WO2005014808A1 - ヌクレオチド鎖修飾方法 - Google Patents

ヌクレオチド鎖修飾方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2005014808A1
WO2005014808A1 PCT/JP2004/009524 JP2004009524W WO2005014808A1 WO 2005014808 A1 WO2005014808 A1 WO 2005014808A1 JP 2004009524 W JP2004009524 W JP 2004009524W WO 2005014808 A1 WO2005014808 A1 WO 2005014808A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleotide
nucleotide chain
chain
modifying
modified
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/009524
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shigeki Joko
Original Assignee
Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2003186151A external-priority patent/JP4518754B2/ja
Priority claimed from JP2004187133A external-priority patent/JP4383265B2/ja
Application filed by Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. filed Critical Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.
Priority to US10/554,495 priority Critical patent/US20070077629A1/en
Priority to EP04746993A priority patent/EP1647592B1/en
Priority to DE602004019926T priority patent/DE602004019926D1/de
Priority to CA2517167A priority patent/CA2517167C/en
Publication of WO2005014808A1 publication Critical patent/WO2005014808A1/ja
Priority to US12/720,482 priority patent/US20100291637A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for modifying a nucleotide chain, and in particular, to a method for directly modifying the 3 ′ end of a nucleotide chain with a modifying substance to label, label, and immobilize the nucleotide chain.
  • radioisotopes have been used as a modifying substance for labeling and labeling nucleotide chains such as DNA, RNA, oligonucleotides, and nucleic acids. Due to restrictions, restrictions on handling locations, exposure issues, disposal issues, etc., their use is on a declining trend.
  • a method for modifying, labeling, and labeling a nucleotide chain by using a fluorescent substance such as fluorescein or a biotin as a modifying substance in place of a radioisotope has been widely used.
  • Methods for modifying nucleotide chains can be broadly classified into three methods: 5'-end modification, 3'-end modification, and internal modification.
  • Non-Patent Document 1 a method of modifying with 5′-terminal phosphoric acid via a phosphate group has been devised (for example, see Non-Patent Document 1 below). Pyotin is modified with enzymes such as alfa phosphatase and horseradish peroxidase using the high affinity of biotin and avidin, and gene analysis is performed using chemiluminescence of these enzymes. Methods for increasing the sensitivity have been reported (for example, see Non-Patent Documents 2 and 3). Numerous other methods for modifying the nucleotide via the phosphate group at the 5 'end have been proposed (see, for example, Patent Document 1 and Non-Patent Documents 4 to 13).
  • the amount of modification of the nucleotide chain to the modifying substance is basically one, and the alkaline phosphatase dissociates the phosphate group at the 5' end of the nucleotide. Therefore, it is basically necessary to avoid combining it with alfa phosphatase to achieve high sensitivity.
  • Alkaline phosphatase is also present in bacteria suspended in the air, and when contaminated during gene analysis, modification such as the modification of the 5'-terminal phosphate-bonded substance is likely to occur. The state lacks stability and also causes background noise.
  • the phosphoramidite method which is frequently used as the 5′-terminal modification method, is complicated in that the reaction does not proceed completely, and it is necessary to separate and remove unreacted substances by liquid chromatography or the like.
  • the internal modification method is to incorporate nucleotides into the nucleotide chain, which are modified by a labeling or labeling modifier in advance during the reaction to replicate the nucleotide chain.
  • a random primer method or a nick translation method for labeling and labeling chains has been developed (for example, see Patent Document 4 and Non-Patent Documents 20 to 22).
  • This modification method combines the polymerase chain reaction, a gene amplification reaction, the so-called PCR method (see, for example, Patent Documents 5 to 8 and Non-Patent Documents 23 to 25) to amplify and label nucleotide chains. And labeling can be performed simultaneously (for example, see Non-Patent Document 26), thereby increasing the sensitivity of gene analysis and increasing the throughput of gene analysis represented by a gene microarray. (For example, see Patent Document 9 and Non-Patent Documents 27 to 29).
  • a deoxynucleotide triphosphate or dideoxynucleotide triphosphate that has been labeled and labeled in advance is synthesized (for example, see Non-patent Documents 14 and 2).
  • a tailing method has been developed in which this labeled or labeled nucleotide is added to the 3 ′ side of the nucleotide chain by terminal deoxynucleotidyl transferase (for example, Patent Document 3 and Non-Patent Documents 15 to 1). 8).
  • This 3′-end modification method is widely used because it can modify the nucleotide chain according to the required situation, has higher retention stability of the modifying substance than the 5′-end modification method, and is suitable as a modification site. ing.
  • Patent Document 10 proposes that the added glycoside bond of peracyl be degraded by peracyl DNA dalicosidase.
  • the formation of a nucleotide chain incorporating peracyl instead of thymidine is frequently performed. Have been used.
  • peracil which is used to prevent amplification of nucleotide chains derived from contamination, is incorporated into the nucleotide chain for amplification.
  • Another three-terminal modification method is to attach a modifying substance for labeling and labeling directly to the 3'-terminal nucleotide in the early stage of synthesis to form a chemically synthesized nucleotide chain. It achieves high retention stability of the modifier on the chain.
  • the number of nucleotides in the nucleotide chain obtained by chemical synthesis is about 100 due to the synthesis capability such as synthesis by-products and yield, and the number of nucleotides directly modified at the 3 'terminal used here is small.
  • the conjugation method cannot be applied to 3 'terminal modification of a nucleotide chain having more than 100 nucleotides amplified by biological extraction or PCR. That is, the length of the nucleotide chain to be modified is limited.
  • a nucleotide chain is immobilized on a substrate by pre-treating the nucleotide chain to an epoxy group or an amino group.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned conventional problems, and irrespective of the nucleotide configuration of the nucleotide chain, the modification substance is directly modified at the 3 ′ terminal without degradation of the nucleotide chain.
  • Nucleotide chain It is intended to provide a modification method.
  • the present invention also provides a method for modifying a nucleotide chain that can selectively and simply modify not only the 3 'end of a single-stranded nucleotide chain, but also one of the nucleotides forming the double strand, and the 3' end of the strand. It is intended to provide. Disclosure of the invention
  • the method for modifying a nucleotide chain of the present invention is characterized in that a nucleotide sequence having a specific base is present on the nucleotide chain to be modified in which the nucleotide sequence has a specific base, A degrading enzyme to impart a functional group capable of binding to a desired modifying substance to the 3 ′ end of the nucleotide chain to be modified, and to the 3 ′ end of the nucleotide chain having the functional group.
  • the method is characterized in that the modifying substance is bonded.
  • nucleotide chain having a nucleotide sequence having a specific base serving as an enzyme substrate on the 3 ′ side By modifying a nucleotide chain having a nucleotide sequence having a specific base serving as an enzyme substrate on the 3 ′ side, only the nucleotide sequence portion is decomposed and reacted with a desired modifying substance to bind. To form functional groups. By doing so, the nucleotide chain can be directly modified with the modifying substance (this modification can be performed easily, and labeling and labeling can be performed easily.In addition, if the aim is to immobilize the nucleotide chain, the modifying substance As a linker, it is possible to perform stable and strong fixing.
  • the nucleotide sequence having a specific base is located on the 3 ′ side of the nucleotide chain forming the main chain, and the specific base is a base not present in the main chain. This makes it possible to prevent the main chain portion from being degraded even when the degrading enzyme acts, and the sequence information of the main chain portion is not obtained. The completely held state can be maintained.
  • a nucleotide sequence having a specific base may be added to the 3 ′ side of the nucleotide chain forming the main chain. This is a method for intentionally adding a nucleotide having a base serving as an enzyme substrate. Irrespective of whether the nucleotide chain to be modified is single-stranded or double-stranded, it can be easily modified with a modifying substance only at the 3 ′ end of the nucleotide chain. By appropriately selecting the nucleotide sequence to be added, unnecessary incorporation of a base sequence is also eliminated.
  • a single-stranded nucleotide to be modified is annealed with a nucleotide chain having a sequence complementary to the 3′-terminal region of the nucleotide chain in the 3′-terminal region, and 3 ′ of the nucleotide chain to be modified is A complementary nucleotide sequence containing a specific base can be added to one side.
  • a double-stranded nucleotide having at least one nucleotide chain to be modified is cleaved with a restriction enzyme that specifically recognizes a base sequence in the 3′-terminal region of the nucleotide chain to be modified, and the cleaved nucleotide to be modified is cleaved.
  • a complementary nucleotide sequence containing a specific base can be added to the 3 ′ side of the strand.
  • a double-stranded nucleotide having a nucleotide sequence containing a specific base in the 5'-terminal region at the 3'-terminal side of the nucleotide chain to be modified which is at least one of the double-stranded nucleotides, is subjected to DNA ligase.
  • DNA ligase By joining with a restriction enzyme that specifically recognizes the base sequence at the 3 ′ end side of the specific base of the joined nucleotide chain, A nucleotide sequence containing a specific base can be added to the 3 ′ side of the nucleotide chain to be modified.
  • Addition of a nucleotide sequence can be performed by incorporating nucleotides using DNA polymerase.
  • the nucleotide chain in which the nucleotide sequence having a specific base is present may be a chemically synthesized nucleotide chain.
  • an oligonucleotide having a base sequence complementary to a specific base Prior to the action of the degrading enzyme, it is preferable to add an oligonucleotide having a base sequence complementary to a specific base. By generating a complementary bond between the bases of two nucleotides, the substrate specificity of the enzyme can be increased, and the reaction efficiency can be improved.
  • an aldehyde group can be added to the 3 'end of the nucleotide chain to be modified.
  • an aldehyde group can be added to the 3 ′ end of the nucleotide chain to be modified.
  • the specific base is hypoxanthine
  • 3-methyladenine DNA glycosidase as a degrading enzyme
  • an aldehyde group can be added to the 3 'end of the nucleotide chain to be modified. Can be.
  • an aldehyde group can be added to the 3 'end of the nucleotide chain to be modified, for example, by using the combination shown in Table 1 below. .
  • the modifying substance may be a substance that labels and labels a nucleotide chain.
  • the modified nucleotide chain can be used as a detection probe or target in gene analysis.
  • a fluorescent substance, a vitamin, a lipid, an amino acid, an oligopeptide, a protein or an exogenous substance can be suitably used.
  • Amino acids, oligopeptides, and proteins have an amino group.
  • Other amino acids, oligopeptides, and proteins can be fused with an aldehyde group at the 3 'end of a nucleotide chain by having an amino group. This makes it possible to add a function possessed by a fluorescent substance, a vitamin, a fat, an amino acid, an oligopeptide, a protein, or an exogenous substance to the nucleotide chain.
  • the modifying substance may be a substance capable of binding to a substrate for gene analysis. This makes it possible to stably immobilize the modified nucleotide chain on a substrate as a detection probe or a target.
  • an aminoalkanethiol or an aminosilane coupling compound can be suitably used as such a modifying substance. These compounds can be stably bonded to a noble metal, glass or resin substrate.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing the principle of the nucleotide chain modification method according to the first embodiment of the present invention
  • Figure 2 shows a partial process of the nucleotide chain modification method shown in Figure 1. Shows the chemical reaction formula of the process of modifying the resulting aldehyde derivative with fluorescein,
  • FIG. 3 shows the chemical reaction formulas of a partial process of the nucleotide chain modification method shown in Fig. 1, in which the resulting aldehyde derivative is modified with alkynethiol and in which it is immobilized on a noble metal substrate.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram showing the principle of the nucleotide chain modification method according to Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 5 shows the chemical reaction formula of the reaction center of the nucleotide chain in FIG. 4
  • FIG. 6 is an explanatory diagram showing the principle of the nucleotide chain modification method according to the third embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram showing the principle of the nucleotide chain modification method according to Embodiment 4 of the present invention.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram showing the principle of the nucleotide chain modification method according to the fifth embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 shows the results of polyacrylamide electrophoresis of the nucleotide chain in each reaction process in the method for modifying a nucleotide chain ′ of Example 1 of the present invention
  • Figure 10 shows the results of film exposure of the nucleotide chain in each reaction step in the nucleotide chain modification method of Example 2 of the present invention
  • FIG. 11 shows the results of polyacrylamide electrophoresis of a nucleotide chain and film exposure in each reaction process in the nucleotide chain modification method of Example 3 of the present invention.
  • Embodiment 1 of the present invention will be described with reference to FIG.
  • Base represents an arbitrary base such as adenine, guanine, cytosine, thymine, peracyl, etc.
  • HX represents hypoxanthine
  • Cyt represents cytosine.
  • the nucleotide sequence containing hypoxanthine is added to the 3 'end of the nucleotide chain (I) by the action of deoxynucleotidyl transferase to obtain the nucleotide chain (II).
  • nucleotide chain (II) is annealed with an oligonucleotide chain (B) having several tens of nucleotides and having cytosine to obtain a nucleotide chain (III).
  • nucleotide chain (IV) having an aldehyde group at the terminal.
  • a modifying substance having an amino group H 2 N—R (the modifying substance will be described later)
  • the Schiff base in which the nucleotide chain (IV) and the modifying substance are dehydrated and condensed is reacted. That is, a nucleotide chain (V) whose 3 ′ end is directly modified with a modifying substance is obtained.
  • the first-stage reaction can be omitted by synthesizing a nucleotide chain having a specific base sequence in advance. It is.
  • the nucleotide chain can be fluorescently labeled (labeled), and this nucleotide can be used as a probe or target for gene analysis such as hybridization. It becomes.
  • a modified nucleotide chain (VII) is obtained in which 8-amino-1 year old octanethiol residue is bonded directly to the 3 'end of the chain.
  • This modified nucleotide chain (VII) is applied to the noble metal substrate (E). By doing so, a strong covalent bond between the thiol group and the substrate (E) can be formed, and the nucleotide chain (VII ') can be immobilized on the substrate (E).
  • the modifying substance for labeling and labeling the nucleotide chain has the ability to bind to the functional group added to the 3 ′ end of the nucleotide chain.
  • a fluorescent substance such as fluorescein, texas thread, rhodamine, a cyanine compound represented by Cy3'Cy5, or a non-fluorescent substance such as piotin or digoxigenin must form an amino group at the terminal. And can be used as a modifier. Nucleotide chains labeled (labeled) with these modifiers can be used as probes or overnight targets for gene analysis such as hybridization.
  • Amino acids, peptides and proteins can also be used as modifiers.
  • phenylalanine, tryptophan, and tyrosine have fluorescence and can be used for labeling and labeling.
  • Non-fluorescent amino acids and peptides can also be used for labeling and labeling by binding fluorescein or the like (hereinafter, labeled compound) to the side chain.
  • a peptide having a chain of amino acids has a side chain corresponding to the number thereof, it is possible to bind a plurality of labeled compounds.
  • trilysine has three amino groups in the side chain, so It is possible to arbitrarily bind up to a total of three labeled compounds having a group, a succinimide group and the like.
  • nucleotide chain can be modified using a substance obtained by modifying a hydrocarbon such as alkyl, aryl, cycloalkane, aromatic, saccharide, etc. having an amino group with a labeling compound as a modifying substance.
  • a hydrocarbon such as alkyl, aryl, cycloalkane, aromatic, saccharide, etc. having an amino group with a labeling compound as a modifying substance.
  • Labeling and labeling nucleotide chains using, for example, proteins such as alkaline phosphatase, peroxidase, colored and fluorescent transferrin, hemoglobin, green fluorescent protein, blue fluorescent protein, and aequorin as modifiers. It is also useful for genetic analysis, especially in situ hybridization.
  • proteins such as alkaline phosphatase, peroxidase, colored and fluorescent transferrin, hemoglobin, green fluorescent protein, blue fluorescent protein, and aequorin as modifiers. It is also useful for genetic analysis, especially in situ hybridization.
  • noble metal colloids such as gold colloids and silver colloids with amino groups formed on the surface
  • magnetic microparticles, and microparticles represented by polymer microparticles such as polystyrene beads can also be used as nucleotide chain modifiers. It is.
  • a compound having an amino group among thiol compounds collectively referred to as alkylthiol can be used as a modifying substance. Since the nucleotide chain can be immobilized on a noble metal via a modifying substance, use of a measurement method such as an electrochemical measurement method using a noble metal as a substrate, a quartz crystal microbalance method, or a surface plasmon resonance method for gene analysis Becomes possible.
  • Alkanethiol can be used without any particular limitation on the structure and the like as long as the thiol group and the amino group that bind to the noble metal are present.
  • Hydrocarbon residues between amino groups and thiol groups are linear, branched, and cyclo It may be in various forms such as cyclic, aryl chain, aromatic cyclic and the like, and the number of carbon atoms, the position of the amino group and the like may be various.
  • Substrates Quartz crystal microbalance method, surface plasmon resonance method, etc. use gold substrates for general purpose, but depending on the measurement method, etc., platinum, silver, copper, palladium, indium, nickel, iron, aluminum, and those And the like can also be used as the substrate.
  • a silane coupling compound having an amino group may be used, so that it can be used on substrates such as glass, silicon, silica, alumina, myric, and polymer resins such as polystyrene, nylon, and epoxy.
  • substrates such as glass, silicon, silica, alumina, myric, and polymer resins such as polystyrene, nylon, and epoxy.
  • the nucleotide chain can be immobilized, and the method can be applied to various conventional gene analysis methods.
  • the silane coupling compound may be any compound having an amino group and an alkoxy group, and can be used without any particular limitation in the structure and the like, like the alkanethiol.
  • Examples of silane coupling compounds that can be used are gamma-aminopropyltriethoxysilane, N-beta-aminoethyl, gamma-aminopropylmethyldimethoxysilane, and N-beta (aminoethyl) -gamma-aminopropyltrimethyl.
  • Toxisilane N-benzoyl (aminoethyl) gamma-aminopropyl triethoxysilane, gamma-aminopropyl trimethoxysilane and the like.
  • a substance that does not originally have an amino group can also modify the nucleotide chain through an appropriate spacer having an amino group.
  • a substance having a carboxyl group can modify the nucleotide chain by interposing a substance having a diamino structure such as 1,2-diaminoethane or 1,6-diaminohexane as a spacer. It becomes.
  • a substance having a hydrazine group, an aminoxyl group, a cyano group, or a substance having a magnesium halide such as Grignard reagent can also be used as the modifying substance.
  • FIG. 4 shows the principle of the nucleotide chain modification method according to the second embodiment of the present invention
  • FIG. 5 shows the chemical reaction formula of the reaction center of the nucleotide chain in FIG.
  • N Represents an arbitrary base among adenine, guanine, thymine, and cytosine; And any of adenine, guanine, thymine, and cytosine that form complementary base pairs.
  • N 2 is N.
  • N 3 is adenine that form complementary base pairs with the N 2, hypoxanthine, thymine, of the cytosine Indicates an arbitrary base.
  • N 0 , N! , N 2 and N 3 are shown only in part and are not intended to limit the number.
  • DITP, dATP, dCTP, and dTTP are 2'-deoxyinosine-5'-triphosphate, 2'-deoxyadenosine-5-triphosphate, and 2-doxycytidine-5, respectively.
  • NH 2 —R represents any modifying substance having an amino group as described above.
  • the nucleotide chain to be modified (2-1: the number in Fig. 4; the same applies hereinafter) is base N. In the 3 'terminal region. This nuku An additional nucleotide chain (2-2) is annealed to the leotide chain (2-1) to form a double-stranded nucleotide. Nucleotide chain (2 one 2) has' end sequence of the base N Q and a phase complementary manner any base region 3 '3 nucleotide strand (2 1) to the side, to immediately 5' Has tosin C, followed by base N. The have the sequence of any base N 2 not complementary to the 5 'end region is projected after Aniru.
  • nucleotide chain (2-3) formed at this time has a nucleotide sequence complementary to the single-stranded region of the nucleotide chain (2-2) at the one end of the nucleotide chain (2-1). And has hypoxanthine Hx corresponding to cytosine C in the nucleotide chain (2-2).
  • the formed complete double-stranded nucleotide is reacted with 31-methyladenyl DNA glycosidase type I, and subjected to alkaline heat treatment to obtain the 1 'position of the nucleotide (deoxyribose) containing hypoxanthine Hx. It specifically degrades the glycosidic bond between carbon and oxygen, thus giving an aldehyde group to the 3 'end of the nucleotide chain (2-4) formed.
  • a modifying substance having an amino group (NH 2 -R) is added, and each aldehyde group is reacted with the amino group to form a Schiff base.
  • the nucleotide chain (2-5) formed at this time is the target product, and the modifying substance is directly bonded to the 3 ′ end of the starting nucleotide chain (2-1).
  • nucleotide chains (2-2) are separated and removed.
  • the removal of the nucleotide chain (2-2) is performed by heat-treating the double-stranded nucleotide to which the modifier is bound, or by allowing a phosphate group to be present at the 5 'end of the nucleotide chain (2-2) to make it unique. It can be easily done by the action of lambda nuclease, which degrades chemically.
  • nucleotide chain (2-2) Some Guanin base New 1 N 2 for the in to that instead of hypoxanthine, three to Mechiruade two emissions DNA Gurikoshida Ichize]! Be small fragment by type You can also. (Embodiment 3)
  • FIG. 6 shows the principle of the nucleotide chain modification method according to the third embodiment of the present invention.
  • a nucleotide sequence containing hypoxanthine which is a substrate for the above-mentioned 3-methyladenine DNA daricosidase type III, is added to one of the nucleotide chains to be modified among the double-stranded nucleotides.
  • N Q, Ni, N 2 , C, Hx, 5 ' and 3' are defined agree with the adenine N 4 forms a N 2 and complementary base pairs, Guani down, thymine, cytosine A indicates adenine, G indicates guanine, and T indicates thymine.
  • a double-stranded nucleotide consists of a first nucleotide chain (2-1 1) and a second nucleotide chain (2-12), of which the nucleotide chain (2-11) is to be modified .
  • the nucleotide chain (2-11-1) has a base N at the 3 'end region.
  • the nucleotide chain (2-12) has a sequence of base Ni in the 5 'terminal region.
  • This double-stranded nucleotide is dissociated into a single strand by heat treatment or heat treatment, and the dissociated nucleotide chain (2-11) is annealed with a third nucleotide chain (2-1-3).
  • the second nucleotide chain (2-13) is a base N in the 3 'terminal region of the nucleotide chain (2-11). It has a sequence of any base complementary to 3 'side, has cytosine C immediately 5' side, and then base N. The sequences have any sequence of bases N 2 not complementary, the 5 'side is single-stranded cytosine C after Aniru.
  • DNA polymerase catalyzes these partial double-stranded nucleotides to incorporate dITP, dATP, dCTP, and dTTP to form complete double-stranded nucleotides.
  • the nucleotide chain (2-14-1) formed at this time has a nucleotide sequence complementary to the single-stranded region of the nucleotide chain (2-2) at the 3 'end of the nucleotide chain (2-11-1). It has hypoxanthine Hx at the position corresponding to cytosine C in the nucleotide chain (2-2).
  • an aldehyde group is added to the 3 ′ end of the nucleotide chain (2-1 1), and the modifying substance is bound.
  • unnecessary nucleotide chains can be removed.
  • FIG. 7 shows the principle of the nucleotide chain modification method according to the fourth embodiment of the present invention.
  • This method is a method for modifying a nucleotide chain in the case where an appropriate restriction enzyme cleavage site is present in a nucleotide chain forming a double strand.
  • N. ,, A, G, T, C, ⁇ ⁇ ⁇ are as defined above
  • N 2 and N 4 represent mutually complementary base groups arbitrarily selected from bases such as adenine, guanine, thymine, cytosine, hypoxanthine and peracyl.
  • Double-stranded nucleotides consist of a first nucleotide chain (2-21) and a second nucleotide chain (2-22), of which the nucleotide chain (2-21) is the target of modification .
  • the nucleotide sequence (GGAT CC / CC TA) that is recognized and restricted by the restriction enzyme BamHI at the 3 'terminal region of the nucleotide chain (2-21) (the 5' terminal region of the nucleotide chain (2-22)). GG) is present.
  • the double-stranded nucleotide was cut by B AMH I, nucleotides only G is present in the 3 'side of the N 0 (2-2 3) and, there is CCTAG 5 one side of the nucleotide (2- 2 4) to form a partially double-stranded nucleotide consisting of:
  • nucleotide chain (2-25) formed by this process is complementary to the single-stranded region of the nucleotide chain (2-24) at the 3 'end of the nucleotide chain (2-23). It has a nucleotide sequence added, and has a hypoxanthine HX at a position corresponding to S1 and SINC of the nucleotide chain (2-24).
  • FIG. 8 shows the principle of the nucleotide chain modification method according to the fifth embodiment of the present invention.
  • this method double-stranded nucleotides in which hypoxanthine has been incorporated into the base sequence in advance are joined.
  • N 0 , 1 , C, and Hx have the same meanings as described above, and N 2 and N 4 are mutually selected arbitrarily selected from bases such as adenine, guanine, thymine, cytosine, hiboxanthin, and peracyl. Shows complementary bases.
  • a double-stranded nucleotide consists of a first nucleotide chain (2-31) and a second nucleotide chain (2-32), of which the nucleotide chain (2-31) is the target of modification. It is.
  • Nucleotide chain (2-3 1) 'has the sequence of bases N Q in terminal region
  • the nucleotide chain (2-3 2) is 3 nucleotides chain (2-3 1)' 3 complementary to the terminal regions It has a base sequence forming a base pair on the 5 ′ side.
  • a separate double-stranded nucleotide is conjugated to this double-stranded nucleotide using DNA ligase as a catalyst.
  • the separate double-stranded nucleotides, the nucleotide chain having the sequence of bases N 4 on both sides of hypoxanthine HX (2- 3 3), on both sides of the cytosine C, and the base N 4 complementary base N 2 Using a sequence consisting of a nucleotide chain (2-34) having a sequence, and joining such that the nucleotide chain (2-33) is located on one side of the nucleotide chain (2-31) to be modified I do.
  • nucleotide chain (2-35) (nucleotide chain (2-31) and nucleotide chain (2-33)) and the nucleotide chain (2-36) (nucleotide chain (2-31) )) And a nucleotide chain (2-33)) are formed.
  • a nucleotide sequence corresponding to 3 base pairs is provided 5 ′ from the position of hypoxanthine Hx (and 3 ′ to the position of cytosine C).
  • the nucleotide sequence in this portion can be omitted.
  • a recognition sequence formed by a restriction enzyme is formed at the junction, so that the efficiency of the conjugation reaction by DNA ligase will increase, so that the site is located one side from the position of hypoxanthine H x (and 3 'side from the position of cytosine C) It is preferable to have a nucleotide sequence corresponding to ⁇ 4 base pairs.
  • Position of hypoxanthine Hx in the nucleotide chain (2—33) when the sequence of the nucleotide sequence and the sequence of the base at the 5 ′ end of the nucleotide chain (2—32) are the following sequence (I): 5 ′ and the sequence 3 ′ from the position of cytosine C in the nucleotide chain (2 ⁇ 34), a sequence (III) is formed at the junction, and this sequence ( III) is a sequence that is recognized and cleaved by the restriction enzyme H inc ⁇ , so that the ligase reaction proceeds efficiently.
  • ends of the two sets of double-stranded nucleotides to be joined are It may be a blunt end such as a tide chain or a protruding end from which one nucleotide chain protrudes, such as a cleavage site by BamHI.
  • Such cleavage with restriction enzymes and conjugation with DNA ligase have conventionally been used for integrating genes into vectors and the like.
  • a gene nucleotide chain
  • a modifying substance under the same reaction conditions.
  • This makes it possible to effectively use various nucleotide chain samples without wasting them.
  • a PET vector (Studier, F. et al., Methods Enzymol, 185, 60), which is a gene expression vector, has a BamHI site at its gene insertion site.
  • the length of the nucleotide chain to be modified may be at least 3 or more, but it is necessary to define the nucleotide chain sequence for use in gene analysis, and for that purpose the nucleotide chain length should be at least 10 or more. It is desirable to have.
  • the nucleotides located on the 3 ′ side of hypoxanthine HX have a nucleotide length of at least one base pair when using the methods of Embodiments 2 and 3. Good, but when using the methods of Embodiments 4 and 5, the chain length is desirably 2 to 4 base pairs or more. This is because, for the restriction enzyme ⁇ ligase to work sufficiently, a chain length somewhat longer than the sequence region recognized by each enzyme is required.
  • the addition of a nucleotide sequence containing hivoxanthin Hx and the action of 3-methyladenine DNA daricosidase type using a nucleotide containing hivoxanthin Hx as a substrate are described.
  • nucleotides containing the bases in the 3 'terminal region of Table 1 (supra) and DNA glycosidase can similarly modify the 3' end of the nucleotide chain with a desired modifying substance.
  • nucleotide chain to be modified a single-stranded chemically synthesized nucleotide chain having 30 nucleotides (consigned to Sigma-Genosya) was used.
  • This nucleotide chain encodes positions 8 to 37 of the 16S ribosomal liponucleic acid gene of Escherichia coli, and has the following base sequence from the 5 'end.
  • A, T, G, and C represent the base, adenine, thymine, guanine, and cytosine in the deoxynucleotide, respectively.
  • the nucleotide chain was recovered by ethanol precipitation, and 100 M oligodeoxycytosine (nucleotide number: 18; (NewEngland BioLabs) was added, and the nucleotide sequence was annealed with the hypoxanthine base of the nucleotide sequence tailed to the 3 ′ side of the nucleotide chain.
  • the nucleotide chain was converted to 0.3 u / 1 of 3-methyladenine DNA glycosylase type II (Trevigen), ImM ethylenediaminetetraacetic acid, 1 mM glycol terdiaminetetraacetic acid, ImM dithiolate. , 10 mM M 2-[4-(2-hydroxyethyl) 1-1-piperazinyl] ethanesulfonate Mixture with potassium hydroxide (pH 7.4) at 37 ° C. To cut the daricoside bond in the nucleotide sequence tailed on the 3 'side of the nucleotide chain.
  • Tevigen 3-methyladenine DNA glycosylase type II
  • ImM ethylenediaminetetraacetic acid 1 mM glycol terdiaminetetraacetic acid
  • ImM dithiolate ImM dithiolate.
  • the nucleotide chain was recovered by ethanol precipitation, mixed with 5 mM fluorescein cadaverine (manufactured by Molecular Probes) under the conditions of 0.1 M sodium carbonate (H9.5), and the reaction solution was added to 50%.
  • the reaction was carried out at room temperature for 2 hours to form a Schiff salt group between the aldehyde group at the 3 'end of the nucleotide chain and the amino group present in fluorescein cadaverine.
  • sodium borohydride was added to 1 mg Zm 1 to make the reaction solution 100, and the reaction was carried out at 4 ° C all day and night to reduce the Schiff base and stabilize the bond. .
  • Fig. 9 shows the results of this modification process traced by 7-molar urea-polyacrylamide gel electrophoresis (Molecular Cloning, 2nd edition, page 11.23, 1989). Numbers and arrows on the left side of the figure have each base number The moving position of the nucleotide chain is shown. The nucleotide chain was detected according to a silver staining method (Electrophoresis 4:92, 1983).
  • Lanes A, B, and C show the molecular weight marker, oligodeoxycytosine, and the untreated nucleotide chain, respectively.
  • Lane D shows a nucleotide chain having a hypoxanthine-containing nucleotide sequence tailed to the 3 ′ side, and the number of nucleotides has increased to 100 or more.
  • Lane E shows the nucleotide chain annealed by oligodoxycytosine.
  • Lane F shows a nucleotide chain having an aldehyde group formed at the 3 ′ end, and the number of nucleotides has been reduced to 30.
  • Lane G shows a stabilized nucleotide chain whose 3 ′ end is modified with fluorescein cadaverine.
  • amino groups are also present in adenine, guanine, and cytosine of the nucleotide chain to be modified, a reaction may occur inside the nucleotide chain and self-polymerization may occur. No confusion occurred.
  • the amino group of the nucleotide chain can be protected with a suitable protecting group such as a benzoyl group or isoptyryl group used in the chemical synthesis of the nucleotide chain.
  • Example 1 According to the method of Southern (J. Mol. Biol. 98, 503, 1975), the nucleotide chain of each step electrophoresed in Example 1 was used. It was transferred to a nylon membrane (Schleicher & Schuell). '' An anti-fluorescein antibody (Amersham Biosciences), labeled with horseradish peroxidase, was dropped onto the nucleotide chain on the nylon membrane, and the presence or absence of fluorescein was determined. Filimem, AmershamBiosciences Ney, HyperfilmECL) were exposed and detected by the Daniji luminescence method (ECL Detection Reagents, manufactured by AmershamBiosciences). The results are shown in FIG. The numbers and arrows on the left side of the figure show the positions of the nucleotide chains having the respective base numbers as in FIG.
  • Lane A shows the molecular weight. 2 ', 3'-Dideoxyperidine-5'-triphosphate (manufactured by EnzoDiagnostics), which has been previously labeled with fluorescein, is tailed with terminal deoxynucleotidyl transferase.
  • lane G luminescence of a nucleotide chain having 30 nucleotides was detected, indicating that the modified nucleotide chain was actually modified with fluorescein kabaverine.
  • oligodexoxycytosine with 18 nucleotides was also modified with fluorescein cabaverine. This is because oligodexoxycytosine randomly anneals to the nucleotide chain of the hypoxanthine that has been tailored, so that no partial double strand is formed and 3-methyladenine DNA glycosidase II This is because there are places where does not work. This results in oligodeoxyhypoxanthine with a small number of nucleotides and an aldehyde at its 3 'end.
  • the aldehyde group is modified by fluorescein cadaverine, and oligodeoxyhypoxanthine and oligodeoxycytosine are reannealed during these reactions.
  • unnecessary oligodeoxycytosine can be obtained by gel chromatography, ion-exchange chromatography, or oligodeoxyhypoxanthine, oligodoxyguanine immobilized on microparticles such as polystyrene beads by an appropriate method, or a mixture of these.
  • annealing with the oligonucleotide thus obtained, it can be easily separated and removed.
  • Example 1 and Example 2 it is possible to directly modify the 3 ′ end of a nucleotide chain with a modifying substance by the method of the present invention.
  • the cDNA sequence of human skeletal muscle myosin heavy chain 1 5831 to 5850 (Gen Bank, National Biotechnology Information Center, U.S.A., Internet F.S. http: ⁇ www.ncbi.nlm.niii.gov/Genbank/index.html), accession number: NM—005963, as of February 2004) single-strand with 20 nucleotides
  • a deoxynucleotide chain was used.
  • nucleotide chain complementary to this nucleotide chain As a nucleotide chain complementary to this nucleotide chain, a single-stranded genuine xy-nucleated tide chain having 29 nucleotides (consigned by Sigma-Genosys) was used. Modifiers include aminooxymethyl carbonyl hydrazone-C y 5 was used. Each nucleotide chain has the following base sequence. Modified nucleotide chain
  • the final concentrations of the modified nucleotide chain (hereinafter, referred to as MYH1) and the complementary nucleotide chain (hereinafter, referred to as MYH1-BamHI) are 10 M and 20 / M, respectively.
  • the mixture was cooled to room temperature over 30 minutes or more to form a double strand in which the 5 ′ region (CTTTCAGCA) of cMYH1-BamHI was projected.
  • the formed double-stranded nucleotides were recovered by ethanol precipitation, and 10 mM d ITP, 1 OmM dATP, 1 OmM d TTP, 1 OmM d CTP, 5 OmM sodium chloride, 2 OmM magnesium chloride, 4 OmM In a solution of Tris-HCl (pH 7.5), add T7 DNA polymerase-modifying enzyme Sequenase Ver. 2.0 (US B) to a final concentration of 0.5 U / 1 ( A total of 1001) was reacted at 37 ° C for 4 hours to add a nucleotide sequence containing hypoxanthine complementary to MYH1-BamHI to the 3 'end of MYH1. A complete 29 base pair double stranded nucleotide was formed. MYH 1 formed at this time is (array 1) one HxHxA Expressed as TC CH x AT.
  • H7.4 3-methyladenine DNA dali cosidase III
  • a double-stranded nucleotide having an aldehyde group at the end of MYH 1 is placed in a solution of 50 mM 4-(2-hide mouth kisshethyl) piperazine-11-ethanesulfonic acid sodium monohydroxide (pH 7.2).
  • Aminooxymethylcarbonyl hydrazone-Cy5 as a modifying substance was added to a final concentration of 240 M (total amount: 1001), and reacted at room temperature for 24 hours to obtain the aldehyde at the 3 'terminal of MYH1.
  • a Schiff base was formed between the group and the amine at Cy5.
  • This MYH 1 is represented by (sequence 1) one CHHNO CHNHNH—Cy5. Fig.
  • FIG. 11 shows the results of tracking the nucleotide chain in each step by 16% polyacrylamide gel electrophoresis (90 mM tris-borate / 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid buffer).
  • the nucleotide chain is SY Staining was performed with BRG O 1 d (Molecular Probes).
  • M indicates the molecular weight
  • 20 bp, 30 bp, 50 bp, and 100 bp are, respectively, 20 base pairs, 30 base pairs, and 50 bases of double-stranded nucleotides. Indicated are migration positions of 100 base pairs.
  • the band in lane 1 shows the modified nucleotide chain (MYH 1); the band in lane 2 shows the complementary nucleotide chain (MYH 1 -BamH I); a band appearing at about 30 base pairs in lane 3 Indicates the partially double-stranded nucleotide formed in step 1; the band in lane 4 that is slightly slower in mobility than lane 3 is the complete 2 bp of 29 base pairs formed in step 2.
  • a band with a slightly higher mobility than lane 4 indicates a double-stranded nucleotide having an aldehyde group attached to MYI-I1; The band indicates a double-stranded nucleotide in which MYH1 has been modified with a modifying substance.
  • amino-substituted xymethylcarbonylhydrazone-Cy5 (cyanine-based dye), which is a modifying substance, is synthesized from Cy5—hydrazine (Amei'sham Biosciences) using Ide et al., Biochemistry, 32, 8276, 1993) and according to the method of Gruber et al., Bioconjugate Chemistry 11, 161 (2000), and synthesized and purified as follows.
  • this method is a method that can directly and simply modify the 3 'end of the nucleotide chain with any modifying substance quantitatively and stably.
  • labeling and labeling can be performed by limiting the nucleotide chain having the target genetic information, and in the case of immobilizing the nucleotide chain, the modifying substance is stable and strong as a linker. Can be immobilized, preventing spurious results of gene analysis Industrial applicability
  • the 3 ′ end of the nucleotide chain to be modified is quantitatively and stably treated with an arbitrary modifying substance irrespective of whether the nucleotide chain is single-stranded or double-stranded. It is useful for gene analysis that requires labeling, labeling, and immobilization of nucleotide chains.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

ヒポキサンチン（Ｈｘ）等の特定の塩基を有したヌクレオチド配列が３´側に存在する修飾対象のヌクレオチド鎖（Ｉ）に、前記特定の塩基を含んだヌクレオチドに特異的な分解酵素を作用させて、ヌクレオチド鎖（Ｉ）の３´末端に、所望の修飾物質（たとえばアミノ基を有するＮＨ２Ｒ）に対して結合能を有する官能基（たとえばアルデヒド基）を付与し、このヌクレオチド鎖の３´末端に前記修飾物質を結合させるヌクレオチド鎖修飾方法。酵素基質となる特定の塩基を有したヌクレオチド配列が３´側に存在するヌクレオチド鎖を修飾対象とすることにより、前記ヌクレオチド配列部分のみを分解して、所望の修飾物質と反応して結合する官能基を形成する方法である。このようにすることにより、ヌクレオチド鎖を修飾物質で直接に修飾することができ、簡便にラベル化、標識化可能となるとともに、ヌクレオチド鎖の固定化を目的とする場合には、修飾物質をリンカーとして安定、強固な固定を行なうことが可能となる。

Description

明 細 書 ヌクレオチド鎖修飾方法 技術分野
本発明は、 ヌクレオチド鎖修飾方法に関するものであり、 特にヌ クレオチド鎖の 3 '末端を修飾物質で直接的に修飾して、 ヌクレオ チド鎖をラベル化、 標識化、 固定化する方法に関する。 背景技術
従来、 遺伝子解析においては、 D N A、 R N A、 オリゴヌクレオ チド、 核酸等のヌクレオチド鎖をラベル化、 標識化するための修飾 物質として、 放射性同位元素が採用されてきたが、 半減期による取 扱期間の制限、 取扱場所の制限、 被爆の問題、 廃棄の問題等がある ため、 その利用は減少傾向にある。 近年では、 放射性同位元素に代 替する修飾物質として、 フルォレセィン等の蛍光物質あるいはピオ チン等を用いて、 ヌクレオチド鎖を修飾し、 ラベル化、 標識化する 方法が汎用されるようになっている。 ヌクレオチド鎖を修飾する方 法は、 5 '末端修飾法、 3 '末端修飾法、 内部修飾法の 3つに大別 できる。
5 '末端修飾法としては、 5 '末端のリン酸基を介してピオチン で修飾する方法が考案されている （例えば、 下記の非特許文献 1.参 照） 。 ピオチンについては、 ピオチンとアビジンとの高親和性を利 用して、 アル力リフォスファ夕一ゼ、 西洋ヮサビペルォキシダーゼ 等の酵素で修飾し、 これら酵素の化学発光を用いて遺伝子解析を高 感度化する方法が報告されている（例えば、非特許文献 2〜 3参照）。 ヌクレオチドの 5 '末端のリン酸基を介した修飾方法は、 これら以 外にも多数提案されている （例えば、 特許文献 1及び非特許文献 4 〜 1 3参照） 。
しかし 5 '末端のリン酸基を介した修飾方法では、 ヌクレオチド 鎖への修飾物質の修飾量は基本的に 1つであり、 アル力リフォスフ ァターゼはヌクレオチドの 5 '末端のリン酸基を解離させるので、 高感度化を実現するためにアル力リフォスファターゼと組み合わせ ることは基本的に避ける必要がある。 またアルカリフォスファタ一 ゼは、 空気中に浮遊する細菌中にも存在しており、 遺伝子解析中に 夾雑した場合は、 5 '末端のリン酸基に結合した修飾物質が解離し やすい等、 修飾状態に安定性を欠くことになり、 バックグランドノ ィズの要因にもなる。 さらに、 5 '末端修飾法として繁用されるホ スホロアミダイ 卜法は、 反応が完全に進行しないため、 未反応物を 液体クロマトグラフィー等で分離除去する必要があるなど、 操作が 繁雑である。
内部修飾法としては、 ヌクレオチド鎖を複製させる反応の際に、 ラベル化、 標識化のための修飾物質で予め修飾処理を施したデォキ シヌクレオチド三リン酸をヌクレオチド鎖内に取り込ませることで、 ヌクレオチド鎖をラベル化、 標識化するランダムプライマー法ある いはニック トランスレ一ション法が開発されている (例えば、 特許 文献 4及び非特許文献 2 0〜 2 2参照） 。
この修飾方法は、 遺伝子増幅反応であるポリメラ一ゼ連鎖反応、 いわゆる P C R法 （例えば、 特許文献 5〜 8及び非特許文献 2 3 〜 2 5参照) と組み合わせることで、 ヌクレオチド鎖の増幅とラベル 化、 標識化とを同時に行なうことが可能であり （例えば、 非特許文 献 2 6参照） 、 それにより遺伝子解析の高感度化をもたらし、 遺伝 子マイクロアレイに代表される遺伝子解析のハイスループッ ト化を 実現している（例えば、特許文献 9及び非特許文献 2 7〜 2 9参照）。
これらランダムプライマ一法、 ニック トランスレーション法及び P C R法においては、 ヌクレオチドの取り込み効率、 修飾ヌクレオ チド合成等の点から、 チミジンに替えてゥラシルあるいは予め蛍光 物質などでラベル化、 標識化したゥラシルを取り込んだヌクレオチ ド鎖の形成が繁用されている。 さらにゥラシルに代替する利点とし て、 P C R法の際に、 反応混液中に夾雑する外因性汚染由来のヌク レオチド鎖にゥラシルを取り込ませ、 ゥラシル D N Aグリコシラー ゼを作用させることで、 汚染由来のヌクレオチド鎖の増幅を防止す る方法もある （例えば、 特許文献 1 1〜 1 3及び非特許文献 3 1〜 3 3参照） 。
しかし P C R法による修飾物質のヌクレオチド鎖内への取り込み は、 取り込み数が 1 0〜 2 0あるいは 3 0程度 （例えば、 非特許文 献 3 0参照） とランダムであり、 完全な定量化には至っていない。 またデォキシヌクレオチド三リン酸のラベル化、 標識化処理は煩雑 であるため、 任意のラベル化、 標識化処理体は誰にでも容易に得ら れるものではなく、 結果として修飾物質の種類が限定される。 さら にヌクレオチド鎖内に修飾物質が取り込まれているため、 遺伝子解 析のハイブリダイゼ一ションの際に、 つまりヌクレオチド鎖の二本 鎖形成の際に、 修飾物質による立体障害は避けられない。 ヌクレオ チド鎖を当初より蛍光物質等で標識化することに用途が限定される 欠点もある。 3 '末端修飾法としては、 予めラベル化、 標識化処理を施したデ ォキシヌクレオチド三リン酸あるいはジデォキシヌクレオチド三リ ン酸を合成し （例えば、 非特許文献 1 4及び特許文献 2参照） 、 こ のラベル化、 標識化ヌクレオチドをターミナルデォキシヌクレオチ ジルトランスフェラーゼによりヌクレオチド鎖の 3 '側に付加させ るテーリング法が開発されている （例えば、 特許文献 3及び非特許 文献 1 5〜 1 8参照） 。 この 3 '末端修飾法は、 必要な状況に応じ てヌクレオチド鎖を修飾可能であり、 5 '末端修飾法に比べて修飾 物質の保持安定性が高く、 修飾部位として好適であるため、 汎用さ れている。
しかしデォキシヌクレオチド三リン酸あるいはジデォキシヌクレ ォチド三リン酸のラベル化、 標識化処理は煩雑であるため、 任意の ラベル化、 標識化処理体は誰にでも容易に得られるものではなく、 結果として修飾物質の種類が限定される。 またテーリング段階でヌ クレオチド鎖の 3 '側に不要なヌクレオチド配列が付加するため、 特にデォキシヌクレオチド三リン酸を利用した場合に、 反応条件に よってヌクレオチドの付加数がランダムになるため （例えば、 非特 許文献 1 9参照） 、 遺伝子解析の高感度化は実現できるものの、 定 量性に課題がある。 3 '側に付加した不要な塩基配列は、 遺伝子解 析のハイブリダィゼーシヨンの際にミスマッチの要因ともなる。 余分な塩基の付加という点では、 特許文献 1 0において、 付加し たゥラシルのグリコシド結合をゥラシル D N Aダリコシダーゼによ り分解することが提案されている。 しかし上述したランダムプライ マー法、 ニック トランスレーション法、 及び P C R法においては、 チミジンに替えてゥラシルを取り込んだヌクレオチド鎖の形成が繁 用されている。 また P C R法の際に、 汚染由来のヌクレオチド鎖の 増幅を防止するために用いるゥラシルが、 増幅を目的するヌクレオ チド鎖にも取り込まれる。 したがって、 ゥラシルを取り込んだヌク レオチド鎖に対して特許文献 1 0記載の方法を適用すると、 3 '側に 付加したゥラシルのみならず修飾対象のヌクレオチド鎖中のゥラシ ルにもゥラシル D N Aダリコシラーゼが作用し、 ヌクレオチド鎖自 体が分解されてしまう。
他の 3 一末端修飾法として、 化学合成ヌクレオチド鎖を形成させ る合成初期に、 3 '末端のヌクレオチドに直接的に、 ラベル化、 標 識化のための修飾物質を結合させる方法もあり、 ヌクレオチド鎖へ の修飾物質の高い保持安定性を実現している。 しかし化学合成で得 られるヌクレオチド鎖のヌクレオチド数は、 合成副産物、 収率等の 合成能力の関係で 1 0 0程度であり、 ここで使用されている 3 '末 端への直接的な修飾物質の結合方法を、 生体抽出及び P C R等で増 幅したヌクレオチド数 1 0 0を超えるヌクレオチド鎖の 3 '末端修 飾に適用することはできない。 つまり、 修飾されるヌクレオチド鎖 の鎖長に制限がある。
さらに、 これら 3種類の修飾方法は、 ヌクレオチド鎖が 2本鎖の 状態で存在する時に、 一方のヌクレオチド鎖のみを選択的に修飾す るのは困難である。 つまり、 従来の方法でヌクレオチド鎖をラベル 化、 標識化する場合、 通常は 2本鎖の状態で存在しているヌクレオ チド鎖の両鎖が同時に修飾されてしまい、 どちらか一方のヌクレオ チド鎖を選択的に修飾したり、 もう一方のヌクレオチド鎖を分離除 去することは困難である。 そのため、 2本鎖の内の一方のヌクレオ チド鎖に含まれる遺伝子情報を解析する際に、 情報を要さないもう 一方のヌクレオチド鎖も解析に供され、 擬似結果をまねく要因とな つている。
一方、 ヌクレオチド鎖の修飾は、 ラベル化、 標識化の他に、 ヌク レオチド鎖を基板に固定化するために行なわれている。 このための 基板は当初、 疎水性と正電荷の片方または両方を有するニトロセル ロース、 ナイロン、 フッ化ポリビニリデンよりなるものが利用され ていたが、 固定化したヌクレオチド鎖が解離してしまうことがあつ た。 近年では、 ヌクレオチド鎖の 5 '末端あるいは 3 '末端にアミ ノ基、アルデヒド基などの官能基を持たせる修飾処理を施す一方で、 ガラス、 シリコンなどの基板を用い、 その表面がアルデヒド基ある いはエポキシ基あるいはアミノ基になるように予め処理を施すこと により、 ヌクレオチド鎖を基板に固定化する方法がとられる。 この ような方法で配列の異なるヌクレオチド鎖を基板単位面積当たり多 数固定化することにより、 遺伝子解析マイクロアレイを実現してい る。 しかしこのヌクレオチド鎖の固定化においても、 上述したヌク レオチド鎖の修飾の問題が存在する。
(特許文献)
1 特許 1 7 0 6 2 8 9号
2 特開昭 6 1 一 1 1 5 0 9 4号
3 特公平 7 ― 3 1 1 9 4号
4 特表 2 0 0 0 一 5 0 8 7 0 9号
5 特許 1 8 1 4 7 1 3号
6 特許 2 0 9 3 7 3 0号
7 特許 2 0 9 3 7 3 1号
8 特許 2 6 1 3 8 7 7号 9 特表平 1 0一 5 0 3 8 4 1号
10 特願 2 0 0 2 ― 0 4 9 0 5 5号
11 特許 2 1 0 3 1 5 5号
12 特表 2 0 0 0 ― 5 0 2 2 5 1号
13 特開平 1 1 ― 1 1 3 5 9 9号
(非特許文献）
1 チュ （Chu B.C.F) ら、 Nucleic Acids Res.、 11巻、 6543頁、 1983年
2 ベック （Beck.S.) 、 Methods Enzymol. , 216巻、 143頁、 1992年
3 フロンンユタイノ ( Bronstein.I.ノ ら、 Methods Enzymol.、 217巻、 398頁、 1993年
4 アルブス （Alves.A.M.) ら、 Tetrahedron Lett.、 30巻、 3089 頁、 0989年
5 コクッザ ( Cocuzza.A.J.) 、 Tetrahedron Lett. , 30巻、 6287 頁、 1989年
6 タイセン （Theisen.P.) ら、 Tetrahedron Lett.、 33巻、 5033 頁、 1992年
7 ケンプ （Kempe.T.) ら、 Nucleic Acids Res.、 13卷、 45頁、 1985年
8 スミス （Smith. L.M.) ら、 Nucleic Acids Res.、 13巻、 2399 頁、 1985年
9 アンソーンュ (Ansorge.W .) り、 Nucleic Acids Res.、 15卷、 4593頁、 1987年
10 クック （Cook.A.F.) 、 Nucleic Acids Res. , 16卷、 4077頁、 1988年
11 ロジェ （Roget.A) ら、 Nucleic Acids Res.、 17卷、 1989年 1 ミシゥラ （Misiura.K.) ら、 Nucleic Acids Res.、 18巻、 4545 頁、 1990年
13 ピ一ルス （Pieles.U.) ら、 Nucleic Acids Res.、 18卷、 4355 頁、 1990年
14 ランガ一 （Langer.P.R.) ら、 Pro Natl.Acad.Sci.USA、 78 巻、 6633頁、 1981年
15 ロイコゥドリ一（Roychoudhury.R.) ら、 Nucleic Acids Res.3 卷、 101頁、 1976年
16 ビンセント （Vincent. C.) ら、 Nucleic Acids Res.、 10巻、 6787頁、 1982年
17 ヨウサフ （Yousaf.S.I.) ら、 Gene、 3巻、 309頁、 1984年
18 シユミッッ （Schmitz.G.G.) ら、 Anal.Biocliem.、 192 巻、 222頁、 1991年
19 ジャクソン （Jackson.D.A.) ら、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA、 69巻、 2905頁、 1972年
20 ファインバーグ （Feinberg.A.P) ら、 Anal.Biochem.、 132 巻、 6頁、 1983年
21 ファインバーグ （Feinberg.A.P) ら、 Anal.Biochem.、 137 巻、 266頁、 1984年
22 リグビー （Rigby.P.W.J) ら、 J.Mol.Biol.、 113卷、 237頁、 1977年
23 ミユリス （Mullis.K.B.) ら、 Methods Enzymol.、 155巻、 335頁、 1987年 24 サイキ （Saiki.R.) 、 Science^ 239巻、 487頁、 1988年 25 シ—バート （Siebert.P.D.) ら、 Natureゝ 359卷、 557頁、 1991年
26 ディ （Day.P.J.R.) ら、 Biocliem.J.、 267卷、 119頁、 1990 年
27 シェナ (Schena.M.) ら、 Science, 270 巻、 467 頁、 1992 年
28 シャロン （Schalon.D.) ら、 Genome Res.、 6巻、 639頁、 1996年
29 核酸マイ ク ロ ア レイ 特集、 Nature Genet. 、 21 巻 Supplements 1月、 1999年
30 アマ一シャム ·ノ ィォサイエンス社 (Aniersham Bioscience) ウェブサイ ト
(htt /wwwl. amershamDiosciences.com/aptrix/uppO 1077. nsf/C ontent/microarrays— labe丄 ling%5し' microarrays— labelling— cysci'ibe —postlabelling OpenDocument&nometitle^microari'ays) 、 2003 年 4月 14 日アクセス）
31 ロンゴ （Longo.M.C.) ら、 Gene、 93巻、 125頁、 1990年 32 ソ一ントン （Thornton. C.G.) ら、 BioTechniques、 13 卷、 180頁、 1992年
33 ソベック （Sobek.H.) ら、 FE S Lett.、 388巻、 1頁、 1996 年
本発明は、 前記従来の問題点に鑑みてなされたものであり、 ヌク レオチド鎖の塩基構成に関わらず、 ヌクレオチド鎖の分解を伴うこ となく、 3 '末端部に修飾物質を直接的に修飾できるヌクレオチド鎖 修飾方法を提供することを目的とする。
また本発明は、 1本鎖のヌクレオチド鎖の 3 '末端のみならず、 2本鎖を形成している一方のヌクレオチド,鎖の 3 '末端をも選択的 に簡便に修飾できるヌクレオチド鎖修飾方法を提供することを目的 とする。 発明の開示
上記目的を達成するために、本発明のヌクレオチド鎖修飾方法は、 特定の塩基を有したヌクレオチド配列が 3 '側に存在する修飾対象 のヌクレオチド鎖に、 前記特定の塩基を含んだヌクレオチドに特異 的な分解酵素を作用させて、 前記修飾対象のヌクレオチド鎖の 3 ' 末端に所望の修飾物質に対して結合能を有する官能基を付与し、 前 記官能基を有したヌクレオチド鎖の 3 '末端に前記修飾物質を結合 させることを特徴とする。 酵素基質となる特定の塩基を有したヌク レオチド配列が 3 '側に存在するヌクレオチド鎖を修飾対象とする ことにより、 前記ヌクレオチド配列部分のみを分解して、 所望の修 飾物質と反応して結合する官能基を形成するのである。 このように することにより、 ヌクレオチド鎖を修飾物質で直接 (こ修飾すること ができ、 簡便にラベル化、 標識化可能となるとともに、 ヌクレオチ ド鎖の固定化を目的とする場合には、 修飾物質をリンカ一として安 定、 強固な固定を行なうことが可能となる。
特定の塩基を有したヌクレオチド配列が、 主鎖となすヌクレオチ ド鎖の 3 '側に位置し、前記特定の塩基が前記主鎖に存在しない塩基 であるのが好ましい。 このことにより、 分解酵素が作用しても主鎖 部分が分解されるのを回避することができ、 主鎖部分の配列情報が 完全に保持された状態を維持可能となる。 ヌクレオチド鎖の配列情 報を定義するには、 少なくとも 1 0塩基前後のヌクレオチド配列を 有することが望ましい。
特定の塩基を有したヌクレオチド配列を、 主鎖となすヌクレオチ ド鎖の 3 '側に付加してもよい。酵素基質となる塩基を持ったヌクレ ォチドを意図的に付加させる方法である。 修飾対象のヌクレオチド 鎖が 1本鎖であるか 2本鎖であるかにかかわらず、 ヌクレオチド鎖 の 3 '末端に限定して、 修飾物質で簡便に修飾することが可能であ る。 付加するヌクレオチド配列を適宜に選択することで、 不必要な 塩基配列の取り込みも排除される。
詳細には、 修飾対象とする 1本鎖ヌクレオチドに、 当該ヌクレオ チド鎖の 3 '末端領域に相補的な配列を 3 '末端領域に有するヌク レオチド鎖をァニールし、 前記修飾対象のヌクレオチド鎖の 3 一側 に特定の塩基を含んだ相補的ヌクレオチド配列を付加することがで きる。
また、 少なくとも一方のヌクレオチド鎖を修飾対象とする 2本鎖 ヌクレオチドを、 修飾対象のヌクレオチド鎖の 3 '末端領域の塩基 配列を特異的に認識する制限酵素で切断し、 切断した修飾対象のヌ クレオチド鎖の 3 '側に特定の塩基を含んだ相補的ヌクレオチド配 列を付加することができる。
また、 2本鎖ヌクレオチドの少なく とも一方である修飾対象のヌ クレオチド鎖の 3 '末端側に、 特定の塩基を含んだヌクレオチド配 列を 5 '末端領域に有した 2本鎖ヌクレオチドを D N Aリガーゼで 接合し、 接合したヌクレオチド鎖の前記特定の塩基よりも 3 '末端 側の塩基配列を特異的に認識する制限酵素で切断することにより、 前記修飾対象のヌクレオチド鎖の 3 '側に特定の塩基を含んだヌク レオチド配列を付加することができる。
ヌクレオチド配列の付加は、 D N Aポリメラ一ゼを用いてヌクレ ォチドを取り込むことにより行うことができる。
特定の塩基を有したヌクレオチド配列が存在するヌクレオチド鎖 は、 化学合成されたヌクレオチド鎖であってよい。
分解酵素を作用させるに先だって、 特定の塩基と相補的な塩基配 列を有するォリゴヌクレオチドを添加するのが好ましい。 2本のヌ クレオチドの塩基間に相補的結合を生じさせることにより、 酵素の 基質特異性を高めることができ、 反応効率を向上させることが可能 となる。
修飾対象のヌクレオチド鎖の 3 '末端にたとえばアルデヒド基を 付与することができる。 具体的には、 分解酵素として D N Aグリコ シダーゼを使用することで、 修飾対象のヌクレオチド鎖の 3 '末端 にアルデヒド基を付与することができる。 より具体的には、 特定の 塩基がヒポキサンチンである時に、 分解酵素として 3—メチルアデ ニン D N Aグリコシダ一ゼを使用することで、 修飾対象のヌクレオ チド鎖の 3 '末端にアルデヒド基を付与することができる。
特定の塩基および分解酵素は種々の組合せが可能であるが、 たと えばゥラシルのヌクレオチド鎖への組み込みは、 遺伝子解析の様々 な手法の中で汎用されているため、 これを特定の塩基として利用す ることは望ましくない場合がある。 汎用頻度の低いヒポキサンチン とその分解酵素を利用することで、 ヌクレオチド鎖の 3 '末端修飾を 実施する際の利用者の利便性を大幅に向上することが可能となる。 また、 ヌクレオチド鎖の塩基の構成や鎖長に関わらず、 ヌクレオチ ド鎖の 3 '末端側を直接的に簡便に、 任意の修飾物質で、 定量的、 安 定的に修飾することが可能となる。 ヌクレオチド鎖内への不必要な 塩基配列、 修飾された塩基の取り込みを排除し、 ヌクレオチド鎖の 3 '末端に限定して修飾物質で修飾できる方法である。
上記したヒポキサンチンと 3 一メチルアデニン D N Aダリコシダ —ゼとの組み合わせのほか、 たとえば以下の表 1に示す組み合わせ て用いても、 修飾対象のヌクレオチド鎖の 3 '末端にアルデヒド基 を付与することができる。
ヌクレオチド鎖 3 '側に取り込む 翻する DNAグリコシ夕 ゼ . ヌクレ才チドの ·Κ DNA衝麵素
•ヒポキサ：^ン .ヒポキサ ^ン DNAグリコシダーゼ
• 3一メチルァテ、ニン . 3一メチルアデ ン DNAダリコシダーゼ
• 3—ェチルアデニン I型
• 3—メチリレアデニン
.ヒポキサ ン . 3—メチルアデニン DNAグリコシ夕 ゼ
.キサ ？ン 腿
- 3—メチルク ニン
- 7—メチルク ニン
• 1 , Ν6—エタノアデニン
• 8—ォキソグァニン
- 7—工チルプリン
• 3—ェチルブリン
. 7, 3—ジ工チルプリン
. 1—力ルポキシェチルアデニン
• 7—カルボキシェチルクプニン
·〇2—メチレピリミジン
- 7 (2—エトキシェチル) クプニン
- 7 (2—ヒドロキシェチル) グァニン
• 7 (2—クロロェチル) クァニン
• 1， 2—ビス (7—ク ニル) ェ夕ン
• 3—ェチ ォェチルプリン
•Ν2· 3—エタノクァニン
•Ν2· 3—工テノクァニン
• 5—ヒド ΠΙキシメチレクラシリレ
• 5—ホルミルゥラシル
- 1， Ν4—ェテノシ卜シン
• 1, Ν2—ェテノクプニン
• 3, Ν2—ェテノク ニン
-ゥラシリレ
• 5—ヒドロキシゥラシレ •ゥラシル DNAグリコシタ一ゼ
• 5, 6—ジヒドロキシゥラシル
- 5—フリレ才ロウラシレ 表 1 (続き) ヌクレオチド鎖 3 '側に取り込む 翻する DNAダリコシタ ゼ . ヌクレ才チドの:^ S DNA傷麵臻
-チミングリコール
• 5， 6—ジヒドロチミン •エンドヌクレア一fn
• 5, 6—ジヒドロキシジヒド□チミン
•ヒドロキシシトシン
'ゥレア
• 5—ヒド口キシー 5ーメチルヒダントイン
• 6—ヒドロキシー 5, 6ージヒドロキシピリミジン
• 5—ヒドロキシゥラシレ
• 5—ヒドロキシ一 6—ヒドロチミン
• 5, 6—ジヒドロウラシル
'ゥラシルグリコール
• 5—ヒドロキシ一 6—ヒドロウラシリレ
. 8—仲ノクプニン
- 7, 8—ジヒドロー 8—ォキソク^7ニン • 8一才キソグァニン DNAグリコシダーゼ
. 8—才キソアデニン
-ホルムアミドクァニン
•メチルホルムアミドグァニン
. 7—メチルクプニン
• 1， 6—ジアミノー 5—ホルムアミドピリミジン -ホルムアミドピリミジン DNAグリコシダ -ホルムアミドク ニン ーゼ
•メチルホルムアミドク ニン
•ホルムアミドアデ ン
. 8—才キソアデニン
• 8—才キソク ニン
• 7, 8—ジヒドロー 8—ォキソ^ 7ニン
•ヒドロキシシ卜シン
- 5—ヒドロキシゥラシル
•アフラ卜キシン結合イミドゾ一ル«犬クフニン
•ィミタ " 1^开¾剽犬 N— 2—ァミノフリレ才レン一
8—ク^7ニン
• 8—ォキソク ニン
- Mu t Y - DNAグリコシ夕 ゼ
•アデニン/^ 7ニンミスマッチ
- 1, N4—ェテノシトシン
•ミスマツチウラシル DNAグリコシラーゼ
•ゥラシル Zク ニンミスマッチ
•ピリミジンタ マ一 .ピリミジン夕 Yマ一 DNAグリコシラーゼ
•チミン/グァニンミスマッチ
•チミン
•グァニン zク ニンミスマッチ DNAグリコシダ—ゼ 修飾物質は、 ヌクレオチド鎖の 3 '末端に付与される官能基と結 合を形成するアミノ基を有するものを好適に使用できる。
修飾物質は、 ヌクレオチド鎖をラベル化、 標識化する物質であつ てよい。 これにより、 修飾されたヌクレオチド鎖を、 遺伝子解析に おける検出プローブあるいはターゲッ 卜として使用可能である。
そのような修飾物質として、 蛍光性物質、 ビタミン、 脂質、 アミ ノ酸、 オリゴペプチド、 タンパク質または、 生体外因性物質を好適 に使用できる。 アミノ酸、 オリゴペプチド、 タンパク質は、 ァミノ 基を有しているため、 その他のものはアミノ基を持たせることで、 ヌクレオチド鎖の 3 '末端のアルデヒ ド基と融合させることが可能 となる。 これによりヌクレオチド鎖に、 蛍光性物質、 ビタミン、 脂 質、 アミノ酸、 オリゴペプチド、 タンパク質または、 生体外因性物 質が有する機能を付加することができる。
修飾物質は、 遺伝子解析のための基板への結合能を有した物質で あってよい。 これにより、 修飾されたヌクレオチド鎖を、 検出プロ —ブあるいはターゲッ トとして、 基板に安定に固定化することが可 能となる。
そのような修飾物質として、 アミノアルカンチオールまたはアミ ノシラン力ップリング化合物を好適に使用できる。 これら化合物は 貴金属製、ガラス製あるいは樹脂製の基板に安定に結合可能である。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の実施の形態 1のヌクレオチド鎖修飾方法の原理 を示した説明図であり、
図 2は、 図 1に示したヌクレオチド鎖修飾方法の一部過程であつ て、 生成するアルデヒド誘導体をフルォレセィンで修飾する過程の 化学反応式を示し、
図 3は、 図 1に示したヌクレオチド鎖修飾方法の一部過程であつ て、生成するアルデヒド誘導体をアル力ンチオールで修飾する過程、 およびそれを貴金属基板に固定化する過程の化学反応式を示し、 図 4は、 本発明の実施の形態 2のヌクレオチド鎖修飾方法の原理 を示した説明図であり、
図 5は、図 4のヌクレオチド鎖の反応中心部の化学反応式を示し、 図 6は、 本発明の実施の形態 3のヌクレオチド鎖修飾方法の原理 を示した説明図であり、
図 7は、 本発明の実施の形態 4のヌクレオチド鎖修飾方法の原理 を示した説明図であり、
図 8は、 本発明の実施の形態 5のヌクレオチド鎖修飾方法の原理 を示した説明図であり、
図 9は、 本発明の実施例 1のヌクレオチド鎖修飾方法'における各 反応過程のヌクレオチド鎖のポリァクリルアミ ド電気泳動の結果を 示し、
図 1 0は、 本発明の実施例 2のヌクレオチド鎖修飾方法における 各反応過程のヌクレオチド鎖のフィルム露光の結果を示し、
図 1 1は、 本発明の実施例 3のヌクレオチド鎖修飾方法における 各反応過程のヌクレオチド鎖のポリアクリルアミ ド電気泳動および フィルム露光の結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。 (実施の形態 1 )
本発明の実施の形態 1 を図 1に基づき説明する。 図中、 1 、 m及 び nは、 0または任意の自然数を表わし、 B a s eは、 アデニン、 グァニン、 シトシン、 チミン、 ゥラシル等の任意の塩基を示し、 H Xはヒポキサンチンを、 C y tはシトシンをそれぞれ示す。
任意の塩基配列を有するヌクレオチド鎖 （ I ) と、 2 '—デ才キシ イノシン一 5 三リン酸 （A ) (以下に構造を示すようにヒポキサ ンチン H xを有している） とに、 ターミナルデォキシヌクレオチジ ルトランスフェラ一ゼを作用させることにより、 ヌクレオチド鎖 ( I ) の 3 '末端に、 ヒポキサンチンを含んだヌクレオチドの配列を 付加し、 ヌクレオチド鎖 （II) を得る。
Figure imgf000019_0001
得られたヌクレオチド鎖 (II) に、 シトシンを有した数十ヌクレ ォチド長のオリゴヌクレオチド鎖 ( B ) をァニールさせることによ り、 ヌクレオチド鎖 (III ) を得る。
この一部 2本鎖となったヌクレオチド鎖 (III ) に 3—メチルァ デニン D N Aダリコシラーゼ II型を作用させ、 アル力リ熱処理する ことにより、 ヒポキサンチンを有するヌクレオチドのグリコシド結 合を切断し、 残存するデォキシリポ一スーリン酸結合を切断して、 3 末端にアルデヒ ド基を持ったヌクレオチド鎖 (IV) を得る。 このヌクレオチド鎖 （IV) に、 アミノ基を有する修飾物質 （H 2 N— R (修飾物質については後述する）） を反応させることにより、 ヌクレオチド鎖 （IV) と修飾物質とが脱水縮合したシッフ塩基、 す なわち、 3 '末端が修飾物質で直接的に修飾されたヌクレオチド鎖 ( V ) を得る。
目的とするヌクレオチド鎖が化学合成可能な数十ヌクレオチド鎖 長のものであれば、 予め特定の塩基の配列を有するヌクレオチド鎖 を合成しておくことで、 第 1段階の反応を省略することも可能であ る。
図 2に示すように、 3 '末端にアルデヒド基を持ったヌクレオチド 鎖 (IV) に対して、 蛍光物質として知られるフルォレセィンカダベ リン （C ) を反応させると、 ヌクレオチド鎖の 3 '末端に直接的にフ ルォレセィンカダベリンが結合した修飾ヌクレオチド鎖 (VI) が得 られる。
このようにしてフルォレセィンで修飾することにより、 ヌクレオ チド鎖を蛍光ラベル化 （標識化） することができ、 このヌクレオチ ドをハイブリダイゼ一ションなどの遺伝子解析のためのプローブあ るいはターゲッ トとして利用可能となる。
図 3に示すように、 3 '末端にアルデヒド基を持ったヌクレオチド 鎖 （IV) に対して、 アミノ基を有するチオール、 ここでは 8—アミ ノー 1 一オクタンチオール ( D ) を反応させると、 ヌクレオチド鎖 の 3 '末端に直接的に 8 —アミノー 1 一才クタンチオール残基が結 合した修飾ヌクレオチド鎖 （VII ) が得られる。
この修飾ヌクレオチド鎖 （VII ) を貴金属の基板 （E ) に作用さ せることにより、 チオール基と基板 （E ) との強固な共有結合を形 成させて、 ヌクレオチド鎖 （VII ') を基板 （E ) に固定化すること ができる。
このようにして基板 （E ) に固定化することにより、 貴金属を基 板として利用する電気化学的測定法、 水晶発振子マイクロバランス 法、 表面プラズモン共鳴法等の測定法を、 遺伝子解析に利用するこ とが可能となる。
なお、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化するための修飾物質は、 ヌクレオチド鎖の 3 '末端に付与される官能基に対する結合能を有 していればよい。 たとえば、 蛍光性物質であるフルォレセィン、 テ キサスレッ ド、 ローダミン、 C y 3 ' C y 5に代表されるシァニン 化合物、 あるいは、 非蛍光物質であるピオチン、 ジゴキシゲニン等 は、 アミノ基を末端に形成することで、 修飾物質として使用するこ とができる。 これらの修飾物質でラベル化 (標識化) したヌクレオ チド鎖をハイプリダイゼーションなどの遺伝子解析のためのプロ一 ブあるいは夕一ゲッ トとして利用可能となる。
アミノ酸、 ペプチド、 タンパク質も修飾物質として使用可能であ る。 アミノ酸の内、 フエ二ルァラニン、 トリプトファン、 チロシン は蛍光性を有するため、 ラベル化、 標識化に使用できる。 蛍光性を 有しないアミノ酸やペプチドも、 側鎖にフルォレセイン等 (以下、 標識化合物） を結合させることで、 ラベル化、 標識化に使用可能で ある。
アミノ酸が連鎖したぺプチドは、 その数に応じた側鎖が存在する ため、複数の標識化合物を結合させることが可能となる。たとえば、 トリ リシンには側鎖にァミノ基が 3つ存在するため、 力ルポキシル 基、 スクシンイミ ド基等を有する標識化合物を任意に合計 3つまで 結合させることが可能となる。
ペプチドに限らず、 アミノ基を有するアルキル、 ァリル、 シクロ アルカン、 芳香族、 糖類等の炭化水素類を標識化合物で修飾した物 質を修飾物質として用いて、 ヌクレオチ.ド鎖を修飾することも可能 であり、 ヌクレオチド鎖のラベル化、 標識化を実現できる。
またたとえば、 アルカリフォスファターゼ、 ペルォキシダ一ゼ、 有色性、 蛍光性を有する トランスフェリン、 ヘモグロビン、 緑色蛍 光タンパク、 青色蛍光タンパク、 ェクオリン等のタンパク質を修飾 物質として用いて、 ヌクレオチド鎖をラベル化、 標識化することも 可能であり、 遺伝子解析、 とりわけイン · サイチューでのハイプリ ダイゼーシヨンに有用である。
その他、 表面にアミノ基を形成させた金コロイ ド、 銀コロイ ド等 の貴金属コロイ ド、 磁性微粒子、 ポリスチレンビーズ等の高分子微 粒子に代表される微粒子なども、 ヌクレオチド鎖の修飾物質として 使用可能である。
ヌクレオチド鎖を貴金属に固定化したい場合は、修飾物質として、 アル力ンチオールと総称されるチオール化合物の内でアミノ基を有 する化合物を採用可能である。 修飾物質を介してヌクレオチド鎖を 貴金属に固定化できるため、 貴金属を基板として利用する電気化学 的測定法、 水晶発振子マイクロバランス法、 表面プラズモン共鳴法 等の測定法を、 遺伝子解析に利用することが可能となる。
アルカンチオールは、 貴金属と結合するチオール基とアミノ基と が存在すれば、 構造等に特に限定なく使用することができる。 アミ ノ基 · チオール基間の炭化水素残基は、 直鎖状、 分岐鎖状、 シクロ 環状、 ァリル鎖状、 芳香環状等、 種々の形態であってよく、 その炭 素数、 ァミノ基の位置等も、 種々可能である。
基板水晶発振子マイクロパランス法、 表面プラズモン共鳴法等で は、 金の基板を汎用するが、 測定法等に応じて、 白金、 銀、 銅、 パ ラジウム、 インジウム、 ニッケル、 鉄、 アルミニウム、 及びそれら の合金等も基板として使用可能である。
修飾物質として、 アミノ基を有するシラン力ップリング化合物を 使用してもよく、 それにより、 ガラス、 シリコン、 シリカ、 アルミ ナ、 マイ力、 及びポリスチレン、 ナイロン、 エポキシ等の高分子樹 脂等の基板にヌクレオチド鎖を固定化することが可能となり、 従来 からの様々な遺伝子解析手法にも適用可能となる。
シランカツプリング化合物は、 アミノ基とアルコキシ基とを有す る化合物であれば、 アルカンチオールと同様に、 構造等に特に制限 なく使用可能である。 使用可能なシランカツプリング化合物はたと えば、ガンマーァミノプロピルトリエトキシシラン、 N—べ一夕 （ァ ミノェチル) —ガンマーァミノプロピルメチルジメ トキシシラン、 N—ベータ (ァミノェチル) 一ガンマ一ァミノプロピルトリメ トキ シシラン、 N—ベ一夕 （アミノエチル） 一ガンマーァミノプロピル トリエトキシシラン、 ガンマーァミノプロビルトリメ トキシシラン 等である。
本来はアミノ基を有しない物質も、 アミノ基を有する適当なスぺ ーサ一を介することで、 ヌクレオチド鎖を修飾可能である。 たとえ ばカルボキシル基を有する物質は、 スぺ一サ一として、 1， 2—ジ アミノエタン、 1， 6—ジァミノへキサン等のジァミノ構造を有す る物質を介在させることで、 ヌクレオチド鎖を修飾可能となる。 さらには、 ヒドラジン基、 アミノォキシル基、 シァノ基を有する 物質、 あるいは G r i g n a r d試薬の様にハロゲン化マグネシゥ ムを有する物質も、 修飾物質として使用可能である。
(実施の形態 2)
図 4は、 本発明の実施の形態 2のヌクレオチド鎖修飾方法の原理 を示し、 図 5は、 図 4のヌクレオチド鎖の反応中心部の化学反応式 を示す。
図 4および図 5において、 N。 はアデニン、 グァニン、 チミン、 シトシンの内の任意の塩基を示し、 は N。 と相補的塩基対を形 成するアデニン、 グァニン、 チミン、 シトシンの内の任意の塩基を 示す。 N2 は N。 とは相補的塩基対を形成しないアデニン、 グァニ ン、 チミン、 シトシンの内の任意の塩基を示し、 N3は N2 と相補 的塩基対を形成するアデニン、 ヒポキサンチン、 チミン、 シトシン の内の任意の塩基を示す。 Cはシトシンを示し、 Hxはヒポキサン チンを示し、 これら NQ 、 N J , N2 、 N3 、 C、 Hxはいずれも、 2 '一デォキシヌクレオチド (以下、 単にヌクレオチドという） に 含まれている。 N0 、 N！ , N2 、 N3 は一部のみ示したもので、 個 数を限定する意図はない。
また、 d I TP、 dATP、 d CTP、 d TTPはそれぞれ、 2 'ーデォキシィノシン— 5 '—三リン酸、 2 '—デォキシアデノシ ンー 5 一一三リン酸、 2 一—デォキシシチジン— 5 一一三リン酸、 2 一ーデォキシチミジン一 5 '一三リン酸を示す。 NH2 _ Rは、 前述したような、 アミノ基を有する任意の修飾物質を示す。
修飾対象のヌクレオチド鎖 (2 - 1 ： 図 4中の番号を示す。 以下 同様） は、 塩基 N。 の配列を 3 '末端領域に有している。 このヌク レオチド鎖 ( 2 - 1 ) に別途のヌクレオチド鎖 (2 - 2) をァニー ルさせて、 2本鎖ヌクレオチドを形成する。 ヌクレオチド鎖 ( 2一 2 ) は、 ヌクレオチド鎖 （ 2— 1 ) の 3 '末端領域の塩基 NQ と相 補的な任意な塩基 の配列を 3 '側に有し、 そのすぐ 5 '側にシ トシン Cを有し、 続いて塩基 N。 とは相補的でない任意の塩基 N2 の配列を有していて、 ァニール後に 5 '末端領域が突出する。
この部分的 2本鎖ヌクレオチドに、 DNAポリメラ一ゼを触媒と して、 d I TP、 dATP、 d CTP、 dTTPを取り込ませるこ とにより、 完全な 2本鎖ヌクレオチドを形成する。 この際に形成さ れるヌクレオチド鎖 （2— 3) は、 ヌクレオチド鎖 （2— 1 ) の 3 一末端に、 ヌクレオチド鎖 （2— 2) の 1本鎖領域に相補的なヌク レオチド配列が付加したものとなり、 ヌクレオチド鎖 （2— 2) の シトシン Cに対応するヒポキサンチン Hxを有する。
形成された完全 2本鎖ヌクレオチドに対して、 3一メチルアデ二 ン D N Aグリコシダ一ゼ Π型を作用させ、 アルカリ熱処理すること により、 ヒポキサンチン Hxを含んだヌクレオチド （デォキシリボ ース） の 1 '位の炭素と酸素の間のグリコシド結合を特異的に分解 し、 これにより形成されるヌクレオチド鎖 (2 - 4) の 3 '末端に アルデヒド基を付与する。
次いで、 アミノ基を有した修飾物質 ( N H 2一 R ) を添加して、 それぞれのアルデヒド基とアミノ基とを反応させることにより、 シ ッフ塩基を形成させる。 この際に形成されるヌクレオチド鎖 （2— 5 ) が目的産物であり、 出発物質であるヌクレオチド鎖 ( 2 - 1 ) の 3 '末端に直接に修飾物質が結合したものとなる。
修飾終了後に、不要なヌクレオチド鎖（ 2— 2 ) を分離除去する。 このヌクレオチド鎖 （2— 2) の除去は、 修飾物質が結合した 2本 鎖ヌクレオチドを熱処理するか、 あるいはヌクレオチド鎖 （ 2— 2 ) の 5 '末端にリン酸基を存在させて、 これを特異的に分解するラム ダェキソヌクレア一ゼを作用させることで、 容易に行える。 予めヌ クレオチド鎖 （ 2— 2) の塩基 Ν1 N2 のグァニンの一部をヒポ キサンチンに代えたものとしておく ことにより、 3一メチルアデ二 ン DNAグリコシダ一ゼ]!型によって小断片化することもできる。 (実施の形態 3)
図 6は、 本発明の実施の形態 3のヌクレオチド鎖修飾方法の原理 を示す。 この方法では、 2本鎖ヌクレオチドの内、 修飾対象とする 一方のヌクレ才チド鎖に、 上述した 3一メチルアデニン D N Aダリ コシダーゼ Π型に対する基質となるヒポキサンチンを含んだヌクレ ォチド配列を付加する。
図中、 NQ 、 Ni、 N2 、 C、 Hx、 5 'および 3 'は前記と同意 義であり、 N4 は N2 と相補的塩基対を形成するアデニン、 グァニ ン、チミン、 シトシンの内のいずれかの塩基を示し、 Aはアデニン、 Gはグァニン、 Tはチミンをそれぞれ示す。
2本鎖ヌクレオチドは、 第 1のヌクレオチド鎖 （2— 1 1 ) と第 2のヌクレオチド鎖 (2 - 1 2) とからなり、 この内、 ヌクレオチ ド鎖 (2 - 1 1 ) が修飾対象である。 ヌクレオチド鎖 (2 - 1 1 ) は 3 '末端領域に塩基 N。 の配列を有し、 ヌクレオチド鎖 （ 2— 1 2) は 5 '末端領域に塩基 N i の配列を有している。
この 2本鎖ヌクレオチドを加熱処理あるいはアル力リ処理して 1 本鎖に解離させ、 解離したヌクレオチド鎖 （2— 1 1) に第 3のヌ クレオチド鎖 (2 - 1 3) をァニールさせて、 部分的な 2本鎖ヌク レオチドを形成する。 第 2のヌクレオチド鎖 （2— 1 3) は、 ヌク レオチド鎖 （2— 1 1) の 3 '末端領域の塩基 N。 と相補的な任意 の塩基 の配列を 3 '側に有し、 そのすぐ 5 '側にシトシン Cを 有し、 続いて塩基 N。配列とは相補的でない任意の塩基 N2 の配列 を有していて、ァニール後にシトシン Cから 5 '側が 1本鎖になる。
この部分的 2本鎖ヌクレオチドに、 DNAポリメラーゼを触媒と して、 d I TP、 d ATP, d CTP、 dTTPを取り込ませるこ とにより、 完全な 2本鎖ヌクレオチドを形成する。 この際に形成さ れるヌクレオチド鎖 (2 - 1 4) は、 ヌクレオチド鎖 (2 - 1 1 ) の 3 '末端に、 ヌクレオチド鎖 （2— 2) の 1本鎖領域に相補的な ヌクレオチド配列を付加したものとなり、 ヌクレオチド鎖 （ 2— 2 ) のシトシン Cに対応する位置にヒポキサンチン Hxを有する。
この完全 2本鎖ヌクレオチドに対して、 実施の形態 2と同様の操 作を行うことで、 ヌクレオチド鎖 （2— 1 1) の 3 '末端にアルデ ヒ ド基を付与し、 修飾物質を結合させ、 不要なヌクレオチド鎖を除 去することができる。
なおここでは一方のヌクレオチド鎖のみを修飾対象とする場合の 修飾方法を例示したが、 双方のヌクレ才チド鎖を修飾対象とする場 合も同様にして修飾可能であることは理解されよう。
(実施の形態 4)
図 7は、 本発明の実施の形態 4のヌクレオチド鎖修飾方法の原理 を示す。 この方法は、 2本鎖を形成しているヌクレオチド鎖に適当 な制限酵素切断部位が存在する場合のヌクレオチド鎖修飾方法であ る。
図中、 N。 、 、 A、 G、 T、 C, Η χは前記と同意義を有し、 N2 、 N4 はアデニン、 グァニン、 チミン、 シトシン、 ヒポキサン チン、 ゥラシルなどの塩基中から任意に選択した互いに相補的な塩 基を示す。
2本鎖ヌクレオチドは、 第 1のヌクレオチド鎖 （ 2— 2 1 ) と第 2のヌクレオチド鎖 ( 2 - 2 2 ) とからなり、 この内、 ヌクレオチ ド鎖 （ 2— 2 1 ) が修飾対象である。 ヌクレオチド鎖 （ 2— 2 1 ) の 3 '末端領域 （ヌクレオチド鎖 （ 2— 2 2 ) の 5 '末端領域） に は、 制限酵素 B amH Iが認識して切断する塩基配列 （GGAT C C/C C TA GG) が存在している。
まず、 2本鎖ヌクレオチドを B amH I により切断して、 N 0 の 3 '側に Gのみが存在するヌクレオチド （ 2— 2 3 ) と、 の 5 一側に C C T A Gが存在するヌクレオチド（ 2— 2 4)とからなる、 部分的 2本鎖ヌクレオチドを形成する。
この部分的 2本鎖ヌクレオチドに、 DNAポリメラ一ゼを触媒と して、 d I T P、 d AT P, d C T P、 d TT Pを取り込ませるこ とにより、 完全な 2本鎖ヌクレオチドを形成する。 これにより形成 されるヌクレ才チド鎖 （ 2 _ 2 5 ) は、 ヌクレ才チド鎖 （ 2— 2 3 ) の 3 '末端に、 ヌクレオチド鎖 （ 2— 2 4) の 1本鎖領域に相補的 なヌクレオチド配列を付加したものとなり、 ヌクレオチド鎖 （ 2— 2 4 )のシ 1、シン Cに対応する位置にヒポキサンチン H Xを有する。 この完全 2本鎖ヌクレオチドに対して、 実施の形態 2と同様の操 作を行うことで、 ヌクレオチド鎖 （ 2— 2 1 ) の 3 '末端に 1ヌク レ才チドのみを付加して 7ルデヒド基を付与し、 修飾物質を結合さ せ、 不要なヌクレオチド鎖を除去することができる。
(実施の形態 5 ) 図 8は、 本発明の実施の形態 5のヌクレオチド鎖修飾方法の原理 を示す。 この方法では、 予めヒポキサンチンを塩基配列に取り込ん だ 2本鎖ヌクレオチドを接合する。
図中、 N0 、 1 , C、 Hxは前記と同意義を有し、 N2 、 N4 は アデニン、 グァニン、 チミン、 シ卜シン、 ヒボキサンチン、 ゥラシ ルなどの塩基中から任意に選択した互いに相補的な塩基を示す。
2本鎖ヌクレ才チドは、 第 1のヌクレオチド鎖 (2 - 3 1) と第 2のヌクレオチド鎖 (2— 3 2) とからなり、 この内、 ヌクレオチ ド鎖 （2— 3 1) が修飾対象である。 ヌクレオチド鎖 （2— 3 1 ) は、 3 '末端領域に塩基 NQ の配列を有し、 ヌクレオチド鎖 （2— 3 2) は、 ヌクレオチド鎖 （2— 3 1) の 3 '末端領域と相補的塩 基対を形成する塩基 の配列を 5 '側に有している。
この 2本鎖ヌクレオチドに、 D N Aリガーゼを触媒にして別途の 2本鎖ヌクレオチドを接合する。この別途の 2本鎖ヌクレオチドは、 ヒポキサンチン H Xの両側に塩基 N4の配列を有したヌクレオチド 鎖 （ 2— 3 3) と、 シトシン Cの両側に、 塩基 N4に相補的な塩基 N2 の配列を有したヌクレオチド鎖 （2— 34) とからなるものを 用い、 修飾対象のヌクレオチド鎖 （ 2— 3 1 ) の 3 一側にヌクレオ チド鎖 （2— 3 3) が配置されるように接合する。 これにより、 ヌ クレオチド鎖 （ 2— 3 5 ) (ヌクレオチド鎖 (2 - 3 1) とヌクレ ォチド鎖 (2 - 3 3) ) と、 ヌクレオチド鎖 (2 - 36) (ヌクレ ォチド鎖 (2 - 3 1 ) とヌクレオチド鎖 (2 - 3 3) ) とからなる 2本鎖ヌクレオチドが形成される。
この完全 2本鎖ヌクレオチドに対して、 実施の形態 2と同様の操 作を行うことで、 ヌクレ才チド鎖 (2 - 3 1 ) の N。配列の近傍の 3 '末端にアルデヒド基を付与し、 修飾物質を結合させ、 不要なヌ クレオチド鎖を除去することができる。
なお、 この実施の形態 5では、 ヒポキサンチン Hxの位置から 5 '側 （およびシトシン Cの位置から 3 '側） に、 3塩基対 （N 2 — N 4 ) に相応するヌクレオチド配列を持たせているが、 この部分の ヌクレオチド配列は省略することも可能である。
ただし、 接合箇所に制限酵素による認識配列を形成すると、 DN Aリガーゼによる接合反応の効率が高くなるため、 ヒポキサンチン H xの位置から 5 一側 （およびシトシン Cの位置から 3 '側） に 3 〜 4塩基対に相応するヌクレオチド配列を持たせておくのが好まし い。
例えば、 ヌクレオチド鎖 （ 2 _ 3 1 ) の 3 '末端の塩基 N。 の配 列とヌクレオチド鎖 （2 — 3 2 ) の 5 '末端の塩基 の配列とが 以下の配列 （ I ) である場合に、 ヌクレオチド鎖 （ 2— 3 3 ) にお けるヒポキサンチン H xの位置から 5 '側と、 ヌクレオチド鎖 （2 - 3 4 ) におけるシトシン Cの位置から 3 '側とに配列 （II) を持 たせておくと、 接合箇所に配列 （III) が形成され、 この配列 （III) は制限酵素 H i n c Πが認識切断する配列であるため、 リガーゼ反 応が効率的に進行する。
• ■ GTC 3 ' 5 " GAC■■ · · GTCGAC · ·
■ ■ CAG 5 ' 3 CTG■ · - - CAGCTG - -
(I) (II) (III) 接合する 2組の 2本鎖ヌクレオチドの末端は、 上記したヌクレオ チド鎖のような平滑末端であってもよいし、 B a m H I による切断 部位のような、 一方のヌクレオチド鎖が突出した突出末端であって もよい。
このような制限酵素による切断と D N Aリガーゼによる接合は、 従来より遺伝子のベクタ一等への組み込みに利用されている。 本発 明方法を併用することで、 遺伝子 （ヌクレオチド鎖） のベクター等 への組み込みと修飾物質による修飾とを、 同一の反応条件下で実現 可能となり、 わずかな検体から P C R法等により増幅した貴重なヌ クレオチド鎖試料を、 無駄に使用することなく有効に活用可能とな る。例えば、遺伝子発現べクタ一である P E T系ベクター（Studier,F. ら、 Methods Enzymol、 185巻、 60頁） はその遺伝子挿入部位に B a m H Iサイ トを有しているため、 実施の形態 4に示す方法を適用 することにより、 ヌクレオチド鎖の修飾とベクターへの組み込みが 同時に実現可能となる。
修飾対象のヌクレオチド鎖の鎖長は少なくとも 3以上であればよ いが、 遺伝子解析の用途にはヌクレオチド鎖の配列を規定する必要 があり、 そのためにはヌクレオチド鎖の鎖長は少なくとも 1 0以上 であるのが望ましい。
ヒポキサンチン H Xよりも 3 '側に配置されるヌクレオチド酉己歹 IJ は、 実施の形態 2および実施の形態 3の方法を使用する場合は、 少 なく とも 1塩基対に相応する鎖長であればよいが、 実施の形態 4お よび実施の形態 5の方法を使用する場合は、 2〜 4塩基対以上の鎖 長であるのが望ましい。 制限酵素ゃリガーゼを十分に作用させるに は、 各酵素が認識する配列領域よりも幾分に長い鎖長が必要なため である。 上記した各実施の形態では、 ヒボキサンチン H xを含んだヌクレ ォチド配列を付加すること、 またヒボキサンチン H xを含んだヌク レオチドを基質とする 3—メチルアデニン D N Aダリコシダ一ゼ Π 型を作用させることを例示したが、 これに限定されない。 表 1 (前 掲） の塩基を 3 '末端領域に含んだヌクレオチドと D N Aグリコシ ダーゼとの組み合わせでも、 同様にしてヌクレオチド鎖の 3 '末端 を所望の修飾物質で修飾可能である。
以下、 具体的な実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。 (実施例 1 )
修飾対象のヌクレオチド鎖として、 ヌクレオチド数 3 0の一本鎖 化学合成ヌクレオチド鎖 （Sigma-Genosya社に合成を委託） を用い た。 このヌクレオチド鎖は、 大腸菌の 1 6 Sリボゾームリポ核酸遺 伝子の 8〜 3 7位をコードするもので、 5 '末端より以下の塩基配列 を有する。 A、 T、 G、 Cはそれぞれデォキシヌクレオチド中の塩 基、 アデニン、 チミン、 グァニン、 シトシンを示す。
AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCT (配列 1 ) まず、 ヌクレオチド鎖を 5 μ Μになるように、 2単位 （以下、 u と略す) / β 1 のターミナルデォキシヌクレ才チジルトランスフエ ラ一ゼ （Inviti'ogen 社製） 、 1 0 mM 2 '—デォキシイノシン— 5 ' —三リン酸、 2 m M塩化コバルト、 1 mMジチォスレイ トール、 0 . 1 Mカコジル酸力リウム （ p H 7 . 2 ) の反応液 5 0 1 中に混和 し、 3 7 °Cで 4時間反応させて、 ヌクレオチド鎖の 3 '側に、 ヒポキ サンチン塩基を有するヌクレ才チド配列をテーリングさせた。
このヌクレオチド鎖をエタノール沈殿により回収し、 1 0 0 M の オ リ ゴ デ ォ キ シ シ ト シ ン （ ヌ ク レ オ チ ド 数 1 8 、 NewEnglandBioLabs社製） を添加して、 ヌクレオチド鎖の 3 '側に テ一リングしたヌクレオチド配列のヒポキサンチン塩基とァニ一リ ングさせた。
次にヌクレオチド鎖を、 0 . 3 u / 1 の 3 —メチルアデニン D N Aグリコシラーゼ II 型 （Trevigen製） 、 I m Mエチレンジアミ ン四酢酸、 1 m Mグリコールェ一テルジァミン四酢酸、 I m Mジチ オスレイ ト一ル、 1 0 m M 2— [ 4— ( 2 —ヒドロキシェチル） 一 1 —ピペラジニル]エタンスルフォン酸一水酸化力リウム（ p H 7 . 4 ) の反応液に混和し、 3 7 °Cで一昼夜反応させて、 ヌクレオチド 鎖の 3 '側にテーリングしたヌクレ才チド配列のダリコシド結合を 切断した。
この反応液に 0 . 1 Mになるように水酸化ナトリゥムを添加し、 1 0 0 °Cで 5分間加熱して、ヌクレオチド鎖の 3 '倒に残存するリン 酸を解離させ、 3 '末端にアルデヒド基を形成させた。
このヌクレオチド鎖をエタノール沈殿により回収し、 0 · 1 M炭 酸ナトリウム ( H 9 . 5 ) 条件下で 5 m Mフルォレセィンカダベ リン（MolecularProbes社製） と混合し、反応液を 5 0 1 にして、 室温で 2時間反応させて、 ヌクレオチド鎖の 3 '末端のアルデヒド基 とフルォレセィンカダベリンに存在するアミノ基との間でシッフ塩 基を形成させた。 その後に、 1 m g Zm 1 になるよう水素化ホウ素 ナトリゥムを添加し、 反応液を 1 0 0 2 1 とし、 4 °Cで一昼夜反応 させることにより、 シッフ塩基を還元し、 結合を安定化させた。
この修飾プロセスを 7モル尿素一ポリァクリルアミ ドゲル電気泳 動 （Molecular Cloning 第 2版 11.23頁 1989年） により追跡 した結果を図 9に示す。 図中左側の数字と矢印は各塩基数を有する ヌクレオチド鎖の 動位置を示している。ヌクレオチド鎖の検出は、 銀染色法 （Electrophoresis 4巻 92頁 1983年） に従った。
レーン A、 B及び Cはそれぞれ、 分子量マーカー、 オリゴデォキ シシトシン、 及び未処理のヌクレ才チド鎖をそれぞれ示している。 レーン Dは、 ヒポキサンチンを有するヌクレオチド配列が 3 '側にテ —リングしたヌクレオチド鎖を示し、 ヌクレオチド数は 1 0 0以上 に増加している。 レーン Eは、 オリゴデォキシシトシンがァニーリ ングしたヌクレオチド鎖を示す。 レーン Fは、 3 '末端にアルデヒ ド 基が形成したヌクレオチド鎖を示し、 ヌクレオチド数は 3 0に減少 している。 レーン Gは、 3 '末端がフルォレセインカダベリンで修飾 され安定化されたヌクレオチド鎖を示す。
レーン Dにおいて、 ヒポキサンチンを有するヌクレオチドのテー リングが認められず、 未反応のヌクレオチド鎖が若干残存している のが認められるが、 これは、 テ一リング反応時間の延長や、 夕一ミ ナルデォキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ添加量の増加等に より、 容易に解消可能である。
なお、 修飾対象のヌクレオチド鎖のアデニン、 グァニン、 シトシ ンにもアミノ基が存在するため、ヌクレオチド鎖内部で反応が生じ、 自己重合してしまう可能性もあるが、 レーン Fに示す通り、 自己重 合は生じなかった。 しかし必要があれば、 ヌクレオチド鎖の化学合 成時に用いられるベンゾィル基、 ィソプチリル基等の適当な保護基 で、 ヌクレオチド鎖のアミノ基を保護することも可能である。
(実施例 2 )
実施例 1で電気泳動させた各過程のヌクレオチド鎖を、 S o u t h e r nの方法 （ J.Mol.Biol.98巻、 503頁、 1975年） に従って、 ナイロン膜 （Schleicher & Schuell社製） に転写した。 ' ナイロン膜上のヌクレオチド鎖に対して、 西洋ヮサビ由来のペル ォ キ シ ダ ー ゼ で 標 識 し た 抗 フ ル ォ レ セ ィ ン 抗 体 (AmershamBiosciences社製） を滴下し、 フルォレセインの有無を ィ匕字発光法 ( AmershamBiosciences 社製、 ECL Detection Reagents ) によ り フ イ リレム 、 AmershamBiosciences ネェ 、 HyperfilmECL) を露光させて検出した。 結果を図 1 0に示す。 図 中左側の数字と矢印は、 図 9と同様に各塩基数を有するヌクレオチ ド鎖の位置を示している。
レーン Aは分子量マ一力一を示す。 予めフルォレセィンラベルし た 2 '， 3 '—ジデォキシゥリジン— 5 '—三リン酸 (EnzoDiagnostics 社製） をターミナルデォキシヌクレオチジルトランスフェラーゼで テーリング処理したものである。
レーン B〜Fでは、 発光の検出は認められず、 ヌクレオチド鎖は フルォレセィンで修飾されていないことがわかる。
レーン Gにおいて、 ヌクレオチド数 3 0のヌクレオチド鎖の発光 が検出されており、 修飾ヌクレ才チド鎖が実際にフルォレセィンカ バべリンで修飾されたことがわかる。
レーン Gでは、 ヌクレ才チド数 1 8のオリゴデォキシシ卜シンも フルォレセインカバべリンで修飾されている。 これは、 テ一リング したヒポキサンチンのヌクレ才チド鎖部分にオリゴデォキシシトシ ンがランダムにァニールするため、 部分的に 2本鎖が形成されず、 3 一メチルアデニン D N Aグリコシダ一ゼ II 型が作用しない箇所 が存在してしまうためである。 それにより、 わずかなヌクレオチド 数のオリゴデォキシヒポキサンチンが生じ、その 3 '末端にアルデヒ ド基が形成され、 そのアルデヒド基をフルォレセィンカダベリンが 修飾し、 これらの反応中にオリゴデォキシヒポキサンチンとオリゴ デォキシシトシンとが再ァニールするためである。 しかし不要なォ リゴデォキシシトシンは、 ゲルクロマトグラフィー、 イオン交換ク 口マトグラフィーさらにはポリスチレンビーズ等の微粒子に適当な 方法で固定化したオリゴデォキシヒポキサンチン、 オリゴデォキシ グァニン、 あるいはこれらを混合したオリゴヌクレオチドとァニー ルさせることで、 容易に分離除去可能である。
以上、 実施例 1及び実施例 2に示した通り、 本発明の方法によつ て、 ヌクレオチド鎖の 3 '末端に直接的に修飾物質を修飾することが 可能である。
上記各実施例に示したヌクレオチド鎖の構成'鎖長さ、修飾物質、 反応条件、 反応組成等は単なる例示であり、 これらに限定されるこ となく任意に改変可能である。
(実施例 3 )
修飾対象のヌクレオチド鎖として、 ヒ 卜の骨格筋ミオシン重鎖 1 の c D N A配列 5 8 3 1〜 5 8 5 0位 （米国国立バイォテクノロジ 一インフォメーションセンターの G e n B a n k、 インターネッ 卜 ゥエフサイ 卜 (http：〃 www.ncbi.nlm. niii.gov/Genbank/index. html)、 ァクセッション番号 ： NM— 005963、 2004年 2月現在） に相応する ヌ ク レ オチ ド 数 2 0 の一本鎖デォキ シ ヌ ク レ オチ ド 鎖 (Signia-Genosys社にて委託合成） を用いた。 このヌクレオチド鎖 に相補的なヌクレオチド鎖として、 ヌクレオチド数 2 9の一本鎖デ 才キシヌクレ才チド鎖 ( Sigma-Genosys社にて委託合成）を用いた。 修飾物質として、 アミノォキシメチルカルポニルヒ ドラゾンー C y 5を用いた。 各ヌクレオチド鎖は下記の塩基配列を有している。 被修飾ヌクレオチド鎖
TGCTG AAAGG TGACC AAAGA (配列 2 )
相補的ヌクレオチド鎖
ATCGGATCCTCTTTGGTCACCTTTCAGCA (配歹 'J 3 )
ステップ 1
被修飾ヌクレオチド鎖 （以下、 MYH 1と記す） と相補的ヌクレ ォチド鎖 （以下、 MYH 1 -B amH I と記す） とを、 最終濃度がそ れぞれ 1 0 M、 2 0 /Mになるように、 5 OmM塩化ナトリゥム、 1 OmM塩化マグネシウム、 1 mMジチオスレイ ト一ル、 1 0 ηιΜ トリスー塩酸 （pH 7. 5) の緩衝液に懸濁し （総量 1 0 0 μ 1 ) 、 6 5°Cで 1 0分加温した後、 3 0分以上かけて室温まで冷却するこ とにより、 c MYH l -B amH Iの 5 '領域（CTTTCAGCA) が突出した 2本鎖を形成した。
ステップ 2
形成された 2本鎖ヌクレ才チドをエタノール沈殿により回収し、 1 0 mM d I TP、 1 OmM dATP、 1 OmM d TTP、 1 OmM d CTP、 5 OmM塩化ナトリウム、 2 OmM塩化マグ ネシゥム、 4 OmMトリス—塩酸 ( p H 7. 5 ) の溶液に入れ、 T 7 DNAポリメラ一ゼ改変酵素シーケネース V e r . 2. 0 (US B社） を最終濃度 0. 5 U / 1 になるよう添加し （総量 1 0 0 1 ) 、 3 7 °Cで 4時間反応させることにより、 MYH 1の 3 '末端 に、 M YH 1 -B amH I に相補的なヒポキサンチンを含んだヌクレ ォチド配列を付加して、 完全な 2 9塩基対の 2本鎖ヌクレオチドを 形成した。 この際に形成される MYH 1は （配列 1 ) 一 HxHxA T C CH x ATで表わされる。
ステツプ 3
形成された 2本鎖ヌクレオチドをエタノール沈殿により回収し、 1 mMエチレンジアミン四酢酸、 1 mMエチレングリコール一ビス ( 2—アミノエチルエーテル） 四酢酸 (=ダリコールエーテルジァ ミン四酢酸） 、 1 mMジチオスレイ ト一ル、 1 0mM4— （2—ヒ ドロキシェチル) ピぺラジン— 1一エタンスルホン酸一水酸化力リ ゥム （ H 7. 4) の溶液に入れ、 3—メチルアデニン DNAダリ コシダーゼ Π型 （Trevigen社） を最終濃度 0. 2 u Z /x 1 になるよ うに添加し （総量 1 0 0 1 ) 、 3 7 °Cで一昼夜反応させることに より、 ヒポキサンチンを持ったデォキシリポースのグリコシド結合 部分を加水分解して、 MYH 1の 3 '末端にアルデヒド基を付与し た。 この MYH 1は （配列 1) — CHOで表わされる。
ステップ 4
MYH 1の末端にアルデヒド基を持った 2本鎖ヌクレオチドを、 5 0 mM 4 - ( 2—ヒド口キシェチル) ピぺラジン一 1ーェタン スルホン酸一水酸化ナトリウム （pH 7. 2 ) の溶液に入れ、 修飾 物質としてのァミノォキシメチルカルポニルヒドラゾン一 C y 5を 最終濃度 240 Mになるよう添加し （総量 1 0 0 1 ) 、 室温で 一昼夜反応させることにより、 MYH 1の 3 '末端のアルデヒド基 と C y 5のァミンとの間でシッフ塩基を形成させた。 この MYH 1 は （配列 1) 一 CHHNO CHNHNH— C y 5で表わされる。 各ステップのヌクレオチド鎖を 1 6 %ポリアクリルアミ ドゲル電 気泳動 ( 9 0 mMトリス—ホウ酸 · 2 mMエチレンジアミン四酢酸 緩衝液） で追跡した結果を図 1 1に示す。 ヌクレオチド鎖は、 S Y B R G o 1 d (Molecular Probes社） により染色した。 図中の Mは 分子量マ一力一を示し、 2 0 b p、 3 0 b p、 5 0 b p、 1 0 0 b pはそれぞれ、 2本鎖ヌクレオチドの 2 0塩基対、 3 0塩基対、 5 0塩基対、 1 0 0塩基対の泳動位置を示している。
レーン 1のバンドは被修飾ヌクレオチド鎖 ( M Y H 1 ) を示し ； レーン 2のバンドは相補的ヌクレオチド鎖 （MYH l -B amH I ) を示し ； レーン 3において 3 0塩基対程度の位置に出現したパンド は、 ステップ 1で形成された部分的 2本鎖ヌクレオチドを示し ； レ —ン 4における、 レーン 3に比べて移動度が若干遅いバンドは、 ス テツプ 2で形成された 2 9塩基対の完全 2本鎖ヌクレオチドを示 し ； レーン 5における、 レ一ン 4に比べて移動度が若干速いバンド は、 アルデヒド基が MYI-I 1に付与された 2本鎖ヌクレ才チドを示 し ； レーン 6におけるバンドは、 修飾物質で M YH 1が修飾された 2本鎖ヌクレオチドを示す。
レ一ン 5とレーン 6 との間には移動度の有意な差は認められない が、 電気泳動後の各レーンの 2本鎖ヌクレオチドを S o u t h e r nの方法 （J.Mol.Biol.、 98 巻、 503 頁、 1975 年） でナイロン膜 (Schleicher & Scliuell 社） に転写し、 西洋ヮサビペルォキシダ —ゼ標識した抗シァニン抗体 （Rockland 社） を利用して、 ルミノ —ル反応による化学発光の有無をフィルム（商品名 HyperfilmECL、 Amersham Biosciences社） で調べたところ、 フィルムの露光はレ ーン 6の 2本鎖ヌクレ才チドによってのみ起こった（レーン 6 一 )。 この結果は、 レーン 6の 2本鎖ヌクレオチドに、 西洋ヮサビペルォ キシダ一ゼ標識した抗シァニン抗体が結合していること、 つまり、 前記抗体が結合可能なァミノォキシメチルカルポニルヒドラゾンー C y 5が M Y H 1に結合していることを示す。
修飾物質であるアミノ才キシメチルカルポニルヒドラゾン一 C y 5 (シァニン系色素） は、 C y 5 — ヒ ド ラジン （ Amei'sham Biosciences社）を出発物質として、イデら（Ide et al.、 Biochemistry、 32 巻、 8276 頁、 1993 年） 及びグル一バーら （Gruber et al.、 Bioconjugate Chemistry 11巻、 161頁、 2000年） の方法に準じ て、 以下のようにして合成し、 精製した。
-40-
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000041_0002
1 mM C y 5—ヒドラジンと 3 mM 第三ブトキシカルポニル アミ ノォキシ酢酸 （ t — B o c —NH—〇一 CH2 C〇〇H)
(Fluka社） とを、 3mM N, N '—ジシクロへキシルカルポジ イミ ド （D C C) と 3mM 1—ヒドロキシー 1 H—ベンゾチアゾ ール （HOB t ) との存在下 （総量 3 0 0 I ) 、 4 °Cで一昼夜反 応させて縮合させ、 この反応混合物を濃縮した後、 50 %トリフル ォロ酢酸 （TFA) ( 2 0 0 0 1 ) を添加し、 室温で 1時間反応 させることにより、 縮合物の第三ブトキシカルポニル基 （ t一 B o c ) を切断し、 最後に反応物混合物を 5 %N, N '—ジイソプロピ ルェチルアミン （D I P E A) で中和し、 C 8シリカゲルカラムに て精製することにより、 目的の化合物を得た。 収率 1 3. 4 %。 以上のように、 本発明によれば、 1本鎖ヌクレオチド、 および 2 本鎖ヌクレオチドの内の選択した一方あるいは双方のヌクレオチド 鎖の 3 '末端を、 ヌクレオチド鎖の鎖長に関わらず修飾物質で直接 に修飾することができる。 特定の塩基として、 主鎖部分に存在しな い塩基、 たとえば、 本来は遺伝子として存在せず、 P CR増幅の際 等にもヌクレオチド鎖に取り込まれない塩基を選択することで、 主 鎖部分の分解を回避できる。 ヌクレオチド鎖 （主鎖部分） の塩基構 成や鎖長に関わらず、 ヌクレオチド鎖の 3 '末端側を直接的に簡便に、 任意の修飾物質で、 定量的、 安定的に修飾できる方法である。
よって、 目的とする遺伝子情報を有したヌクレオチド鎖を限定し て、 ラベル化、 標識化可能であるとともに、 ヌクレオチド鎖の固定 化を目的とする場合には、 修飾物質をリンカ一として安定、 強固に 固定化することが可能であり、 遺伝子解析の擬似結果を防止できる 産業上の利用可能性
本発明のヌクレオチド鎖修飾方法は、 修飾対象のヌクレオチド鎖 の 3 '末端を、 ヌクレオチド鎖が 1本鎖であるか 2本鎖であるかに 関わらず、 任意の修飾物質で、 定量的、 安定的に修飾することが可 能であり、 ヌクレオチド鎖のラベル化、 標識化、 固定化等を要する 遺伝子解析などに有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 特定の塩基を有したヌクレオチド配列が 3 '側に存在する修飾 対象のヌクレオチド鎖に、 前記特定の塩基を含んだヌクレオチドに 特異的な分解酵素を作用させて、 前記修飾対象のヌクレオチド鎖の 3 '末端に所望の修飾物質に対して結合能を有する官能基を付与し、 前記官能基を有したヌクレオチド鎖の 3 '末端に前記修飾物質を結 合させるヌクレオチド鎖修飾方法。
2 . 特定の塩基を有したヌクレオチド配列が、 主鎖となすヌクレ ォチド鎖の 3 '側に位置し、前記特定の塩基が前記主鎖に存在しない 塩基である請求項 1記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
3 . 特定の塩基を有したヌクレオチド配列を、 主鎖となすヌクレ ォチド鎖の 3 '側に付加する請求項 1 または請求項 2のいずれかに 記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
4 . 特定の塩基を有したヌクレオチド配列を、 テーリング法によ り付加する請求項 3記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
5 . 修飾対象とする 1本鎖ヌクレオチドに、 当該ヌクレオチド鎖 の 3 '末端領域に相補的な配列を 3 '末端領域に有するヌクレオチ ド鎖をァニールし、 前記修飾対象のヌクレオチド鎖の 3 '側に特定 の塩基を含んだ相補的ヌクレオチド配列を付加する請求項 3記載の ヌクレ才チド鎖修飾方法。
6 . 少なく とも一方のヌクレオチド鎖を修飾対象とする 2本鎖ヌ クレオチドを、 修飾対象のヌクレオチド鎖の 3 '末端領域の塩基配 列を特異的に認識する制限酵素で切断し、 切断した修飾対象のヌク レオチド鎖の 3 '側に特定の塩基を含んだ相補的ヌクレオチド配列 を付加する請求項 3記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
7 . 2本鎖ヌクレオチドの少なくとも一方である修飾対象のヌク レオチド鎖の 3 '末端側に、 特定の塩基を含んだヌクレオチド配列 を 5 '末端領域に有した 2本鎖ヌクレオチドを D N Aリガーゼで接 合し、 接合したヌクレオチド鎖の前記特定の塩基よりも 3 '末端側 の塩基配列を特異的に認識する制限酵素で切断することにより、 前 記修飾対象のヌクレオチド鎖の 3 '側に特定の塩基を含んだヌクレ ォチド配列を付加する請求項 3記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
8 . ヌクレオチド配列の付加は、 D N Aポリメラーゼを用いてヌ クレオチドを取り込むことにより行う請求項 5または請求項 6のい ずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
9 . 特定の塩基を有したヌクレ才チド配列が存在するヌクレオチ ド鎖が、 化学合成されたヌクレオチド鎖である請求項 1記載のヌク レオチド鎖修飾方法。
1 0 . 分解酵素を作用させるに先だって、 特定の塩基と相補的な 塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを添加する請求項 1記載のヌ クレオチド鎖修飾方法。
1 1 . 修飾対象のヌクレオチド鎖の 3 '末端に付与する官能基が アルデヒド基である請求項 1記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
1 2 . 分解酵素として D N Aグリコシダーゼを使用して修飾対象 のヌクレオチド鎖の 3 '末端にアルデヒド基を付与する請求項 1記 載のヌクレオチド鎖修飾方法。
1 3 . 特定の塩基がヒポキサンチンであり、 分解酵素として 3— メチルアデニン D N Aグリコシダ一ゼを使用して修飾対象のヌクレ ォチド鎖の 3 '末端にアルデヒド基を付与する請求項 1記載のヌク レオチド鎖修飾方法。
1 4 . 修飾物質が、 ヌクレオチド鎖の 3 '末端に付与される官能 基と結合を形成するアミノ基を有する請求項 1記載のヌクレオチド 鎖修飾方法。
1 5 . 修飾物質が、 ヌクレオチド鎖をラベル化、 標識化する物質 である請求項 1または請求項 1 4のいずれかに記載のヌクレオチド 鎖修飾方法。
1 6 . 修飾物質が、 蛍光性物質、 ビタミン、 脂質、 アミノ酸、 ォ リゴペプチド、 タンパク質または、 生体外因性物質である請求項 1 5記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
7 . 修飾物質が、 遺伝子解析のための基板への結合能を有した 物質である請求項 1または請求項 1 4のいずれかに記載のヌクレオ チド鎖修飾方法。
1 8 . 修飾物質が、 アミノアルカンチオールまたはアミノシラン カツプリング化合物である請求項 1 7記載のヌクレオチド鎖修飾方
PCT/JP2004/009524 2003-06-30 2004-06-29 ヌクレオチド鎖修飾方法 WO2005014808A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/554,495 US20070077629A1 (en) 2003-06-30 2004-06-29 Method for modifying nucleotide chain
EP04746993A EP1647592B1 (en) 2003-06-30 2004-06-29 Method of modifying nucleotide chain
DE602004019926T DE602004019926D1 (de) 2003-06-30 2004-06-29 Verfahren zur modifizierung einer nukleotidkette
CA2517167A CA2517167C (en) 2003-06-30 2004-06-29 Method for modifying nucleotide chain
US12/720,482 US20100291637A1 (en) 2003-06-30 2010-03-09 Method for modifying nucleotide chain

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003186151A JP4518754B2 (ja) 2003-06-30 2003-06-30 ヌクレオチド鎖修飾方法
JP2003-186151 2003-06-30
JP2004187133A JP4383265B2 (ja) 2004-06-25 2004-06-25 ヌクレオチド鎖修飾方法
JP2004-187133 2004-06-25

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/720,482 Continuation-In-Part US20100291637A1 (en) 2003-06-30 2010-03-09 Method for modifying nucleotide chain

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005014808A1 true WO2005014808A1 (ja) 2005-02-17

Family

ID=34137878

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/009524 WO2005014808A1 (ja) 2003-06-30 2004-06-29 ヌクレオチド鎖修飾方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20070077629A1 (ja)
EP (1) EP1647592B1 (ja)
KR (1) KR100683025B1 (ja)
AT (1) ATE425250T1 (ja)
CA (1) CA2517167C (ja)
DE (1) DE602004019926D1 (ja)
WO (1) WO2005014808A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022156117A1 (zh) * 2021-01-22 2022-07-28 南京大学 一种利用糖苷酶和氧胺化合物修饰dna的方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8129115B2 (en) 2006-06-06 2012-03-06 Panasonic Corporation Method of modifying nucleotide chain

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989006698A1 (en) * 1988-01-12 1989-07-27 Boehringer Mannheim Gmbh Process for detecting nucleic acids
WO1999054501A1 (en) * 1998-04-22 1999-10-28 Enterprise Ireland Trading As Bioresearch Ireland A method for the characterisation of nucleic acid molecules involving generation of extendible upstream dna fragments resulting from the cleavage of nucleic acid at an abasic site
WO2000058329A1 (en) * 1999-03-29 2000-10-05 Goldsborough, Andrew Cleavage of nucleic acid from solid supports
WO2002036821A2 (en) * 2000-11-03 2002-05-10 University College Cork - National University Of Ireland, Cork; Method for the amplification and optional characterisation of nucleic acids
WO2003012100A2 (en) * 2001-07-31 2003-02-13 Direvo Biotech Ag Method for the production of nucleic acids consisting of stochastically combined parts of source nucleic acids
JP2003246794A (ja) * 2002-02-26 2003-09-02 Matsushita Kotobuki Electronics Industries Ltd ヌクレオチド鎖修飾方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5200313A (en) * 1983-08-05 1993-04-06 Miles Inc. Nucleic acid hybridization assay employing detectable anti-hybrid antibodies
US4828979A (en) * 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5800992A (en) * 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
CA2255774C (en) * 1996-05-29 2008-03-18 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
AU762888B2 (en) * 1997-02-12 2003-07-10 Us Genomics Methods and products for analyzing polymers
WO2000036151A1 (en) * 1998-12-14 2000-06-22 Li-Cor, Inc. A heterogeneous assay for pyrophosphate detection
US6586178B1 (en) * 1999-03-05 2003-07-01 Tosoh Corporation Nucleic acid probe
US6924104B2 (en) * 2000-10-27 2005-08-02 Yale University Methods for identifying genes associated with diseases or specific phenotypes
JP2003024694A (ja) * 2001-07-12 2003-01-28 Misa Sakooka 脇や袖も早く乾く洗濯用ハンガー
EP1456409B1 (en) * 2001-11-28 2010-02-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Parallel polymorphism scoring by amplification and error correction
US20040137456A1 (en) * 2002-04-04 2004-07-15 Hiroki Yokota Method for identifying and characterizing individual dna molecules
JP4551216B2 (ja) * 2002-05-17 2010-09-22 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド 核酸の断片化、標識および固定化の方法
AU2002329063A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-23 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for genotyping thymidylate synthase gene
US7354706B2 (en) * 2003-09-09 2008-04-08 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event
WO2005047521A2 (en) * 2003-11-10 2005-05-26 Investigen, Inc. Methods of preparing nucleic acid for detection

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989006698A1 (en) * 1988-01-12 1989-07-27 Boehringer Mannheim Gmbh Process for detecting nucleic acids
WO1999054501A1 (en) * 1998-04-22 1999-10-28 Enterprise Ireland Trading As Bioresearch Ireland A method for the characterisation of nucleic acid molecules involving generation of extendible upstream dna fragments resulting from the cleavage of nucleic acid at an abasic site
WO2000058329A1 (en) * 1999-03-29 2000-10-05 Goldsborough, Andrew Cleavage of nucleic acid from solid supports
WO2002036821A2 (en) * 2000-11-03 2002-05-10 University College Cork - National University Of Ireland, Cork; Method for the amplification and optional characterisation of nucleic acids
WO2003012100A2 (en) * 2001-07-31 2003-02-13 Direvo Biotech Ag Method for the production of nucleic acids consisting of stochastically combined parts of source nucleic acids
JP2003246794A (ja) * 2002-02-26 2003-09-02 Matsushita Kotobuki Electronics Industries Ltd ヌクレオチド鎖修飾方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TAKAHASHI T.: "In situ hybridization no tameno oligonucleotide probe dai 3 kai oligonucleotide probe no hihoshasei hyoshiki", BIO. IND., vol. 14, no. 4, 1997, pages 26 - 45, XP002996265 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022156117A1 (zh) * 2021-01-22 2022-07-28 南京大学 一种利用糖苷酶和氧胺化合物修饰dna的方法

Also Published As

Publication number Publication date
ATE425250T1 (de) 2009-03-15
KR20060021288A (ko) 2006-03-07
US20070077629A1 (en) 2007-04-05
EP1647592A1 (en) 2006-04-19
DE602004019926D1 (de) 2009-04-23
CA2517167A1 (en) 2005-02-17
CA2517167C (en) 2010-08-03
EP1647592A4 (en) 2006-06-28
EP1647592B1 (en) 2009-03-11
KR100683025B1 (ko) 2007-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102085242B1 (ko) 표적 핵산 검출을 위한 방법 및 조성물
EP1877415B1 (en) New labelling strategies for the sensitive detection of analytes
EP2028272B1 (en) Method of modifying nucleotide chain
Borsenberger et al. Diene-modified nucleotides for the Diels–Alder-mediated functional tagging of DNA
WO2003078623A1 (fr) Molecule fonctionnelle et son procede de production
US20090221429A1 (en) Method for Detecting Target Nucleic Acid with Specific Base Sequence and Set of Nucleic Acids for Detection
US9005892B2 (en) Labelling strategies for the sensitive detection of analytes
JP4518754B2 (ja) ヌクレオチド鎖修飾方法
WO2005014808A1 (ja) ヌクレオチド鎖修飾方法
Wolfe et al. Synthesis and polymerase incorporation of 5′‐amino‐2′, 5′‐dideoxy‐5′‐N‐triphosphate nucleotides
JP4383265B2 (ja) ヌクレオチド鎖修飾方法
US20100291637A1 (en) Method for modifying nucleotide chain
JP2003246794A (ja) ヌクレオチド鎖修飾方法
JP2006006179A5 (ja)
JPH08506967A (ja) ３’−アミノ置換オリゴヌクレオチドの酵素による連結反応

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2517167

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004746993

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020057017735

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007077629

Country of ref document: US

Ref document number: 10554495

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004811356X

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020057017735

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004746993

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10554495

Country of ref document: US