または１０−４ｆｍｏｌとした。反応を２時間進行させ、その後ＮａＯＨを最終濃度５０ｍＭまで添加した。実施例１に記載するように、反応液の標識されたＤＮＡフラグメント含量を、元の反応液の５μＬ等量（ＮａＯＨおよびホルムアルデヒド負荷色素の添加前）の分析によって分析した。
【０１５７】
イメージ分析から明らかになったところによれば、検出可能な量の標識された２０量体オリゴヌクレオチドが各試験反応で生成され、コントロール反応では生成されなかった。
【０１５８】
同様の結果が、熱安定酵素、ＤＮＡシュトッフェル・フラグメント、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＵＤＧおよびＴｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａエンドヌクレアーゼＩＶを使用して上記の実験を反復した際に観察された。ブースターテンプレートの自己プライミングから生じる非特異増幅を回避するために、一般にブースターの３’末端はＤＮＡポリメラーゼによる伸長を阻害する保護基を含有する。上記の４２量体に使用した保護基はジデオキシシトシンヌクレオチドであった。
【０１５９】
実施例６
本発明にかかる方法を使用して自己アニール４１量体を循環的に伸長させた。この反応によって２０量体が生成されたが、これはその後、保護された３’末端（使用した保護は逆向きシチジンヌクレオチドであった）を有する４２量体（ブースター）上の開始プライマーとしての役割を果たす。この第２の反応で同じ２０量体が循環的伸長によって生成されるようにブースターを設計した（図２参照）。これらの２０量体はその後、他のブースター分子上で更なる伸長を起動し、元の４１量体上の反応からのシグナルを増幅する。４１量体および４２量体ブースターは放射能標識したα３２Ｐ−ｄＣＴＰの導入が可能となるように設計した。反応液は（１）１００ｆｍｏｌの４１量体、（２）１ｆｍｏｌの４１量体、（３）１００ｆｍｏｌのブースター、または（４）１ｆｍｏｌの４１量体および１００ｆｍｏｌのブースターのいずれかを、Ｔａｑシュトッフェル・フラグメントバッファー（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）に３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＵＴＰ、および０．０２ｍＭおよび０．２μＬのα３２Ｐ−ｄＣＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍｌ、約８００Ｃｉ／ｍＭ）を補足したものに混合して含有した。この反応混液に鉱油を積層し、９５℃で２分間インキュベートした後、温度を７０℃とし、その温度で保持した。その後、１０ＵのＴａｑシュトッフェル・フラグメント、２μＬのＡｆＵＤＧ−Ｔｈｉｏ、および２μＬのＥｃｏＥｎｄｏＩＶをこの順番で添加し、反応液の最終容量を２５μＬとした。反応液を７０℃で６０分間インキュベートし、その後ＥＤＴＡを最終濃度１０ｍＭまで添加して反応を終了させた。等量の９８％ホルムアミド負荷バッファー（０．０２５％ ブロモフェノールブルー、０．０２５％ キシレンシアノールを含有）を添加し、サンプルを変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。電気泳動後、ゲルをホスホル・スクリーンに暴露し、イメージをＳｔｏｒｍ（商標）８６０ホスホイメージャーを使用して検出した。
【０１６０】
イメージ分析から明らかになったところによれば、反応（１）において、２０量体の標識されたＤＮＡ産物、そしてより少量の−６０量体、および多くの２０量体より小さい生成物が生成された。同じ生成物が反応（２）で生成されたが、はるかに少ない量であった。反応（３）では標識された反応生成物は存在しなかったが、反応（４）では標識された２０量体が生成され、これは反応（２）で生成されたものより多量であり、またより少ない量で２０量体より小さい標識された生成物が生成された。３’末端保護として逆向きヌクレオチドを使用すると、末端保護にジデオキシヌクレオチドを使用するより効果的であった。
【０１６１】
実施例７
本発明にかかる方法を使用して４１量体オリゴヌクレオチド（開始プライマー−ＩＰ）を循環的に伸長させたが、これはその３’末端で自己相補的、すなわちパリンドロームであり、従ってＧＭＡ反応のそれ自体のテンプレートとしての役割を果たす。相補的領域は４１量体の３’末端から２０塩基伸長し、オリゴヌクレオチドのこの部分は本質的にＩＰとして作用する。４１量体の、このＩＰに相補的な領域（ＩＰ結合部位）の５’側の領域をＩＰ結合部位に続いて１個のＡ残基を含有するように設計したが、これによって４１量体の循環的伸長の際、ＧＭＡ反応に次いで別々の２０ヌクレオチドのＤＮＡフラグメントが生成される。また、多くのＧ残基を含有するように４１量体を設計した。これによって、α３２Ｐ−ｄＣＴＰの導入により、反応の際に生成される置換された下流ＤＮＡフラグメント（２０量体）を標識することができた。オリゴヌクレオチドは人工的に合成し、電気泳動後にポリアクリルアミドゲルから切り出して精製した。目的は、本発明にかかる方法により、Ｅ． ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶの代わりにＥ． ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＩＩを使用して４１量体がそれ自体にアニールし、循環的／反復的に伸長され、標識された１本鎖２０量体ＤＮＡフラグメント（置換されたフラグメント）の多数のコピーを生成するかどうかを確認することであった。酵素を添加する前に、反応液には以下を含有させた：１００ｆｍｏｌの４１量体オリゴヌクレオチド、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、７ｍＭ ジチオトレイトール、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＵＴＰ、０．０２ｍＭ ｄＣＴＰ、および０．２μＬ α３２Ｐ−ｄＣＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍｌ、約８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（総量２２μＬ）。この混合液に鉱油を積層し、９５℃で２分間加熱した。その後反応温度を３７℃まで低下させ、この温度で保持した。次いで５ユニットのクレノウフラグメント（３’→５’ｅｘｏ）、１０ユニットのＥ． ｃｏｌｉウラシルＤＮＡグリコシラーゼおよび０．１ユニットのＥ． ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＩＩを添加し、反応液の最終容量を２５μＬとした。エンドヌクレアーゼＩＩＩを含有しないコントロール反応の場合は、水を添加して最終容量２５μＬとした。３０分間以上、反応を進行させた。ＥＤＴＡを最終濃度１０ｍＭまで添加して反応を停止させた。その後、等量のホルムアミド負荷色素（９８％ホルムアミド、０．０２５％ ブロモフェノールブルー、０．０２５％ キシレンシアノール）を添加した。次いでサンプルを２０％ 変性（７Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、電気泳動を実施してＤＮＡフラグメントのサイズ分析を行った。電気泳動後、ゲルをホスホル・スクリーンに暴露し、次いでＳｔｏｒｍ（商標）８６０ホスホイメージャーを使用してイメージを検出した。
【０１６２】
イメージ分析から明らかになったところによれば、検出可能な量の標識された２０量体オリゴヌクレオチドが各試験反応で生成され、コントロール反応ではされなかった。
【０１６３】
実施例８
本発明にかかる方法を使用して２１量体オリゴヌクレオチド（開始プライマー−ＩＰ）を循環的に伸長させたが、これは重合化反応のテンプレートとしての役割を果たす４０量体オリゴヌクレオチド（テンプレート核酸）のある領域に相補的である。相補的領域を４０量体の３’末端から伸長させた。４０量体の、このＩＰに相補的な領域（ＩＰ結合部位）の５’側の領域を多くのＣ残基を含有するように設計したが、これによって、伸長された２１量体の循環的伸長の際、ＧＭＡ反応に次いで別々のサイズのＤＮＡフラグメントが生成される。また、各Ａ残基の間に多くのＧ残基が存在するように４０量体を設計した。これによって、α３２Ｐ−ｄＣＴＰの導入により、反応の際に生成される置換された下流ＤＮＡフラグメントを標識することができた。いずれのオリゴヌクレオチドも人工的に合成し、電気泳動後にポリアクリルアミドゲルから切り出して精製した。目的は、本発明にかかる方法によって２１量体が４０量体にアニールし、循環的／反復的に伸長され、標識された１本鎖ＤＮＡフラグメント（置換されたフラグメント）の多数のコピーを生成するかどうかを確認することであった。酵素を添加する前に、反応液には以下を含有させた：１００ｆｍｏｌの各オリゴヌクレオチド、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＩＴＰ、およびｄＴＴＰ、０．０２ｍＭ ｄＣＴＰ、および０．２μＬ α３２Ｐ−ｄＣＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍｌ、−８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（総量２２μＬ）。この混合液に鉱油を積層し、９５℃で２分間加熱した。その後反応温度を７０℃まで低下させ、この温度で保持した。次いで１０ユニットのＴａｑポリメラーゼ シュトッフェル・フラグメント、および８００ｐｇのＴｍａＥｎｄｏＶをこの順番で添加し、反応液の最終容量を２５μＬとした。エンドヌクレアーゼＶを含有しないコントロール反応の場合は、水を添加して最終容量２５μＬとした。ＥＤＴＡを最終濃度１０ｍＭまで添加して反応を停止させた。その後、１／２量のホルムアミド負荷色素（９８％ホルムアミド、０．０２５％ ブロモフェノールブルー、０．０２５％ キシレンシアノール）を添加し、９５℃で５分間加熱して反応生成物を変性させた。次いでサンプルを２０％ 変性（７Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、電気泳動を実施してＤＮＡフラグメントのサイズ分析を行った。電気泳動後、ゲルをホスホル・スクリーンに暴露し、Ｓｔｏｒｍ（商標）８６０ホスホイメージャーを使用してイメージを検出した。
【０１６４】
イメージ分析から明らかになったところによれば、エンドヌクレアーゼＶを含む反応は種々のサイズの標識されたＤＮＡフラグメントを多く含有し、これは伸長におけるｄＩＴＰ導入に関わる位置で線引きされ、時間と共に増加し、エンドヌクレアーゼＶを含有しないコントロール反応では見られなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、特に実施例１に記載する本発明にかかる方法のある態様の流れ図である。
【図２】図２は、実施例４に記載する本発明にかかる方法の別の態様の流れ図である。
技術分野
本発明は核酸の増幅およびキャラクタリゼーションのための新規の方法に関する。
【０００２】
発明の背景
標的核酸テンプレート上での核酸プライマーの伸長は非常に重要な過程であり、核酸の検出、診断、および定量を含む多様な適用がある。特に、テンプレート上でのプライマーの伸長は、ｉ）プライマーがテンプレートにアニールしたことの直接的な証拠であり、ｉｉ）そのテンプレート上にプライマーに相補的な配列が存在することを確証し、従ってｉｉｉ）そのテンプレートまたは標的核酸の存在を確証する。わずか１塩基だけが異なる密接に関係するプライマーを使用して、配列中の１塩基が異なる核酸を区別することが慣例的に可能である。核酸の検出、診断、および定量の方法としてテンプレート核酸上でのプライマーの伸長を使用する際の重大な制限は、典型的な伸長反応においてプライマーはテンプレートにアニール（ハイブリダイズ）するが、１度しか伸長されないことである。従って、サンプル中のテンプレート量が伸長されるプライマーの量を決定する。核酸の検出、診断、および定量の分野における適用の大半では、もし伸長反応が何らかの様式で反復または循環されなければ、しばしばテンプレートの量が少なすぎるために伸長されたプライマーを直接検出することができない。
【０００３】
この重大な制限を克服するために増幅過程が必要である。種々のこれらの過程がこれまでに報告されており、それらは本質的に以下のいずれかを伴う：ａ）伸長されたプライマーを熱を使用してテンプレートから解離させ、それによって新たなプライマーのアニーリングおよびそれに続く伸長が可能となるような周期的な解離条件；ｂ）一方の鎖だけが修飾された（ｈｅｍｉ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＤＮＡ認識部位の未修飾鎖にニックを生成するための制限酵素、およびニックで３’ＤＮＡ末端を伸長し、下流ＤＮＡ鎖を置換する５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼの能力を使用することによるＤＮＡにおけるプライマーの反復生成；ｃ）プライマー伸長が連続的に進行するようなテンプレート核酸の循環；および／またはｄ）転写法によるテンプレートのコピーの生成（これが後のプライマー伸長反応においてテンプレートとなる）。
【０００４】
検出および操作できるようなレベルまで核酸を増幅する（複数のコピーを生成する）ことは非常に有用である。特定の標的核酸の十分量を生成するそれらの増幅過程は一般に、核酸のキャラクタリゼーションに必要とされる最初の重要な工程である。サンプルから特定の核酸配列を直接増幅することによって同サンプル中の該核酸の存在または不在の診断が可能となり、従ってＤＮＡ／遺伝子診断において非常に有用である。サンプルからの核酸の直接増幅およびその後のキャラクタリゼーションは種々の目的のために実施することができ、それらには、特定の核酸における変異および多形のようなＤＮＡ変異の存在または不在の診断がある。増幅過程は多くの場合、増幅および増幅した標的の完全な、または部分的なキャラクタリゼーションが共に可能となるように設計できる。
【０００５】
現在知られている核酸の増幅およびキャラクタリゼーションの方法は、特に以下に関して種々の制限を受ける：プライマーの解離、プライマーの生成、特異性、可変性、１本鎖ＤＮＡの生成、および多重性（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）の促進のために必要な過程、およびハイスループット・ゲノタイピング、特に単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）のゲノタイピング（下記）。
【０００６】
プライマーの伸長
テンプレート上でのプライマーの伸長そのものは文献に十分記録されている。これは、テンプレートまたは標的核酸上でプライマーをそれに相補的な配列にさせた後、ＤＮＡ前駆体（一般にｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）の存在下でＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートすることによって行うことができ、それによってテンプレート鎖上で（プライマーに関して）５’から３’方向に、３’−ＯＨ（ヒドロキシ）末端からプライマーが伸長され、元のテンプレートに相補的な、新たに合成されたＤＮＡ鎖が生成される。プライマーの伸長は、プライマーが遊離の３’−ＯＨ末端を有する場合にのみ起こる。プライマー伸長法によるテンプレートからのこの相補鎖の増幅は以下を必要とする：ａ）プライマー伸長が、アニールしたプライマー分子ごとに１回より多く起こる、ｂ）新たなプライマーは反復してテンプレートにアニールし、伸長される、そして／またはｃ）相補鎖はその後の第２のプライマーの伸長のテンプレートとなる。
【０００７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
核酸テンプレートの増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行うことができる（Ｓａｉｋｉ， Ｒ． Ｋ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１（１９８８））。
【０００８】
一般に、ＰＣＲによる核酸テンプレートの標的セグメントの増幅は、ＰＣＲで好適な合成オリゴヌクレオチドプライマーを耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ前駆体と共に使用して実施する。変性、アニーリング、およびプライマー伸長の複数回の循環によって標的セグメントが指数的に増幅される。従って生成物の検出は、特定の遺伝子座の一定の配列の存在を示す。増幅産物の長さはプライマーの長さを合わせたもの、およびテンプレート上のそれらの３’末端間の長さなどによって決定できる。
【０００９】
ＰＣＲには耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが必ず必要である。それは熱サイクル過程を含むため、この技術の自動化には特殊な装置が必要である。典型的な反応は、通常、反応を開始するために２つのプライマーを必要とし、従って、特にいくつかの異なる増幅反応の多重化（すなわち１本の試験管で）を考慮したい場合、このことで反応は更に複雑になる。これによってより多くのプライマーが反応中に存在することになり、そのため誤った、非特異的な増幅の可能性が増す。更に、反応のアニール温度は反応に使用する両方のプライマーに好適でなければならないため、ＰＣＲ反応の設計および最適化がより複雑になる。このことは、異なる増幅反応の多重化の場合、１つのアニール温度が多重化される全ての増幅反応に適合しなければならないため、更なる不利益となる。
【００１０】
また、反応の際にテンプレート核酸の複数のコピーが生成してその後のテンプレートとして作用するため、増幅子のコンタミネーションの可能性がある。
【００１１】
転写に基づく増幅法
転写に基づく増幅法（Ｋｗｏｈ， Ｄ． Ｙ．ら， （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６ １１７３−１１７７；Ｇｕａｔｅｌｌｉら， Ｊ． Ｃ．ら， （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７ １８７４−１８７８；Ｃｏｍｐｔｏｎら， Ｊ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５０ ９１−９２）は標的核酸上でのプライマーの伸長に依存する増幅方法であり、それによってＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターが増幅されるべき標的領域の上流に生成される。本質的に、標的配列に隣接する１対のプライマーをテンプレート核酸と共にインキュベートする。プライマーの一方はテンプレートに相補的でしれにアニールする配列の上流（５’）にＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター配列を有する。他方のプライマーはテンプレートの相補鎖のセグメントに相補的である。ＲＮＡプロモーター配列を有するプライマーを、核酸ポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）およびＤＮＡ前駆体を使用してテンプレート鎖上で伸長させる。ハイブリッド核酸（テンプレート鎖および新たに合成された相補鎖）の熱変性またはテンプレート鎖の酵素的変性の後、第２のプライマーを新たに合成された相補鎖とアニールさせ、同鎖上で伸長させる。これによって２本鎖で、標的配列に結合したＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを有する産物が得られる。この産物をＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ前駆体と共にインキューベートすることによってその標的配列の多くのＲＮＡ転写物が生成される。それぞれのＲＮＡ転写物は今度は相補的ＤＮＡ鎖生成のためのテンプレートとなり、この過程は等温条件下で反応成分が限界となるか、または不活性化されるまで、自己持続型循環様式で継続する。これによって標的核酸配列が大きく増幅される。
【００１２】
１つの重大な不利益は、これらの技術が、本質的にＤＮＡより不安定でより分解されやすいＲＮＡにこれらの技術が完全に依存していることである。このため反応はリボヌクレアーゼのコンタミネーションに極度に高い感受性を有する。一般に方法はテンプレートとしてＲＮＡを必要とし、ＤＮＡテンプレートには適さない、または最適でない。
【００１３】
また反応は、反応の開始のために少なくとも２つのプライマーを必要とし、プライマーの１つはＲＮＡポリメラーゼのための転写開始部位を導入するように特別に設計しなければならない。
【００１４】
更にまた、反応の際にテンプレート核酸の複数のコピーが生成してその後のテンプレートとして作用するため、増幅子のコンタミネーションの可能性がある。
【００１５】
これらの技術は更なる工程を加えなければ変異または多形の検出に好適でない。
【００１６】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）
ＳＤＡは、制限酵素が、一方の鎖だけが修飾された２本鎖ＤＮＡの未修飾鎖の特定の認識部位にニックを生成する能力、および５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡが得られたニックで３’末端を伸長し、そうすることで下流ＤＮＡ鎖を置換する能力に基づく増幅法である（Ｗａｌｋｅｒ， Ｇ． Ｔ．ら， ＰＮＡＳ ８９：３９２−３９６ （１９９２））。テンプレート上でのカップリング反応によって標的ＤＮＡが指数的に増幅されるが、そこではテンプレート鎖上での反応から置換された鎖が相補鎖上の反応の標的となり、また逆も同様である。本質的にＤＮＡサンプルの熱変性によって２つの１本鎖ＤＮＡフラグメント（Ｔ１およびＴ２）が生成される。２つのＤＮＡ増幅プライマー（Ｐ１およびＰ２）は過剰に存在する。Ｐ１の３’末端はＴ１の３’末端に結合し、５’側が突き出た（ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）デュプレックスを形成する。同様に、Ｐ２はＴ２と結合する。Ｐ１およびＰ２の５’側の突出部分はＨｉｎｃＩＩのような制限酵素の認識配列を含む。５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損型のＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ前駆体であるｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、および修飾型前駆体であるデオキシアデノシン５’−［アルファチオ］トリホスフェートを使用してデュプレックスの３’末端が伸長され、これによってＰ１Ｔ１およびＰ２Ｔ２上にヘミホスホロチオエート認識部位が生成される。ＨｉｎｃＩＩはヘミホスホロチオエート認識部位の保護されていないプライマー鎖にニックを生成し、修飾された相補鎖は無傷のままである。ＤＮＡポリメラーゼはＰ１Ｔ１上のニックで３’末端を伸長し、下流鎖を置換し、これはＴ２と機能的に同等である。同様に、Ｐ２Ｔ２上のニックでの伸長により下流鎖が置換され、これはＴ１と機能的に同等である。ニックでの伸長によってニック生成が可能なＨｉｎｃＩＩ認識部位が再生されるので、ニック生成および重合化／置換工程はＰ１Ｔ１およびＰ２Ｔ２上で連続的に循環する。Ｐ１Ｔ１から置換された鎖はＰ２の標的となり、Ｐ２Ｔ２から置換された鎖はＰ１の標的となるので、標的の増幅は指数的である。
【００１７】
ＳＤＡの主な不利益は特定の制限酵素のための部位を導入するように特別に設計されたプライマーを使用しなければならないことである。一般に、反応を実施するためにアンプリコンごとに２つ以上の配列特異的プライマーが必要とされる。更に、この反応で１つのプライマーを使用して生成される増幅されたフラグメントが所定の３’末端を有するのは容易ではない。置換されたフラグメント上の所定の３’末端によってその後のこの同じフラグメントとの反応が起動されるので、これもまたＳＤＡの重要な不利益である。
【００１８】
国際特許ＷＯ９７／０３２１０号は、標的核酸サンプル中の候補となる遺伝子座における特定の核酸配列の存在または不在を迅速に検出するための方法を開示しており、方法は以下の工程を含む：ｉ）該候補遺伝子座の１つ以上のあらかじめ選択した位置にＤＮＡグリコシラーゼの基質である修飾された塩基を導入し；ｉｉ）該ＤＮＡグリコシラーゼを用いて修飾された塩基を切り出して無塩基（ａｂａｓｉｃ）部位を生成し；ｉｉｉ）工程ｉｉ）で生成された無塩基部位でリン酸結合を開裂し；そしてｉｖ）工程ｉｉｉ）の開裂産物を分析して該標的核酸配列中の該候補遺伝子座における該特定の核酸配列の存在または不在を確認する。方法は特に、ＤＮＡサンプル中の特定の変異の検出（ＤＮＡ中の複数の既知の変異の検出を含む）に適用される。
【００１９】
国際特許ＷＯ９９／５４５０１号は核酸分子のキャラクタリゼーションの方法を開示しており、方法は以下の工程を含む：ｉ）修飾された塩基、例えばウラシル（ＤＮＡグリコシラーゼの基質である）をＤＮＡ分子に導入し；ｉｉ）該ＤＮＡグリコシラーゼを用いて修飾された塩基を切り出して無塩基部位を生成し；ｉｉｉ）無塩基部位でＤＮＡを開裂して伸長可能な上流ＤＮＡフラグメントを生成し；そしてｉｖ）伸長可能な上流フラグメントを、その伸長を可能とする酵素（例えばポリメラーゼまたはリガーゼ）およびテンプレート核酸の存在下でインキュベートし、得られるフラグメントを分析する。しかしながら、国際特許ＷＯ９９／５４５０１号に記載されるＤＮＡの開裂方法では、塩基が切り出された位置が重要である。
【００２０】
国際特許ＷＯ９９／５４５０１号に例証される方法では、増幅された標的核酸を含有する反応混液を、増幅工程で伸長しなかったプライマーを消化するためのエキソヌクレアーゼＩ、および増幅工程で導入されなかったｄＮＴＰを消化するためのエビ・アルカリホスファターゼで処理した。従ってテンプレート核酸の更なる増幅は起こらず、方法は１サイクルだけに限定された。
【００２１】
従って、より多目的に使用でき、より特異的で、情報処理量がより高く、反応の多重化を容易にし、そして１本鎖ＤＮＡの生成を可能とするような、核酸の増幅およびキャラクタリゼーションの改善された方法を開発することが重要である。
【００２２】
従って本発明はテンプレート核酸の増幅のための方法を提供し、方法は以下の工程を同時に実施することを含む：
ｉ）核酸プライマーを該テンプレート核酸、標準的なＤＮＡ前駆体ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたＤＮＡ前駆体ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼと反応させ、伸長された核酸プライマーを得る（該核酸プライマーは該テンプレートに結合したままである）；
ｉｉ）修飾された塩基を含有する伸長された核酸プライマーを開裂して、該ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能な遊離の３’−ＯＨ末端を生成する；そして
ｉｉｉ）それによって生成されたＤＮＡフラグメント上で工程ｉ）およびｉｉ）を反復する。
【００２３】
ある態様では、修飾された塩基を含有する伸長された核酸プライマーを３’−エンドヌクレアーゼによって開裂する。
【００２４】
この態様では、好ましくは３’−エンドヌクレアーゼはＥ． ｃｏｌｉ由来のエンドヌクレアーゼＶまたは他の生物で見られるその同族体である。
【００２５】
別の態様では、方法は以下の工程を含む：
ｉ）核酸プライマーを該テンプレート核酸、標準的なＤＮＡ前駆体ヌクレオチド、少なくとも１つの、ＤＮＡグリコシラーゼの基質である修飾されたＤＮＡ前駆体ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼと反応させ、伸長された核酸プライマーを得る（該核酸プライマーは該テンプレートに結合したままである）；
ｉｉ）ＤＮＡグリコシラーゼを用いて伸長された核酸プライマーから修飾された前駆体ヌクレオチドの修飾された塩基を切り出して無塩基部位を生成する；
ｉｉｉ）伸長された核酸プライマーを無塩基部位で開裂し、該ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できる遊離の３’−ＯＨ末端を生成する；そして
ｉｉｉ）それによって生成されたＤＮＡフラグメント上で工程ｉ）−ｉｉｉ）を反復する。
【００２６】
本発明にかかる方法は以下に記載するような多くの特有の利点を有する。しかしながら、より一般的には本発明にかかる方法は既存の技術にまさる重要な利点を有し、単一のハイスループットプロセスを提供するという点でより多目的に利用でき、より適応性が高く、ＤＮＡの検出、定量、およびキャラクタリゼーションの分野において多くの異なるフォーマットに容易に適合できる。
【００２７】
本発明について、主にＤＮＡグリコシラーゼの使用を伴う態様を参照にして以下に記載する。出願人は本発明にかかるこの方法に関して、グリコシラーゼ介在型増幅（ＧＭＡ）という用語を造った。しかしながら、ここでは本発明の全ての態様はＧＭＡという頭字語で集合的に表わされる。
【００２８】
従って、本発明にかかる方法では、修飾されたＤＮＡ前駆体ヌクレオチドはここに記載するようにＤＮＡグリコシラーゼの基質であるか、または３’−エンドヌクレアーゼによって認識される。
【００２９】
一般に、核酸テンプレート鎖は天然の、または人工的に合成した核酸由来のいずれの鎖であってもよい。
【００３０】
好ましくは、テンプレート核酸はＤＮＡである。
【００３１】
本発明にかかる方法は核酸プライマーによって起動／開始される。便宜上、反応の開始の原因となるプライマーをここでは開始プライマー（ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ：ＩＰ）と呼ぶ。
【００３２】
ＩＰはＤＮＡポリメラーゼによる伸長が可能な遊離の３’ＯＨ末端を有するいずれの核酸でもよい。ＩＰは人工的に合成された、例えば合成オリゴヌクレオチドであるか、または天然に存在する核酸から直接的に、または間接的に誘導してもよい。
【００３３】
ある態様では、核酸プライマーはＤＮＡプライマーである。
【００３４】
標準的なＤＮＡ前駆体ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド３リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰである。ある限定された状況では、ジデオキシヌクレオチド３リン酸を使用し、反応に含めてもよい。従って、可能な標準的な前駆体にはｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＴＴＰも含まれる。
【００３５】
好ましくはＤＮＡ前駆体ヌクレオチドはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰから選択される。
【００３６】
いくつかの核酸ポリメラーゼのうちの１つをＧＭＡに使用してもよい。ＤＮＡテンプレートを使用する場合はＤＮＡポリメラーゼを使用する。ＲＮＡテンプレートを使用する場合はＲＮＡテンプレートを利用できるＤＮＡポリメラーゼが必要であり、一般にそれらの酵素は逆転写酵素である。通常、伸長プライマーの下流の核酸の置換または消化のいずれが必要かによって、２つのクラスのＤＮＡポリメラーゼを使用する。置換されたフラグメントを生成するために鎖の置換を必要とする場合、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを使用する。反対に５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、下流ＤＮＡはＧＭＡ反応の各サイクルで分解される。これによって以下に更に検討するような検出可能な産物が生成される。
【００３７】
ＤＮＡに導入する場合に必要によってＤＮＡグリコシラーゼの基質となる、そして／または３’−エンドヌクレアーゼによって認識されるような修飾された前駆体ヌクレオチドがいくつか知られている。後者の場合、修飾された前駆体ヌクレオチドによって、３’−エンドヌクレアーゼ酵素による開裂がその導入部位の３’側のホスホジエステル結合に向けられる。
【００３８】
それぞれの場合で開裂はＤＮＡ中の修飾された塩基の存在に依存し、それが以下の２つの方法のいずれかでＤＮＡの開裂を指図し、開裂の位置を指図する：すなわち１）グリコシラーゼによる修飾された塩基の切り出しおよびそれに続く無塩基部位の開裂、または２）伸長された核酸プライマーの３’−エンドヌクレアーゼ酵素による、修飾された塩基の導入部位の３’側にある第２のホスホジエステル結合での開裂。ある態様では、修飾された核酸前駆体はｄＵＴＰである。
【００３９】
修飾された前駆体ヌクレオチドｄＵＴＰはウラシル塩基および糖リン酸部分を含有する塩基糖リン酸である。前駆体ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＵＴＰ（ｄＴＴＰの代わりに）を使用したテンプレート上でのプライマー伸長により、チミンが完全にウラシルで置換された、テンプレートに相補的な新たに合成されたＤＮＡが得られる。
【００４０】
しかしながら、当業者に認識されるように他の修飾された核酸前駆体、例えばｄＩＴＰおよび８−ＯＨ ｄＧＴＰを使用することもできる。
【００４１】
修飾された前駆体ヌクレオチドｄＩＴＰはヒポキサンチン塩基および糖リン酸部分を含有する塩基糖リン酸である。修飾された前駆体ヌクレオチド８−ＯＨ ｄＧＴＰは８−ＯＨグアニン塩基および糖リン酸部分を含有する塩基糖リン酸である。
【００４２】
グリコシラーゼ基質前駆体ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、および８−ＯＨ ｄＧＴＰはＤＮＡに導入すると、それぞれグリコシラーゼ基質塩基ウラシル、ヒポキサンチン、および８−ＯＨグアニンを生成する。
【００４３】
ある態様では、ＤＮＡグリコシラーゼはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）である。
【００４４】
ＤＮＡ中のウラシルはＵＤＧによって特異的に認識され、ＤＮＡから遊離される。ＤＮＡ中に存在する場合、ＵＤＧは他のウラシル関連塩基も認識する。
【００４５】
多くのＤＮＡグリコシラーゼが報告されている。これらの酵素は、グリコシラーゼ基質塩基をＤＮＡバックボーンに結合させるＮ−グリコシド結合を開裂する。これによってＤＮＡから塩基が遊離し、無塩基部位が生成される。
【００４６】
他の好適なＤＮＡグリコシラーゼにはアルキルプリンＤＮＡグリコシラーゼ（ＡＤＧ）またはホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧ）ＤＮＡグリコシラーゼがある。
【００４７】
ヒポキサンチンはアルキルプリンＤＮＡグリコシラーゼ（ＡＤＧ）によって特異的に認識され、ＤＮＡから遊離される。この酵素はＤＮＡ中に存在する場合、Ｎ３メチルアデニン、Ｎ３メチルグアニン、Ｏ２メチルシトシン、およびＯ２メチルチミジンも認識および遊離する。８−ＯＨグアニンはＦＰＧ ＤＮＡグリコシラーゼによって特異的に認識され、ＤＮＡから遊離される。この酵素はＤＮＡ中に存在する場合、開環したプリンも認識および遊離する。
【００４８】
核酸の無塩基部位でホスホジエステル結合を開裂するいくつかの物質が知られている。結合の開裂は無塩基部位の５’または同部位の３’であってもよい。５’開裂はリン酸部分の近接部または末端部で起こってもよく、それぞれ遊離の３’ＯＨ基または３’リン酸基を有する３’末端を持つ上流フラグメントを生成する。３’−ＯＨ末端はテンプレート上でのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が可能であり、一方３’−リン酸末端は伸長不能である。それらの３’−リン酸末端は一般に、３’ホスファターゼ活性を有するＴ４ポリヌクレオチドキナーゼのようなホスファターゼ酵素で処理することによって伸長可能となる。リン酸部分の５’側を開裂し、遊離の３’ＯＨを有する３’末端を生成する物質はＡＰエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素、例えばＥ． ｃｏｌｉ由来のＡＰエンドヌクレアーゼＩＶである。リン酸部分の３’側を開裂し、遊離の３’−Ｐ基を有する３’末端を生成する物質はアルカリ、熱、およびある種のＤＮＡ修復酵素（例えばＦＰＧ）および塩基性タンパク質およびペプチドである。無塩基部位の３’側を開裂する物質には熱、およびＡＰリアーゼ活性を有するある種のＤＮＡ修復酵素、例えばＥ． ｃｏｌｉ由来のエンドヌクレアーゼＩＩＩがある。それらの３’−デオキシリボホスフェート（ｄＲｐ）末端は一般に、ＡＰエンドヌクレアーゼでの処理によって伸長可能となる。ＦＰＧ−ＤＮＡグリコシラーゼは無塩基部位の５’および３’側の両方を開裂する。
【００４９】
好ましくは、伸長された核酸を、核酸の無塩基部位で開裂する酵素を用いて無塩基部位で開裂する。
【００５０】
更に、好ましくは酵素は無塩基部位の５’側を開裂し、遊離の３’ＯＨ末端を生成するＡＰエンドヌクレアーゼ、特にＡＰエンドヌクレアーゼＩＶである。
【００５１】
伸長されたプライマーを３’−エンドヌクレアーゼで開裂する場合、それらの酵素による伸長されたプライマーの開裂は伸長されたプライマー中の修飾された塩基の存在に依存し、開裂は修飾された塩基の導入部位の３’側（すなわち下流）のホスホジエステル結合で起こる。グリコシラーゼおよびＡＰの部位開裂の作用とは対照的に、３’−エンドヌクレアーゼによる伸長されたプライマーの開裂は修飾された塩基の切り出しを伴わず、無塩基部位の生成を伴わない。３’−エンドヌクレアーゼによる開裂は伸長されたプライマー中の修飾された塩基の存在、および酵素による該修飾された塩基の認識に依存する。開裂は通常、修飾された塩基／ヌクレオチドの３’側にある第２のホスホジエステル結合で起こる。この開裂事象によってＤＮＡ鎖にニックが生成され、３’−ＯＨおよび５’−ホスホリル基が生成される。次いで反応に存在するＤＮＡポリメラーゼは遊離の３’ＯＨ基から伸長できる。上記のように、３’エンドヌクレアーゼはＥ． ｃｏｌｉ由来のエンドヌクレアーゼＶであってもよい。エンドヌクレアーゼＶはＤＮＡ中のいくつかの修飾された塩基（ウラシル、ヒポキサンチン（イノシン）、および尿素残基を含む）を認識する。修飾された塩基を有するＤＮＡの開裂に加え、エンドヌクレアーゼＶは無塩基部位を含有するＤＮＡも開裂する。従って一定の状況では、エンドヌクレアーゼＶを使用し、ＤＮＡ中に無塩基部位を生成するＤＮＡグリコシラーゼの作用と組み合わせて、伸長されたプライマーを開裂することができる。
【００５２】
ある態様では、標準的な前駆体ヌクレオチドの１つが修飾された前駆体ヌクレオチドで部分的に置換される。
【００５３】
例えば、修飾された前駆体ヌクレオチドｄＵＴＰに加えて前駆体ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰを使用するテンプレート上でのプライマー伸長によって、チミンがランダムにウラシルで置換された、テンプレートに相補的な新たに合成されたＤＮＡが得られる。ＤＮＡ合成過程で、テンプレートＤＮＡ鎖中のアデニン残基に相補的な位置でウラシルが新たに合成されたＤＮＡに導入される。従って置換された下流フラグメントは、新たに合成されたＤＮＡ中のｄＵＭＰのランダムな導入位置によって制限される。これによって、テンプレート核酸鎖中のＡ残基の反対側の相補鎖中へのｄＵＴＰ対ｄＴＴＰ導入の組み合わせ（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）に従って複数のサイズの置換されたフラグメントが生成される。
【００５４】
同様の方法でｄＧＴＰをｄＩＴＰで、またはｄＧＴＰを８−ＯＨ ｄＧＴＰで置換することにより、テンプレートに相補的な新たに合成されたＤＮＡ中のｄＧＴＰの全部または一部が、テンプレートＤＮＡ鎖中のシトシン残基に相補的な位置で、それぞれヒポキサンチンまたは８−ＯＨグアニンで置換される。１つ以上の標準的なＤＮＡ前駆体の全部または一部を１つ以上のジデオキシ停止ヌクレオチド（一度導入されるとテンプレート上でのプライマーの更なる伸長を不可能とするヌクレオチド）で置換することを使用して、必要によってＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長を停止させることができる。１つ以上の標準的なＤＮＡ前駆体の一部を１つ以上のジデオキシ停止ヌクレオチドで置換すると、テンプレート鎖上の多くの異なる位置でプライマーの伸長が停止し、多くの異なる長さの停止されたプライマーが生成される。１つ以上の標準的なＤＮＡ前駆体の全部を１つ以上のジデオキシ停止ヌクレオチドで置換すると、テンプレート鎖上の特定の位置でプライマーの伸長が停止し、特定の長さの停止されたプライマーが生成される。１つ以上の修飾された前駆体ヌクレオチドを、１つ以上のＤＮＡグリコシラーゼと共にＧＭＡに使用してもよい。２つのＤＮＡグリコシラーゼを使用してもよく、これによって一方は修飾された塩基をプライマーから遊離させ、他方は新たに合成されたＤＮＡに導入されると修飾された塩基を遊離する。
【００５５】
必要により、本発明にかかる方法の工程ｉ）およびｉｉ）またはｉ）−ｉｉｉ）を、試薬の１つが限界となるまで循環させて継続することができる。
【００５６】
本発明にかかる方法は等温条件下で実施することができる。
【００５７】
従って、方法が等温である場合、熱サイクルは必要ではない。
【００５８】
本発明にかかる方法は、１つのプライマーを使用するプライマー伸長反応において複数の、新たに合成された、別々のＤＮＡセグメントを増幅できる、唯一の等温増幅反応である。
【００５９】
認識されるように、本発明にかかる方法によって核酸相補鎖中の修飾された塩基の位置によって特定された核酸の置換された１本鎖下流フラグメントが蓄積する。
【００６０】
従って、本発明にかかる方法によって開始プロモーターの下流に異なる１本鎖プライマーの複数のコピーを生成する方法が提供される。個別の下流プライマーは標的テンプレート核酸が存在する時にのみ生成されるので、これによって検出目的のための他に例を見ないような特異性が得られる。従ってＤＮＡ診断に関して、ＧＭＡは特異性の点で、これまでに報告された増幅方法より著しく改善されたものである。
【００６１】
１つのテンプレートサンプルからの複数のＤＮＡセグメントの増幅が強く求められているが、現在の増幅技術では限界がある。この限界は、既存の技術が指数的な増幅を使用しており、そして／または、より扱いにくく、２本鎖産物もしくは大きいサイズの１本鎖産物を生成する、という事実に起因する。
【００６２】
本発明にかかる方法はＤＮＡセグメントの多重増幅のための既存の方法にまさる著しい利点を有する。
【００６３】
本発明にかかる方法を使用して、開始核酸プライマーの下流の個別の１本鎖プライマーの複数のコピーを生成することができる。
【００６４】
置換された下流フラグメントは第２の反応で伸長できる。
【００６５】
更に、置換された下流フラグメントを第２のテンプレート核酸上で伸長することができる。
【００６６】
また複数の第２のテンプレートをＤＮＡチップ上に固定することができる。
【００６７】
本発明のこれらの観点について更に以下に記載する。
【００６８】
本発明にかかる方法を検出診断に使用することができる。従って、例えば方法を病原体の検出に使用できる。
【００６９】
本発明にかかる方法を変異の存在または不在の検出、および多形の検出に使用することもできる。
【００７０】
認識されるように、本発明にかかる方法をサンプル中の核酸レベルの定量に使用することができる。
【００７１】
本発明にかかるＧＭＡ法はいくつかの方法を用いて定性および定量の両方を行うことができる。従って、ＩＰおよび／またはテンプレート核酸上のその相補的アニーリング部位の特性および量を、テンプレート上でＧＭＡ反応を起動するＩＰの能力によって評価することができる。本発明に従って得られる分解能は、必要により、ＩＰおよび／またはテンプレートもしくは標的核酸間の１個の塩基の違いを確認できるほど高くすることができ、これはＧＭＡ反応をうまく起動させられることに基づく。ＩＰは天然に存在する核酸から直接または間接的に誘導してもよく、ＧＭＡによってＩＰの定性的および定量的キャラクタリゼーションが可能となるため、ＧＭＡを使用して核酸の定性的および定量的キャラクタリゼーションを行うことができる。これは核酸の検出、診断、および定量の分野で非常に有用である。これには例えば、組織サンプル中のある種の細菌およびウィルスのような病原性微生物の検出および定量、その中の変異体の検出、ヒトの疾病の原因となる変異の検出、１個のヌクレオチド多形の検出、および特定のｍＲＮＡ種の量／力価の定量がある。
【００７２】
本発明にかかる方法は定量の分野で既存の技術をはるかに越えた利点を有する。ＧＭＡの反応速度論は直線であるため、ＧＭＡ反応は、指数関数的速度論を有する既存の増幅技術より測定／定量が容易である。
【００７３】
本発明にかかる方法はコンタミネーション制御の領域でも既存の技術をはるかに越えた利点を有する。この理由は、既存の技術と異なり、基本的なフォーマットのＧＭＡは開始プライマーがその後に使用するための新たなテンプレートを合成せず、この過程の反応論が直線であることである。
【００７４】
本発明にかかる方法をプライマーまたはテンプレートとして機能できる核酸からのシグナル増幅に使用することもできる。
【００７５】
本発明にかかる方法は既存の技術よりはるかに優れており、１個の直線テンプレートを使用して、開始プライマーからのシグナル増幅が可能となる。ＧＭＡでは増幅された置換型の下流フラグメントに開始プライマーが導入されない。これによって、置換された下流フラグメントは常に開始プライマーである５’尾部を有さないという利点が与えられる。更にこれは置換された下流フラグメントが第２の反応で伸長されて、開始プライマーに相補的な配列の無い、相補的置換型下流フラグメントを生成できることを意味する。
【００７６】
本発明にかかる方法は特有のものであり、１つの反応容器内で実施でき、テンプレート上でのＩＰの伸長によってＩＰとは異なる新たなプライマーが生成および増幅され、このプライマーはその後、それが誘導された同じテンプレートまたは別のテンプレート上でＩＰとして作用する。
【００７７】
本発明のある態様について、図１に関連して以下のように例証する：
事象１ プライマーがテンプレート上の相補的配列に結合する；
事象２ 結合後、プライマーの遊離３’ＯＨ末端がＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。これはプライマーの３’ＯＨ末端への前駆体ヌクレオチドの重合化によって起こる。テンプレートの配列に従って、前駆体ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および／またはｄＴＴＰ）が修飾された前駆体ヌクレオチドに加えて伸長プライマーに導入される。修飾された前駆体ヌクレオチドは一般に、標準的な前駆体ヌクレオチドの１つを完全に、または部分的に置換する。新たに合成されたＤＮＡ鎖は最初のテンプレートに相補的であり、ここでは相補的テンプレート鎖と呼ぶ；
事象３ 修飾された前駆体ヌクレオチドが新たに合成されたＤＮＡに導入されると、そのＤＮＡは特定のＤＮＡグリコシラーゼの基質である修飾された塩基を含有する。その結果として、修飾された塩基が新たに合成されたＤＮＡに現れるたびに、ＤＮＡ中のデオキシリボース部分にその塩基を結合させるＮ−グリコシラーゼ結合の開裂によってそれがＤＮＡから遊離される。これによって無塩基部位が生成されるが、これは本質的に、近接側および末端側（すなわちデオキシリボース部分の５’および３’（ ５’結合が元のプライマーに最も近い））でホスホジエステル結合によって隣接するＤＮＡに結合するデオキシリボース部分である；そして
事象４ 無塩基部位は例えばＡＰエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ）酵素の基質である。その結果として、無塩基部位が現れるたびにＡＰＥによって開裂される。この酵素はデオキシリボース部分の５’側のホスホジエステル結合を開裂し、上流ＤＮＡセグメント上に遊離３’ＯＨ末端および下流セグメントの５’末端に結合するデオキシリボース部分を生成する。
【００７８】
事象５ 反応中に存在するＤＮＡポリメラーゼは、上流フラグメントが新たに生成されるたびに、その３’ＯＨ末端から新たなＤＮＡを合成し、その間に重合化の下流ＤＮＡを１本鎖として置換する。これによって新たな前駆体ヌクレオチド（修飾された前駆体ヌクレオチドを含む）が新たに合成された相補的テンプレート鎖に導入され、テンプレート核酸中のその相補的塩基の反対側の新たに合成された鎖の各位置に新しい修飾された塩基が出現する。
【００７９】
従って、この態様にかかる反応工程ｉ）からｉｉｉ）は、試薬の１つが限界となるまで連続的に循環する。
【００８０】
反応のサイクルで生成されたそれぞれの遊離３’ＯＨ末端はその後の反応サイクル毎に１回伸長され、下流ＤＮＡセグメントがそれに付随して置換される。反応は連続的であるため、正味の結果は、生成された各３’ＯＨ末端からの新たなＤＮＡの反復合成、および個別のサイズの個別の１本鎖フラグメントとしての置換された下流ＤＮＡ（ここでは置換された下流フラグメント、または置換されたフラグメントと呼ぶ）の蓄積であり、これはポリメラーゼによるＤＮＡ合成の停止のため、相補鎖および／または３’末端中の修飾された塩基の位置によって規定される。
【００８１】
伸長および開裂されたプライマーはポリメラーゼによるヌクレオチド（修飾された前駆体ヌクレオチドを含む）の導入により、直ちに再び伸長される。標準的な前駆体ヌクレオチド、修飾された前駆体ヌクレオチド、ポリメラーゼ、グリコシラーゼ、および開裂物質は全て、同じ反応中に同時に存在するので、伸長および開裂の連続的サイクルによって置換された下流フラグメントの多数のコピーが増幅される。
【００８２】
修飾された前駆体ヌクレオチドがｄＵＴＰの場合、修飾された塩基はウラシルであり、これを使用する場合、特異的ＤＮＡグリコシラーゼはウラシルＤＮＡグリコシラーゼである。それゆえ、置換された下流フラグメントは相補鎖中のウラシルの位置、従ってテンプレート核酸中のアデニン塩基の位置によって限定または規定されるが、これはウラシルがアデニンと通常のワトソン・クリック塩基対を形成するためである。
【００８３】
従って、手短に言えば、プライマーがテンプレートに結合し、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。デオキシＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＵＴＰが伸長プライマーに取り込まれる。次いで、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼが新たに合成された鎖中のウラシル塩基を切り出し、得られる無塩基部位がＡＰエンドヌクレアーゼ酵素によって開裂される。
【００８４】
あるいはまた、３’エンドヌクレアーゼは新たに合成された鎖中のウラシルを認識し、ウラシル部分の３’側にある第２のホスホジエステルで鎖を開裂する。
【００８５】
次いで、ＤＮＡポリメラーゼは新たに生成された３’ＯＨ末端から、それらが生成されるたびに新たなＤＮＡを合成し始め、重合化が進行するにつれて３’または下流ＤＮＡを置換する。ここでも、これによって更なるウラシルが新たに合成されたＤＮＡに導入され、その後これが切り出され、そして／または認識され、ＤＮＡが開裂され、新たな３’ＯＨ末端から重合化が開始される。
【００８６】
ＧＭＡは中温または高温で実施してもよい。ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントｅｘｏを中温（通常２５℃から４２℃の間。一般的には３７℃）で使用してもよく、あるいは高温で（一般的には５０℃から８０℃の間であるが、より高くてもよい）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（シュトッフェルフラグメント）由来の鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ）を使用してもよい。両タイプのポリメラーゼを合わせて、または連続的に反応に加えてもよい。ポリメラーゼがＤＮＡから分離する前にかなりの長さまでプライマーを伸長させることができるような高い加工性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）が必要とされる場合は、加工性の高いポリメラーゼを使用することができる。対照してみると、ポリメラーゼがＤＮＡから解離する前にプライマーが短い長さまで伸長されるように低い加工性が必要とされる場合、低加工性ポリメラーゼを使用できる。ＲＮＡテンプレートを使用する場合、鎖置換活性を有する逆転写酵素をＧＭＡ反応に使用してもよい。
【００８７】
最も単純な場合には、人工または合成のプライマーをＩＰとして提供し、所定のテンプレートまたは標的核酸上でＧＭＡ反応を起動する。ＩＰは、テンプレート中の特定の標的配列にハイブリダイズするように選択する。ＩＰのハイブリダイゼーションに次いで、ＧＭＡが開始され、伸長されたＩＰは循環反応で反復して伸長され、置換された下流ＤＮＡフラグメントが増幅される。これらの置換されたフラグメントは、公表されている方法に従って多くの異なるアプローチで定性的および定量的にキャラクタライズすることができる。
【００８８】
置換されたフラグメントの直接検出は種々の方法で行うことができ、例えばそれらを好適に標識してもよい。
【００８９】
置換されたフラグメントの標識は種々の方法によって行うことができ、それらには、合成の際、または後の、放射性リガンド、蛍光リガンド、または検出可能なリガンドのフラグメントへの付加がある。標識された前駆体ヌクレオチドを伸長反応において使用することによって、これらのフラグメントの検出が容易になる。銀または臭化エチジウム染色のような直接的なＤＮＡ染色法によって、電気泳動移動度に基づくサイズ分離後のそれらの検出が容易となる。それらのフラグメントへの相補または試験核酸のハイブリダイゼーションを使用してそれらを同定してもよく、そのような相補または試験核酸を置換されたフラグメントに直接固定化およびハイブリダイズさせてもよい。この点では、ＤＮＡマクロアレイ、ＤＮＡマイクロアレイ、およびＤＮＡチップは非常に好適である。あるいはまた、置換されたフラグメントが架橋ハイブリダイゼーション分子として作用し、１つの試験核酸（固定化してもよい）が置換されたフラグメントの一部にハイブリダイズし、第２の試験またはレポーター核酸が置換されたフラグメントの残部にハイブリダイズするようにしてもよい。ここでも、ＤＮＡマクロアレイおよびＤＮＡマイクロアレイはこれに関して非常に好適である。
【００９０】
相補または試験核酸は、種々の直接的または間接的な標識方法（例えばレポーター−クエンチャー蛍光色素法）によって好適に標識してもよい。置換されたフラグメントは１本鎖なので、相補的な分子へのハイブリダイゼーションによって２本鎖核酸が生成され、これを２本鎖特異的プローブ（例えばＳＹＢＲグリーン）を使用して検出してもよい。これは本発明にかかるＧＭＡ反応で、２本鎖ＤＮＡに特異的に結合するＳＹＢＲグリーン試薬に加え、置換されたフラグメントに相補的なＤＮＡを含めることによって行ってもよい。
【００９１】
置換されたフラグメント、特にその３’末端の配列は、その後の反応または同じＧＭＡ反応において開始プライマーとして機能するその能力によって測定することができる。本質的にそれらの測定は、それらのフラグメントおよび特にその３’末端が選択された条件下でテンプレート上の選択された相補的配列にハイブリダイズし、第２のＧＭＡ反応においてＩＰとして機能する能力に基づく。認識されるように、テンプレート上の相補的配列およびテンプレート分子そのものの選択には多くの可能性がある。それでもなお、置換されたフラグメントがＧＭＡ反応において自身の力でＩＰとして機能する能力は選択した標的配列へのハイブリダイゼーション、またはそれへのハイブリダイゼーションの欠如の基準であり、従って置換されたフラグメントの一部または全部の配列の特性の測定はこの基準に基づく。
【００９２】
置換されたフラグメントの検出は特異性の観点から非常に有利である。なぜならその生成は以下に依存するためである：ａ）標的テンプレートにＩＰがうまくハイブリダイズすること、そしてｂ）正しいテンプレート上でＧＭＡ反応が起動されること。従って、予想される置換されたフラグメントが検出されるということは、ＩＰが正しいテンプレート上の正しい領域にハイブリダイズしたという証拠である。
【００９３】
置換されたフラグメントの同定または配列は種々の方法を使用して確認することができ、それらにはハイブリダイゼーション、質量測定、そして核酸に直接ライゲートするその能力または１つ以上の核酸分子のライゲーションに必要とされる相補鎖として作用するその能力がある。例えば直鎖の試験ＤＮＡの５’および３’末端をライゲートさせて環を形成するための架橋ハイブリダイゼーション分子としての役割を果たすその能力を評価することによって検出およびキャラクタライズすることができる。その後、ハイブリダイズした置換されたフラグメント、または更なるプライマーは新たな環状テンプレート上でのＧＭＡ反応のＩＰの役割をし、ローリングサークル複製（ＲＣＲ）機構によってＤＮＡが増幅される。
【００９４】
留意すべきことに、置換された下流フラグメントはＩＰとして作用することに加え、その後のＧＭＡ反応のテンプレートとしても作用する。
【００９５】
ＩＰを生成できる多くの方法がある。いずれの場合にも供給または生成されるＩＰは、その後のＤＮＡ重合化工程を起動できるように遊離の３’ＯＨ末端を有さなければならない。
【００９６】
ＩＰを人工的に合成することによって、ＩＰの合成、設計、および修飾の点で多くの可能性が与えられる。人工的に合成されたプライマーの多くの異なる修飾が既に報告されている。それらには塩基、糖、およびホスホジエステル結合の修飾があり、また、グリコシラーゼの基質塩基（例えばウラシル、ヒポキサンチン、および８−ヒドロキシグアニン）をプライマーに導入するためのものがある。
【００９７】
一般に、標準的な、または修飾されたＩＰはテンプレート核酸上のその相補的配列の全部または一部と特異的に対合するように合成される。十分確立されているところによれば、伸長できる可能性のあるプライマーの３’末端およびテンプレートの塩基間の相補性はＩＰがそのテンプレート上で伸長されるかどうかを決定する重要なパラメーターの１つである。テンプレートの一部に完全に相補的であるＩＰはＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能であるが、テンプレートの一部に、その３’末端の塩基を除いて完全に相補的であるＩＰはストリンジェントな条件下で伸長されない。従って、認識されるように、テンプレート上でのＩＰの伸長を使用して、１塩基だけが異なるような近い関係にあるＩＰ間の識別をすることができる。同様に、認識されるように、テンプレート上でのＩＰの伸長を使用して、１塩基だけが異なるような近い関係にあるテンプレート間の識別をすることができる。この方法はヒト遺伝学の分野で特に重要なものであり、これによって変異および単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）のような多形の検出をすることができる。
【００９８】
ＩＰおよびテンプレート間のハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーはかなり変化させられることが十分確立されている。低ストリンジェンシー条件によってＤＮＡ分子間の低特異性ハイブリダイゼーションが可能となる。従って低ストリンジェンシー条件下では、部分的に相補的なＤＮＡ分子が互いにハイブリダイズできる。そのため、それらの条件下では部分的に相補的なＩＰがテンプレートにハイブリダイズする。それらの条件下では、１つのＩＰがテンプレート核酸上の部分的に相補的な１つ以上の部位でハイブリダイズおよび伸長されうる。ストリンジェンシー条件が非常に低くて複数の部位でプライミングが起こる場合、工程はランダム・プライミングと呼ばれる（ただしプライミングは完全にランダムなのではなく、ＩＰの一番３’側の５塩基とテンプレート間十分対合していることが一般に必要とされる）。ストリンジェンシーが高くなるにつれ、ハイブリダイゼーションの特異性が高くなり、完全に相補的なプライマーのハイブリダイゼーションだけが起こり、部分的に相補的なプライマーは、たとえそれが１つの塩基が異なるだけであっても、ハイブリダイズしないようなハイブリダイゼーション条件は容易に確認できる。ハイブリダイゼーションの際、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが変更されうるような多くのパラメーターがある（例えば温度）。温度が高くなるほどハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは高くなる。その結果として、ＤＮＡ分子間のハイブリダイゼーションに依存する酵素過程において、より高い温度でより高い特異性が得られる。しかしながら、より高い温度での酵素過程では、通常、熱安定酵素が必要とされる。
【００９９】
人工的に合成されたプライマーまたは天然の核酸の開裂後にＩＰを生成させ、新たな遊離３’ＯＨ末端が生成されるようにしてもよい。開裂は１本鎖もしくは２本鎖に依存する、１本鎖もしくは２本鎖の状況に置ける修飾された塩基の存在に依存する、配列に依存する、不対合の存在に依存する、または特定の構造の存在に依存する、のいずれかであってもよい。従って、１本鎖または２本鎖の状況で特異的グリコシラーゼによって認識される修飾された塩基を有するプローブのグリコシラーゼ介在型開裂を通してプライマーを生成してもよい。ＩＰの生成は、例えばプローブがテンプレート核酸にアニールする場合、２本鎖の状況で不対合特異的エンドヌクレアーゼまたはグリコシラーゼによって認識される不対合塩基を有するプローブの開裂によって行ってもよい。これは塩基の不対合がプライマーとテンプレート間のハイブリダイズしたセグメントの１つ以上の位置で生成されるようにプライマーを設計し、２本鎖核酸の不対合塩基で特異的に開裂することが既に明らかになっている１つ以上の種々のエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡグリコシラーゼと共にインキュベートすることによって行うことができる。これらにはＴ７エンドヌクレアーゼＩ、ＭｕｔＹ、ＤＮＡグリコシラーゼ、チミン不対合ＤＮＡグリコシラーゼ、およびエンドヌクレアーゼＶがある。
【０１００】
ＩＰは、開裂酵素（ｃｌｅａｖａｓｅ）のような構造特異的酵素を使用し、重複オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによって生成された複合体を開裂することによって生成してもよい。
【０１０１】
プライマーは３’末端をブロッキングして合成し、プライマーの開裂によって保護基を遊離させない限りプライマーが伸長されないようにしてもよい。それらのプライマーをここでは３’−保護プライマーと呼ぶ。プライマーの保護された３’末端はいくつかの方法で得ることができ、それらには３’リン酸エステル化、３’末端におけるジデオキシヌクレオチドの導入、３’アミンまたは３’チオール基を有するプライマーの合成、３’末端に１つ以上の逆向き（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ヌクレオチドを有するプライマーの合成、またはＤＮＡリアーゼによる無塩基部位の開裂がある。
【０１０２】
従って本発明のある態様では、非相補的な３’末端を有するように（すなわちその３’末端がテンプレートに相補的でないように）プライマーを合成し、３’末端がプライマーの開裂によって遊離されない限りプライマーが伸長されないようにしてもよい。
【０１０３】
非相補的な５’末端を有するようにプライマーを合成し、開裂によってテンプレート核酸からプライマーが解離するようにしてもよい。その後、解離したプライマーは別のテンプレート上でのＧＭＡ反応においてＩＰとしての役割を果たす。
【０１０４】
３’保護プライマー脱保護し、非相補的３’末端または非相補的５’末端を遊離させるためのプライマーの開裂は、テンプレート核酸の全部または一部へのプライマーのハイブリダイゼーションによって行ってもよく、これによって開裂に次いで、新たな遊離３’ＯＨ末端を有するＩＰが生成され、同一の、または別のテンプレート上でＩＰが伸長されるようになる。この場合のテンプレート上で伸長できるようになるためのハイブリダイズしたプライマーの開裂には、そのプライマーのハイブリダイズしたセグメントにおける１つ以上の位置でプライマーが開裂される必要がある。これは、プライマーが３−アルキルプリンＤＮＡグリコシラーゼ（例えばＡｌｋＡ）の基質である修飾された塩基、ヒポキサンチンを含有するように設計することによって行うことができる。
【０１０５】
本発明の更なる態様では、熱安定性開裂物質を使用して、ハイブリダイズしたプライマーを修飾された塩基または不対合塩基で開裂し、プローブが開裂されると２つ以上のフラグメントが熱的に不安定となり、標的核酸から解離し、それによって別の完全長のプライマーがハイブリダイズできるようになる。この往復過程がシグナル（開裂されたプライマーの生成の増加）を増幅する。その後、３’ＯＨ末端を有する開裂された産物はその後の、または合わせた（ｃｏｕｐｌｅｄ）ＧＭＡ反応においてＩＰとしての役割を果たすことができる。
【０１０６】
ＩＰは、修飾された塩基でプライマーを開裂することによって生成してもよく、それらの開裂はテンプレート上のプライマーの伸長に依存する。これによって元のプライマーより小さいＩＰの生成が可能となり、これは種々の方法でキャラクタライズできる。例えば、Ｅ． ｃｏｌｉのウラシルＤＮＡグリコシラーゼはプライマーの３’位の最末端または末端から２番目からウラシルを遊離しない。しかしながら、プライマーがテンプレート上で伸長されれば、プライマーの３’位の最末端または末端から２番目にあったウラシルは新たに伸長された核酸の３’末端から更に離れた位置となり、従って遊離される。このように遊離３’ＯＨ末端を有し、元のプライマーより１または２塩基短いプライマーが生成され、その後のＧＭＡ反応のＩＰとなる。
【０１０７】
ＩＰは以下のようなＤＮＡまたはＲＮＡ開裂物質を用いた完全または部分的な酵素的または化学的な開裂によって天然に存在する、または増幅した核酸から生成してもよい：増幅の際の通常のＤＮＡ塩基のグリコシラーゼ基質塩基への変換またはそれらの塩基の導入に次ぐＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、ＤＮＡの部分的または完全な脱プリンまたは脱ピリミジン後のＡＰエンドヌクレアーゼ、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドにおいてＲＮＡまたはＤＮＡを開裂する酵素（例えばＲＮアーゼＨ）、および核酸ハイブリッド分子（例えばＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよびＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド）の変性および再アニーリング後に生成されたＤＮＡ不対合で開裂する酵素。ＤＮＡまたはＲＮＡの酵素的または化学的開裂は、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されない３’末端を生成しうる。それらの３’末端は一般に、３’ホスファターゼ活性を有するＡＰエンドヌクレアーゼＩＶまたはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼのような１つ以上の酵素で処理することによって伸長可能にすることができる。開裂物質が２本鎖、１本鎖、または配列特異的であってもよいことは十分確立されている。２本鎖または１本鎖核酸を、それぞれ１つ以上の開裂物質を使用して開裂して小さな２本鎖または１本鎖フラグメントとし、その後ＧＭＡを行ってもよい。これによって置換されたフラグメントのサイズを制限する方法が提供される。
【０１０８】
デュプレックス分子の１本鎖の開裂またはニック生成によって遊離３’ＯＨ末端を有する核酸断片が得られ、これはＧＭＡ反応においてそれがハイブリダイズするテンプレート上で、または別のテンプレート上で、ＩＰとして直接機能できる。デュプレックス分子の１つの鎖の開裂またはニック生成はある種の開裂物質を使用して行うことができる。少量のヌクレアーゼ酵素（例えばＤＮアーゼ）で非特異的に核酸にニックを生成することができ、これによって核酸テンプレート上の多くの位置から多くの異なる置換された下流フラグメントが生成される。
【０１０９】
より特異的な物質、例えば制限酵素Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ（ＤＮＡの認識配列ＧＡＧＴＣの３’側の４塩基下流にニックを生成する）を用いて核酸にニックを生成することができる。あるいはまた、制限酵素、例えばＨｉｎｃＩＩまたはＢｓｏＢＩを用いて核酸にニックを生成することができるが、これは一方の鎖だけが修飾された２本鎖ＤＮＡの未修飾鎖に特異的認識部位でニックを生成し、それによって遊離３’ＯＨ末端を生成する。ＲＮＡをある種のＲＮアーゼ、より特定して言えば配列または構造特異的ＲＮアーゼ（例えばリボザイム）で非特異に開裂してもよい。ＲＮアーゼＨはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを開裂する。従って、逆転写酵素によるＲＮＡテンプレート上でのｃＤＮＡの合成の後、ＲＮＡをＲＮアーゼＨで開裂することができる。オリゴヌクレオチドＤＮＡ分子をＲＮＡ上の１つ以上の配列にさせた後、ＲＮアーゼＨによってＲＮＡを特異的に開裂することができる。
【０１１０】
特に、オリゴ／ポリｄＴの添加によってｍＲＮＡ種の２本鎖の３’ポリＡ尾部を生成する方法が提供される。ＲＮアーゼＨの添加によってポリＡ尾部が消化され、各ｍＲＮＡ種に独自の３’末端が提供される。この方法によってサンプル中の各ｍＲＮＡ種がＧＭＡでＩＰとして作用できる可能性がありうるような方法が提供される。
【０１１１】
２本鎖核酸を開裂してその遊離３’ＯＨ末端を露出させ、開裂したＤＮＡがＧＭＡにおいてＩＰとして機能できるようにしてもよい。例えば２本鎖ＤＮＡを熱によって変性させてもよい。あるいはまた、デュプレックスＤＮＡを５’末端から段階的な非加工性の（ｎｏｎ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）反応で加水分解するＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼで処理してもよい。この酵素は１本鎖ＤＮＡ上では不活性であり、従ってデュプレックス領域がもはや存在しない場合、停止する。
【０１１２】
重要なことに、デュプレックス分子の１本鎖の不対合での特異的開裂によって３’ＯＨ末端を有する核酸フラグメントが生成され、これは、それがハイブリダイズするテンプレートまたは別のテンプレート上でＩＰとして直接的に機能できる。これによって核酸における変異および多形を同定する方法が提供される。
【０１１３】
この観点では、本発明によって、以下のような方法で核酸中の特定の位置（候補となる遺伝子座）での変異または多形の存在または不在を調査することが可能となる：３’が保護されたプライマーを標的核酸にアニールさせ、候補となる遺伝子座に不対合を生成させる。不対合は一般にプライマーに関して内部に位置する。すなわち、テンプレート上で候補となる遺伝子座の塩基と不対合を生じる塩基はプライマーの５’末端または３’末端ヌクレオチドの塩基残基ではない。不対合特異的グリコシラーゼおよび無塩基部位開裂物質を用いた不対合位置でのプライマーの開裂に際し、プライマーの５’側の開裂断片は３’ＯＨ末端を有し、従ってその同じテンプレートまたは別のテンプレート上でＧＭＡ反応を開始できる。従って得られるＧＭＡは、プライマーのテンプレートへの（逆も同様）結合によって不対合が生じたか生じなかったかによって変異の存在または不在を示す。
【０１１４】
更に、再アニールした核酸ハイブリッド分子を不対合特異的酵素、例えばＴ７エンドヌクレアーゼＩ、ＭｕｔＹ ＤＮＡグリコシラーゼ、チミン不対合ＤＮＡグリコシラーゼ、またはエンドヌクレアーゼＶで処理することができる。ＰＣＲ法による遺伝子増幅とその後の再アニールおよび不対合でのＤＮＡの開裂を不対合特異的修復酵素と組み合わせることによって遊離３’ＯＨ末端が生じ、これはその後のＧＭＡ反応においてその相補鎖からの解離後、異なるテンプレート上でＩＰとしての役割を果たすことができる。
【０１１５】
あるいはまた、標準的な“一度で終わる（ｏｎｃｅ ｏｆｆ）”鎖置換反応またはＧＭＡ反応において鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用して不対合部位に生成された３’ＯＨ末端からの伸長によって置換されたフラグメントが生成され、これはその後のＧＭＡ反応においてＩＰとしての役割を果たす。ＩＰの生成は不対合の存在に依存するので、ＧＭＡ反応の起動は不対合を示す。ゲノム全体を増幅する方法をこの方法と併用し、複数のプローブおよび／または複数のテンプレートを使用して置換されたフラグメントを検出する場合、多くの増幅産物を不対合の存在について試験することができる。選択されたプローブおよび／または選択されたテンプレートを使用して不対合を配することができる。プローブのアレイを使用して、これを広範なゲノム探索または複数の増幅された核酸の同時探索に適用することができる。
【０１１６】
ＧＭＡ反応における変性ＩＰの使用によって、テンプレート上の複数の部位でＧＭＡを起動する方法が提供される。ＩＰの変性を非常に高度にし、それによってテンプレートのランダムな起動をさせてもよい。そのような場合、一般に、ランダムヘキサマーのようなＩＰ、またはその３’配列としてランダムヘキサマーを有するようなより長いプライマーをゲノムＤＮＡのようなテンプレートと共に使用する。より特異的な複数の起動を、低レベルの変性を有するＩＰで行ってもよい。
【０１１７】
本発明にかかる方法を、ＧＭＡによって提供される新規のシグナル増幅法として使用することができる。ＧＭＡ反応で生成される伸長されたＩＰおよび置換されたフラグメントは遊離の３’ＯＨ末端を有し、伸長可能なプライマーとして機能することができる。鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用して、テンプレート上でのＧＭＡの際に生成される置換されたフラグメントは、好適なテンプレートがあれば、第２のＧＭＡ反応でＩＰとして自由に機能できる。テンプレートは同一の反応で、またはシグナル増幅の方法として別の反応で提供してもよい。シグナル増幅に使用するために提供するテンプレートをここではシグナル増幅テンプレートまたはブースターテンプレートと呼ぶ。これは元のテンプレートの量が少ない場合（これは最初のＧＭＡでゲノムＤＮＡをテンプレートまたは標的核酸として使用する場合にしばしば起こる）、特に重要である。ブースターテンプレートは、興味の開始プライマーに相補的な内在性配列（ここでは‘ＩＰ結合部位’と呼ぶ）を有するように合成する。一般にこの配列は、ＧＭＡ反応の際に生成される伸長された開始プライマーまたは置換されたフラグメントに相補的である。一般に、ＩＰ結合部位はブースターテンプレートの３’末端にある（ブースターテンプレートは、ＩＰを５’から３’方向に重合化および伸長するポリメラーゼによって３’から５’方向に読まれる）。１つ以上の塩基がブースターテンプレート上のＩＰ結合部位の上流（５’）に存在し、これはＧＭＡ反応で使用される修飾された塩基に相補的である。一般にこの塩基はアデニン残基である。これによってＧＭＡ反応の際、修飾された塩基（一般にＵ）がこの位置で伸長するＩＰに導入される。この位置に続く（上流の）配列（ここではブースター配列と呼ぶ）には、最初のＧＭＡ反応で使用される修飾された塩基に相補的な塩基が存在しない。ブースター配列は種々のサイズが可能であり、一般に１８ヌクレオチドより長い。一般に、ブースター配列は偽自己プライミングを防止するために逆向きヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のような３’修飾を有する。ＤＮＡ合成ブロックがブースターテンプレートのＩＰに相補的な領域に含まれて偽自己プライミングを防止してもよい。開始プライマーがブースターテンプレート上でＧＭＡを起動するとブースター配列の相補配列が生成され、ここではこれを相補的ブースター配列と呼ぶ。この手順の正味の効果は、一般にブースターテンプレートが無制限にあるために相補的ブースター配列が高レベルまでコピー／増幅され、生成されるどのＩＰもＧＭＡ反応で起動されていないブースターテンプレートを起動する役割を果たしうることである。相補的ブースター配列は検出目的のための万能レポーターとしての役割を果たすことができる。
【０１１８】
非常に高レベルのシグナル増幅を達成するために、ＧＭＡ反応において修飾された塩基に相補的な１つ以上の塩基がブースター配列（すなわちＢＳ＃１）に続くことも可能である。今度はこのブースター配列に第２のブースター配列（ＢＳ＃２）が続く。ＢＳ＃２は一般にＢＳ＃１と同一である。ＩＰがブースターテンプレート上でＧＭＡ反応を起動する場合、ＢＳ＃１およびＢＳ＃２の相補配列（ここでは相補的ブースター配列＃１（ｃＢＳ＃１）および相補的ブースター配列＃２（ｃＢＳ２）と呼ぶ）が生成される。ｃＢＳ＃１およびｃＢＳ＃２は同一であり、ＢＳ＃１からブースターテンプレートを起動するＩＰとして機能する。それらはＢＳ＃２にも結合するが、ＧＭＡ反応の各サイクルで置換される。この正味の効果は、ブースターテンプレートは一般に無制限にあるためにｃＢＳ＃２を高レベルまで増幅することができ、どのｃＢＳ＃１およびｃＢＳ＃２もＧＭＡ反応で起動されていないブースターテンプレートの開始プライマーとしての役割を果たしうるこりである。
【０１１９】
ブースターテンプレートの設計には多くの可能性がある。ｃＢＳ＃１が最初のＧＭＡ反応で生成されるなら、ｃＢＳ＃１が開始プライマーとして作用するので、ＢＳ＃１およびＢＳ＃２配列のみを有し、それらが修飾された塩基に相補的な１個の塩基で分離されているブースターテンプレートが必要とされる。ブースターテンプレートを、いくつかの異なるＩＰ結合部位（すなわち多くの異なる配列のＩＰの結合および起動を可能とする）、およびそれに続く同一の、または異なるブースター配列ユニットを有するように設計することができる。
【０１２０】
開始されたＧＭＡ反応の進行を検出またはモニタリングするための更なる可能性は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のモニタリングによるものである。ＧＭＡによってテンプレート上でＤＮＡフラグメントの連続的な再伸長（すなわち重合化）が起こるので、新たに合成されたＤＮＡにｄＮＭＰが連続的に導入され、それぞれの導入されたヌクレオチド１リン酸毎にピロリン酸部分（ＰＰｉ）が遊離される。従ってＰＰｉ検出アッセイ（Ｎｙｒｅｎ， Ｐ． （１９８７） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １６７， ２３５−２３８）を使用してＧＭＡ活性を間接的に検出またはモニタリングすることができる。
【０１２１】
前駆体ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰに加えて修飾された前駆体ヌクレオチド（例えばｄＵＴＰ）を使用するＧＭＡ反応では、生成される置換されたフラグメントは、テンプレート鎖中のＡ残基の反対側の新たに合成された相補鎖へのｄＵＴＰ対ｄＴＴＰ導入の組み合わせに従って多くのサイズとなる。そのような場合のブースターテンプレート上の好適なＩＰ結合部位は、ＩＰが最初に起動されたところの５’（テンプレートに関して）側にある最初のテンプレートの部分と同一の配列である。ＤＮＡの配列中で、Ａ残基はテンプレート中の所定の位置に０．２５の頻度で存在すると期待されるので、ｄＵＴＰまたはｄＴＴＰは平均４塩基毎に導入されると期待される。従って、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを使用するＧＭＡ反応では、置換されたフラグメントの期待されるサイズの平均は３ヌクレオチドである。ところが、ＤＮＡポリメラーゼが２つのｄＮＴＰのいずれかを０．５の確率で挿入する場合のｄＵＴＰとｄＴＴＰの割合を使用すると、生成する置換されたフラグメントのサイズは最小３ヌクレオチドから最大サイズの範囲に及び、置換されたフラグメントのサイズが大きくなるほど置換されたフラグメントの生成頻度は低下する。しかしながら、置換されたフラグメントが大きいほどＩＰとして作用する置換されたフラグメントおよびＩＰ結合部位間のハイブリダイゼーションがよりストリンジェントになりうる。従って元のテンプレート核酸上のＩＰ結合部位の５’側の配列と同一であるブースターテンプレート上のＩＰ結合部位が望ましい。例えば、４０ヌクレオチドセグメント内にｄＵＴＰまたはｄＴＴＰが導入されうる位置を１０箇所有するように置換されたフラグメントを選択する場合、置換されたＤＮＡの４０ヌクレオチドに相補的であるブースターテンプレート上のＩＰ結合部位が好適である。
【０１２２】
ＳＮＰまたは変異の検出では、テンプレート核酸を起動するＩＰが、選択されたＳＮＰの位置からテンプレート鎖に関して３’側に位置し、生成される置換されたフラグメントの１つの組み合わせがＳＮＰ部位で規定される３’末端を有するようにしてもよい。そのようなケースでは、テンプレート核酸上のＳＮＰの存在によって、ＳＮＰ部位が存在しなければ生成されない独自の３’ＯＨ末端を有する置換されたフラグメントが生成される。ＧＭＡ反応において標準的な前駆体および修飾された前駆体（例えばｄＴＴＰおよびｄＵＴＰ）の混合物を使用して、置換されたフラグメンが好適なサイズで生成されるようにすることができ、それによってＩＰストリンジェントな条件下でブースターテンプレート上でＩＰ結合部位にハイブリダイズすることが可能となる。更に、ブースターテンプレート上のＩＰ結合部位を、ＳＮＰ部位およびその部位の状態によって規定される独自の３’ＯＨ末端を有する置換されたフラグメントでしか起動されないように設計することができる。これはＧＭＡを支持するキーとなるアデニン残基がブースターテンプレート上の５’の十分近くに位置するようにブースターテンプレートを設計することによって行うことができ、それによって元のテンプレート上のＳＮＰ部位を越えた次のｄＵＴＰ導入位置で規定される３’ＯＨ末端で生成された置換されたフラグメントの３’末端がブースターテンプレート上のキーとなるアデニン残基の反対側または５’側となるようにする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、３’ＯＨ末端がＳＮＰ部位の上流部位（テンプレートとして作用するその鎖の相補鎖に関して）から生成される置換されたフラグメントは、ＩＰ結合部位にハイブリダイズしないため、ブースターテンプレートを起動しない。
【０１２３】
本発明の更なる態様によれば、ＩＰ結合部位を変性させ、多くの異なる開始プライマーの結合部位として作用できるようにしてもよい。２つ以上のブースターテンプレートをＧＭＡ反応に含め、第１のブースターテンプレートから生成されるｃＢＳが第２のブースターテンプレートの開始プライマーとして作用するようにすることができる。これには、第２のブースターテンプレートが多くの異なるＧＭＡ反応で同一であり、そのため万能ブースター配列として役立つという更なる利点がある。これによって１個の終点（ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ）ブースターテンプレートを使用する、検出およびシグナル増幅のための１本化された（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅｄ）工程が容易になる。一般に終点ブースターテンプレートは直接または間接的にＧＭＡのレポーターとしての役割を果たすように設計および合成される。
【０１２４】
ＧＭＡ反応におけるＩＰによって下流の伸長されたプライマーが置換され、これはその後のＧＭＡ反応においてＩＰとしての役割を果たす。これはＳＮＰおよび変異の検出に使用するのに重要である。プライマーをＳＮＰ部位の十分近くに配置して、導入される最初の修飾された前駆体がＳＮＰ部位に、またはその近くに存在するようにしてもよい。従ってプライマーはＳＮＰがその位置に存在するかしないかによって、異なる長さまで伸長される。いくつかの方法（ブースターテンプレート上でのその後のＧＭＡでＩＰとして機能する能力を含む）のいずれかによって、その後のキャラクタリゼーションのために異なって伸長されたプライマーの多くのコピーを生成するのが好ましい。異なって伸長されたプライマーの多くのコピーは、ポリメラーゼ連鎖反応に関して報告されている熱サイクル過程によって得てもよい。あるいはまた、異なって伸長されたプライマーを、このプライマーの５’側（すなわちテンプレート鎖の３’側）でＧＭＡ反応を開始することによって反復して置換してもよい。これはＳＮＰ部位の近傍に位置するプライマーの５’にハイブリダイズするＩＰを使用して行い、このＩＰはＧＭＡを開始する。下流プライマーは同じ反応の各サイクルで伸長されるが、各サイクルで置換もされる。一度置換されると、新たなプライマーがハイブリダイズし、伸長される。
【０１２５】
テンプレート核酸から生成される置換されたフラグメント、およびブースターテンプレートから生成される相補的ブースター配列を５’ヌクレアーゼアッセイで検出してもよい。一般に、５’ヌクレアーゼアッセイは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（テンプレートの下流にアニールするプローブの分解を誘引する）を使用するテンプレート上でのＤＮＡ合成の開始プライマーとして作用するその能力によって、特定の核酸を検出するアッセイである。この変性は反応に使用するポリメラーゼ中の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の存在に基づく。典型的なプローブはレポーター蛍光色素およびクエンチャー色素の両方を近接して有するオリゴヌクレオチドである。プローブの分解によってレポーターとクエンチャーが互いに隔離／分離すると、蛍光強度が上昇する。従って、蛍光の増加は、プローブがテンプレートにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって、それがテンプレート核酸上で開始プライマーを伸長する際、分解されたことを示す。
【０１２６】
このアッセイの変法は、プローブがテンプレートの一部であるが、テンプレートのある部分に相補的であるようなアプローチを使用する。これによって、プローブがテンプレート核酸上の相補配列との塩基対合によってテンプレートの一部とステム（ｓｔｅｍ）を形成し、これによって効率的に、１つの遊離５’末端と１つのループ末端を有する２本鎖ステムが生成される。
【０１２７】
あるいはまた、一方の末端にレポーターを有し、他方の末端にクエンチャーを有する自己相補的プローブを使用してもよい。この場合、プローブが塩基の対合によってステムおよびループを形成してレポーターがクエンチャーに近づき、これによって蛍光がクエンチングされる。完全または部分的に相補的な置換されたフラグメントまたはｃＢＳの存在下でステム・ループ構造を変性させることにより、プローブと置換されたフラグメントまたはｃＢＳ間のハイブリダイゼーションが可能となる。これによってプローブが２本鎖となり、レポーターおよびクエンチャー間の距離が増加し、蛍光強度が上昇する。
【０１２８】
結合したレポーター−クエンチャーとの併用にＧＭＡを適合させることによって独自のブースターテンプレートが提供され、これによってＩＰ検出およびシグナル増幅が同時に行えるようになる。本質的に、ブースターテンプレートはＩＰ結合部位、およびそれに続く自己相補配列（２本鎖ステム・ループ構造の形成によって、結合したレポーター−クエンチャーを近づける）を有するように設計する。ＩＰ結合部位およびステム・ループ構造を形成する配列には、ＧＭＡ反応において修飾された塩基に相補的な塩基が存在しない。ＩＰ結合部位はステム・ループ配列の３’側であり、開始プライマーに相補的な配列および／またはｃＢＳに相補的な配列を含有しうる。ＧＭＡ反応において修飾された塩基に相補的な１つ以上の塩基がステム・ループの５’に存在し、別のｃＢＳに相補的な配列がそれに続く。開始プライマーがレポーター・クエンチャー・ブースターテンプレート上で伸長される場合、正味の効果はブースターテンプレートのＩＰ結合部位およびステム・ループ部分が直線化され、ＧＭＡの際、鎖置換によって２本鎖となり、２本鎖のままである。ブースターテンプレートの５’末端で更なるｃＢＳが合成され、これが今度はＧＭＡ反応において起動していないブースターテンプレートの開始プライマーとして作用することによって、シグナルが増幅される。ステム・ループが直線化され、２本鎖になると、蛍光強度が上昇し、蛍光の測定値が反応におけるＩＰのレベルの基準としての役割を果たす。
【０１２９】
本発明にかかる別のシグナル検出法は、置換されたフラグメントの一部または全部がそれ自体の内部、またはそれ自体の他のコピーとの間のいずれかで、自己相補的であって、２本鎖ＤＮＡを形成するようにブースターテンプレートを設計することを伴う。その後、ＳＹＢＲグリーンのような２本鎖特異的プローブの結合によって２本鎖ＤＮＡを容易に検出できる。
【０１３０】
ブースターテンプレートは環状であってもよい。それらの環状ブースターテンプレートによって、伸長ＤＮＡポリメラーゼを回転環状（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ）複製方式で連続的に進行させる方法が提供される。環状ブースターテンプレートと共に使用できる多くの変法がある。最も単純な形態では、環状ブースターテンプレートが回転環状増幅のテンプレートとしての役割を果たし、ＩＰが環上でのＤＮＡ複製のイニシエーターとして作用してもよい。それらの場合、ＤＮＡはポリメラーゼまたはＤＮＡ前駆体が限界となるまで連続的に合成される。それらのブースターテンプレートをＧＭＡ反応に含めるには、ブースターテンプレートを、ＧＭＡ反応において修飾された前駆体ヌクレオチドに相補的な残基を含有しないように設計する必要がある。
【０１３１】
あるいはまた、１つ以上のＩＰ結合部位、およびそれに続く、ＧＭＡの際に伸長ＩＰへの修飾された前駆体の導入をサポートする残基を有するようにブースターテンプレートを設計してもよい。更にこれに１つ以上のブースター配列が続いてもよい。ＧＭＡ反応において、ブースター配列が先行し、修飾された塩基に相補的な１つ以上の塩基がそれに続いてもよい。ブースター配列の相補配列は、生成されると、起動されていないブースターテンプレートのＩＰとして作用する。その後のブースターテンプレートの起動によって更なる未起動のブースターテンプレートの更なるＩＰが提供され、全てのブースターテンプレートが起動されるまで反応が継続し、試薬の１つが限界となるまで複製が継続される。この方法の正味の効果はブースターテンプレートの全てまたは一部の線状コピーが各サイクルで生成されることである。自己起動ブースター配列を有する第２の相補的ブースターテンプレートを含めることによって、ブースターテンプレートの多くの線状コピーを生成する方法が提供される。その後、２つのブースターテンプレートの線状コピーを互いにハイブリダイズさせて２本鎖ＤＮＡを生成し、これはいくつかの方法（例えばＳＹＢＲグリーンのような２本鎖特異的ＤＮＡ結合物質を含む）によって検出することができる。
【０１３２】
１つのブースターテンプレートを、互いに塩基対を作って２本鎖ＤＮＡを生成するｃＢＳを生成するように設計してもよい。ブースターテンプレートはこの適用に特に好適である。なぜならＤＮＡ環内の自己相補的領域は自己相補的領域内にないＩＰ結合部位にハイブリダイズするＩＰによって、変性を行わずに起動できるためである。対照的に、ＩＰをＩＰ結合部位へ接近させるには完全な２本鎖線状相補ＤＮＡの変性が必要である。
【０１３３】
本発明の別の態様では、ブースターまたは第２テンプレートを固相支持体、例えばミクロ−もしくはマクロ−アレイまたはＤＮＡ‘チップ’に固定化することができる。多くの異なるブースターまたは第２テンプレートをＤＮＡチップに固定化し、次いでこれを使用して多くの異なる核酸および多くの異なるＧＭＡ反応を高情報処理でキャラクタライズすることができる。好ましい態様では、１つがその３’末端を介して第２テンプレートに結合する。これによって、他の反応性を有する３’ＯＨ基が接近できなくなり、従ってポリメラーゼによって伸長されずにテンプレートとしてのみ作用し、それによってバックグラウンド非特異的伸長が低減する。
【０１３４】
本発明の別の態様では、ＤＮＡ算定（ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）におけるＧＭＡの使用を提供する。現在いよいよ認識されているところによれば、固有の物理的および化学的特性によって、ＤＮＡは難解な数学的作業への解決を評価するための方法を提供してもよい。認識されるように、開始プライマー、テンプレート、および／またはブースターテンプレートを情報の個々の、または合わせた断片として作用するように設計することによって、それが問題および／または解決となろうと、数学的な問題の解決は、ＧＭＡ反応を使用して算定することができる。好ましくはＩＰおよびテンプレートは人工的に合成する。また、認識されるようにＤＮＡ算定においてＧＭＡを使用することによって同時操作および並行探索が可能となり、完全な一連の可能性のある解決が引き出される。
【０１３５】
本発明によれば、ここに記載するようなＤＮＡ算定における、および／またはＤＮＡ算定の“手段”としての方法（ここでは集合的にＤＮＡ算定という）の使用を提供する。
【０１３６】
本発明について、以下の実施例によって更に例証する。
【０１３７】
発明の実施の形態
種々の酵素を以下の実施例に使用した。以下に記載するように、これらの酵素には市販のものもあり、またＥ． ｃｏｌｉ株における過剰発現から精製したものもあった。
【０１３８】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＵＤＧ（ＴｍａＵＤＧ）
ＴｍａＵＤＧタンパク質のオープンリーディングフレームをＰＣＲによってＴ． ｍａｒｉｔｉｍａゲノムＤＮＡから増幅した。製造者の説明書（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＰＣＲ産物をｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ過剰発現ベクターに挿入した。次いで製造者の説明書に従って、熱ショックによってコンピテントＴＯＰ−１０ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコンストラクトでトランスフォームした。ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ／ＴｍａＵＤＧコンストラクトを含有する細胞をＯＤ６００が０．６（１０００ｍＬ）となるまで増殖させ、アラビノースを最終濃度０．２％まで添加して過剰発現を誘導した。３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を溶解し、融合タンパク質の精製を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者の説明書に従って行った。溶出したタンパク質を含有する１５ｍＬの画分（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で判定）を回収した。次いでＭｏｎｏ−Ｓ樹脂を使用したイオン交換クロマトグラフィーによって画分を更に精製し、最も濃度の高いタンパク質溶出画分０．５ｍＬを回収し、５０％までグリセロールを添加した後、必要時まで−２０℃で保存した。
【０１３９】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ エンドヌクレアーゼ ＩＶ （ＴｍａＥｎｄｏ ＩＶ ）
ＴｍａＥｎｄｏＩＶタンパク質のオープンリーディングフレームをＰＣＲによってＴ． ｍａｒｉｔｉｍａゲノムＤＮＡから増幅した。製造者の説明書（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＰＣＲ産物をｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ過剰発現ベクターに挿入した。次いで製造者の説明書に従って、熱ショックによってコンピテントＴＯＰ−１０ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコンストラクトでトランスフォームした。ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ／ＴｍａＥｎｄｏＩＶコンストラクトを含有する細胞をＯＤ６００が０．６（１０００ｍＬ）となるまで増殖させ、アラビノースを最終濃度０．２％まで添加して過剰発現を誘導した。３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を溶解し、融合タンパク質の精製を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者の説明書に従って行った。溶出したタンパク質を含有する１５ｍＬの画分（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で判定）を回収した。次いでＭｏｎｏ−Ｓ樹脂を使用したイオン交換クロマトグラフィーによって画分を更に精製し、最も濃度の高いタンパク質溶出画分０．５ｍＬを回収し、５０％までグリセロールを添加した後、必要時まで−２０℃で保存した。
【０１４０】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ エンドヌクレアーゼ Ｖ （ＴｍａＥｎｄｏ Ｖ ）
ＴｍａＥｎｄｏＶタンパク質のオープンリーディングフレームをＰＣＲによってＴ． ｍａｒｉｔｉｍａゲノムＤＮＡから増幅した。製造者の説明書（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＰＣＲ産物をｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ過剰発現ベクターに挿入した。次いで製造者の説明書に従って、熱ショックによってコンピテントＴＯＰ−１０ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコンストラクトでトランスフォームした。ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ／ＴｍａＥｎｄｏＶコンストラクトを含有する細胞をＯＤ６００が０．５（１０００ｍＬ）となるまで増殖させ、アラビノースを最終濃度０．２％まで添加して過剰発現を誘導した。３７℃で８時間インキュベートした後、細胞を溶解し、融合タンパク質の精製を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者の説明書に従って行った。溶出したタンパク質を含有する１５ｘ１ｍＬの画分（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で判定）を回収およびプールした。次いでＭｏｎｏ−Ｓ樹脂を使用したイオン交換クロマトグラフィーによってプールした画分を更に精製し、最も濃度の高いタンパク質溶出画分０．５ｍＬを回収し、５０％までグリセロールを添加した後、必要時まで−２０℃で保存した。
【０１４１】
Ｅ． ｃｏｌｉ エンドヌクレアーゼ ＩＶ （ＥｃｏＥｎｄｏ ＩＶ ）
ＥｃｏＥｎｄｏＩＶタンパク質のオープンリーディングフレームをＰＣＲによってＥ． ｃｏｌｉゲノムＤＮＡから増幅した。製造者の説明書（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＰＣＲ産物をｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ過剰発現ベクターに挿入した。次いで製造者の説明書に従って、熱ショックによってコンピテントＴＯＰ−１０ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコンストラクトでトランスフォームした。ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ／ＥｃｏＥｎｄｏＩＶコンストラクトを含有する細胞をＯＤ６００が０．６となるまで増殖させ（１０００ｍＬ）、アラビノースを最終濃度０．２％まで添加して過剰発現を誘導した。
【０１４２】
３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を溶解し、融合タンパク質の精製を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者の説明書に従って行った。溶出したタンパク質を含有する１５ｍＬの画分（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で判定）を回収した。次いでＭｏｎｏ−Ｓ樹脂を使用したイオン交換クロマトグラフィーによって、プールした画分を更に精製し、最も濃度の高いタンパク質溶出画分０．５ｍＬを回収し、５０％までグリセロールを添加した後、必要時まで−２０℃で保存した。
【０１４３】
Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ ＵＤＧ − チオレドキシン（ＡｆＵＤＧ − Ｔｈｉｏ）
ＡｆＵＤＧタンパク質のオープンリーディングフレームをＰＣＲによってＡ． ｆｕｌｇｉｄｕｓゲノムＤＮＡから増幅した。製造者の説明書（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＰＣＲ産物をｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ ＴｈｉｏＦｕｓｉｏｎ過剰発現ベクターに挿入した。次いで製造者の説明書に従って、熱ショックによってコンピテントＴＯＰ−１０ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコンストラクトでトランスフォームした。ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ−ＴｈｉｏＦｕｓｉｏｎ／ＡｆＵＤＧコンストラクトを含有する細胞をＯＤ６００が０．６（２０００ｍＬ）となるまで増殖させ、アラビノースを最終濃度０．２％まで添加して過剰発現を誘導した。３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を溶解し、融合タンパク質の精製を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者の説明書に従って行った。溶出したタンパク質を含有する１５ｍＬの画分（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で判定）を回収し、必要時まで４℃で保存した。
【０１４４】
実施例１
本発明にかかる方法を使用して２５量体オリゴヌクレオチド（開始プライマー−ＩＰ）を循環的に伸長させたが、これは重合化反応のテンプレートとしての役割を果たす８０量体オリゴヌクレオチド（テンプレート核酸）のある領域に相補的である。相補的領域は８０量体の３’末端から１０塩基目から、８０量体の３’末端から３５塩基目まで伸長した。８０量体の、このＩＰに相補的な領域（ＩＰ結合部位）の５’側の領域を多数のＡ残基を含有するように設計したが、これによって２５量体の循環的伸長の際、ＧＭＡ反応に次いで別々のサイズのＤＮＡフラグメントが生成される。また、特定の数のＧ残基がそれぞれのＡ残基の間に存在するように８０量体を設計した。これによって、α３２Ｐ−ｄＣＴＰの導入により、反応の際に生成される置換された下流ＤＮＡフラグメントを標識することができた。方法のフローチャートを図１に示す。どちらのオリゴヌクレオチドも人工的に合成し、電気泳動後にポリアクリルアミドゲルから切り出して精製した。目的は、本発明にかかる方法によって２５量体が８０量体にアニールし、循環的／反復的に伸長され、標識された１本鎖ＤＮＡフラグメント（置換されたフラグメント）の多数のコピーを生成するかどうかを確認することであった。
【０１４５】
酵素を添加する前に、反応液には以下を含有させた：１００ｆｍｏｌの各オリゴヌクレオチド、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、７ｍＭ ジチオトレイトール、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＵＴＰ、０．０２ｍＭ ｄＣＴＰ、および０．２μＬ α３２Ｐ−ｄＣＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍｌ、約８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（総量１７μＬ）。この混合液に鉱油を積層し、９５℃で２分間加熱した。その後反応温度を３７℃まで低下させ、この温度で保持した。次いで５ユニットのクレノウフラグメント（３’→５’ｅｘｏ）、１ユニットのＥ． ｃｏｌｉウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、および２ユニットのＥ． ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶまたは２μＬのＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａエンドヌクレアーゼＩＶのいずれかをこの順番で添加し、反応液の最終容量を２０μＬとした。エンドヌクレアーゼＩＶを含有しないコントロール反応、およびエンドヌクレアーゼＩＶもウラシルＤＮＡグリコシラーゼも含有しないコントロール反応の場合は、水を添加して最終容量２０μＬとした。エンドヌクレアーゼＩＶの添加後、３０分間隔で反応液から５μＬのサンプルを採取した。ＮａＯＨを最終濃度５０ｍＭまでサンプルに添加した後、９５℃で１５分間加熱した。その後、等量のホルムアミド負荷色素（９８％ホルムアミド、０．０２５％ ブロモフェノールブルー、０．０２５％ キシレンシアノール）を添加した。次いでサンプルを２０％ 変性（７Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、電気泳動を実施してＤＮＡフラグメントのサイズ分析を行った。電気泳動後、ゲルをホスホル・スクリーンに暴露し、次いでイメージをＳｔｏｒｍ（商標）８６０でスキャンした。
【０１４６】
イメージ分析から明らかになったところによれば、エンドヌクレアーゼＩＶを含有する反応液は多くの７０塩基より短い種々のサイズの標識されたＤＮＡフラグメントを含有し、これは時間と共に数が増加し、エンドヌクレアーゼＩＶを含有しないコントロール反応、またはエンドヌクレアーゼＩＶおよびウラシルＤＮＡグリコシラーゼのどちらも含有しないコントロール反応では見られなかった。
【０１４７】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａエンドヌクレアーゼＩＶ標品は内在性および／または混入３’−５’エンドヌクレアーゼ活性を含有した。これはＧＭＡ反応の際、非特異的なバックグラウンド増幅を誘引する。この活性および非特異的増幅を回避するために、エンドヌクレアーゼＩＶ酵素を熱処理した後、ＧＭＡ反応に使用した。エンドヌクレアーゼＩＶ酵素のストックを９０℃で１０分間加熱した後、氷上に５分間以上放置し、次いで５分間以上遠心分離した。Ｅ． ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶ標品はそれらの活性を含有することが観察され、標品は使用前にエキソヌクレアーゼ活性の不活性化も必要であった。
【０１４８】
実施例２
本発明にかかる方法を使用して４１量体オリゴヌクレオチド（開始プライマー−ＩＰ）を循環的に伸長させたが、これはその３’末端で自己相補的、すなわちパリンドローム（ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ）であり、従ってＧＭＡ反応のそれ自体のテンプレートとしての役割を果たす。相補的領域は４１量体の３’末端から２０塩基伸長し、オリゴヌクレオチドのこの部分は本質的にＩＰとして作用する。４１量体の、このＩＰに相補的な領域（ＩＰ結合部位）の５’側の領域をＩＰ結合部位に続いて１個のＡ残基を含有するように設計したが、これによって４１量体の循環的伸長の際、ＧＭＡ反応に次いで別々の２０ヌクレオチドのＤＮＡフラグメントが生成される。また、多くのＧ残基を含有するように４１量体を設計した。これによって、α３２Ｐ−ｄＣＴＰの導入により、反応の際に生成される置換された下流ＤＮＡフラグメント（２０量体）を標識することができた。オリゴヌクレオチドは人工的に合成し、電気泳動後にポリアクリルアミドゲルから切り出して精製した。目的は、本発明にかかる方法によって４１量体がそれ自体にアニールし、循環的／反復的に伸長され、標識された１本鎖２０量体ＤＮＡフラグメント（置換されたフラグメント）の多数のコピーを生成するかどうかを確認することであった。
【０１４９】
酵素を添加する前に、反応液には以下を含有させた：１００ｆｍｏｌの４１量体オリゴヌクレオチド、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、７ｍＭ ジチオトレイトール、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＵＴＰ、０．０２ｍＭ ｄＣＴＰ、および０．２μＬ α３２Ｐ−ｄＣＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍｌ、約８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（総量１７μＬ）。この混合液に鉱油を積層し、９５℃で２分間加熱した。その後反応温度を３７℃まで低下させ、この温度で保持した。次いで５ユニットのクレノウフラグメント（３’→５’ｅｘｏ）、１ユニットのＥ． ｃｏｌｉウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、および２ユニットのＥ． ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶまたは２μＬのＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａエンドヌクレアーゼＩＶのいずれかを添加し、反応液の最終容量を２０μＬとした。エンドヌクレアーゼＩＶを含有しないコントロール反応、およびエンドヌクレアーゼＩＶもウラシルＤＮＡグリコシラーゼも含有しないコントロール反応の場合は、水を添加して最終容量２０μＬとした。３０分間以上、反応を進行させた。ＥＤＴＡを最終濃度１０ｍＭまで添加して反応を停止させた。その後、等量のホルムアミド負荷色素（９８％ホルムアミド、０．０２５％ ブロモフェノールブルー、０．０２５％ キシレンシアノール）を添加した。次いでサンプルを２０％ 変性（７Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、電気泳動を実施してＤＮＡフラグメントのサイズ分析を行った。電気泳動後、ゲルをホスホル・スクリーンに暴露し、次いでイメージをＳｔｏｒｍ（商標）８６０でスキャンした。
【０１５０】
イメージ分析から明らかになったところによれば、検出可能な量の標識および増幅された２０量体オリゴヌクレオチドが各試験反応で生成され、コントロール反応ではされなかった。
【０１５１】
実施例３
本発明にかかる方法を実施例２に記載するようにして、以下のようないくつかの変更を加えて行った：
酵素を添加する前に、反応液には以下を含有させた：１００ｆｍｏｌの４１量体パリンドローム・オリゴヌクレオチド、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＧＴＰ、０．０２ｍＭ ｄＣＴＰ、およびα３２Ｐ−ｄＣＴＰ（容量２０μＬ）。この混合液に鉱油を積層し、９５℃で２分間加熱した。その後温度を６０℃まで低下させ、そのまま保持した。１０ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ・シュトッフェルフラグメント、２μＬユニットのＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａＵＤＧ、および４ユニットのＥ． ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶ（またはエンドヌクレアーゼＩＶを含有しないコントロール反応の場合は水）をこの順番で反応液に添加し、反応液の最終容量を２５μＬとした。エンドヌクレアーゼＩＶの添加後、３０分間隔で反応液から５μＬのサンプルを採取した。これらのサンプルを１０ｍＭ ＥＤＴＡの最終濃度とした。その後、等量のホルムアミド負荷色素（９８％ホルムアミド、０．０２５％ ブロモフェノールブルー、０．０２５％ キシレンシアノール）を添加した。実施例１のようにＤＮＡサンプルのサイズ分析を行った。
【０１５２】
イメージ分析から明らかになったところによれば、エンドヌクレアーゼＩＶを含有する反応液は多量の標識されたＤＮＡを含有し、これはエンドヌクレアーゼＩＶを含有しないコントロール反応では見られなかった。試験反応液中のＤＮＡの量は時間と共に増加し、エンドヌクレアーゼＩＶの添加から９０分間でピークに達した。
【０１５３】
実施例４
本発明にかかる方法を実施例２に記載するようにして、以下のようないくつかの変更を加えて行った：
酵素を添加する前に、反応液には以下を含有させた：１００ｆｍｏｌの４１量体オリゴヌクレオチド、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＧＴＰ、０．０２ｍＭ ｄＣＴＰ、および０．２μＬ α３２Ｐ−ｄＣＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍｌ、約８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（容量２０μＬ）。この混合液に鉱油を積層し、９５℃で２分間加熱した。その後温度を７０℃まで低下させ、そのまま保持した。１０ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ・シュトッフェルフラグメント、２μＬ ＡｆＵＤＧ−Ｔｈｉｏ、および２μＬ ＥｃｏＥｎｄｏＩＶ（またはエンドヌクレアーゼＩＶを含有しないコントロール反応の場合は水）をこの順番で反応液に添加し、反応液の最終容量を２５μＬとした。６０分後、ＥＤＴＡを最終濃度１０ｍＭまで添加して反応を終了させた。その後、等量のホルムアミド負荷色素（９８％ホルムアミド、０．０２５％ ブロモフェノールブルー、０．０２５％ キシレンシアノール）を添加した。実施例１のようにＤＮＡサンプルのサイズ分析を行った。電気泳動後、ゲルをホスホル・スクリーンに暴露し、イメージをＳｔｏｒｍ（商標）８６０ホスホイメージャーを使用して検出した。
【０１５４】
イメージ分析から明らかになったところによれば、エンドヌクレアーゼＩＶを含有する反応液は多量の予期される標識された２０量体およびより小さいフラグメントをより少ない量で含有し、それらはエンドヌクレアーゼＩＶを添加していないコントロール反応では見られなかった。
【０１５５】
実施例５
本発明にかかる方法を使用して、アトモル量の４１量体パリンドローム・オリゴヌクレオチドからのプライマーの伸長を検出した。４１量体オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ触媒型伸長により、それ自体をテンプレートとして使用して生成された産物のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ消化、およびその後のエンドヌクレアーゼＩＶ消化により、その産物の１つとして２０量体１本鎖オリゴヌクレオチド（すなわちその後にＩＰとして作用できる置換されたフラグメント）を生成した。このオリゴヌクレオチドは第２のプライマーとして作用する。この例では、本発明にかかる方法により、フィードバック・ループ反応によって２０量体オリゴヌクレオチドの循環的伸長の検出が可能となる。４２量体オリゴヌクレオチド（ブースターテンプレート）を図２に図式で示すように設計した。２０量体の第２プライマー／置換されたフラグメントの相補配列がこの４２量体中に２回反復される。反復配列は（５’から３’に読んで）ＡＴ配列で分離されている。このオリゴヌクレオチドは４１量体パリンドローム・オリゴヌクレオチドと同様に合成および精製した。この４２量体は反応液中に大過剰量で含有させた。２０量体の第２プライマーを上記のように生成すれば、これはその後、本発明にかかる方法によって４２量体オリゴヌクレオチドにアニールし、それ自体が循環的に伸長され、結果としてその多量のコピーが生成される。その後、これらの新たに生成した２０量体の第２プライマーをそれ自体、４２量体オリゴヌクレオチドの他のコピーにアニールさせ、新たな周期の循環的伸長などを開始することができる。目的は、実施例２に示すように通常、少なすぎて検出できないような４１量体パリンドローム・オリゴヌクレオチドの量を検出することであり、これは上記の本発明にかかる方法のフィードバック・ループ適用によって検出可能な量の２０量体の第２プライマーを生成することによる。
【０１５６】
実施例２に記載する反応を、以下の変更を除いて、３回反復した。上記の４２量体を最終濃度４０ｎｇ／反応液で、各反応液中に含有させた。４１量体パリンドローム・オリゴヌクレオチドの濃度は、異なる組のコントロール（反応にエンドヌクレアーゼＩＶが含有されていない）および試験反応（反応にエンドヌクレアーゼＩＶが含有されている）において反応液毎に１．０ｆｍｏｌ、１０−２ｆｍｏｌ、または１０−４ｆｍｏｌとした。反応を２時間進行させ、その後ＮａＯＨを最終濃度５０ｍＭまで添加した。実施例１に記載するように、反応液の標識されたＤＮＡフラグメント含量を、元の反応液の５μＬ等量（ＮａＯＨおよびホルムアルデヒド負荷色素の添加前）の分析によって分析した。
【０１５７】
イメージ分析から明らかになったところによれば、検出可能な量の標識された２０量体オリゴヌクレオチドが各試験反応で生成され、コントロール反応では生成されなかった。
【０１５８】
同様の結果が、熱安定酵素、ＤＮＡシュトッフェル・フラグメント、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＵＤＧおよびＴｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａエンドヌクレアーゼＩＶを使用して上記の実験を反復した際に観察された。ブースターテンプレートの自己プライミングから生じる非特異増幅を回避するために、一般にブースターの３’末端はＤＮＡポリメラーゼによる伸長を阻害する保護基を含有する。上記の４２量体に使用した保護基はジデオキシシトシンヌクレオチドであった。
【０１５９】
実施例６
本発明にかかる方法を使用して自己アニール４１量体を循環的に伸長させた。この反応によって２０量体が生成されたが、これはその後、保護された３’末端（使用した保護は逆向きシチジンヌクレオチドであった）を有する４２量体（ブースター）上の開始プライマーとしての役割を果たす。この第２の反応で同じ２０量体が循環的伸長によって生成されるようにブースターを設計した（図２参照）。これらの２０量体はその後、他のブースター分子上で更なる伸長を起動し、元の４１量体上の反応からのシグナルを増幅する。４１量体および４２量体ブースターは放射能標識したα３２Ｐ−ｄＣＴＰの導入が可能となるように設計した。反応液は（１）１００ｆｍｏｌの４１量体、（２）１ｆｍｏｌの４１量体、（３）１００ｆｍｏｌのブースター、または（４）１ｆｍｏｌの４１量体および１００ｆｍｏｌのブースターのいずれかを、Ｔａｑシュトッフェル・フラグメントバッファー（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）に３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＵＴＰ、および０．０２ｍＭおよび０．２μＬのα３２Ｐ−ｄＣＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍｌ、約８００Ｃｉ／ｍＭ）を補足したものに混合して含有した。この反応混液に鉱油を積層し、９５℃で２分間インキュベートした後、温度を７０℃とし、その温度で保持した。その後、１０ＵのＴａｑシュトッフェル・フラグメント、２μＬのＡｆＵＤＧ−Ｔｈｉｏ、および２μＬのＥｃｏＥｎｄｏＩＶをこの順番で添加し、反応液の最終容量を２５μＬとした。反応液を７０℃で６０分間インキュベートし、その後ＥＤＴＡを最終濃度１０ｍＭまで添加して反応を終了させた。等量の９８％ホルムアミド負荷バッファー（０．０２５％ ブロモフェノールブルー、０．０２５％ キシレンシアノールを含有）を添加し、サンプルを変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。電気泳動後、ゲルをホスホル・スクリーンに暴露し、イメージをＳｔｏｒｍ（商標）８６０ホスホイメージャーを使用して検出した。
【０１６０】
イメージ分析から明らかになったところによれば、反応（１）において、２０量体の標識されたＤＮＡ産物、そしてより少量の−６０量体、および多くの２０量体より小さい生成物が生成された。同じ生成物が反応（２）で生成されたが、はるかに少ない量であった。反応（３）では標識された反応生成物は存在しなかったが、反応（４）では標識された２０量体が生成され、これは反応（２）で生成されたものより多量であり、またより少ない量で２０量体より小さい標識された生成物が生成された。３’末端保護として逆向きヌクレオチドを使用すると、末端保護にジデオキシヌクレオチドを使用するより効果的であった。
【０１６１】
実施例７
本発明にかかる方法を使用して４１量体オリゴヌクレオチド（開始プライマー−ＩＰ）を循環的に伸長させたが、これはその３’末端で自己相補的、すなわちパリンドロームであり、従ってＧＭＡ反応のそれ自体のテンプレートとしての役割を果たす。相補的領域は４１量体の３’末端から２０塩基伸長し、オリゴヌクレオチドのこの部分は本質的にＩＰとして作用する。４１量体の、このＩＰに相補的な領域（ＩＰ結合部位）の５’側の領域をＩＰ結合部位に続いて１個のＡ残基を含有するように設計したが、これによって４１量体の循環的伸長の際、ＧＭＡ反応に次いで別々の２０ヌクレオチドのＤＮＡフラグメントが生成される。また、多くのＧ残基を含有するように４１量体を設計した。これによって、α３２Ｐ−ｄＣＴＰの導入により、反応の際に生成される置換された下流ＤＮＡフラグメント（２０量体）を標識することができた。オリゴヌクレオチドは人工的に合成し、電気泳動後にポリアクリルアミドゲルから切り出して精製した。目的は、本発明にかかる方法により、Ｅ． ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶの代わりにＥ． ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＩＩを使用して４１量体がそれ自体にアニールし、循環的／反復的に伸長され、標識された１本鎖２０量体ＤＮＡフラグメント（置換されたフラグメント）の多数のコピーを生成するかどうかを確認することであった。酵素を添加する前に、反応液には以下を含有させた：１００ｆｍｏｌの４１量体オリゴヌクレオチド、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、７ｍＭ ジチオトレイトール、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＵＴＰ、０．０２ｍＭ ｄＣＴＰ、および０．２μＬ α３２Ｐ−ｄＣＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍｌ、約８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（総量２２μＬ）。この混合液に鉱油を積層し、９５℃で２分間加熱した。その後反応温度を３７℃まで低下させ、この温度で保持した。次いで５ユニットのクレノウフラグメント（３’→５’ｅｘｏ）、１０ユニットのＥ． ｃｏｌｉウラシルＤＮＡグリコシラーゼおよび０．１ユニットのＥ． ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＩＩを添加し、反応液の最終容量を２５μＬとした。エンドヌクレアーゼＩＩＩを含有しないコントロール反応の場合は、水を添加して最終容量２５μＬとした。３０分間以上、反応を進行させた。ＥＤＴＡを最終濃度１０ｍＭまで添加して反応を停止させた。その後、等量のホルムアミド負荷色素（９８％ホルムアミド、０．０２５％ ブロモフェノールブルー、０．０２５％ キシレンシアノール）を添加した。次いでサンプルを２０％ 変性（７Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、電気泳動を実施してＤＮＡフラグメントのサイズ分析を行った。電気泳動後、ゲルをホスホル・スクリーンに暴露し、次いでＳｔｏｒｍ（商標）８６０ホスホイメージャーを使用してイメージを検出した。
【０１６２】
イメージ分析から明らかになったところによれば、検出可能な量の標識された２０量体オリゴヌクレオチドが各試験反応で生成され、コントロール反応ではされなかった。
【０１６３】
実施例８
本発明にかかる方法を使用して２１量体オリゴヌクレオチド（開始プライマー−ＩＰ）を循環的に伸長させたが、これは重合化反応のテンプレートとしての役割を果たす４０量体オリゴヌクレオチド（テンプレート核酸）のある領域に相補的である。相補的領域を４０量体の３’末端から伸長させた。４０量体の、このＩＰに相補的な領域（ＩＰ結合部位）の５’側の領域を多くのＣ残基を含有するように設計したが、これによって、伸長された２１量体の循環的伸長の際、ＧＭＡ反応に次いで別々のサイズのＤＮＡフラグメントが生成される。また、各Ａ残基の間に多くのＧ残基が存在するように４０量体を設計した。これによって、α３２Ｐ−ｄＣＴＰの導入により、反応の際に生成される置換された下流ＤＮＡフラグメントを標識することができた。いずれのオリゴヌクレオチドも人工的に合成し、電気泳動後にポリアクリルアミドゲルから切り出して精製した。目的は、本発明にかかる方法によって２１量体が４０量体にアニールし、循環的／反復的に伸長され、標識された１本鎖ＤＮＡフラグメント（置換されたフラグメント）の多数のコピーを生成するかどうかを確認することであった。酵素を添加する前に、反応液には以下を含有させた：１００ｆｍｏｌの各オリゴヌクレオチド、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＩＴＰ、およびｄＴＴＰ、０．０２ｍＭ ｄＣＴＰ、および０．２μＬ α３２Ｐ−ｄＣＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍｌ、−８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（総量２２μＬ）。この混合液に鉱油を積層し、９５℃で２分間加熱した。その後反応温度を７０℃まで低下させ、この温度で保持した。次いで１０ユニットのＴａｑポリメラーゼ シュトッフェル・フラグメント、および８００ｐｇのＴｍａＥｎｄｏＶをこの順番で添加し、反応液の最終容量を２５μＬとした。エンドヌクレアーゼＶを含有しないコントロール反応の場合は、水を添加して最終容量２５μＬとした。ＥＤＴＡを最終濃度１０ｍＭまで添加して反応を停止させた。その後、１／２量のホルムアミド負荷色素（９８％ホルムアミド、０．０２５％ ブロモフェノールブルー、０．０２５％ キシレンシアノール）を添加し、９５℃で５分間加熱して反応生成物を変性させた。次いでサンプルを２０％ 変性（７Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、電気泳動を実施してＤＮＡフラグメントのサイズ分析を行った。電気泳動後、ゲルをホスホル・スクリーンに暴露し、Ｓｔｏｒｍ（商標）８６０ホスホイメージャーを使用してイメージを検出した。
【０１６４】
イメージ分析から明らかになったところによれば、エンドヌクレアーゼＶを含む反応は種々のサイズの標識されたＤＮＡフラグメントを多く含有し、これは伸長におけるｄＩＴＰ導入に関わる位置で線引きされ、時間と共に増加し、エンドヌクレアーゼＶを含有しないコントロール反応では見られなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、特に実施例１に記載する本発明にかかる方法のある態様の流れ図である。
【図２】図２は、実施例４に記載する本発明にかかる方法の別の態様の流れ図である。
Claims (29)
- テンプレート核酸の増幅のための方法であり、以下の工程：
ｉ）核酸プライマーを該テンプレート核酸、標準的なＤＮＡ前駆体ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたＤＮＡ前駆体ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼと反応させ、伸長された核酸プライマーを得る（該核酸プライマーは該テンプレートに結合したままである）；
ｉｉ）修飾された塩基を含有する伸長された核酸プライマーを開裂して、該ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能な遊離の３’−ＯＨ末端を生成する；そして
ｉｉｉ）それによって生成されたＤＮＡフラグメント上で工程ｉ）およびｉｉ）を反復する
を同時に実施することを含む上記方法。 - 修飾された塩基を含有する伸長された核酸プライマーを３’−エンドヌクレアーゼによって開裂する、請求項１記載の方法。
- ３’−エンドヌクレアーゼがＥ． ｃｏｌｉ由来のエンドヌクレアーゼＶである、請求項２記載の方法。
- 以下の工程：
ｉ）核酸プライマーを該テンプレート核酸、標準的なＤＮＡ前駆体ヌクレオチド、ＤＮＡグリコシラーゼの基質である少なくとも１つの修飾されたＤＮＡ前駆体ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼと反応させ、伸長された核酸プライマーを得る（該核酸プライマーは該テンプレートに結合したままである）；
ｉｉ）ＤＮＡグリコシラーゼによって、伸長された核酸プライマーから修飾されたＤＮＡ前駆体ヌクレオチドの修飾された塩基を切り出して無塩基（ａｂａｓｉｃ）部位を生成する；
ｉｉｉ）伸長された核酸プライマーを無塩基部位で開裂し、該ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できる遊離の３’−ＯＨ末端を生成する；そして
ｉｖ）それによって生成されたＤＮＡフラグメント上で工程ｉ）−ｉｉｉ）を反復するを含有する、請求項１記載の方法。 - テンプレート核酸がＤＮＡである、上記請求項のいずれか１項に記載される方法。
- 核酸プライマーがＤＮＡプライマーである、上記請求項のいずれか１項に記載される方法。
- ＤＮＡ前駆体ヌクレオチドがｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰから選択される、請求項１−６のいずれか１項に記載される方法。
- ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有する、上記請求項のいずれか１項に記載される方法。
- 修飾された核酸前駆体がｄＵＴＰである、上記請求項のいずれか１項に記載される方法。
- ＤＮＡグリコシラーゼがウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）である、請求項４−９のいずれか１項に記載される方法。
- 伸長された核酸を、核酸の無塩基部位で開裂する酵素によって無塩基部位で開裂する、請求項４−１０のいずれか１項に記載される方法。
- 酵素がＡＰエンドヌクレアーゼである、請求項１１記載の方法。
- 標準的な前駆体ヌクレオチドの１つが修飾された前駆体ヌクレオチドで部分的に置換される、上記請求項のいずれか１項に記載される方法。
- 工程ｉ）およびｉｉ）が、試薬の１つが限界となるまで循環して継続される、請求項１−３、５−９、および１３のいずれか１項に記載される方法。
- 工程ｉ）−ｉｉｉ）が、試薬の１つが限界となるまで循環して継続される、請求項４−１３のいずれか１項に記載される方法。
- 等温条件下で実施される、上記請求項のいずれか１項に記載される方法。
- 相補的核酸鎖中の修飾された塩基の位置によって特定される核酸の置換された１本鎖下流フラグメントの蓄積が起こる、上記請求項のいずれか１項に記載される方法。
- 開始核酸プライマーの下流にある別々の１本鎖プライマーの多数のコピーを生成するための、上記請求項のいずれか１項に記載される方法。
- 置換された下流フラグメントが第２の反応で伸長される、請求項１７または１８記載の方法。
- 置換された下流フラグメントが第２のテンプレート核酸上で伸長される、請求項１７−１９のいずれか１項に記載される方法。
- 多数の第２のテンプレートをＤＮＡチップ上に固定化する、請求項１７−２０のいずれか１項に記載される方法。
- 検出診断に使用するための、上記請求項のいずれか１項に記載される方法。
- 病原体の検出に使用される、請求項２２記載の方法。
- 変異の存在または不在の検出に使用される、請求項２２記載の方法。
- 多形の検出に使用される、請求項２２記載の方法。
- サンプル中の核酸のレベルを定量するための、上記請求項のいずれか１項に記載される方法。
- プライマーまたはテンプレートとして機能できるいずれかの核酸からのシグナル増幅に使用するための、上記請求項のいずれか１項に記載される方法。
- ＤＮＡ算定（ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）に使用するための、上記請求項のいずれか１項に記載される方法。
- 実質的に以下に記載および例証する、請求項１記載の方法。
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