JP4518754B2 - ヌクレオチド鎖修飾方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヌクレオチド鎖修飾方法に関するものであり、特にヌクレオチド鎖の３´末端を修飾物質で直接的に修飾して、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化、固定化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、遺伝子解析において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸等のヌクレオチド鎖をラベル化、標識化するための修飾物質として、放射性同位元素が採用されてきたが、半減期による取扱期間の制限、取扱場所の制限、被爆の問題、廃棄の問題等があるため、その利用は減少傾向にある。近年では、放射性同位元素に代替する修飾物質として、フルオレセイン等の蛍光物質あるいはビオチン等を用いて、ヌクレオチド鎖を修飾し、ラベル化、標識化する方法が汎用されるようになっている。ヌクレオチド鎖を修飾する方法は、５´末端修飾法、３´末端修飾法、内部修飾法の３つに大別できる。
【０００３】
５´末端修飾法としては、５´末端のリン酸基を介してビオチンで修飾する方法が考案されており（例えば、非特許文献１参照）、さらに、ビオチンとアビジンとの高親和性を利用して、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素で修飾することにより、これら酵素の化学発光を用いて遺伝子解析を高感度化する方法が報告されている（例えば、非特許文献２〜３参照）。ヌクレオチドの５´末端のリン酸基を介した修飾方法は、これら以外にも多数提案されている（例えば、特許文献１及び非特許文献４〜１３参照）。
【０００４】
しかし５´末端のリン酸基を介した修飾方法においては、ヌクレオチド鎖への修飾物質の修飾量は基本的に１つであり、その一方で高感度化を実現するために使用するアルカリフォスファターゼはヌクレオチドの５´末端のリン酸基を解離させるので、ヌクレオチド鎖の５´末端修飾とアルカリフォスファターゼ利用との組み合せは基本的に避ける必要がある。またアルカリフォスファターゼは、空気中に浮遊する細菌中にも存在するので、遺伝子解析中に夾雑した場合には、５´末端のリン酸基に結合した修飾物質が解離しやすい等、修飾状態に安定性を欠くのみならず、バックグランドノイズの要因になるという課題がある。
【０００５】
ヌクレオチドの３´末端修飾法としては、予めラベル化、標識化処理を施したデオキシヌクレオチド三リン酸あるいはジデオキシヌクレオチド三リン酸を合成し（例えば、非特許文献１４及び特許文献２参照）、このラベル化、標識化ヌクレオチドをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりヌクレオチド鎖の３´側に付加させるテーリング法が開発されている（例えば、特許文献３及び非特許文献１５〜１８参照）。
【０００６】
このような３´末端修飾法は、５´末端修飾法に比べて修飾物質の保持安定性が高く、汎用されているが、デオキシヌクレオチド三リン酸あるいはジデオキシヌクレオチド三リン酸のラベル化、標識化処理が煩雑であるため、任意のラベル化、標識化処理体は誰にでも容易に得られるものではなく、結果として修飾物質の種類が限定される。また、テーリング段階でヌクレオチド鎖の３´側に不要なヌクレオチド配列が付加するため、特にデオキシヌクレオチド三リン酸を利用した場合に反応条件によってヌクレオチドの付加数がランダムになるため（例えば、非特許文献１９参照）、遺伝子解析の高感度化は実現できるものの、定量性に課題がある。また３´側に付加した不要な塩基配列は、遺伝子解析のハイブリダイゼーションの際にミスマッチの要因となる課題がある。
【０００７】
他の３´末端修飾法として、化学合成ヌクレオチド鎖を作成する合成初期に、３´末端のヌクレオチドに直接的に、ラベル化、標識化のための修飾物質を結合させる方法もあり、ヌクレオチド鎖への修飾物質の高い保持安定性を実現している。しかし化学合成で得られるヌクレオチド鎖のヌクレオチド数は、合成副産物、収率等の合成能力の関係で１００程度であり、ここで使用されている３´末端への直接的な修飾物質の結合方法を、生体抽出及びＰＣＲ等で増幅したヌクレオチド数１００を超えるヌクレオチド鎖の３´末端修飾に適用することはできない。つまり、修飾されるヌクレオチド鎖の鎖長に制限がある、という課題がある。
【０００８】
内部修飾法としては、ヌクレオチド鎖を複製させる反応の際に、ラベル化、標識化のための修飾物質で予め修飾処理を施したデオキシヌクレオチド三リン酸をヌクレオチド鎖内に取り込ませることで、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化するランダムプライマー法あるいはニックトランスレーション法が開発されている（例えば、特許文献４及び非特許文献２０〜２２参照）。
【０００９】
これらの方法は、遺伝子増幅反応であるポリメラーゼ連鎖反応いわゆるＰＣＲ法（例えば、特許文献５〜８及び非特許文献２３〜２５参照）と組み合わせることで、ヌクレオチド鎖の増幅とラベル化、標識化とを同時に行なうことが可能であり（例えば、非特許文献２６参照）、遺伝子解析の高感度化をもたらし、定量性も報告されており、遺伝子マイクロアレイに代表される遺伝子解析のハイスループット化を実現している（例えば、特許文献９及び非特許文献２７〜２９参照）。
【００１０】
これらランダムプライマー法、ニックトランスレーション法及びＰＣＲ法においては、ヌクレオチドの取り込み効率、修飾ヌクレオチド合成等の点から、チミジン塩基に替えてウラシル塩基あるいは予め蛍光物質などでラベル化、標識化したウラシル塩基を取り込んだヌクレオチド鎖の形成が繁用されている。さらにウラシル塩基に代替する利点として、ＰＣＲ法の際に、反応混液中に夾雑する外因性汚染由来のヌクレオチド鎖にウラシル塩基を取り込ませ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを作用させることで、汚染由来のヌクレオチド鎖の増幅を防止する方法もある（例えば、特許文献１１〜１３及び非特許文献３１〜３３参照）。
【００１１】
しかしこれらの方法は、ヌクレオチド鎖内へのラベル化、標識化されたヌクレオチドの取り込み数が１０〜２，３０程度（例えば、非特許文献３０参照）とランダムであり、完全な定量化には課題がある。また３´末端修飾法であるテーリング法と同様に、ヌクレオチド鎖内に取り込ませるためのデオキシヌクレオチド三リン酸のラベル化、標識化処理が煩雑であるため、任意のラベル化、標識化処理体は誰にでも容易に得られるものではなく、結果として修飾物質の種類が限定される。さらに、ヌクレオチド鎖内に修飾物質が取り込まれているため、遺伝子解析のハイブリダイゼーションの際に、つまりヌクレオチド鎖の二本鎖形成の際に、取り込まれた修飾物質による立体障害を回避できない課題がある。
【００１２】
ヌクレオチド鎖の修飾は、ラベル化、標識化の他に、ヌクレオチド鎖を基板に固定化するために行なわれている。ヌクレオチド鎖の５´末端あるいは３´末端にアミノ基、アルデヒド基等の官能基を持たせる修飾処理を施し、ガラス、シリコンなどの基板の表面を、ヌクレオチド鎖の末端がアミノ基である時はアルデヒド基あるいはエポキシ基になるように、またヌクレオチド鎖の末端がアルデヒド基である時はアミノ基になるように、処理を施すことにより、ヌクレオチド鎖を基板に固定化するのである。このようにして配列の異なるヌクレオチド鎖を基板単位面積当たり多数固定化することにより、遺伝子解析マイクロアレイを実現している。
【００１３】
基板に固定化したヌクレオチド鎖を安定に保持するためには、上述したようにヌクレオチド鎖の３´末端を修飾することにより、アミノ基あるいはアルデヒド基を持たせるのが望ましい。そしてそのために使用可能なヌクレオチド鎖は、化学合成したヌクレオチド鎖のみである。しかしこれも上述したように、化学合成可能なヌクレオチド鎖はヌクレオチド数１００程度に制限されるものであり、そのため、固定化が不安定であっても、５´末端を修飾したヌクレオチド鎖を使用しているのが現状である。
【００１４】
修飾処理を施さずにヌクレオチド鎖を基板へ固定化する方法もある。基板表面を正に帯電するよう表面処理し、ヌクレオチド鎖中の負に帯電しているリン酸基を静電結合させることでヌクレオチド鎖を固定化するか、あるいは基板表面を疎水性にし、ヌクレオチド鎖を吸着結合させている。この方法を利用してヌクレオチド鎖を固定化したマイクロアレイも実現されている。
【００１５】
しかしこの固定化方法では、ヌクレオチド鎖長が長くなるにしたがってヌクレオチド鎖１分子の基板占有率が高くなるため、長鎖のヌクレオチド鎖ほど基板単位面積当たりの固定化量が少なくなる課題がある。そのため、基板単位面積当たりの固定化量を向上させるにはやはり、ヌクレオチド鎖の５´末端あるいは３´末端を、基板へ固定化するための修飾物質で修飾する方法をとることになる。
【００１６】
上述したヌクレオチド鎖のラベル化、標識化、固定化の課題を解決するものとして、ヌクレオチド鎖の３´末端部を直接的に修飾物質で修飾する方法が提案されている（特許文献１０参照）。この方法は、ヌクレオチド鎖の３´側に２つ以上のウラシル塩基を付加させ、付加したウラシルのグリコシド結合をウラシルＤＮＡグリコシラーゼで分解して、３´末端にアルデヒド基を形成させ、このアルデヒド基とアミノ基を有する修飾物質とを共有結合させることにより、ヌクレオチド鎖の３´末端を修飾する。
【００１７】
【特許文献１】
特許１７０６２８９号公報
【００１８】
【特許文献２】
特開昭６１−１１５０９４号公報
【００１９】
【特許文献３】
特公平７−３１１９４号公報
【００２０】
【特許文献４】
特表２０００−５０８７０９号公報
【００２１】
【特許文献５】
特許１８１４７１３号公報
【００２２】
【特許文献６】
特許２０９３７３０号公報
【００２３】
【特許文献７】
特許２０９３７３１号公報
【００２４】
【特許文献８】
特許２６１３８７７号公報
【００２５】
【特許文献９】
特表平１０−５０３８４１号公報
【００２６】
【特許文献１０】
特開２００３−２４６７９４公報
【００２７】
【特許文献１１】
特許２１０３１５５号公報
【００２８】
【特許文献１２】
特表２０００−５０２２５１号公報
【００２９】
【特許文献１３】
特開平１１−１１３５９９号公報
【００３０】
【非特許文献１】
チュ（Chu B.C.F）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１１巻、６５１３頁、１９８３年
【００３１】
【非特許文献２】
ベック（Beck.S.）、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、２１６巻、１４３頁、１９９２年
【００３２】
【非特許文献３】
ブロンシュタイン（Bronstein.I.）ら、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、２１７巻、３９８頁、１９９３年
【００３３】
【非特許文献４】
アルブス（Alves.A.M.）ら、「テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）」、３０巻、３０８９頁、１９８９年
【００３４】
【非特許文献５】
コクッザ（Cocuzza.A.J.）、「テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）」、３０巻、６２８７頁、１９８９年
【００３５】
【非特許文献６】
タイセン（Theisen.P.）ら、「テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）」、３３巻、５０３３頁、１９９２年
【００３６】
【非特許文献７】
ケンプ（Kempe.T.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１３巻、４５頁、１９８５年
【００３７】
【非特許文献８】
スミス（Smith.L.M.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１３巻、２３９９頁、１９８５年
【００３８】
【非特許文献９】
アンソージュ（Ansorge.W.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１５巻、４５９３頁、１９８７年
【００３９】
【非特許文献１０】
クック（Cook.A.F.）、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１６巻、４０７７頁、１９８８年
【００４０】
【非特許文献１１】
ロジェ（Roget.A）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１７巻、１９８９年
【００４１】
【非特許文献１２】
ミシウラ（Misiura.K.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１８巻、４３４５頁、１９９０年
【００４２】
【非特許文献１３】
ピールス（Pieles.U.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１８巻、４３５５頁、１９９０年
【００４３】
【非特許文献１４】
ランガー（Langer.P.R.）ら、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA」、７８巻、６６３３頁、１９８１年
【００４４】
【非特許文献１５】
ロイコウドリー（Roychoudhury.R.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、３巻、１０１頁、１９７６年
【００４５】
【非特許文献１６】
ビンセント（Vincent.C.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１０巻、６７８７頁、１９８２年
【００４６】
【非特許文献１７】
ヨウサフ（Yousaf.S.I.）ら、「ジーン（Gene）」、３巻、３０９頁、１９８４年
【００４７】
【非特許文献１８】
シュミッツ（Schmitz.G.G.）ら、「アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）」、１９２巻、２２２頁、１９９１年
【００４８】
【非特許文献１９】
ジャクソン（Jackson.D.A.）ら、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA」、６９巻、２９０５頁、１９７２年
【００４９】
【非特許文献２０】
ファインバーグ（Feinberg.A.P）ら、「アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）」、１３２巻、６頁、１９８３年
【００５０】
【非特許文献２１】
ファインバーグ（Feinberg.A.P）ら、「アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）」、１３７巻、２６６頁、１９８４年
【００５１】
【非特許文献２２】
リグビー（Rigby.P.W.J）ら、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、１１３巻、２３７頁、１９７７年
【００５２】
【非特許文献２３】
ミュリス（Mullis.K.B.）ら、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、１５５巻、３３５頁、１９８７年
【００５３】
【非特許文献２４】
サイキ（Saiki.R.）、「サイエンス（Science）」、２３９巻、４８７頁、１９８８年
【００５４】
【非特許文献２５】
シーバート（Siebert.P.D.）ら、「ネイチャー（Nature）」、３５９巻、５５７頁、１９９１年
【００５５】
【非特許文献２６】
デイ（Day.P.J.R.）ら、「バイオケミカル・ジャーナル（Biochem.J.）、２６７巻、１１９頁、１９９０年
【００５６】
【非特許文献２７】
シェナ（Schena.M.）ら、「サイエンス（Science）」、２７０巻、４６７頁、１９９５年
【００５７】
【非特許文献２８】
シャロン（Schalon.D.）ら、「ゲノム・リサーチ（Genome Res.）」、６巻、６３９頁、１９９６年
【００５８】
【非特許文献２９】
核酸マイクロアレイ特集、「ネーチャージェネティックス（Nature Genet.）」、２１巻 Supplement、１月、１９９９年
【００５９】
【非特許文献３０】
アマーシャム・バイオサイエンス（AmershamBiosciences）社ウェブサイト、［２００３年４月１４日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/microarrays_labelling%5Cmicroarrays_labelling_cyscribe_postlabelling?OpenDocument&hometitle=microarrays＞
【００６０】
【非特許文献３１】
ロンゴ（Longo.M.C.）ら、「ジーン（Gene）」、９３巻、１２５頁、１９９０年
【００６１】
【非特許文献３２】
ソーントン（Thornton.C.G.）ら、「バイオテクニクス（BioTechniques）」、１３巻、１８０頁、１９９２年
【００６２】
【非特許文献３３】
ソベック（Sobek.H.）ら、「ＦＥＢＳレターズ（FEBS Lett.）」、３８８巻、１頁、１９９６年
【００６３】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、ヌクレオチド鎖の修飾方法には、５´末端修飾法、３´末端修飾法、及び内部修飾法の３種類があるが、それぞれに一長一短があるため、利用者は、利用目的に応じてそれぞれの方法を取捨選択しなければならないという負担がある。
【００６４】
この問題を解決するものとして特許文献１０記載の方法が提案されており、ヌクレオチド鎖の鎖長に関係なく、ヌクレオチド鎖の３´側を直接的に簡便に任意の修飾物質で修飾して、安定に保持可能な方法であるが、その一方で、付加したウラシルのグリコシド結合をウラシルＤＮＡグリコシラーゼにより分解する原理から理解されるように、ヌクレオチド鎖中にウラシル塩基の配列が存在しない時しか実施できないという制約を有している。
【００６５】
ところが、上述したように、ランダムプライマー法、ニックトランスレーション法及びＰＣＲ法においては、チミジン塩基に替えてウラシル塩基を取り込んだヌクレオチド鎖の形成が繁用されている。またＰＣＲ法の際に、汚染由来のヌクレオチド鎖の増幅を防止するために用いるウラシル塩基が、増幅を目的するヌクレオチド鎖にも取り込まれる。したがって、このようにウラシル塩基を取り込んだヌクレオチド鎖に対して特許文献１０記載の方法を適用すると、３´側に付加したウラシルのみならずヌクレオチド鎖中のウラシルにもウラシルＤＮＡグリコシラーゼが作用し、ヌクレオチド鎖自体が分解されてしまう。
【００６６】
本発明は上記問題を解決するもので、ヌクレオチド鎖の塩基構成に関わらず、ヌクレオチド鎖の分解を伴うことなく、３´末端部に修飾物質を直接的に修飾できるヌクレオチド鎖修飾方法を提供することを目的とする。
【００６７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明は、ヒポキサンチンを有したヌクレオチド配列が修飾対象のヌクレオチド鎖の３´側に形成され、前記ヒポキサンチンが前記修飾対象のヌクレオチド鎖に存在せず、前記ヒポキサンチンを有したヌクレオチドに３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼを作用させることにより、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の分解を回避し、配列情報を保持した状態で３´末端に修飾物質に対してアルデヒド基を形成し、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端に直接に前記修飾物質を結合させるヌクレオチド鎖修飾方法を提供する。
【００６８】
酵素基質となる特定の塩基を有したヌクレオチド配列が３´側に存在するヌクレオチド鎖を修飾対象とすることにより、前記ヌクレオチド配列部分のみを分解して、所望の修飾物質と反応して結合する官能基を形成するのである。このようにすることにより、ヌクレオチド鎖を修飾物質で直接に修飾することができ、簡便にラベル化、標識化可能となるとともに、ヌクレオチド鎖の固定化を目的とする場合には、修飾物質をリンカーとして安定、強固な固定を行なうことが可能となる。
【００６９】
前記特定の塩基が前記修飾対象のヌクレオチド鎖に存在しないことが必要である。このことにより、分解酵素が作用しても主鎖部分が分解されるのを回避することができ、主鎖部分の配列情報が完全に保持された状態を維持可能となる。ヌクレオチド鎖の配列情報を定義するには、少なくとも１０塩基前後のヌクレオチド配列を有することが望ましい。
【００７０】
反応性を有する官能基として、アルデヒド基を形成することが必要である。
特定の塩基がヒポキサンチンであり、分解酵素が３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼであることが必要である。特定の塩基および分解酵素は種々の組み合わせが可能であるが、たとえばウラシル塩基のヌクレオチド鎖への組み込みは、遺伝子解析の様々な手法の中で汎用されているため、これを特定の塩基として利用することは望ましくない。汎用頻度の低いヒポキサンチン塩基とその分解酵素である３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼを利用することで、ヌクレオチド鎖の３´末端修飾を実施する際の利用者の利便性を大幅に向上することが可能となる。また、ヌクレオチド鎖の塩基の構成や鎖長に関わらず、ヌクレオチド鎖の３´末端側を直接的に簡便に、任意の修飾物質で、定量的、安定的に修飾することが可能となる。ヌクレオチド鎖内への不必要な塩基配列、修飾された塩基の取り込みを排除し、ヌクレオチド鎖の３´末端に限定して修飾物質で修飾できる方法である。
【００７１】
特定の塩基を有したヌクレオチド配列は、テーリング法により付加することができる。酵素基質となる塩基を持ったヌクレオチドを意図的に付加させておく方法である。
【００７２】
分解酵素を作用させるに先だって、特定の塩基と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを添加するのが好ましい。２本のヌクレオチドの塩基間に相補的結合を生じさせることにより、酵素の基質特異性を高めることができ、反応効率を向上させることが可能となる。
【００７３】
修飾物質として、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化可能な物質を使用できる。これにより、修飾されたヌクレオチド鎖を、遺伝子解析における検出プローブあるいはターゲットとして使用可能である。
【００７４】
また修飾物質として、遺伝子解析のための基板への結合能を有した物質を使用できる。これにより、修飾されたヌクレオチド鎖を、検出プローブあるいはターゲットとして、基板に安定に固定化することが可能となる。
【００７５】
ヌクレオチド鎖の３´末端の官能基に反応する修飾物質として、アミノ基を有するものを好適に使用できる。
修飾物質として例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、またはタンパク質を用いることができる。アミノ酸、オリゴペプチド、タンパク質は、アミノ基を有しているため、ヌクレオチド鎖の３´末端のアルデヒド基と融合させることが可能であり、これによりヌクレオチド鎖にアミノ酸、オリゴペプチド、タンパク質が有する機能を付加することができる。
【００７６】
修飾物質として例えば、アミノアルカンチオールまたはアミノシランカップリング化合物を用いることができる。これら化合物は貴金属製、ガラス製あるいは樹脂製の基板に安定に結合可能である。
【００７７】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１を図１に基づき説明する。図中、ｌ、ｍ及びｎは、０または任意の自然数を表わし、Ｂａｓｅは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル等の任意の塩基を示し、Ｈｘはヒポキサンチン塩基を、Ｃｙｔはシトシン塩基をそれぞれ示す。
【００７８】
まず、任意の塩基配列を有するヌクレオチド鎖（Ｉ）と、２´−デオキシイノシン−５´−三リン酸（Ａ）とに、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを作用させることにより、ヌクレオチド鎖（Ｉ）の３´末端に、２´−デオキシイノシン−５´−三リン酸（Ａ）由来のヒポキサンチン塩基配列が付加したヌクレオチド鎖（II）を得る。２´−デオキシイノシン−５´−三リン酸（Ａ）は以下の構造を有する。
【００７９】
【化１】
得られたヌクレオチド鎖（II）に、シトシン塩基を有した数十ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド鎖（Ｂ）をハイブリダイズさせることにより、ヌクレオチド鎖（III ）を得る。
【００８０】
この一部２本鎖となったヌクレオチド鎖（III ）に３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型を作用させ、アルカリ熱処理することにより、ヒポキサンチン塩基を有するヌクレオチドのグリコシド結合を切断し、残存するデオキシリボース−リン酸結合を切断して、３´末端にアルデヒド基を持ったヌクレオチド鎖（IV）を得る。
【００８１】
このヌクレオチド鎖（IV）に、アミノ基を有する修飾物質（Ｈ２Ｎ−Ｒ（Ｒについては後述する））を反応させることにより、ヌクレオチド鎖（IV）と修飾物質とが脱水縮合したシッフ塩基、すなわち、３´末端が修飾物質で直接的に修飾されたヌクレオチド鎖（Ｖ）を得ることができる。
【００８２】
なお、この実施の形態１では、ヒポキサンチン塩基を有するヌクレオチド（Ａ）をテーリングさせ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型を作用させる例を示したが、これに限らず、以下の表１に例示するＤＮＡグリコシラーゼあるいはＤＮＡ修復酵素と各塩基を有するヌクレオチドのテーリングとを組み合せても、同様にしてヌクレオチド鎖の３´末端を修飾物質で直接的に修飾できる。
【００８３】
【表１】
目的とするヌクレオチド鎖が化学合成可能な数十ヌクレオチド鎖長のものであれば、予め特定の塩基の配列を有するヌクレオチド鎖を合成しておくことで、第１段階の反応を省略することも可能である。
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２を図２に基づいて説明する。図中、ｍは、０または任意の自然数を表わし、Ｂａｓｅは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル等の任意の塩基を示す。
【００８４】
上記実施の形態１と同様にして製造した、３´末端にアルデヒド基を持ったヌクレオチド鎖（IV）に対して、蛍光物質として知られるフルオレセインカダベリン（Ｃ）を反応させることにより、ヌクレオチド鎖の３´末端に直接的にフルオレセインカダベリンが結合した修飾ヌクレオチド鎖（VI）を得る。
【００８５】
このようにしてフルオレセインで修飾することにより、ヌクレオチド鎖を蛍光ラベル化（標識化）することができ、このヌクレオチドをハイブリダイゼーションなどの遺伝子解析のためのプローブあるいはターゲットとして利用可能となる。
【００８６】
フルオレセインのほかに、アミノ基を有するテキサスレッド、ローダミン、Ｃｙ３・Ｃｙ５に代表されるシアニン系化合物、ジゴギシゲニン、ビオチン等を用いて同様に、ラベル化、標識化することが可能である。
【００８７】
アミノ酸、ペプチド、タンパク質も、ヌクレオチド鎖への修飾物質として使用可能である。アミノ酸の内、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンは、蛍光性を有するため、ヌクレオチド鎖のラベル化、標識化に使用できる。なおラベル化は、蛍光化合物、染料系化合物等による標識化を言う。蛍光性を有しないアミノ酸やペプチドも、側鎖にフルオレセイン等（以下、標識化合物と言う）を結合させることで、ラベル化、標識化に使用可能である。
【００８８】
アミノ酸が連鎖したペプチドは、その数に応じた側鎖が存在するため、複数の標識化合物を結合させることが可能となる。例えば、リシンが３つ連鎖したトリリシンには側鎖にアミノ基が３つ存在するため、カルボキシル基、スクシンイミド基等を有する標識化合物を任意に合計３つ修飾することが可能となる。
【００８９】
ペプチドに限らず、アミノ基を有するアルキル、アリル、シクロアルカン、芳香族、糖類等の炭化水素類を標識化合物で修飾したものを修飾物質として用いて、ヌクレオチド鎖を修飾することが可能であり、ラベル化、標識化を実現できる。
【００９０】
タンパク質として例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、有色性、蛍光性を有するトランスフェリン、ヘモグロビン、緑色蛍光タンパク、青色蛍光タンパク、エクオリン等を使用すると、ヌクレオチド鎖のラベル化、標識化が可能となり、遺伝子解析、とりわけｉｎ ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーションに有用である。
【００９１】
その他、表面にアミノ基を形成させた金コロイド、銀コロイド等の貴金属コロイド、磁性微粒子、ポリスチレンビーズ等の高分子微粒子に代表される微粒子なども、ヌクレオチド鎖の修飾物質として使用可能である。
（実施の形態３）
本発明の実施の形態３を図３に基づいて説明する。図中、ｍは、０または任意の自然数を表わし、Ｂａｓｅは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル等の任意の塩基を示す。
【００９２】
上記実施の形態１で説明したのと同様にして製造した、３´末端にアルデヒド基を持ったヌクレオチド鎖（IV）に対して、アミノ基を有するチオール、ここでは８−アミノ−１−オクタンチオール（Ｄ）を反応させることにより、ヌクレオチド鎖の３´末端に直接的に８−アミノ−１−オクタンチオール残基が結合した修飾ヌクレオチド鎖（VII ）を得る。
【００９３】
この修飾ヌクレオチド鎖（VII ）を貴金属の基板（Ｅ）に作用させることにより、チオール基と基板（Ｅ）との強固な共有結合を形成させて、ヌクレオチド鎖（VII ′）を基板（Ｅ）に固定化することができる。
【００９４】
このようにすることにより、貴金属を基板として利用する電気化学的測定法、水晶発振子マイクロバランス法、表面プラズモン共鳴法等の測定法を、遺伝子解析に利用することが可能となる。
【００９５】
なお、修飾物質たるアミノ基を有するチオールとして、８−アミノ−１−オクタンチオールを例示したが、ヌクレオチド鎖と結合するアミノ基と貴金属と結合するチオール基とが存在する化合物であれば、特に限定なく使用することができ、アミノ基・チオール基間の炭化水素残基は、直鎖状、分岐鎖状、シクロ環状、アリル鎖状、芳香環状等、種々の形態であってよく、その炭素数、アミノ基の位置等、変更可能である。
【００９６】
貴金属製の基板も、水晶発振子マイクロバランス法、表面プラズモン共鳴法等では、金基板を汎用するが、これに限定されることなく使用することができ、金の他に、白金、銀、銅、パラジウム、インジウム、ニッケル、鉄、アルミニウム、及びそれらの合金等も基板として使用可能である。
【００９７】
修飾物質として、アミノ基を有するシランカップリング化合物を使用してもよく、それにより、ガラス、シリコン、シリカ、アルミナ、マイカ、及びポリスチレン、ナイロン、エポキシ等の高分子樹脂等の基板にヌクレオチド鎖を固定化することが可能となり、従来からの様々な遺伝子解析手法にも適用可能となる。
【００９８】
シランカップリング化合物は、アミノ基とアルコキシ基とを有する化合物であれば、アルカンチオールと同様に、構造等に特に制限なく使用可能である。使用可能なシランカップリング化合物はたとえば、ガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン、ガンマ−アミノプロピルトリメトキシシラン等である。
【００９９】
なお、本来はアミノ基を有しない物質も、アミノ基を有する適当なスペーサーを介することで、ヌクレオチド鎖を修飾可能である。たとえばカルボキシル基を有する物質は、スペーサーとして、１，２−ジアミノエタン、１，６−ジアミノヘキサン等のジアミノ構造を有する物質を介在させることで、ヌクレオチド鎖を修飾可能となる。
【０１００】
さらには、ヒドラジン基、アミノオキシル基、シアノ基を有する物質、あるいはグリニャール試薬の様にハロゲン化マグネシウムを有する物質も、修飾物質として使用可能である。
【０１０１】
【実施例】
以下、具体的な実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
（実施例１）
修飾対象のヌクレオチド鎖として、ヌクレオチド数３０の一本鎖化学合成ヌクレオチド鎖（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社に合成を委託）を用いた。このヌクレオチド鎖は、大腸菌の１６Ｓリボゾームリボ核酸遺伝子の８〜３７位をコードするもので、その塩基配列は５´末端よりａｇａｇｔｔｔｇａｔｃａｔｇｇｃｔｃａｇａｔｔｇａａｃｇｃｔである（配列番号１）。ａ、ｔ、ｇ、ｃはそれぞれデオキシヌクレオチド中の塩基、アデニン、チミン、グアニン、シトシンを示す。
【０１０２】
まず、ヌクレオチド鎖を５μＭになるように、２単位（以下、ｕと略す）／μｌのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１０ｍＭ２´−デオキシイノシン−５´−三リン酸、２ｍＭ塩化コバルト、１ｍＭジチオスレイトール、０．１Ｍカコジル酸カリウム（ｐＨ７．２）の反応液５０μｌ中に混和し、３７℃で４時間反応させて、ヌクレオチド鎖の３´側に、ヒポキサンチン塩基を有するヌクレオチド配列をテーリングさせた。
【０１０３】
このヌクレオチド鎖をエタノール沈殿により回収し、１００μＭのオリゴデオキシシトシン（ヌクレオチド数１８、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ社製）を添加して、ヌクレオチド鎖の３´側にテーリングしたヌクレオチド配列のヒポキサンチン塩基とアニーリングさせた。
【０１０４】
次にヌクレオチド鎖を、０．３ｕ／μｌの３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ社製）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１ｍＭグリコールエーテルジアミン四酢酸、１ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルフォン酸−水酸化カリウム（ｐＨ７．４）の反応液に混和し、３７℃で一昼夜反応させて、ヌクレオチド鎖の３´側にテーリングしたヌクレオチド配列のグリコシド結合を切断した。
【０１０５】
この反応液に０．１Ｍになるように水酸化ナトリウムを添加し、１００℃で５分間加熱して、ヌクレオチド鎖の３´側に残存するリン酸を解離させ、３´末端にアルデヒド基を形成させた。
【０１０６】
このヌクレオチド鎖をエタノール沈殿により回収し、０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）条件下で５ｍＭフルオレセインカダベリン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社製）と混合し、反応液を５０μｌにして、室温で２時間反応させて、ヌクレオチド鎖の３´末端のアルデヒド基とフルオレセインカダベリンに存在するアミノ基との間でシッフ塩基を形成させた。その後に、１ｍｇ／ｍｌになるよう水素化ホウ素ナトリウムを添加し、反応液を１００μｌとし、４℃で一昼夜反応させることにより、シッフ塩基を還元し、結合を安定化させた。
【０１０７】
この修飾プロセスを７モル尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ 第２版 １１．２３頁 １９８９年）により追跡した結果を図４に示す。なお、図中左側の数字と矢印は各塩基数を有するヌクレオチド鎖の泳動位置を示している。ヌクレオチド鎖の検出は、銀染色法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ４巻 ９２頁 １９８３年）に従った。
【０１０８】
レーンＡ、Ｂ及びＣはそれぞれ、分子量マーカー、オリゴデオキシシトシン、及び未処理のヌクレオチド鎖をそれぞれ示している。レーンＤは、ヒポキサンチン塩基を有するヌクレオチド配列が３´側にテーリングしたヌクレオチド鎖を示し、ヌクレオチド数は１００以上に増加している。レーンＥは、オリゴデオキシシトシンがアニーリングしたヌクレオチド鎖を示す。レーンＦは、３´末端にアルデヒド基が形成したヌクレオチド鎖を示し、ヌクレオチド数は３０に減少している。レーンＧは、３´末端がフルオレセインカダベリンで修飾され安定化されたヌクレオチド鎖を示す。
【０１０９】
レーンＤにおいて、ヒポキサンチン塩基を有するヌクレオチドのテーリングが認められず、未反応のヌクレオチド鎖が若干残存しているのが認められるが、これは、テーリング反応時間の延長や、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ添加量の増加等により、容易に解消可能である。
【０１１０】
なお、修飾対象のヌクレオチド鎖のアデニン塩基、グアニン塩基、シトシン塩基にもアミノ基が存在するため、ヌクレオチド鎖内部で反応が生じ、自己重合してしまう可能性もあるが、レーンＦに示す通り、自己重合は生じなかった。しかし必要があれば、ヌクレオチド鎖の化学合成時に用いられるベンゾイル基、イソブチリル基等の適当な保護基で、ヌクレオチド鎖のアミノ基を保護することも可能である。
（実施例２）
実施例１で電気泳動させた各過程のヌクレオチド鎖を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８巻、５０３頁、１９７５年）に従って、ナイロン膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）に転写した。
【０１１１】
ナイロン膜上のヌクレオチド鎖に対して、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼで標識した抗フルオレセイン抗体（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を滴下し、フルオレセインの有無を化学発光法（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＥＣＬ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ）によりフィルム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＨｙｐｅｒｆｉｌｍＥＣＬ）を露光させて検出した。結果を図５に示す。なお、図中左側の数字と矢印は、図４と同様に各塩基数を有するヌクレオチド鎖の位置を示している。
【０１１２】
レーンＡは分子量マーカーを示す。予めフルオレセインラベルした２´，３´―ジデオキシウリジン−５´−三リン酸（ＥｎｚｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）をターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼでテーリング処理したものである。
【０１１３】
レーンＢ〜Ｆでは、発光の検出は認められず、ヌクレオチド鎖はフルオレセインで修飾されていないことがわかる。
レーンＧにおいて、ヌクレオチド数３０のヌクレオチド鎖の発光が検出されており、修飾ヌクレオチド鎖が実際にフルオレセインカバベリンで修飾されていたことがわかる。しかしヌクレオチド数１８のオリゴデオキシシトシンもフルオレセインカバベリンで修飾されている。
【０１１４】
これは、テーリングしたヒポキサンチンのヌクレオチド鎖部分にオリゴデオキシシトシンがランダムにアニールするため、部分的に２本鎖が形成されず、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型が作用しない箇所が存在してしまうためである。
【０１１５】
それにより、わずかなヌクレオチド数のオリゴデオキシヒポキサンチンが生じ、その３´末端にアルデヒド基が形成され、そのアルデヒド基をフルオレセインカダベリンが修飾し、これらの反応中にオリゴデオキシヒポキサンチンとオリゴデオキシシトシンとが再アニールするためである。
【０１１６】
しかし、不要なオリゴデオキシシトシンは、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーさらにはポリスチレンビーズ等の微粒子に適当な方法で固定化したオリゴデオキシヒポキサンチン、オリゴデオキシグアニン、あるいはこれらを混合したオリゴヌクレオチドとアニールさせることで、容易に分離除去可能である。
【０１１７】
以上、実施例１及び実施例２に示した通り、本発明の方法によって、ヌクレオチド鎖の３´末端に直接的に修飾物質を修飾することが可能である。
上記各実施例に示したヌクレオチド鎖の構成・鎖長さ、修飾物質、反応条件、反応組成等は単なる例示であり、これらに限定されることなく任意に改変可能である。
【０１１８】
以上のように本発明によれば、ヒポキサンチンを有したヌクレオチド配列を修飾対象のヌクレオチド鎖の３´側に形成し、前記ヒポキサンチンが前記修飾対象のヌクレオチド鎖に存在せず、前記ヌクレオチド配列部分のみを分解する３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼを作用させ、その後に修飾物質と反応させることにより、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の分解を回避し、配列情報を保持した状態で３´末端を修飾物質で直接に修飾することができ、ヌクレオチド鎖を簡便にラベル化、標識化可能であるとともに、ヌクレオチド鎖の固定化を目的とする場合には、修飾物質をリンカーとして安定、強固な固定が可能である。
【０１１９】
特定の塩基として、修飾対象のヌクレオチド鎖に存在しない塩基、たとえば、本来は遺伝子として存在せず、ＰＣＲ増幅の際等にもヌクレオチド鎖に取り込まれない塩基を選択することで、前記修飾対象のヌクレオチド鎖部分の分解を回避できる。よって、ヌクレオチド鎖の塩基構成や鎖長に関わらず、ヌクレオチド鎖の３´末端側を直接的に簡便に、任意の修飾物質で、定量的、安定的に修飾することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１におけるヌクレオチド鎖修飾方法の原理を示す反応模式図
【図２】本発明の実施の形態２におけるヌクレオチド鎖修飾方法の一部過程であって、形成されるアルデヒド誘導体をフルオレセインで修飾する過程を示す反応模式図
【図３】本発明の実施の形態３におけるヌクレオチド鎖修飾方法の一部過程であって、形成されるアルデヒド誘導体をアルカンチオールで修飾し、貴金属基板に固定化する過程を示す反応模式図
【図４】本発明の実施例１におけるヌクレオチド鎖修飾方法の各反応過程での反応状況を示すポリアクリルアミド電気泳動図
【図５】本発明の実施例２におけるヌクレオチド鎖修飾法による修飾を化学発光法により検出したフィルム露光図
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヌクレオチド鎖修飾方法に関するものであり、特にヌクレオチド鎖の３´末端を修飾物質で直接的に修飾して、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化、固定化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、遺伝子解析において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸等のヌクレオチド鎖をラベル化、標識化するための修飾物質として、放射性同位元素が採用されてきたが、半減期による取扱期間の制限、取扱場所の制限、被爆の問題、廃棄の問題等があるため、その利用は減少傾向にある。近年では、放射性同位元素に代替する修飾物質として、フルオレセイン等の蛍光物質あるいはビオチン等を用いて、ヌクレオチド鎖を修飾し、ラベル化、標識化する方法が汎用されるようになっている。ヌクレオチド鎖を修飾する方法は、５´末端修飾法、３´末端修飾法、内部修飾法の３つに大別できる。
【０００３】
５´末端修飾法としては、５´末端のリン酸基を介してビオチンで修飾する方法が考案されており（例えば、非特許文献１参照）、さらに、ビオチンとアビジンとの高親和性を利用して、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素で修飾することにより、これら酵素の化学発光を用いて遺伝子解析を高感度化する方法が報告されている（例えば、非特許文献２〜３参照）。ヌクレオチドの５´末端のリン酸基を介した修飾方法は、これら以外にも多数提案されている（例えば、特許文献１及び非特許文献４〜１３参照）。
【０００４】
しかし５´末端のリン酸基を介した修飾方法においては、ヌクレオチド鎖への修飾物質の修飾量は基本的に１つであり、その一方で高感度化を実現するために使用するアルカリフォスファターゼはヌクレオチドの５´末端のリン酸基を解離させるので、ヌクレオチド鎖の５´末端修飾とアルカリフォスファターゼ利用との組み合せは基本的に避ける必要がある。またアルカリフォスファターゼは、空気中に浮遊する細菌中にも存在するので、遺伝子解析中に夾雑した場合には、５´末端のリン酸基に結合した修飾物質が解離しやすい等、修飾状態に安定性を欠くのみならず、バックグランドノイズの要因になるという課題がある。
【０００５】
ヌクレオチドの３´末端修飾法としては、予めラベル化、標識化処理を施したデオキシヌクレオチド三リン酸あるいはジデオキシヌクレオチド三リン酸を合成し（例えば、非特許文献１４及び特許文献２参照）、このラベル化、標識化ヌクレオチドをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりヌクレオチド鎖の３´側に付加させるテーリング法が開発されている（例えば、特許文献３及び非特許文献１５〜１８参照）。
【０００６】
このような３´末端修飾法は、５´末端修飾法に比べて修飾物質の保持安定性が高く、汎用されているが、デオキシヌクレオチド三リン酸あるいはジデオキシヌクレオチド三リン酸のラベル化、標識化処理が煩雑であるため、任意のラベル化、標識化処理体は誰にでも容易に得られるものではなく、結果として修飾物質の種類が限定される。また、テーリング段階でヌクレオチド鎖の３´側に不要なヌクレオチド配列が付加するため、特にデオキシヌクレオチド三リン酸を利用した場合に反応条件によってヌクレオチドの付加数がランダムになるため（例えば、非特許文献１９参照）、遺伝子解析の高感度化は実現できるものの、定量性に課題がある。また３´側に付加した不要な塩基配列は、遺伝子解析のハイブリダイゼーションの際にミスマッチの要因となる課題がある。
【０００７】
他の３´末端修飾法として、化学合成ヌクレオチド鎖を作成する合成初期に、３´末端のヌクレオチドに直接的に、ラベル化、標識化のための修飾物質を結合させる方法もあり、ヌクレオチド鎖への修飾物質の高い保持安定性を実現している。しかし化学合成で得られるヌクレオチド鎖のヌクレオチド数は、合成副産物、収率等の合成能力の関係で１００程度であり、ここで使用されている３´末端への直接的な修飾物質の結合方法を、生体抽出及びＰＣＲ等で増幅したヌクレオチド数１００を超えるヌクレオチド鎖の３´末端修飾に適用することはできない。つまり、修飾されるヌクレオチド鎖の鎖長に制限がある、という課題がある。
【０００８】
内部修飾法としては、ヌクレオチド鎖を複製させる反応の際に、ラベル化、標識化のための修飾物質で予め修飾処理を施したデオキシヌクレオチド三リン酸をヌクレオチド鎖内に取り込ませることで、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化するランダムプライマー法あるいはニックトランスレーション法が開発されている（例えば、特許文献４及び非特許文献２０〜２２参照）。
【０００９】
これらの方法は、遺伝子増幅反応であるポリメラーゼ連鎖反応いわゆるＰＣＲ法（例えば、特許文献５〜８及び非特許文献２３〜２５参照）と組み合わせることで、ヌクレオチド鎖の増幅とラベル化、標識化とを同時に行なうことが可能であり（例えば、非特許文献２６参照）、遺伝子解析の高感度化をもたらし、定量性も報告されており、遺伝子マイクロアレイに代表される遺伝子解析のハイスループット化を実現している（例えば、特許文献９及び非特許文献２７〜２９参照）。
【００１０】
これらランダムプライマー法、ニックトランスレーション法及びＰＣＲ法においては、ヌクレオチドの取り込み効率、修飾ヌクレオチド合成等の点から、チミジン塩基に替えてウラシル塩基あるいは予め蛍光物質などでラベル化、標識化したウラシル塩基を取り込んだヌクレオチド鎖の形成が繁用されている。さらにウラシル塩基に代替する利点として、ＰＣＲ法の際に、反応混液中に夾雑する外因性汚染由来のヌクレオチド鎖にウラシル塩基を取り込ませ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを作用させることで、汚染由来のヌクレオチド鎖の増幅を防止する方法もある（例えば、特許文献１１〜１３及び非特許文献３１〜３３参照）。
【００１１】
しかしこれらの方法は、ヌクレオチド鎖内へのラベル化、標識化されたヌクレオチドの取り込み数が１０〜２，３０程度（例えば、非特許文献３０参照）とランダムであり、完全な定量化には課題がある。また３´末端修飾法であるテーリング法と同様に、ヌクレオチド鎖内に取り込ませるためのデオキシヌクレオチド三リン酸のラベル化、標識化処理が煩雑であるため、任意のラベル化、標識化処理体は誰にでも容易に得られるものではなく、結果として修飾物質の種類が限定される。さらに、ヌクレオチド鎖内に修飾物質が取り込まれているため、遺伝子解析のハイブリダイゼーションの際に、つまりヌクレオチド鎖の二本鎖形成の際に、取り込まれた修飾物質による立体障害を回避できない課題がある。
【００１２】
ヌクレオチド鎖の修飾は、ラベル化、標識化の他に、ヌクレオチド鎖を基板に固定化するために行なわれている。ヌクレオチド鎖の５´末端あるいは３´末端にアミノ基、アルデヒド基等の官能基を持たせる修飾処理を施し、ガラス、シリコンなどの基板の表面を、ヌクレオチド鎖の末端がアミノ基である時はアルデヒド基あるいはエポキシ基になるように、またヌクレオチド鎖の末端がアルデヒド基である時はアミノ基になるように、処理を施すことにより、ヌクレオチド鎖を基板に固定化するのである。このようにして配列の異なるヌクレオチド鎖を基板単位面積当たり多数固定化することにより、遺伝子解析マイクロアレイを実現している。
【００１３】
基板に固定化したヌクレオチド鎖を安定に保持するためには、上述したようにヌクレオチド鎖の３´末端を修飾することにより、アミノ基あるいはアルデヒド基を持たせるのが望ましい。そしてそのために使用可能なヌクレオチド鎖は、化学合成したヌクレオチド鎖のみである。しかしこれも上述したように、化学合成可能なヌクレオチド鎖はヌクレオチド数１００程度に制限されるものであり、そのため、固定化が不安定であっても、５´末端を修飾したヌクレオチド鎖を使用しているのが現状である。
【００１４】
修飾処理を施さずにヌクレオチド鎖を基板へ固定化する方法もある。基板表面を正に帯電するよう表面処理し、ヌクレオチド鎖中の負に帯電しているリン酸基を静電結合させることでヌクレオチド鎖を固定化するか、あるいは基板表面を疎水性にし、ヌクレオチド鎖を吸着結合させている。この方法を利用してヌクレオチド鎖を固定化したマイクロアレイも実現されている。
【００１５】
しかしこの固定化方法では、ヌクレオチド鎖長が長くなるにしたがってヌクレオチド鎖１分子の基板占有率が高くなるため、長鎖のヌクレオチド鎖ほど基板単位面積当たりの固定化量が少なくなる課題がある。そのため、基板単位面積当たりの固定化量を向上させるにはやはり、ヌクレオチド鎖の５´末端あるいは３´末端を、基板へ固定化するための修飾物質で修飾する方法をとることになる。
【００１６】
上述したヌクレオチド鎖のラベル化、標識化、固定化の課題を解決するものとして、ヌクレオチド鎖の３´末端部を直接的に修飾物質で修飾する方法が提案されている（特許文献１０参照）。この方法は、ヌクレオチド鎖の３´側に２つ以上のウラシル塩基を付加させ、付加したウラシルのグリコシド結合をウラシルＤＮＡグリコシラーゼで分解して、３´末端にアルデヒド基を形成させ、このアルデヒド基とアミノ基を有する修飾物質とを共有結合させることにより、ヌクレオチド鎖の３´末端を修飾する。
【００１７】
【特許文献１】
特許１７０６２８９号公報
【００１８】
【特許文献２】
特開昭６１−１１５０９４号公報
【００１９】
【特許文献３】
特公平７−３１１９４号公報
【００２０】
【特許文献４】
特表２０００−５０８７０９号公報
【００２１】
【特許文献５】
特許１８１４７１３号公報
【００２２】
【特許文献６】
特許２０９３７３０号公報
【００２３】
【特許文献７】
特許２０９３７３１号公報
【００２４】
【特許文献８】
特許２６１３８７７号公報
【００２５】
【特許文献９】
特表平１０−５０３８４１号公報
【００２６】
【特許文献１０】
特開２００３−２４６７９４公報
【００２７】
【特許文献１１】
特許２１０３１５５号公報
【００２８】
【特許文献１２】
特表２０００−５０２２５１号公報
【００２９】
【特許文献１３】
特開平１１−１１３５９９号公報
【００３０】
【非特許文献１】
チュ（Chu B.C.F）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１１巻、６５１３頁、１９８３年
【００３１】
【非特許文献２】
ベック（Beck.S.）、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、２１６巻、１４３頁、１９９２年
【００３２】
【非特許文献３】
ブロンシュタイン（Bronstein.I.）ら、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、２１７巻、３９８頁、１９９３年
【００３３】
【非特許文献４】
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【非特許文献５】
コクッザ（Cocuzza.A.J.）、「テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）」、３０巻、６２８７頁、１９８９年
【００３５】
【非特許文献６】
タイセン（Theisen.P.）ら、「テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）」、３３巻、５０３３頁、１９９２年
【００３６】
【非特許文献７】
ケンプ（Kempe.T.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１３巻、４５頁、１９８５年
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【００３８】
【非特許文献９】
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【００３９】
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リグビー（Rigby.P.W.J）ら、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、１１３巻、２３７頁、１９７７年
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ミュリス（Mullis.K.B.）ら、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、１５５巻、３３５頁、１９８７年
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サイキ（Saiki.R.）、「サイエンス（Science）」、２３９巻、４８７頁、１９８８年
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シーバート（Siebert.P.D.）ら、「ネイチャー（Nature）」、３５９巻、５５７頁、１９９１年
【００５５】
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デイ（Day.P.J.R.）ら、「バイオケミカル・ジャーナル（Biochem.J.）、２６７巻、１１９頁、１９９０年
【００５６】
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シェナ（Schena.M.）ら、「サイエンス（Science）」、２７０巻、４６７頁、１９９５年
【００５７】
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シャロン（Schalon.D.）ら、「ゲノム・リサーチ（Genome Res.）」、６巻、６３９頁、１９９６年
【００５８】
【非特許文献２９】
核酸マイクロアレイ特集、「ネーチャージェネティックス（Nature Genet.）」、２１巻 Supplement、１月、１９９９年
【００５９】
【非特許文献３０】
アマーシャム・バイオサイエンス（AmershamBiosciences）社ウェブサイト、［２００３年４月１４日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/microarrays_labelling%5Cmicroarrays_labelling_cyscribe_postlabelling?OpenDocument&hometitle=microarrays＞
【００６０】
【非特許文献３１】
ロンゴ（Longo.M.C.）ら、「ジーン（Gene）」、９３巻、１２５頁、１９９０年
【００６１】
【非特許文献３２】
ソーントン（Thornton.C.G.）ら、「バイオテクニクス（BioTechniques）」、１３巻、１８０頁、１９９２年
【００６２】
【非特許文献３３】
ソベック（Sobek.H.）ら、「ＦＥＢＳレターズ（FEBS Lett.）」、３８８巻、１頁、１９９６年
【００６３】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、ヌクレオチド鎖の修飾方法には、５´末端修飾法、３´末端修飾法、及び内部修飾法の３種類があるが、それぞれに一長一短があるため、利用者は、利用目的に応じてそれぞれの方法を取捨選択しなければならないという負担がある。
【００６４】
この問題を解決するものとして特許文献１０記載の方法が提案されており、ヌクレオチド鎖の鎖長に関係なく、ヌクレオチド鎖の３´側を直接的に簡便に任意の修飾物質で修飾して、安定に保持可能な方法であるが、その一方で、付加したウラシルのグリコシド結合をウラシルＤＮＡグリコシラーゼにより分解する原理から理解されるように、ヌクレオチド鎖中にウラシル塩基の配列が存在しない時しか実施できないという制約を有している。
【００６５】
ところが、上述したように、ランダムプライマー法、ニックトランスレーション法及びＰＣＲ法においては、チミジン塩基に替えてウラシル塩基を取り込んだヌクレオチド鎖の形成が繁用されている。またＰＣＲ法の際に、汚染由来のヌクレオチド鎖の増幅を防止するために用いるウラシル塩基が、増幅を目的するヌクレオチド鎖にも取り込まれる。したがって、このようにウラシル塩基を取り込んだヌクレオチド鎖に対して特許文献１０記載の方法を適用すると、３´側に付加したウラシルのみならずヌクレオチド鎖中のウラシルにもウラシルＤＮＡグリコシラーゼが作用し、ヌクレオチド鎖自体が分解されてしまう。
【００６６】
本発明は上記問題を解決するもので、ヌクレオチド鎖の塩基構成に関わらず、ヌクレオチド鎖の分解を伴うことなく、３´末端部に修飾物質を直接的に修飾できるヌクレオチド鎖修飾方法を提供することを目的とする。
【００６７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明は、ヒポキサンチンを有したヌクレオチド配列が修飾対象のヌクレオチド鎖の３´側に形成され、前記ヒポキサンチンが前記修飾対象のヌクレオチド鎖に存在せず、前記ヒポキサンチンを有したヌクレオチドに３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼを作用させることにより、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の分解を回避し、配列情報を保持した状態で３´末端に修飾物質に対してアルデヒド基を形成し、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端に直接に前記修飾物質を結合させるヌクレオチド鎖修飾方法を提供する。
【００６８】
酵素基質となる特定の塩基を有したヌクレオチド配列が３´側に存在するヌクレオチド鎖を修飾対象とすることにより、前記ヌクレオチド配列部分のみを分解して、所望の修飾物質と反応して結合する官能基を形成するのである。このようにすることにより、ヌクレオチド鎖を修飾物質で直接に修飾することができ、簡便にラベル化、標識化可能となるとともに、ヌクレオチド鎖の固定化を目的とする場合には、修飾物質をリンカーとして安定、強固な固定を行なうことが可能となる。
【００６９】
前記特定の塩基が前記修飾対象のヌクレオチド鎖に存在しないことが必要である。このことにより、分解酵素が作用しても主鎖部分が分解されるのを回避することができ、主鎖部分の配列情報が完全に保持された状態を維持可能となる。ヌクレオチド鎖の配列情報を定義するには、少なくとも１０塩基前後のヌクレオチド配列を有することが望ましい。
【００７０】
反応性を有する官能基として、アルデヒド基を形成することが必要である。
特定の塩基がヒポキサンチンであり、分解酵素が３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼであることが必要である。特定の塩基および分解酵素は種々の組み合わせが可能であるが、たとえばウラシル塩基のヌクレオチド鎖への組み込みは、遺伝子解析の様々な手法の中で汎用されているため、これを特定の塩基として利用することは望ましくない。汎用頻度の低いヒポキサンチン塩基とその分解酵素である３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼを利用することで、ヌクレオチド鎖の３´末端修飾を実施する際の利用者の利便性を大幅に向上することが可能となる。また、ヌクレオチド鎖の塩基の構成や鎖長に関わらず、ヌクレオチド鎖の３´末端側を直接的に簡便に、任意の修飾物質で、定量的、安定的に修飾することが可能となる。ヌクレオチド鎖内への不必要な塩基配列、修飾された塩基の取り込みを排除し、ヌクレオチド鎖の３´末端に限定して修飾物質で修飾できる方法である。
【００７１】
特定の塩基を有したヌクレオチド配列は、テーリング法により付加することができる。酵素基質となる塩基を持ったヌクレオチドを意図的に付加させておく方法である。
【００７２】
分解酵素を作用させるに先だって、特定の塩基と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを添加するのが好ましい。２本のヌクレオチドの塩基間に相補的結合を生じさせることにより、酵素の基質特異性を高めることができ、反応効率を向上させることが可能となる。
【００７３】
修飾物質として、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化可能な物質を使用できる。これにより、修飾されたヌクレオチド鎖を、遺伝子解析における検出プローブあるいはターゲットとして使用可能である。
【００７４】
また修飾物質として、遺伝子解析のための基板への結合能を有した物質を使用できる。これにより、修飾されたヌクレオチド鎖を、検出プローブあるいはターゲットとして、基板に安定に固定化することが可能となる。
【００７５】
ヌクレオチド鎖の３´末端の官能基に反応する修飾物質として、アミノ基を有するものを好適に使用できる。
修飾物質として例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、またはタンパク質を用いることができる。アミノ酸、オリゴペプチド、タンパク質は、アミノ基を有しているため、ヌクレオチド鎖の３´末端のアルデヒド基と融合させることが可能であり、これによりヌクレオチド鎖にアミノ酸、オリゴペプチド、タンパク質が有する機能を付加することができる。
【００７６】
修飾物質として例えば、アミノアルカンチオールまたはアミノシランカップリング化合物を用いることができる。これら化合物は貴金属製、ガラス製あるいは樹脂製の基板に安定に結合可能である。
【００７７】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１を図１に基づき説明する。図中、ｌ、ｍ及びｎは、０または任意の自然数を表わし、Ｂａｓｅは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル等の任意の塩基を示し、Ｈｘはヒポキサンチン塩基を、Ｃｙｔはシトシン塩基をそれぞれ示す。
【００７８】
まず、任意の塩基配列を有するヌクレオチド鎖（Ｉ）と、２´−デオキシイノシン−５´−三リン酸（Ａ）とに、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを作用させることにより、ヌクレオチド鎖（Ｉ）の３´末端に、２´−デオキシイノシン−５´−三リン酸（Ａ）由来のヒポキサンチン塩基配列が付加したヌクレオチド鎖（II）を得る。２´−デオキシイノシン−５´−三リン酸（Ａ）は以下の構造を有する。
【００７９】
【化１】
【００８０】
この一部２本鎖となったヌクレオチド鎖（III ）に３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型を作用させ、アルカリ熱処理することにより、ヒポキサンチン塩基を有するヌクレオチドのグリコシド結合を切断し、残存するデオキシリボース−リン酸結合を切断して、３´末端にアルデヒド基を持ったヌクレオチド鎖（IV）を得る。
【００８１】
このヌクレオチド鎖（IV）に、アミノ基を有する修飾物質（Ｈ２Ｎ−Ｒ（Ｒについては後述する））を反応させることにより、ヌクレオチド鎖（IV）と修飾物質とが脱水縮合したシッフ塩基、すなわち、３´末端が修飾物質で直接的に修飾されたヌクレオチド鎖（Ｖ）を得ることができる。
【００８２】
なお、この実施の形態１では、ヒポキサンチン塩基を有するヌクレオチド（Ａ）をテーリングさせ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型を作用させる例を示したが、これに限らず、以下の表１に例示するＤＮＡグリコシラーゼあるいはＤＮＡ修復酵素と各塩基を有するヌクレオチドのテーリングとを組み合せても、同様にしてヌクレオチド鎖の３´末端を修飾物質で直接的に修飾できる。
【００８３】
【表１】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２を図２に基づいて説明する。図中、ｍは、０または任意の自然数を表わし、Ｂａｓｅは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル等の任意の塩基を示す。
【００８４】
上記実施の形態１と同様にして製造した、３´末端にアルデヒド基を持ったヌクレオチド鎖（IV）に対して、蛍光物質として知られるフルオレセインカダベリン（Ｃ）を反応させることにより、ヌクレオチド鎖の３´末端に直接的にフルオレセインカダベリンが結合した修飾ヌクレオチド鎖（VI）を得る。
【００８５】
このようにしてフルオレセインで修飾することにより、ヌクレオチド鎖を蛍光ラベル化（標識化）することができ、このヌクレオチドをハイブリダイゼーションなどの遺伝子解析のためのプローブあるいはターゲットとして利用可能となる。
【００８６】
フルオレセインのほかに、アミノ基を有するテキサスレッド、ローダミン、Ｃｙ３・Ｃｙ５に代表されるシアニン系化合物、ジゴギシゲニン、ビオチン等を用いて同様に、ラベル化、標識化することが可能である。
【００８７】
アミノ酸、ペプチド、タンパク質も、ヌクレオチド鎖への修飾物質として使用可能である。アミノ酸の内、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンは、蛍光性を有するため、ヌクレオチド鎖のラベル化、標識化に使用できる。なおラベル化は、蛍光化合物、染料系化合物等による標識化を言う。蛍光性を有しないアミノ酸やペプチドも、側鎖にフルオレセイン等（以下、標識化合物と言う）を結合させることで、ラベル化、標識化に使用可能である。
【００８８】
アミノ酸が連鎖したペプチドは、その数に応じた側鎖が存在するため、複数の標識化合物を結合させることが可能となる。例えば、リシンが３つ連鎖したトリリシンには側鎖にアミノ基が３つ存在するため、カルボキシル基、スクシンイミド基等を有する標識化合物を任意に合計３つ修飾することが可能となる。
【００８９】
ペプチドに限らず、アミノ基を有するアルキル、アリル、シクロアルカン、芳香族、糖類等の炭化水素類を標識化合物で修飾したものを修飾物質として用いて、ヌクレオチド鎖を修飾することが可能であり、ラベル化、標識化を実現できる。
【００９０】
タンパク質として例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、有色性、蛍光性を有するトランスフェリン、ヘモグロビン、緑色蛍光タンパク、青色蛍光タンパク、エクオリン等を使用すると、ヌクレオチド鎖のラベル化、標識化が可能となり、遺伝子解析、とりわけｉｎ ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーションに有用である。
【００９１】
その他、表面にアミノ基を形成させた金コロイド、銀コロイド等の貴金属コロイド、磁性微粒子、ポリスチレンビーズ等の高分子微粒子に代表される微粒子なども、ヌクレオチド鎖の修飾物質として使用可能である。
（実施の形態３）
本発明の実施の形態３を図３に基づいて説明する。図中、ｍは、０または任意の自然数を表わし、Ｂａｓｅは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル等の任意の塩基を示す。
【００９２】
上記実施の形態１で説明したのと同様にして製造した、３´末端にアルデヒド基を持ったヌクレオチド鎖（IV）に対して、アミノ基を有するチオール、ここでは８−アミノ−１−オクタンチオール（Ｄ）を反応させることにより、ヌクレオチド鎖の３´末端に直接的に８−アミノ−１−オクタンチオール残基が結合した修飾ヌクレオチド鎖（VII ）を得る。
【００９３】
この修飾ヌクレオチド鎖（VII ）を貴金属の基板（Ｅ）に作用させることにより、チオール基と基板（Ｅ）との強固な共有結合を形成させて、ヌクレオチド鎖（VII ′）を基板（Ｅ）に固定化することができる。
【００９４】
このようにすることにより、貴金属を基板として利用する電気化学的測定法、水晶発振子マイクロバランス法、表面プラズモン共鳴法等の測定法を、遺伝子解析に利用することが可能となる。
【００９５】
なお、修飾物質たるアミノ基を有するチオールとして、８−アミノ−１−オクタンチオールを例示したが、ヌクレオチド鎖と結合するアミノ基と貴金属と結合するチオール基とが存在する化合物であれば、特に限定なく使用することができ、アミノ基・チオール基間の炭化水素残基は、直鎖状、分岐鎖状、シクロ環状、アリル鎖状、芳香環状等、種々の形態であってよく、その炭素数、アミノ基の位置等、変更可能である。
【００９６】
貴金属製の基板も、水晶発振子マイクロバランス法、表面プラズモン共鳴法等では、金基板を汎用するが、これに限定されることなく使用することができ、金の他に、白金、銀、銅、パラジウム、インジウム、ニッケル、鉄、アルミニウム、及びそれらの合金等も基板として使用可能である。
【００９７】
修飾物質として、アミノ基を有するシランカップリング化合物を使用してもよく、それにより、ガラス、シリコン、シリカ、アルミナ、マイカ、及びポリスチレン、ナイロン、エポキシ等の高分子樹脂等の基板にヌクレオチド鎖を固定化することが可能となり、従来からの様々な遺伝子解析手法にも適用可能となる。
【００９８】
シランカップリング化合物は、アミノ基とアルコキシ基とを有する化合物であれば、アルカンチオールと同様に、構造等に特に制限なく使用可能である。使用可能なシランカップリング化合物はたとえば、ガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン、ガンマ−アミノプロピルトリメトキシシラン等である。
【００９９】
なお、本来はアミノ基を有しない物質も、アミノ基を有する適当なスペーサーを介することで、ヌクレオチド鎖を修飾可能である。たとえばカルボキシル基を有する物質は、スペーサーとして、１，２−ジアミノエタン、１，６−ジアミノヘキサン等のジアミノ構造を有する物質を介在させることで、ヌクレオチド鎖を修飾可能となる。
【０１００】
さらには、ヒドラジン基、アミノオキシル基、シアノ基を有する物質、あるいはグリニャール試薬の様にハロゲン化マグネシウムを有する物質も、修飾物質として使用可能である。
【０１０１】
【実施例】
以下、具体的な実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
（実施例１）
修飾対象のヌクレオチド鎖として、ヌクレオチド数３０の一本鎖化学合成ヌクレオチド鎖（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社に合成を委託）を用いた。このヌクレオチド鎖は、大腸菌の１６Ｓリボゾームリボ核酸遺伝子の８〜３７位をコードするもので、その塩基配列は５´末端よりａｇａｇｔｔｔｇａｔｃａｔｇｇｃｔｃａｇａｔｔｇａａｃｇｃｔである（配列番号１）。ａ、ｔ、ｇ、ｃはそれぞれデオキシヌクレオチド中の塩基、アデニン、チミン、グアニン、シトシンを示す。
【０１０２】
まず、ヌクレオチド鎖を５μＭになるように、２単位（以下、ｕと略す）／μｌのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１０ｍＭ２´−デオキシイノシン−５´−三リン酸、２ｍＭ塩化コバルト、１ｍＭジチオスレイトール、０．１Ｍカコジル酸カリウム（ｐＨ７．２）の反応液５０μｌ中に混和し、３７℃で４時間反応させて、ヌクレオチド鎖の３´側に、ヒポキサンチン塩基を有するヌクレオチド配列をテーリングさせた。
【０１０３】
このヌクレオチド鎖をエタノール沈殿により回収し、１００μＭのオリゴデオキシシトシン（ヌクレオチド数１８、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ社製）を添加して、ヌクレオチド鎖の３´側にテーリングしたヌクレオチド配列のヒポキサンチン塩基とアニーリングさせた。
【０１０４】
次にヌクレオチド鎖を、０．３ｕ／μｌの３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ社製）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１ｍＭグリコールエーテルジアミン四酢酸、１ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルフォン酸−水酸化カリウム（ｐＨ７．４）の反応液に混和し、３７℃で一昼夜反応させて、ヌクレオチド鎖の３´側にテーリングしたヌクレオチド配列のグリコシド結合を切断した。
【０１０５】
この反応液に０．１Ｍになるように水酸化ナトリウムを添加し、１００℃で５分間加熱して、ヌクレオチド鎖の３´側に残存するリン酸を解離させ、３´末端にアルデヒド基を形成させた。
【０１０６】
このヌクレオチド鎖をエタノール沈殿により回収し、０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）条件下で５ｍＭフルオレセインカダベリン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社製）と混合し、反応液を５０μｌにして、室温で２時間反応させて、ヌクレオチド鎖の３´末端のアルデヒド基とフルオレセインカダベリンに存在するアミノ基との間でシッフ塩基を形成させた。その後に、１ｍｇ／ｍｌになるよう水素化ホウ素ナトリウムを添加し、反応液を１００μｌとし、４℃で一昼夜反応させることにより、シッフ塩基を還元し、結合を安定化させた。
【０１０７】
この修飾プロセスを７モル尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ 第２版 １１．２３頁 １９８９年）により追跡した結果を図４に示す。なお、図中左側の数字と矢印は各塩基数を有するヌクレオチド鎖の泳動位置を示している。ヌクレオチド鎖の検出は、銀染色法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ４巻 ９２頁 １９８３年）に従った。
【０１０８】
レーンＡ、Ｂ及びＣはそれぞれ、分子量マーカー、オリゴデオキシシトシン、及び未処理のヌクレオチド鎖をそれぞれ示している。レーンＤは、ヒポキサンチン塩基を有するヌクレオチド配列が３´側にテーリングしたヌクレオチド鎖を示し、ヌクレオチド数は１００以上に増加している。レーンＥは、オリゴデオキシシトシンがアニーリングしたヌクレオチド鎖を示す。レーンＦは、３´末端にアルデヒド基が形成したヌクレオチド鎖を示し、ヌクレオチド数は３０に減少している。レーンＧは、３´末端がフルオレセインカダベリンで修飾され安定化されたヌクレオチド鎖を示す。
【０１０９】
レーンＤにおいて、ヒポキサンチン塩基を有するヌクレオチドのテーリングが認められず、未反応のヌクレオチド鎖が若干残存しているのが認められるが、これは、テーリング反応時間の延長や、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ添加量の増加等により、容易に解消可能である。
【０１１０】
なお、修飾対象のヌクレオチド鎖のアデニン塩基、グアニン塩基、シトシン塩基にもアミノ基が存在するため、ヌクレオチド鎖内部で反応が生じ、自己重合してしまう可能性もあるが、レーンＦに示す通り、自己重合は生じなかった。しかし必要があれば、ヌクレオチド鎖の化学合成時に用いられるベンゾイル基、イソブチリル基等の適当な保護基で、ヌクレオチド鎖のアミノ基を保護することも可能である。
（実施例２）
実施例１で電気泳動させた各過程のヌクレオチド鎖を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８巻、５０３頁、１９７５年）に従って、ナイロン膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）に転写した。
【０１１１】
ナイロン膜上のヌクレオチド鎖に対して、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼで標識した抗フルオレセイン抗体（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を滴下し、フルオレセインの有無を化学発光法（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＥＣＬ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ）によりフィルム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＨｙｐｅｒｆｉｌｍＥＣＬ）を露光させて検出した。結果を図５に示す。なお、図中左側の数字と矢印は、図４と同様に各塩基数を有するヌクレオチド鎖の位置を示している。
【０１１２】
レーンＡは分子量マーカーを示す。予めフルオレセインラベルした２´，３´―ジデオキシウリジン−５´−三リン酸（ＥｎｚｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）をターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼでテーリング処理したものである。
【０１１３】
レーンＢ〜Ｆでは、発光の検出は認められず、ヌクレオチド鎖はフルオレセインで修飾されていないことがわかる。
レーンＧにおいて、ヌクレオチド数３０のヌクレオチド鎖の発光が検出されており、修飾ヌクレオチド鎖が実際にフルオレセインカバベリンで修飾されていたことがわかる。しかしヌクレオチド数１８のオリゴデオキシシトシンもフルオレセインカバベリンで修飾されている。
【０１１４】
これは、テーリングしたヒポキサンチンのヌクレオチド鎖部分にオリゴデオキシシトシンがランダムにアニールするため、部分的に２本鎖が形成されず、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型が作用しない箇所が存在してしまうためである。
【０１１５】
それにより、わずかなヌクレオチド数のオリゴデオキシヒポキサンチンが生じ、その３´末端にアルデヒド基が形成され、そのアルデヒド基をフルオレセインカダベリンが修飾し、これらの反応中にオリゴデオキシヒポキサンチンとオリゴデオキシシトシンとが再アニールするためである。
【０１１６】
しかし、不要なオリゴデオキシシトシンは、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーさらにはポリスチレンビーズ等の微粒子に適当な方法で固定化したオリゴデオキシヒポキサンチン、オリゴデオキシグアニン、あるいはこれらを混合したオリゴヌクレオチドとアニールさせることで、容易に分離除去可能である。
【０１１７】
以上、実施例１及び実施例２に示した通り、本発明の方法によって、ヌクレオチド鎖の３´末端に直接的に修飾物質を修飾することが可能である。
上記各実施例に示したヌクレオチド鎖の構成・鎖長さ、修飾物質、反応条件、反応組成等は単なる例示であり、これらに限定されることなく任意に改変可能である。
【０１１８】
以上のように本発明によれば、ヒポキサンチンを有したヌクレオチド配列を修飾対象のヌクレオチド鎖の３´側に形成し、前記ヒポキサンチンが前記修飾対象のヌクレオチド鎖に存在せず、前記ヌクレオチド配列部分のみを分解する３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼを作用させ、その後に修飾物質と反応させることにより、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の分解を回避し、配列情報を保持した状態で３´末端を修飾物質で直接に修飾することができ、ヌクレオチド鎖を簡便にラベル化、標識化可能であるとともに、ヌクレオチド鎖の固定化を目的とする場合には、修飾物質をリンカーとして安定、強固な固定が可能である。
【０１１９】
特定の塩基として、修飾対象のヌクレオチド鎖に存在しない塩基、たとえば、本来は遺伝子として存在せず、ＰＣＲ増幅の際等にもヌクレオチド鎖に取り込まれない塩基を選択することで、前記修飾対象のヌクレオチド鎖部分の分解を回避できる。よって、ヌクレオチド鎖の塩基構成や鎖長に関わらず、ヌクレオチド鎖の３´末端側を直接的に簡便に、任意の修飾物質で、定量的、安定的に修飾することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１におけるヌクレオチド鎖修飾方法の原理を示す反応模式図
【図２】本発明の実施の形態２におけるヌクレオチド鎖修飾方法の一部過程であって、形成されるアルデヒド誘導体をフルオレセインで修飾する過程を示す反応模式図
【図３】本発明の実施の形態３におけるヌクレオチド鎖修飾方法の一部過程であって、形成されるアルデヒド誘導体をアルカンチオールで修飾し、貴金属基板に固定化する過程を示す反応模式図
【図４】本発明の実施例１におけるヌクレオチド鎖修飾方法の各反応過程での反応状況を示すポリアクリルアミド電気泳動図
【図５】本発明の実施例２におけるヌクレオチド鎖修飾法による修飾を化学発光法により検出したフィルム露光図
Claims (8)
- ヒポキサンチンを有したヌクレオチド配列が修飾対象のヌクレオチド鎖の３´側に形成され、前記ヒポキサンチンが前記修飾対象のヌクレオチド鎖に存在せず、前記ヒポキサンチンを有したヌクレオチドに３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼを作用させることにより、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の分解を回避し、配列情報を保持した状態で３´末端に修飾物質に対してアルデヒド基を形成し、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端に直接に前記修飾物質を結合させるヌクレオチド鎖修飾方法。
- ヒポキサンチンを有したヌクレオチド配列は、テーリング法により付加する請求項１記載の
ヌクレオチド鎖修飾方法。 - ３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼを作用させるに先だって、ヒポキサンチンと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを添加する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
- 修飾物質が、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化する物質である請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
- 修飾物質が、遺伝子解析のための基板への結合能を有した物質である請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
- ヌクレオチド鎖の３´末端のアルデヒド基に反応する修飾物質がアミノ基を有する請求項１に記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
- 修飾物質が、アミノ酸、オリゴペプチド、またはタンパク質である請求項６記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
- 修飾物質が、アミノアルカンチオールまたはアミノシランカップリング化合物である請求項６記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
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