JP2006006179A5 - - Google Patents
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一方、ヌクレオチド鎖の修飾は、ラベル化、標識化の他に、ヌクレオチド鎖を基板に固定化するために行なわれている。このための基板は当初、疎水性と正電荷の片方または両方を有するニトロセルロース、ナイロン、フッ化ポリビニリデンよりなるものが利用されていたが、固定化したヌクレオチド鎖が解離してしまうことがあった。近年では、ヌクレオチド鎖に5´末端のリン酸基を介してアミノ基を持たせる修飾処理を施す一方で、ガラス、シリコンなどの基板を用い、その表面がアルデヒド基あるいはエポキシ基になるように予め処理を施すことにより、ヌクレオチド鎖を基板に固定化する方法がとられる。このような方法で配列の異なるヌクレオチド鎖を基板単位面積当たり多数固定化することにより、遺伝子解析マイクロアレイを実現している。
特許1706289号
特開昭61−115094号
特公平7−31194号
特表2000−508709号
特許1814713号
特許2093730号
特許2093731号
特許2613877号
特表平10−503841号
特開2003−246794号
特許2103155号
特表2000−502251号
特開平11−113599号
チュ(Chu B.C.F)ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)」、11巻、6513頁、1983年
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ブロンシュタイン(Bronstein.I.)ら、「メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods Enzymol.)」、217巻、398頁、1993年
アルブス(Alves.A.M.)ら、「テトラヘドロン・レターズ(Tetrahedron Lett.)」、30巻、3089頁、1989年
コクッザ(Cocuzza.A.J.)、「テトラヘドロン・レターズ(Tetrahedron Lett.)」、30巻、6287頁、1989年
タイセン(Theisen.P.)ら、「テトラヘドロン・レターズ(Tetrahedron Lett.)」、33巻、5033頁、1992年
ケンプ(Kempe.T.)ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)」、13巻、45頁、1985年
スミス(Smith.L.M.)ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)」、13巻、2399頁、1985年
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シャロン(Schalon.D.)ら、「ゲノム・リサーチ(Genome Res.)」、6巻、639頁、1996年
核酸マイクロアレイ特集 「ネーチャージェネティックス(Nature Genet.)」、21巻 Supplement、1月、1999年
アマーシャム・バイオサイエンス(Amersham Biosciences)社ウェブサイト(http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/microarrays_labelling%5Cmicroarrays_labelling_cyscribe_postlabelling?OpenDocument&hometitle=microarrays)、2003年4月14日アクセス
分解酵素としてDNAグリコシラーゼを使用してヌクレオチド鎖の3´末端にアルデヒド基を付与することができる。
ヌクレオチド配列の付加は、DNAポリメラーゼを用いてヌクレオチドを取り込むことにより行うことができる。
ヌクレオチド配列の付加は、DNAポリメラーゼを用いてヌクレオチドを取り込むことにより行うことができる。
形成された完全2本鎖ヌクレオチドに対して、3−メチルアデニンDNAグリコシラーゼII型を作用させ、アルカリ熱処理することにより、ヒポキサンチンHxを含んだヌクレオチド(デオキシリボース)の1´位の炭素と酸素の間のグリコシド結合を特異的に分解し、これにより形成されるヌクレオチド鎖(2−4)の3´末端にアルデヒド基を付与する。
修飾終了後に、不要なヌクレオチド鎖(2−2)を分離除去する。このヌクレオチド鎖(2−2)の除去は、修飾物質が結合した2本鎖ヌクレオチドを熱処理するか、あるいはヌクレオチド鎖(2−2)の5´末端にリン酸基を存在させて、これを特異的に分解するラムダエキソヌクレアーゼを作用させることで、容易に行える。予めヌクレオチド鎖(2−2)の塩基N1、N2のグアニンの一部をヒポキサンチンに代えたものとしておくことにより、3−メチルアデニンDNAグリコシラーゼII型によって小断片化することもできる。
(実施形態2)
図3は、本発明の実施形態2におけるヌクレオチド鎖修飾方法であって、2本鎖ヌクレオチドの内、修飾対象とする一方のヌクレオチド鎖に、上述した3−メチルアデニンDNAグリコシラーゼII型に対する基質となるヒポキサンチンを含んだヌクレオチド配列を付加する方法を示す。
(実施形態2)
図3は、本発明の実施形態2におけるヌクレオチド鎖修飾方法であって、2本鎖ヌクレオチドの内、修飾対象とする一方のヌクレオチド鎖に、上述した3−メチルアデニンDNAグリコシラーゼII型に対する基質となるヒポキサンチンを含んだヌクレオチド配列を付加する方法を示す。
上記した各実施形態では、ヒポキサンチンHxを含んだヌクレオチド配列を付加すること、またヒポキサンチンHxを含んだヌクレオチドを基質とする3−メチルアデニンDNAグリコシラーゼII型を作用させることを例示したが、これに限定されない。たとえば、以下の表1に掲載した塩基を3´末端領域に含んだヌクレオチドとDNAグリコシラーゼとの組み合わせでも、同様にしてヌクレオチド鎖の3´末端を所望の修飾物質で修飾可能である。
被修飾ヌクレオチド鎖
TGCTGAAAGGTGACCAAAGA(配列1)
相補的ヌクレオチド鎖
ATCGGATCCTCTTTGGTCACCTTTCAGCA(配列2)
(ステップ1)
被修飾ヌクレオチド鎖(以下、MYH1と記す)と相補的ヌクレオチド鎖(以下、MYH1-BamHIと記す)とを、最終濃度がそれぞれ10μM、20μMになるように、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMジチオスレイトール、10mMトリス−塩酸(pH7.5)の緩衝液に懸濁し(総量100μl)、65℃で10分加温した後、30分以上かけて室温まで冷却することにより、cMYH1-BamHIの5´領域(CTTTCAGCA)が突出した2本鎖を形成した。
(ステップ2)
形成された2本鎖ヌクレオチドをエタノール沈殿により回収し、10mM dITP、10mM dATP、10mM dTTP、10mM dCTP、50mM塩化ナトリウム、20mM塩化マグネシウム、40mMトリス−塩酸(pH7.5)の溶液に入れ、T7DNAポリメラーゼ改変酵素シーケネースver.2.0(USB社)を最終濃度0.5u/μlになるよう添加し(総量100μl)、37℃で4時間反応させることにより、MYH1の3´末端に、MYH1-BamHIに相補的なヒポキサンチンを含んだヌクレオチド配列を付加して、完全な29塩基対の2本鎖ヌクレオチドを形成した。この際に形成されるMYH1は(配列1)−HxHxATCCHxATで表わされる。
(ステップ3)
形成された2本鎖ヌクレオチドをエタノール沈殿により回収し、1mMエチレンジアミン四酢酸、1mMエチレングリコール−ビス(2−アミノエチルエーテル)四酢酸、1mMジチオスレイトール、10mM4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸−水酸化カリウム(pH7.4)の溶液に入れ、3−メチルアデニンDNAグリコシラーゼII型(Trevigen社)を最終濃度0.2u/μlになるように添加し(総量100μl)、37℃で一昼夜反応させることにより、ヒポキサンチンを持ったデオキシリボースのグリコシド結合部分を加水分解して、MYH1の3´末端にアルデヒド基を付与した。このMYH1は(配列1)−CHOで表わされる。
(ステップ4)
MYH1の末端にアルデヒド基を持った2本鎖ヌクレオチドを、50mM 4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸−水酸化ナトリウム(pH7.2)の溶液に入れ、修飾物質としてのアミノオキシメチルカルボニルヒドラゾン−Cy5を最終濃度240μMになるよう添加し(総量100μl)、室温で一昼夜反応させることにより、MYH1の3´末端のアルデヒド基とCy5のアミンとの間でシッフ塩基を形成させた。このMYH1は(配列1)−CHHNOCHNHNH−Cy5で表わされる。
TGCTGAAAGGTGACCAAAGA(配列1)
相補的ヌクレオチド鎖
ATCGGATCCTCTTTGGTCACCTTTCAGCA(配列2)
(ステップ1)
被修飾ヌクレオチド鎖(以下、MYH1と記す)と相補的ヌクレオチド鎖(以下、MYH1-BamHIと記す)とを、最終濃度がそれぞれ10μM、20μMになるように、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mMジチオスレイトール、10mMトリス−塩酸(pH7.5)の緩衝液に懸濁し(総量100μl)、65℃で10分加温した後、30分以上かけて室温まで冷却することにより、cMYH1-BamHIの5´領域(CTTTCAGCA)が突出した2本鎖を形成した。
(ステップ2)
形成された2本鎖ヌクレオチドをエタノール沈殿により回収し、10mM dITP、10mM dATP、10mM dTTP、10mM dCTP、50mM塩化ナトリウム、20mM塩化マグネシウム、40mMトリス−塩酸(pH7.5)の溶液に入れ、T7DNAポリメラーゼ改変酵素シーケネースver.2.0(USB社)を最終濃度0.5u/μlになるよう添加し(総量100μl)、37℃で4時間反応させることにより、MYH1の3´末端に、MYH1-BamHIに相補的なヒポキサンチンを含んだヌクレオチド配列を付加して、完全な29塩基対の2本鎖ヌクレオチドを形成した。この際に形成されるMYH1は(配列1)−HxHxATCCHxATで表わされる。
(ステップ3)
形成された2本鎖ヌクレオチドをエタノール沈殿により回収し、1mMエチレンジアミン四酢酸、1mMエチレングリコール−ビス(2−アミノエチルエーテル)四酢酸、1mMジチオスレイトール、10mM4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸−水酸化カリウム(pH7.4)の溶液に入れ、3−メチルアデニンDNAグリコシラーゼII型(Trevigen社)を最終濃度0.2u/μlになるように添加し(総量100μl)、37℃で一昼夜反応させることにより、ヒポキサンチンを持ったデオキシリボースのグリコシド結合部分を加水分解して、MYH1の3´末端にアルデヒド基を付与した。このMYH1は(配列1)−CHOで表わされる。
(ステップ4)
MYH1の末端にアルデヒド基を持った2本鎖ヌクレオチドを、50mM 4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸−水酸化ナトリウム(pH7.2)の溶液に入れ、修飾物質としてのアミノオキシメチルカルボニルヒドラゾン−Cy5を最終濃度240μMになるよう添加し(総量100μl)、室温で一昼夜反応させることにより、MYH1の3´末端のアルデヒド基とCy5のアミンとの間でシッフ塩基を形成させた。このMYH1は(配列1)−CHHNOCHNHNH−Cy5で表わされる。
Claims (11)
- 修飾対象のヌクレオチド鎖の3´末端側に特定の塩基を含んだヌクレオチド配列を付加し、前記特定の塩基を含んだヌクレオチドに特異的な分解酵素を作用させて、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の3´末端に所望の修飾物質に対して結合能を有する官能基を付与し、前記官能基を有したヌクレオチド鎖の3´末端に前記修飾物質を結合させるヌクレオチド鎖修飾方法。
- 修飾対象とする1本鎖ヌクレオチドに、当該ヌクレオチド鎖の3´末端領域に相補的な配列を3´末端領域に有するヌクレオチド鎖をアニールし、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の3´末端側に特定の塩基を含んだ相補的ヌクレオチド配列を付加する請求項1記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
- 少なくとも一方のヌクレオチド鎖を修飾対象とする2本鎖ヌクレオチドを、修飾対象のヌクレオチド鎖の3´末端領域の塩基配列を特異的に認識する制限酵素で切断し、切断した修飾対象のヌクレオチド鎖の3´末端側に特定の塩基を含んだ相補的ヌクレオチド配列を付加する請求項1記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
- 2本鎖ヌクレオチドの少なくとも一方である修飾対象のヌクレオチド鎖の3´末端側に、特定の塩基を含んだヌクレオチド配列を5´末端領域に有した2本鎖ヌクレオチドをDNAリガーゼで接合することにより、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の3´末端側に特定の塩基を含んだヌクレオチド配列を付加する請求項1記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
- 分解酵素としてDNAグリコシラーゼを使用してヌクレオチド鎖の3´末端にアルデヒド基を付与する請求項1記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
- ヌクレオチド配列の付加は、DNAポリメラーゼを用いてヌクレオチドを取り込むことにより行う請求項2または請求項3のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
- 修飾物質が、ヌクレオチド鎖の3´末端に付与される官能基と結合を形成するアミノ基を有する請求項1記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
- 修飾物質が、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化する物質である請求項1または請求項7のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
- 修飾物質が、蛍光性物質、ビタミン、脂質、アミノ酸、オリゴペプチド、タンパク質または、生体外因性物質である請求項8記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
- 修飾物質が、ヌクレオチド鎖を基板に結合させるために介在させる物質である請求項1または請求項7のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
- 修飾物質が、アミノアルカンチオールまたはアミノシランカップリング化合物である請求項10記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
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