JP2003500070A - 核酸分子を標識するための組成物および方法 - Google Patents

核酸分子を標識するための組成物および方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般的には、逆転写酵素（好ましくは、多サブユニット逆転写酵素（例えば、ＡＳＬＶ逆転写酵素））を使用して核酸分子を標識するための組成物、キット、および方法に関する。詳細には、本発明は、核酸合成の間に核酸分子をローダミン、フルオレセイン、Ｃｙ３、およびＣｙ５からなる群より選択される蛍光分子またはマーカーで蛍光標識するための、方法、キット、および組成物に関する。本発明に従って産生された標識された核酸分子は、核酸の検出および診断のための標識されたプローブとして特に適切である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、分子生物学および細胞生物学の分野にある。本発明は一般的には、
逆転写（ＲＴ）酵素の使用に関し、そして特に、標識された（例えば、蛍光標識
された）核酸分子を合成するための核酸分子（特に、メッセンジャーＲＮＡ分子
）の逆転写のための方法に関する。本発明はまた、これらの方法によって産生さ
れた核酸分子、および検出プローブとしてのこのような標識された核酸分子の使
用に関する。本発明はまた、このような標識された核酸分子を作製するためのキ
ットおよび組成物にも関連する。
【０００２】 （発明の背景） ｃＤＮＡおよびｃＤＮＡライブラリー 生物体、組織、または細胞の構造および生理学を試験することにおいては、そ
の遺伝的な内容物を決定することがしばしば所望される。生物体の遺伝的な枠組
は、生物体の体細胞および生殖細胞中に含まれるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中
のヌクレオチド塩基の二本鎖の配列においてコードされる。ＤＮＡまたは遺伝子
の特定のセグメントの遺伝的な内容物は、遺伝子がコードするタンパク質の産生
の際にのみ明らかになる。タンパク質を産生するためには、ＤＮＡの二重ヘリッ
クスの１本鎖（「コード鎖」）の相補的なコピーが、ポリメラーゼ酵素によって
産生され、それによってリボ核酸（ＲＮＡ）の特異的な配列を生じる。この特異
的な型のＲＮＡは、それがタンパク質の産生のためのＤＮＡからの遺伝的なメッ
セージを含むので、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれる。
【０００３】 所定の細胞、組織、または生物体の中には、無数のｍＲＮＡ種が存在し、それ
ぞれが、別個の、かつ特異的なタンパク質をコードしている。この事実は、組織
または細胞中での遺伝子の発現を研究することにおいて興味を示す研究者らに対
して、強力なツールを提供する−−ｍＲＮＡ分子は、種々の分子生物学的技術に
よって単離され得、そしてさらに操作され得、それによって、細胞、組織、また
は器官の全ての機能的な遺伝的な内容物の解明を可能にする。
【０００４】 遺伝子の発現の研究のための１つの共通のアプローチは、相補ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）クローンの産生である。この技術においては、生物体に由来するｍＲＮＡ分
子が、生物体の細胞または組織の抽出物から単離される。この単離はしばしば、
チミジン（Ｔ）のオリゴマーが複合体化されている、セルロールまたはアガロー
スのような固体のクロマトグラフィーマトリックスを使用する。ほとんどの真核
生物のｍＲＮＡ分子上の３’末端がアデノシン（Ａ）塩基の記号列を含むので、
そしてＡがＴに結合するので、ｍＲＮＡ分子は、組織または細胞の抽出物中の他
の分子および物質から迅速に精製され得る。これらの精製されたｍＲＮＡ分子か
ら、ｃＤＮＡのコピーが、酵素逆転写酵素（ＲＴ）を使用して作製され得、これ
によって、一本鎖のｃＤＮＡ分子の産生を生じる。一本鎖のｃＤＮＡは、次いで
、元のｍＲＮＡの完全な二本鎖のＤＮＡ（従って、生物体のゲノム中に含まれる
、このｍＲＮＡをコードしている、元の二本鎖のＤＮＡ配列）のコピー（すなわ
ち、二本鎖のｃＤＮＡ）に、ＤＮＡポリメラーゼの作用によってに転換され得る
。次いで、タンパク質特異的な二本鎖のｃＤＮＡが、プラスミドまたはウイルス
ベクター中に挿入され得る。これは次いで、宿主である細菌、酵母、動物、また
は植物の細胞中に導入される。次いで、この宿主細胞は、培養培地中で増殖させ
られ、それによって目的の遺伝子を含有している（または多くの場合、それを発
現している）宿主細胞の集団を生じる。
【０００５】 ｍＲＮＡの単離から、単離された遺伝子を含有している宿主細胞の集団の増殖
のためのプラスミドまたはベクター中へのｃＤＮＡの挿入までの、この全体的な
プロセスは、「ｃＤＮＡクローニング」と呼ばれる。ｃＤＮＡが多数の異なるｍ
ＲＮＡから調製される場合は、得られるｃＤＮＡのセットは、「ｃＤＮＡライブ
ラリー」と呼ばれ、これは、このｃＤＮＡのセットが、供給源である細胞、組織
、または生物体中に存在する機能的な遺伝的な情報を含有している遺伝子の「集
団」を示すので、適切な用語である。これらのｃＤＮＡライブラリーの遺伝子型
の分析によって、それらが由来する生物体の構造および機能についての多くの情
報を得ることができる。
【０００６】 （レトロウイルス転写酵素） レトロウイルスＲＴの３つの原型の形態が、完全に研究されている。モロニー
マウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴは、ＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラー
ゼおよびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する７８ｋＤａの単一のサブユニットを含む。
この酵素は、クローン化されており、そしてＥ．ｃｏｌｉ中で完全に活性な形態
で発現されている（Ｐｒａｓａｄ，Ｖ．Ｒ．，Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒ
ｉｐｔａｓｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１
３５頁（１９９３）に概説されている）。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ
は、ｐ６６サブユニットとｐ５１サブユニットとのヘテロ二量体であり、ここで
は、小さいサブユニットは、タンパク質分解性の切断によって大きなサブユニッ
トから誘導される。このｐ６６サブユニットはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
およびＲＮａｓｅ Ｈドメインの両方を有し、一方、このｐ５１サブユニットは
、ＤＮＡポリメラーゼドメインのみを有する。活性なＨＩＶ ｐ６６／ｐ５１Ｒ
Ｔがクローン化されており、そしてＥ．ｃｏｌｉを含む多数の発現宿主中で良好
に発現されている（Ｌｅ Ｇｒｉｃｅ，Ｓ．Ｆ．Ｊ．、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ、１６３頁（１９９３）に概説されている）。ＨＩＶのｐ６６／ｐ５１へテ
ロ二量体中では、５１ｋＤのサブユニットが触媒的に不活化され、そして６６ｋ
Ｄのサブユニットは、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性の両方
を有する（Ｌｅ Ｇｒｉｃｅ，Ｓ．Ｆ．Ｊ．ら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １
０：３９０５（１９９１）；Ｈｏｓｔｏｍｓｋｙ，Ｚ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６
６：３１７９（１９９２））。鳥類肉腫−白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ（こ
れは、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）
ＲＴ、鳥類赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、鳥類
骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、鳥類細網内皮症
ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、鳥類肉腫ウイルス
ＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、鳥類肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウ
イルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス関連ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症関
連ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴを含むがこれに限定されない）もまた、２つのサブユ
ニット（α（約６２ｋＤａ）およびβ（約９４ｋＤａ））のヘテロ二量体である
。ここでは、αは、タンパク質分解性の切断によりβから誘導される（Ｐｒａｓ
ａｄ，Ｖ．Ｒ．、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、１３５頁に概説さ
れている）。ＡＳＬＶ ＲＴは、２つのさらなる触媒的に活性な構造の形態（β
βおよびα）で存在し得る（Ｈｉｚｉ，Ａ．およびＪｏｋｌｉｋ，Ｗ．Ｋ．，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：２２８１（１９７７））。沈降分析は、αβお
よびββが二量体であり、そしてそのαの形態が、単量体の形態と二量体の形態
との間で平衡して存在することを示唆する（Ｇｒａｎｄｇｅｎｅｔｔ，Ｄ．Ｐ．
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７０：２３０（１９７３
）；Ｈｉｚｉ，Ａ．およびＪｏｋｌｉｋ、Ｗ．Ｋ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２５２：２２８１（１９７７）；およびＳｏｌｔｉｓ，Ｄ．Ａ．およびＳｋａｌ
ｋａ、Ａ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３３
７２（１９８８））。このＡＳＬＶ αβ ＲＴおよびββ ＲＴは、同じタン
パク質複合体中で３つの異なる活性を含むレトロウイルスＲＴの唯一の公知の例
である：ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ Ｈ、およびＤＮＡエンドヌクレアー
ゼ（インテグラーゼ）活性（Ｓｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ（１９９３）、１９３頁）。このα形態は、インテグラーゼドメインおよび
活性を欠失している。
【０００７】 ＡＳＬＶ ＲＴの個々のサブユニットの種々の形態がクローン化され、そして
発現されている。これらとして、９８ｋＤａの前駆体ポリペプチド（これらは、
βαに正常にタンパク質分解的にプロセシングされ、そして４ｋＤａのポリペプ
チドがβカルボキシ末端から除去される（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．６１：５３４（１９８７）およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．ら、Ｆｏｃ
ｕｓ １７：５３（１９９５））、ならびに成熟βサブユニット（Ｗｅｉｓ，Ｊ
．Ｈ．およびＳａｌｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｓ．、米国特許第４，６６３，２９０号（
１９８７）；ならびにＳｏｌｔｉｓ，Ｄ．Ａ．およびＳｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３３７２（１９８８）
）。ヘテロ二量体のＲＳＶ αβ ＲＴもまた、クローン化されたＲＳＶ β遺
伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞から精製されている（Ｃｈｅｒｎｏｖ，Ａ．Ｐ
．ら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．２：４９（１９９１））。公開されているＰＣＴ
公開 ＷＯ９８／４７９１２もまた参照のこと。
【０００８】 （核酸分子の標識） 上記のように、ＲＴによって媒介される逆転写によるｍＲＮＡのｃＤＮＡへの
変換は、クローン化された遺伝子から発現されるタンパク質の研究において必須
の工程である。標識された核酸分子（例えば、標識されたｃＤＮＡ）を作製する
ための核酸分子（特に、ｍＲＮＡ）の逆転写もまた、検出および診断における使
用のための標識されたプローブの作成において重要である。代表的には、蛍光標
識が、このようなプローブの作成において使用される。今日までは、Ｓｕｐｅｒ
ＳｃｒｉｐｔTMＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手
可能なＭＭＬＶ ＲＴのＲＮａｓｅ Ｈマイナス誘導体）が、ｍＲＮＡの鋳型か
らの蛍光標識されたプローブの作成に使用されている（ＤｅＲｉｓｉら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７８：６８０−６８６（１９９７））。しかし、合成の間の蛍光ヌ
クレオチドの取り込み率は比較的低く（２％未満）、おそらく、ＭＭＬＶ ＲＴ
が、核酸合成の間、基質として蛍光標識されたヌクレオチドを効率的に使用する
ことができないことに起因する。従って、核酸鋳型の逆転写の間、標識されたヌ
クレオチド（特に、蛍光標識されたヌクレオチド）のより効率的な取り込みの必
要性が存在する。このようなヌクレオチドの効率的な取り込みは、研究の分野お
よび診断の分野において使用され得る、標識されたプローブの改善された合成を
可能にする。
【０００９】 （発明の要旨） 本発明は、上記の核酸標識の限界を克服することにおいて有用である、逆転写
酵素、そのような酵素を含有している組成物およびキット、ならびに方法を提供
する。一般的には、本発明は、合成された核酸分子を標識するための多サブユニ
ットＲＴ（特に、ヘテロ二量体、およびより詳細には、ＨＩＶ ＲＴおよびＡＳ
ＬＶ ＲＴのような２サブユニットの酵素（例えば、二量体））の使用に関する
。好ましくは、このような標識は、標識されたヌクレオチド（特に、蛍光標識さ
れたヌクレオチド）および１つ以上の核酸鋳型（好ましくは、ＲＮＡ、そして最
も好ましくは、ｍＲＮＡ）の使用を含む。本発明に従って、１つ以上の鋳型の全
てまたは一部に対して相補的である、１つ以上の標識された核酸分子が合成され
る。この標識された核酸分子は、好ましくは、合成された分子に取り込まれた１
つ以上の標識されたヌクレオチドを有し、そして好ましい局面においては、この
標識は、１つ以上の蛍光標識である（これは、同じであり得るかまたは異なり得
る）。
【００１０】 本発明はまた、本発明での使用のための組成物に関し、そしてこのような組成
物は、１つ以上の多サブユニットＲＴ（特に、ＨＩＶおよびＡＳＬＶ ＲＴ）を
含み得る。このような組成物はさらに、１つ以上のヌクレオチド、適切な緩衝液
、および／または１つ以上のＤＮＡポリメラーゼを含み得る。本発明の組成物は
また、１つ以上のプライマーを含み得る。これらの組成物中の逆転写酵素は、好
ましくは、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するか、またはＲＮａｓｅ Ｈ活性が減少し
ているか、もしくは実質的に減少しており、そして最も好ましくは、ラウス肉腫
ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素
、ラウス関連ウイルス（ＲＡＶ）逆転写酵素、骨髄芽球症関連ウイルス（ＭＡＶ
）逆転写酵素、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、または他の
ＡＳＬＶ逆転写酵素からなる群より選択される酵素である。２サブユニットのＲ
Ｔが、本発明の使用に好ましく、そしてこのような酵素は、種々の形態、および
αβ、αα、ββなどのようなこのようなサブユニットの組合せ、ならびにそれ
らの変異体、改変体、または誘導体を含み得る。好ましい組成物においては、逆
転写酵素は、作業濃度で存在する。
【００１１】 本発明はまた、１つ以上の標識された核酸分子を作製するための方法に関する
。この方法は、１つ以上の核酸鋳型（好ましくは、１つ以上のＲＮＡ鋳型、およ
び最も好ましくは１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ鋳型）を、逆転写酵素活性を
有している１つ以上のポリペプチドまたは酵素（好ましくは、１つ以上の多サブ
ユニットＲＴ）と混合する工程、ならびに１つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部
に対して相補的である１つ以上の第１の核酸分子を合成するために十分な条件下
でこの混合物をインキュベートする工程を包含する。ここでは、この少なくとも
１つの上記の合成された分子が標識され、そして／または１つ以上の標識された
ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態においては、この１つ以上の第１の核酸
分子は一本鎖のｃＤＮＡ分子である。本発明のこの局面に従う逆転写酵に適切な
核酸鋳型としては、任意の核酸分子または核酸分子（好ましくは、ＲＮＡ、そし
て最も好ましくは、ｍＲＮＡ）の集団、特に、細胞または組織に由来するものが
挙げられる。好ましい局面においては、ｍＲＮＡ分子の集団（代表的には、細胞
または組織から得られる、多数の異なるｍＲＮＡ分子）が、本発明に従って標識
されたｃＤＮＡライブラリーを作製するために使用される。核酸鋳型の好ましい
細胞の供給源として、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、および動物細胞が挙げら
れる。
【００１２】 本発明はまた、１つ以上の二本鎖の核酸分子を作製するための方法に関する。
このような方法は以下の工程を包含する：（ａ）１つ以上の核酸鋳型（好ましく
は、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ、そしてより好ましくは、ｍＲＮＡ鋳型の集団）を、
逆転写酵素活性を有している１つ以上の本発明のポリペプチド（好ましくは、１
つ以上の多サブユニットＲＴ）と混合する工程；（ｂ）１つ以上の鋳型の全てま
たは一部に対して相補的である１つ以上の第１の核酸分子を作製するのに十分な
条件下で混合物をインキュベートする工程；ならびに（ｃ）１つ以上の第１の核
酸分子の全てまたは一部に対して相補的である１つ以上の第２の核酸分子を作製
するのに十分な条件下で、１つ以上の第１の核酸分子をインキュベートする工程
、それによって第１および第２の核酸分子を含有している１つ以上の二本鎖の核
酸分子を形成させる工程。本発明に従うと、この第１および／第２の核酸分子が
標識される（例えば、１つ以上の同じまたは異なる標識されたヌクレオチドを含
み得る）。従って、標識されたヌクレオチドは、１つまたは両方の合成工程で使
用され得る。このような方法は、１つ以上の二本鎖の核酸分子を作製するプロセ
スの一部としての、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼの使用を含み得る。本発明は
また、このような二本鎖の核酸分子を作製するために有用な組成物に関する。こ
のような組成物は、本発明の１つ以上の逆転写酵素を含み、そして必要に応じて
、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、適切な緩衝液、および／または１つ以上のヌ
クレオチド（好ましくは、標識されたヌクレオチドを含む）を含む。
【００１３】 本発明はまた、上記の方法に従って産生された標識された核酸分子（特に、一
本鎖または二本鎖のｃＤＮＡ分子）、およびこれらの核酸分子を含有しているキ
ットに関する。このような分子またはキットは、核酸分子を検出するため（例え
ば、ハイブリダイゼーションによって）、または診断目的のために、使用され得
る。
【００１４】 本発明はまた、本発明の方法における使用のためのキットに関する。このよう
なキットは、標識された核酸分子（一本鎖または日二本鎖）を作製するために使
用され得る。本発明のキットは、その中に厳重に閉じ込められた状態で、１つ以
上の容器（例えば、バイアル、チューブ、ボトルなど）を有している、キャリア
（例えば、箱またはカートン）を含む。本発明のキットの中では、第１の容器は
、本発明の１つ以上の逆転写酵素（好ましくは、ヘテロ二量体酵素または２サブ
ユニット酵素のような１つ以上のこのような多サブユニット酵素、あるいはそれ
らの改変体、誘導体、または変異体）、または本発明の１つ以上の組成物を含む
。本発明のキットはまた、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは、熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼ）から選択される少なくとも１つの成分、核酸の合成に適
切な緩衝液、および１つ以上のヌクレオチドを、同じまたは異なる容器中に含み
得る。あるいは、キットの成分は、別の容器に分けられ得る。１つの局面におい
ては、本発明のキットは、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するか、またはＲＮａｓｅ
Ｈ活性が減少しているか、もしくは実質的に減少している逆転写酵素を含む。こ
のようなＲＴは、好ましくは、ＲＳＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＡＶ逆
転写酵素、ＭＡＶ逆転写酵素、およびＨＩＶ逆転写酵素からなる群より選択され
る。本発明のさらに好ましいキットにおいては、容器中の酵素（逆転写酵素およ
び／またはＤＮＡポリメラーゼ）は、作業の濃度で存在する。
【００１５】 本発明の他の好ましい実施形態が、本発明の以下の説明および特許請求の範囲
を考慮して当業者に明らかである。
【００１６】 （発明の詳細な説明） （定義） 以下の説明においては、組換えＤＮＡ技術において使用される多数の用語は、
広く利用される。明細書および特許請求の範囲（このような用語を与えられた範
囲を含む）の明らかでありそしてより一貫した理解を提供するために、以下の定
義が提供される。
【００１７】 プライマー。本明細書中で使用される場合、「プライマー」は、一本鎖のオリ
ゴヌクレオチドをいう。これは、核酸分子の増幅または重合の間にヌクレオチド
の単量体の共有結合によって伸張される。
【００１８】 鋳型。用語「鋳型」は、本明細書中で使用される場合は、増幅されるか、合成
されるか、または配列決定される、二本鎖または一本鎖の核酸分子をいう。二本
鎖の分子の場合においては、第１および第２鎖を形成するためのその鎖の変性が
、好ましくは、これらの分子が増幅され得るか、合成され得るか、または配列決
定され得る前に行われるか、あるいは、二本鎖の分子が、鋳型として直接使用さ
れ得る。一本鎖の鋳型については、鋳型の一部に対して相補的である少なくとも
１つのプライマーが、適切な条件下でハイブリダイズされ、そして１つ以上のポ
リメラーゼまたは逆転写酵素が、次いで、上記の鋳型の全てまたは一部に対して
相補的である核酸分子を合成し得る。本発明に従って新しく合成された分子は、
もとの鋳型と同じであり得るか、またはそれよりも短い長さであり得る。
【００１９】 取り込み。用語「取り込み」は、本明細書中で使用される場合は、ＤＮＡおよ
び／またはＲＮＡ分子、あるいはプライマーの一部となることを意味する。
【００２０】 ヌクレオチド。本明細書中で使用される場合は、「ヌクレオチド」は、塩基−
糖−リン酸の組合せをいう。ヌクレオチドは、核酸配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）
の単量体のユニットである。用語ヌクレオチドは、リボヌクレオシド三リン酸で
あるＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＧ、ＧＴＰ、およびデオキシリボヌクレオシド三リン
酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、
またはそれらの誘導体）を含む。このような誘導体として、例えば、［αＳ］ｄ
ＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、および７−デアザ−ｄＡＴＰ、ならびにその中
に含有している核酸分子に対してヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導
体が挙げられる。用語ヌクレオチドは、本明細書中で使用される場合は、また、
ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびそれらの誘導体をい
う。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の説明的な例として、ｄｄＡＴＰ、ｄ
ｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが挙げられるが、これら
に限定されない。本発明に従うと、「ヌクレオチド」は、標識されないか、また
は周知の技術によって検出可能に標識され得る。検出可能な標識として、例えば
、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生体発光標識、および酵素標識が
挙げられる。ヌクレオチドの蛍光標識として、フルオレセイン、５−カルボキシ
フルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５−ジクロロ−６−カ
ルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（
Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（Ｔ
ＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’ジメチル
アミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、カスケードブルー（Ｃａｓｃ
ａｄｅ Ｂｌｕｅ）、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ）、テキサ
スレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）、および５−（
２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）が挙げ
られ得るが、これらに限定されない。蛍光標識されたヌクレオチドの特異的な例
として、以下が挙げられる：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔ
ｙ，ＣＡ．から入手可能な、［Ｒ６Ｇ］ｄＵＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＵＴＰ、［
Ｒ１１０］ｄＣＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＣＴＰ、［ＪＯＥ
］ｄｄＡＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ＦＡＭ］ｄｄＣＴＰ、［Ｒ１１０］ｄ
ｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、［ＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ、［ｄＲ６Ｇ］ｄ
ｄＡＴＰ、［ｄＲ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ｄＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、および［
ｄＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ａｒｌｉｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ
，ＩＬから入手可能な、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ ＤｅｏｘｙＮｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅｓ，ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ
５−ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ ＦｌｕｏｒＸ−ｄＣＴＰ、Ｆｌｕｏｒｏ
Ｌｉｎｋ Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、およびＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５−ｄＵＴＰ
；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ
から入手可能な、フルオレセイン−１５−ｄＡＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄ
ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、ＩＲ770−９−ｄＡＴＰ、フ
ルオレセイン−１２−ｄｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、およびフル
オレセイン−１５−２’−ｄＡＴＰ；ならびに、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから入手可能な、ＣｈｒｏｍａＴｉｄｅ標識ヌクレオ
チド、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−４−ＵＴＰ、
ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−１４−ｄＵＴＰ
、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−１４−ｄＵＴＰ、
カスケードブルー−７−ＵＴＰ、カスケードブルー−７−ｄＵＴＰ、フルオレセ
イン−１２−ＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、オレゴングリーン４８
８−５−ｄＵＴＰ、ローダミングリーン−５−ＵＴＰ、ローダミングリーン−５
ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６
−ｄＵＴＰ、テキサスレッド−５−ＵＴＰ、テキサスレッド−５−ｄＵＴＰ、お
よびテキサスレッド−１２−ｄＵＴＰ。
【００２１】 オリゴヌクレオチド。「オリゴヌクレオチド」は、１つのヌクレオチドのデオ
キシリボースまたはリボースの３’位置と隣接しているヌクレオチドのデオキシ
リボースまたはリボースの５’位置との間でのホスホジエステル結合によって連
結されている、ヌクレオチドの共有結合された配列を含有している、合成または
天然の分子をいう。
【００２２】 ハイブリダイゼーション。用語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリ
ダイズする」は、二本鎖の分子を生じるような２つの相補的な一本鎖の核酸分子
（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の塩基対合をいう。本明細書中で使用される場
合は、２つの核酸分子がハイブリダイズされ得るが、塩基対合は、完全には相補
的ではない。従って、不適合である塩基は、当該分野で周知である適切な条件が
使用される限りにおいては、２つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨げな
い。
【００２３】 プローブ。用語プローブは、１つ以上の検出可能なマーカーまたは標識によっ
て検出可能に標識される、一本鎖または二本鎖の核酸分子またはオリゴヌクレオ
チドをいう。このような標識またはマーカーは、同じであり得るかまたは異なり
得、そして放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、生体発光標識、および酵素標
識を含み得るが、１つ以上の蛍光標識（これは同じであるか、または異なる）が
本発明に従うと好ましい。プローブは、ハイブリダイゼーションによる核酸分子
の検出において特異的な有用性を有し、そして従って、診断アッセイにおいて使
用され得る。
【００２４】 概説 本発明は、核酸分子の逆転写の間にしばしば観察される、標識限界を克服する
ことにおいて有用である、キット、組成物、および方法を提供する。従って、本
発明は、これまでは可能ではなかった標識された核酸分子（詳細には、ｃＤＮＡ
分子）の産生を容易にする。
【００２５】 一般的には、本発明は、標識された核酸分子を産生するための核酸分子の逆転
写における使用のための組成物を提供する。このような組成物は、１つ以上の逆
転写酵素（好ましくは、１つ以上の多サブユニットＲＴ）を含み得る。これらの
組成物中の酵素は、好ましくは、作業濃度で存在し、そしてＲＮａｓｅ Ｈ活性
を有するかまたはＲＮａｓｅ Ｈ活性が減少しているか、もしくは実質的に減少
している。しかし、酵素（そのいくつかはＲＮａｓｅ Ｈ活性を有しており、そ
していくつかはＲＮａｓｅ Ｈ活性が減少しているか、または実質的に減少して
いる）の混合物が、本発明の組成物において使用され得る。好ましい逆転写酵素
として、ＲＳＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＡＶ逆転写酵素、ＭＡＶ逆転
写酵素、およびＨＩＶ逆転写酵素、または他のＡＳＬＶ逆転写酵素が挙げられる
。
【００２６】 本発明はまた、１つ以上の核酸分子の逆転写のための方法にも関する。この方
法は、１つ以上の核酸鋳型（これは、好ましくは、ＲＮＡであるかまたはメッセ
ンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり、そしてより好ましくは、ｍＲＮＡ分子の集
団である）を、逆転写酵素活性を有している１つ以上のポリペプチド（好ましく
は、多サブユニットＲＴ）と混合する工程、ならびに１つ以上の鋳型の全てまた
は一部に対して相補的である１つ以上の標識された核酸分子を作成するために十
分な条件下で混合物をインキュベーションする工程を包含する。１つ以上の鋳型
に対して相補的である核酸分子（単数または複数）を作成するために、少なくと
も１つのプライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ）プライマー）および１つ以上のヌ
クレオチド（好ましくは標識された部分、最も好ましくは蛍光標識された部分）
が、３’から５’方向での核酸の合成のために使用される。本発明のこの局面に
従う逆転写に適切な核酸鋳型として、任意の核酸分子、特に、原核生物細胞また
は真核生物細胞に由来するものが挙げられる。このような細胞として、正常な細
胞、疾患の細胞、形質転換された細胞、樹立細胞、先祖細胞、前駆体細胞、胎児
の細胞、胚性の細胞、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞（ヒトの細胞を含む）、鳥
類細胞、植物細胞など、または植物もしくは動物（例えば、ヒト、ウシ、ブタ、
マウス、ヒツジ、ウマ、サル、イヌ、ネコ、ラット、ウサギ、鳥類、魚、昆虫な
ど）から単離された組織が挙げられ得る。このような核酸分子はまた、ウイルス
から単離され得る。
【００２７】 本発明はまた、上記の方法に従って産生された標識された核酸分子を提供する
。このような標識された核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得、そして検出
プローブとして有用である。合成の間に使用される標識されたヌクレオチド（単
数または複数）に依存して、標識された分子は、１つまたは多数の標識を含み得
る。複数の標識が使用される場合は、分子は、多数の同じまたは異なる標識を含
み得る。従って、１つの型または多数の異なる標識されたヌクレオチドが、本発
明の標識された核酸分子を提供するために、核酸分子の合成の間に使用され得る
。このような標識された核酸分子は、従って、１つ以上の標識されたヌクレオチ
ドを含む（これは、同じであり得るかまたは異なり得る）。
【００２８】 本発明はまた、本発明に従う使用のためのキットを提供する。このようなキッ
トは、その中の閉じられた制限の中に１つ以上の容器手段（例えば、バイアル、
チューブ、ボトルなど）を有している、キャリア手段（例えば、箱またはカート
ン）を含む。ここでは、キットは、同じまたは異なる容器中に、１つ以上の逆転
写酵素を含む。本発明のキットは、同じまたは異なる容器中に、１つ以上のＤＮ
Ａポリメラーゼ、１つ以上のプライマー、１つ以上の適切な緩衝液、および／ま
たは１つ以上のヌクレオチド（例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴ
Ｐ）、そして好ましくは、蛍光標識されたｄＮＴＰ）を含み得る。
【００２９】 好ましい局面においては、本発明において使用されるＲＴは、２つ以上のサブ
ユニット（またはそれらの誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変異体）を
含み、そして好ましくは、２つのサブユニット（例えば、二量体またはヘテロニ
量体）を含む。２サブユニットの逆転写酵素は、代表的には、二量体を形成する
αおよびβサブユニットを有するが、サブユニット（およびそのようなサブユニ
ットの誘導体、改変体、または変異体）の任意の形態または組み合わせが使用さ
れ得る。このような組合せとして、αβ、ββ、ααなどが挙げられ得る。本発
明での使用に好ましい２サブユニットのＲＴとして、ＨＩＶ ＲＴ、ＲＳＶ Ｒ
Ｔ、ＡＭＶ ＲＴ、ＡＥＶ ＲＴ、ＲＡＶ ＲＴ、ＨＩＶ ＲＴ、およびＭＡＶ
ＲＴ、または他のＡＳＬＶ ＲＴ、あるいはそれらの変異体、改変体、または
誘導体が挙げられる。好ましい局面においては、ＡＭＶ ＲＴおよび／またはＲ
ＳＶ ＲＴが、本発明に従って使用される。本発明での使用のための逆転写酵素
は、天然の供給源または組換えの供給源から得ることができる。例えば、公開さ
れているＰＣＴ出願番号第ＷＯ９８／４７９１２号を参照のこと。あるいは、本
発明での使用のための逆転写酵素は、商業的に、すなわち例えば、Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ）、またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手することができる。関連する
局面においては、本発明のＲＴの少なくとも１つのサブユニットが、ＲＮａｓｅ
Ｈ活性を減少させるか、実質的に減少させるか、または排除するように、酵素
の活性に影響を与えるように改変され得るかまたは突然変異させられ得る。本発
明での使用のための好ましいＲＴとして、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
，Ｉｎｃ．から入手可能であるＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMおよびＴｈｅｒｍｏ
ＳｃｒｉｐｔTMＩＩ、ならびに第ＷＯ９８／４７９１２号（その全体において本
明細書中で参考として援用されている）に記載されている他のものが、挙げられ
る。
【００３０】 本発明に従うと、標識された生成物の量は、好ましくは、当業者によって決定
され得、そして実施例において議論されるような、合成された生成物中への目的
の標識の取り込みの割合に基づいて測定される。しかし、生成物の標識の量また
は効率を測定する他の手段が、当業者によって認識される。本発明は、鋳型から
の核酸分子の合成の間の、好ましくは、ＲＮＡからの１つ以上のｃＤＮＡ分子の
合成の間の、標識ヌクレオチドの取り込みの割合の増強または増大を提供する。
本発明に従うと、取り込みの割合におけるこのような増強または増大は、好まし
くは、ＭＭＬＶ ＲＴおよび好ましくは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
，Ｉｎｃ．から入手可能なＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTMまたはＳｕｐｅｒＳｃｒｉ
ｐｔTMＩＩのような標準的な逆転写酵素と比較して、取り込みの割合において２
倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、もしくは５０倍
以上増大または増強される。別の局面においては、合成の間の標識ヌクレオチド
（好ましくは蛍光ヌクレオチド）の取り込みの割合は、約５％以上大きい、約７
．５％以上大きい、約１０％以上大きい、約１５％以上大きい、約２０％以上大
きい、約２５％以上大きい、約３０％以上大きい、約４０％以上大きい、あるい
は、約５０％以上大きい。
【００３１】 本発明で使用するための酵素として、ＲＮａｓｅ Ｈ活性が減少しているかま
たは実質的に減少している酵素が挙げられ得る。ＲＮａｓｅ Ｈ活性が減少して
いるかまたは実質的に減少しているこのような酵素は、目的の逆転写酵素中のＲ
Ｎａｓｅ Ｈドメインを変異させることによって、好ましくは、上記のような１
つ以上の点変異、１つ以上の欠失変異、および／または１つ以上の挿入変異によ
って獲得し得る。一般的には、米国特許第５，６６８，００５号、および公開さ
れているＰＣＴ出願第ＷＯ９８／４７９１２号を参照のこと。「ＲＮａｓｅ Ｈ
活性が実質的に減少した」酵素は、野生型のモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ
−ＭＬＶ）、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、またはラウス肉腫ウイルス（
ＲＳＶ）逆転写酵素のような対応する野生型酵素またはＲＮａｓｅ Ｈ+酵素の
ＲＮａｓｅ Ｈ活性の、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、より好ま
しくは、約１５％未満、約１０％未満、約７．５％未満、または約５％未満、そ
して最も好ましくは、約５％未満または約２％未満を有する酵素を意味する。任
意の酵素のＲＮａｓｅ Ｈ活性は、例えば、米国特許第５，２４４，７９７号、
Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：２６５
（１９８８）、Ｇｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．ら、ＦＯＣＵＳ １４（５）：９１（１
９９２）、および米国特許第５，６６８，００５号（それらの全ての開示は、本
明細書中で完全に参考として援用されている）に記載されているアッセイのよう
な種々のアッセイによって決定され得る。
【００３２】 本発明における使用に好ましい酵素として、ＲＳＶ Ｈ-逆転写酵素、ＡＭＶ
Ｈ-逆転写酵素、ＲＡＶ Ｈ-逆転写酵素、ＭＡＶ Ｈ-逆転写酵素、およびＨ
ＩＶ Ｈ-逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されない（一般的には、第
ＷＯ９８／４７９１２号を参照のこと）。本発明において使用される特に好まし
い酵素として、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能な
ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTM、およびＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩＩが挙げら
れる。しかし、ＲＮａｓｅ Ｈ活性が実質的に減少している、リボ核酸分子から
ＤＮＡ分子を産生し得る（すなわち、逆転写酵素活性を有している）任意の酵素
が、本発明の組成物、方法、およびキットにおいて同等に使用され得ることが、
当業者によって理解される。
【００３３】 種々のＤＮＡポリメラーゼが、本発明に従って有用である。このようなポリメ
ラーゼとして、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａ
ｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅ
ａｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍ
ａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌ
ｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴTM）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮ
ＴTMＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮ
Ａポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂ
ｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｃ
ａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕ
ｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈ
ｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆ
ｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮ
Ａポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥTM ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕ
ｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｓｐｐ．ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｔｂ，Ｍｌｅｐ）、ならびにそれらの
変異体、改変体、および誘導体。
【００３４】 本発明に従って使用されるＤＮＡポリメラーゼは、核酸鋳型からＤＮＡ分子を
合成し得る（代表的には、５’から３’の方向で）任意の酵素であり得る。この
ようなポリメラーゼは、中温性（ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ）であり得るかまたは高
温性であり得るが、好ましくは、高熱性である。中温性のポリメラーゼとして、
Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｗｉｅｍａｎｎ，Ｓ．
ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ １８：６８８（１９９５）およびＶｏｓｓ，Ｈ
．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ ２３：３１２（１９９７））、Ｋｌｅｎｏｗ
フラグメントＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩなどが挙げられる
。好ましいＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ
ａｑ（Ｖｏｓｓ，Ｈ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ ２３：３１２（１９９７
））、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、ＶＥＮＴTM、ＤＥＥＰＶＥＮＴTMＴｔｈ（Ｃｈ
ａｎｇ，Ｈ．ら、Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １７６：２３５（１９９４）
）、ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体である（米国特許第５，４
３６，１４９号；米国特許第５，５１２，４６２号；ＷＯ９２／０６１８８号；
ＷＯ９２／０６２００号；ＷＯ９６／１０６４０号；Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．、
Ｇｅｎｅ １１２：２９−３５（１９９２）；Ｌａｗｙｅｒ，Ｆ．Ｃ．ら、ＰＣ
Ｒ Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２：２７５−２８７（１９９３）；Ｆｌａｍａｎ，Ｊ
．−Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（１５）：３２５９−３２６
０（１９９４））。長い核酸分子（例えば、３〜５Ｋｂより長い長さの核酸分子
）の増幅については、少なくとも２つのＤＮＡポリメラーゼ（１つは３’エキソ
ヌクレアーゼ活性を実質的に欠失しており、そして他方は３’エキソヌクレアー
ゼ活性を有している）が、代表的には使用される。米国特許第５，４３６，１４
９号；米国特許第５，５１２，４６２号；およびＢａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｇｅ
ｎｅ １１２：２９−３５（１９９２）を参照のこと。これらの全ての開示が、
それらの全体において本明細書中で参考として援用されている。
【００３５】 （酵素組成物の処方） 本発明の組成物を形成するために、１つ以上の逆転写酵素が、好ましくは緩衝
化食塩水中で混合される。１つ以上のＤＮＡポリメラーゼおよび／または１つ以
上のヌクレオチド（好ましくは、１つ以上の蛍光ヌクレオチド（これらは、同じ
であっても異なっても良い）を含む）が、必要に応じて、本発明の組成物を作製
するために添加され得る。本発明の組成物はまた、１つ以上の核酸鋳型および／
または１つ以上のプライマーを含み得る。より好ましくは、酵素は、安定な緩衝
化食塩水中で作業濃度で提供される。用語「安定（な）」および「安定性」は、
本明細書中で使用される場合は、一般的には、酵素または酵素を含有している組
成物が、約４℃の温度で約１週間、約−２０℃の温度で約２〜６ヶ月間、そして
約−８０℃の温度で約６ヶ月以上保存された後に、もとの酵素活性（ユニットで
）の、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは
少なくとも９０％が、組成物（例えば、酵素組成物）によって保持されることを
意味する。本明細書中で使用される場合は、用語「作業濃度」は、特定の機能（
例えば、核酸の逆転写）を実行するために溶液中で使用される最適な濃度、また
はその最適濃度付近の、酵素の濃度を意味する。
【００３６】 本発明の組成物を形成する際に使用される水は、好ましくは、蒸留され、脱イ
オン化され、そして滅菌濾過され（０．１〜０．２μｍのフィルターを通して）
、そしてＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ酵素の夾雑物を含まない。このような水は
、例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏ
ｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から市販されているか、または必要とされるように
当業者に周知の方法に従って作製され得る。
【００３７】 酵素成分に加えて、本発明の組成物は好ましくは、ｃＤＮＡ分子のような標識
された核酸分子の合成のために必須の、１つ以上の緩衝液および補因子を含む。
本発明の組成物を形成する際の使用に特に好ましい緩衝液は、酢酸塩、硫酸塩、
塩酸塩、リン酸塩、またはＴｒｉｓ−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲ
ＩＳ（登録商標））の遊離の酸の形態であるが、ＴＲＩＳ（登録商標）とほぼ同
じイオン強度およびｐＫａの別の緩衝液が、同等の結果を伴って使用され得る。
緩衝塩に加えて、補因子の塩（例えば、カリウムの塩（好ましくは、塩化カリウ
ムまたは酢酸カリウム）およびマグネシウムの塩（好ましくは、塩化マグネシウ
ムまたは酢酸マグネシウム））が、組成物中に含まれる。組成物および／または
合成反応混合物への１つ以上の炭水化物および／または糖の添加もまた、保存の
際の組成物および／または反応混合物の増強された安定性を支持するために有利
であり得る。本発明の組成物および／または合成反応混合物中への包含に好まし
いこのような炭水化物または糖として、スクロース、トレハロースなどが挙げら
れるが、これらに限定されない。さらに、このような炭水化物および／または糖
は、本発明の酵素組成物およびキットの作製において使用される酵素についての
保存緩衝液に添加され得る。このような炭水化物および／または糖は、多数の供
給源（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む）から市販されている。
【００３８】 最初に緩衝塩、補因子の塩、および炭水化物、または糖を、水中に作業濃度で
溶解し、そして酵素の添加の前に溶液のｐＨを調整することが、しばしば好まし
い。この方法においては、ｐＨ−感受性の酵素は、本発明の組成物の処方の間に
、酸によって媒介される不活化またはアルカリによって媒介される不活化にあま
り供されない。
【００３９】 本発明の組成物中のＲＴの濃度は、使用される逆転写酵素の型に依存して変化
し得る。例えば、ＡＭＶ ＲＴ、ＭＡＶ ＲＴ、ＲＳＶ ＲＴ、およびＲＡＶ
ＲＴは、好ましくは、約１００から約５０００ユニット／ｍｌ、約１２５から約
４０００ユニット／ｍｌ、約１５０から約３０００ユニット／ｍｌ、約２００か
ら約２５００ユニット／ｍｌ、約２２５から約２０００ユニット／ｍｌの溶液中
での作業濃度で、そして最も好ましくは、約２５０から約１０００ユニット／ｍ
ｌの作業濃度で添加される。高温性のＤＮＡポリメラーゼのグループの酵素、な
らびにそれらの変異体、改変体、および誘導体は、好ましくは、約１００から約
１０００ユニット／ｍｌ、約１２５から約７５０ユニット／ｍｌ、約１５０から
約７００ユニット／ｍｌ、約２００から約６５０ユニット／ｍｌ、約２２５から
約５５０ユニット／ｍｌの溶液中での作業濃度で、そして最も好ましくは、約２
５０から約５００ユニット／ｍｌの作業濃度で添加される。酵素は、任意の順序
で溶液に添加され得るか、または同時に添加され得る。
【００４０】 本発明の組成物はさらに、１つ以上のヌクレオチド（好ましくは、蛍光ヌクレ
オチドで部分）を含み得る。これは、好ましくは、デオキシヌクレオシド三リン
酸（ｄＮＴＰ）である。本発明の組成物のｄＮＴＰ成分は、新しく合成された核
酸の「成形（ｂｕｉｌｄｉｎｇ）」ブロックとして作用し、ポリメラーゼまたは
逆転写酵素の作用によってその中に取り込まれる。
【００４１】 （核酸またはｃＤＮＡ分子の産生） 本発明に従って、核酸またはｃＤＮＡ分子（一本鎖または二本鎖）が、種々の
核酸鋳型分子から調製され得る。本発明における使用に好ましい鋳型としては、
一本鎖または二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ分子、ならびに二本鎖のＤＮＡ：ＲＮ
Ａハイブリッドが挙げられる。より好ましい鋳型としては、メッセンジャーＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ）分子、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子、およびリボソー
マルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子が挙げられるが、ｍＲＮＡ分子が、本発明に従うと
好ましい鋳型である。
【００４２】 好ましくは、核酸鋳型は、種々の細胞、組織、器官、または生物体のような、
天然の供給源から得ることができる。核酸分子の供給源として使用され得る細胞
は、原核生物（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ
、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｌｅｇｉｏ
ｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉ
ｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の種を
含むがこれらに限定されない、細菌細胞）、あるいは、真核生物（真菌（特に、
酵母）、植物、原生動物および他の寄生虫、ならびに動物（昆虫（特に、Ｄｒｏ
ｓｏｐｈｉｌａ種の細胞）、線虫（特に、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌ
ｅｇａｎｓ細胞）、および哺乳動物（特に、ヒトの細胞）を含む）を含む）であ
り得る。
【００４３】 核酸の供給源として使用され得る哺乳動物の体細胞としては、血球（網状赤血
球および白血球）、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞（中枢神経系または抹消神経
系に由来する）、筋肉細胞（骨格筋、平滑筋、心筋に由来する筋細胞および筋芽
細胞を含む）、結合組織の細胞（繊維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞
、骨細胞、および骨芽細胞を含む）、ならびに他の間質細胞（例えば、マクロフ
ァージ、樹状細胞、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞）が挙げられる。哺乳動物の生殖細胞（
精母細胞および卵母細胞）もまた、上記の体細胞および生殖細胞を生じる先祖細
胞、前駆細胞、および幹細胞であり得る場合には、本発明での使用のための核酸
の供給源として使用され得る。脳、腎臓、肝臓、膵臓、血液、骨髄、筋肉、神経
、皮膚、尿生殖器、循環器、リンパ系、胃腸系、および結合組織の供給源に由来
する組織または器官、ならびに哺乳動物（ヒトを含む）の胚または胎児に由来す
る組織または器官のような、哺乳動物の組織または器官もまた核酸の供給源とし
ての使用に適切である。
【００４４】 任意の上記の原核生物または真核生物の、細胞、組織、および器官は、正常な
もの、疾患のもの、形質転換されたもの、確立されたもの、先祖のもの、前駆体
のもの、胎児のもの、または胚性のものであり得る。疾患の細胞として、例えば
、感染性の疾患（細菌、真菌、または酵母、ウイルス（ＡＩＤＳ、ＨＩＶ、ＨＴ
ＬＶ、ヘルペス、肝炎などを含む）または寄生虫によって引き起こされる）、遺
伝的または生化学的な病理（例えば、嚢胞性繊維症、血友病、アルツハイマー病
、筋ジストロフィー、または多発性硬化症）、あるいは癌性のプロセスに関連す
るものが挙げられ得る。形質転換された動物細胞株または確立された動物細胞株
として、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬ
ａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｋ５６２細胞、２９３細胞、Ｌ９２９細胞、Ｆ９細胞
などが挙げられ得る。本発明での使用のための核酸の供給源として適した他の細
胞、細胞株、組織、器官、および生物体が、当業者に明らかである。
【００４５】 一旦、出発細胞、組織、器官、または他のサンプルが得られると、核酸鋳型（
例えば、ｍＲＮＡ）は、当該分野で周知の方法によってそれらから単離され得る
（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｃｅｌｌ １５：６８７−７０１（１９
７８）；Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２：１６１−１７０（１９８２）；Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．およびＨｏｆｆｍａ
ｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ ２５：２６３−２６９（１９８３）を参照のこと）。
このように単離された核酸分子は、次いで、本発明に従ってｃＤＮＡ分子および
ｃＤＮＡライブラリーを調製するために使用され得る。
【００４６】 本発明の実施においては、標識されたｃＤＮＡ分子または標識されたｃＤＮＡ
ライブラリーが、上記のように得られた１つ以上の核酸分子（好ましくは、ｍＲ
ＮＡ分子の集団のような１つ以上のｍＲＮＡ分子である）を、本発明の逆転写酵
素活性を有している１つ以上のポリペプチドと、または本発明の１つ以上の組成
物と、そして好ましくは、本発明の１つ以上のＲＳＶ ＲＴおよび／またはＡＭ
Ｖ ＲＴおよび／または他のＡＳＬＶ ＲＴと、１つ以上の標識されたｃＤＮＡ
分子（一本鎖または二本鎖）を形成するような酵素または組成物の作用による核
酸分子の逆転写に好ましい条件下で混合することによって産生される。従って、
本発明の方法は、以下の工程を包含する：（ａ）１つ以上の核酸鋳型（好ましく
は、１つ以上のＲＮＡまたはｍＲＮＡ鋳型（例えば、ｍＲＮＡ分子の集団））を
、１つ以上の本発明の逆転写酵素と混合する工程、および（ｂ）１つ以上の鋳型
の全てまたは一部に対して相補的である１つ以上の標識された核酸分子を作成す
るために十分な条件下で混合物をインキュベートする工程。本発明は、ｃＤＮＡ
分子またはライブラリーを産生するために、以下の実施例に記載されているよう
なｃＤＮＡの合成の方法と、または当該分野で周知である他の方法と組合せて使
用され得る（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．およびＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｇ
ｅｎｅ ２５：２６３−２６９（１９８３）；Ｋｒｕｇ，Ｍ．Ｓ．およびＢｅｒ
ｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３１６−３２５（１９
８７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ、８．６０−８．６３頁（１９８９）を参照のこと）。
【００４７】 他の局面においては、本発明は、核酸分子を増幅するための方法において使用
され得る。本発明のこの局面に従う核酸の増幅方法は、１工程（例えば、１工程
のＲＴ−ＰＣＲ）反応であり得るかまたは２工程（例えば、２工程のＲＴ−ＰＣ
Ｒ）反応であり得る。本発明に従うと、１工程のＲＴ−ＰＣＲ型の反応は１つの
チューブ中で達成され得、それによって混入の可能性を低くする。このような１
工程の反応は、以下の工程を包含する：（ａ）核酸鋳型（例えば、ｍＲＮＡ）を
、本発明の逆転写酵素活性を有している１つ以上のポリペプチド、および１つ以
上のＤＮＡポリメラーゼと混合する工程、ならびに（ｂ）鋳型の全てまたは一部
に相補的である標識された核酸分子を増幅するために十分な条件下で混合物をイ
ンキュベートする工程。あるいは、増幅は、鋳型を、本発明の逆転写酵素活性を
有している１つ以上のポリペプチドと混合することによって達成され得る。この
ような反応混合物の、適切な条件下でのインキュベーションは、鋳型の全てまた
は一部に対して相補的である標識された核酸分子の増幅を可能にする。このよう
な増幅は、逆転写酵素活性のみによって、またはＤＮＡポリメラーゼと組合せて
達成され得る。２工程のＲＴ−ＰＣＲ反応は、２つの異なる工程において達成さ
れ得る。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）核酸鋳型（例えば、
ｍＲＮＡ）を、本発明の１つ以上の逆転写酵素と混合する工程、（ｂ）鋳型の全
てまたは一部に相補的である標識された核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）を作成
するために十分な条件下でこの混合物をインキュベートする工程、（ｃ）標識さ
れた核酸分子と１つ以上のＤＮＡポリメラーゼを混合する工程、ならびに（ｄ）
標識された核酸分子を増幅するために十分な条件下で工程（ｃ）の混合物をイン
キュベートする工程。長い核酸分子（例えば、約３〜５Ｋｂの長さよりも長い）
の増幅のためには、ＤＮＡポリメラーゼの組合せ（例えば、３’エキソヌクレア
ーゼ活性を有している１つのＤＮＡポリメラーゼおよび３’エキソヌクレアーゼ
活性が実質的に減少している別のＤＮＡポリメラーゼ）が、使用され得る。
【００４８】 本発明に従って使用され得る増幅方法として、ＰＣＲ（米国特許第４，６８３
，１９５号および同第４，６８３，２０２号）、鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄ
ｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ；米国特許第
５，４５５，１６６号；第ＥＰ ０ ６８４ ３１５号）、および核酸配列に基
づく増幅（ＮＡＳＢＡ；米国特許第５，４０９，８１８号；第ＥＰ ０ ３２９
８２２号）が挙げられる。
【００４９】 （キット） 別の実施形態においては、本発明は、核酸分子の逆転写または増幅における使
用のためのキットに組み立てられ得る。本発明のこの局面に従うキットは、その
中の閉じられた制限の中に１つ以上の容器手段（例えば、バイアル、チューブ、
アンプル、ボトルなど）を有している、キャリア手段（例えば、箱、カートン、
チューブなど）を含む。ここでは、第１の容器手段は、逆転写酵素活性を有して
いる本発明の１つ以上のポリペプチドを含む。本発明のキットはまた、（同じ容
器中または異なる容器中に）１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、適切な緩衝液、１
つ以上のヌクレオチド（好ましくは、同じであり得るかまたは異なり得る１つ以
上の蛍光ヌクレオチドを含む）、および／または１つ以上のプライマーを含み得
る。
【００５０】 本発明の特異的な局面においては、逆転写および増幅のキットは、本発明の逆
転写酵素活性を有している１つ以上のポリペプチドを含有している１つ以上の成
分（混合物中または別々に）、標識された核酸分子の合成に必要とされる１つ以
上のヌクレオチド、および／または１つ以上のプライマー（例えば、逆転写のた
めのオリゴ（ｄＴ））を含み得る。このような逆転写および増幅のキットはさら
に、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼを含み得る。本発明の逆転写および増幅のキ
ットでの使用に適切である、逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチ
ド、プライマー、および他の成分を有している好ましいポリペプチドとしては、
本明細書中に記載されているものが挙げられる。本発明のこの局面によって含ま
れるキットはさらに、標準的な核酸の逆転写または増幅プロトコールを実行する
ために必須のさらなる試薬および化合物を含み得る。このようなキットはまた、
本発明に従う核酸分子を標識するための説明書を含み得る。
【００５１】 本明細書中に記載されている方法および適用に対する他の適切な改変および適
応が、明らかであり、そして本発明の範囲またはその任意の実施形態の範囲を逸
脱することなく行われ得ることが、当業者に容易に明らかである。ここでは本発
明が詳細に記載されるが、同じものが、以下の実施例を参照してさらに明らかに
理解される。以下の実施例は、本発明を説明する目的のみのために本明細書中に
含まれ、そして本発明を限定するようには意図されない。
【００５２】 （実施例） （蛍光ヌクレオチドを使用する第１鎖のｃＤＮＡの合成。） ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTMＩＩ反応については、Ｃｙ３−ｄＵＴＰまたはＲ１
１０−ｄＵＴＰを、１μｇのオリゴｄ（Ｔ）２５マーでプライムした１μｇのＨ
ｅｌａ ｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡ中に取り込んだ。しかし、ＡＭＶ ＲＴお
よびＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTM反応については、０．５μｇのオリゴｄ（Ｔ）
２５マーを、１μｇのＨｅｌａ ｍＲＮＡをプライムするために使用した。この
混合物を、７０℃で１０分間加熱し、次いで１０分間氷上に移した。反応条件を
、逆転写酵素間で変化した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩTM反応の緩衝液は、５
０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣ
ｌ2、１０ｍＭのＤＴＴ、１μＣｉのＰ32α−ｄＣＴＰ、５００μＭのｄＮＴＰ
、および１００μＭの蛍光ｄＵＴＰを含んだ。ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTM反応
の緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、７５ｍＭのＫＣｌ、
７．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴ、２μＣｉのＰ32α−ｄＣＴＰ、１
ｍＭのｄＮＴＰ、および２００μＭの蛍光ｄＵＴＰを含んだ。ＡＭＶ ＲＴ反応
の緩衝液は、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１００ｍＭのＫＣ
ｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴ、０．５μＣｉのＰ32α−ｄＣＴ
Ｐ、２５０μＭのｄＮＴＰ、および１００μＭの蛍光ｄＵＴＰを含んだ。反応緩
衝液を、Ｈｅｌａ ｍＲＮＡおよびオリゴｄ（Ｔ）２５マーの混合物に対して添
加した。２００ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩTM、１５ユニットのＴ
ｈｅｒｍｏ ＳｃｒｉｐｔTM、または７．５ユニットのＡＭＶ ＲＴを、この反
応において使用した。次いで、この反応物を、ＲＴの最適な反応温度（Ｓｕｐｅ
ｒＳｃｒｉｐｔTMＩＩについては４５℃、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｒｉｐｔTMについ
ては５５℃、そしてＡＭＶ ＲＴについては４２℃）で１時間、インキュベート
した。２μｌの反応混合物をピペッティングし、そして最終５０μｌの２０ｍＭ
のＥＤＴＡ溶液中で５μｇの酵母のｔＲＮＡと混合した。このＥＤＴＡ溶液を、
第１鎖のｃＤＮＡの収量の計算に使用した。
【００５３】 （ＴＣＡ沈降および第１鎖のｃＤＮＡ合成の収量の計算） 二連の１０μｌのサンプル（２０ｍＭのＥＤＴＡ溶液から）を、ガラスファイ
バーフィルター上にスポットし、そして１５分間熱ランプ上で乾燥した。１セッ
トのフィルターを、氷冷した１０％（ｗ／ｖ）のＴＣＡ溶液で１回、そして５％
のＴＣＡ溶液（１０分、予備洗浄）で２回、室温で洗浄した。洗浄後、フィルタ
ーを、９５％のエタノールで５分間洗浄し、次いで熱ランプ上で乾燥した。洗浄
したフィルターおよび洗浄していないフィルターを、反応物中のＰ32の量、およ
び取り込まれたＰ32の量を決定するために、標準的なシンチレーション（ｓｃｉ
ｎｔｉｌｌａｎｔ）において計数した。第１鎖の合成の収量の計算のために使用
した式は以下のとおりである：
【００５４】
【数１】 （蛍光ヌクレオチドの取り込みの吸光度） ２〜４μｌの第１鎖の反応混合物を取っておき、これを、「標準」として使用
し、そして残りの１６〜１８μｌの第１鎖の反応混合物を、２分の１の容量のＮ
Ｈ4Ａｃ、および２．５倍の容量のエタノール、およびキャリアとしての５μｇ
の酵母のｔＲＮＡを用いて、沈殿した。沈殿後、ペレットを、バックグラウンド
の蛍光を下げるために７０％のエタノールで２回洗浄した。沈殿物を、５０ｍＭ
のＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中に再懸濁し、そして蛍光ヌクレオチドの取り
込みを決定した。「標準」を、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液中に稀釈し、そして吸
光度を決定した。Ｃｙ３−ｄＵＴＰおよびＲ１１０−ｄＵＴＰについての励起ス
ペクトルは、５５０ｎｍおよび５０３ｎｍである。発光スペクトルの範囲は、Ｃ
ｙ３−ｄＵＴＰについては５６０〜６００ｎｍであり、そしてＲ１１０−ｄＵＴ
Ｐについては５０８〜５６０ｎｍである。「標準」とエタノールで沈殿したサン
プルとの間の差異が、蛍光ヌクレオチドの取り込みである。
【００５５】 （Ｃｙ３−ｄＵＴＰ／ＨｅＬａ ｍＲＮＡを用いた、ＳＳ ＩＩ、ＴＳ Ｉか
らのパーセント取り込みサンプルの計算） （Ａ．標準曲線。これは、２００μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰを含有している標準
的なサンプルの段階稀釈である。）
【００５６】
【表１】 （Ｂ．Ｃｙ３−ｄＵＴＰ／Ｈｅｌａ ｍＲＮＡを用いたＳＳ ＩＩのサンプル
） 沈殿していない反応サンプルは、１００ｐモル／μｌのＣｙ３−ｄＵＴＰを含
んだ。これは、１μｌ中の１００μＭのＣｙ３−ｄＵＴＰの濃度から計算した。
【００５７】 沈殿した反応サンプル（１４μｌの全量）（これは、Ｃｙ３−ｄＵＴＰを取り
込んだｃＤＮＡを含んだ）を、発光において測定した（１４μｌ）。光学単位を
、標準曲線によってｎＭに転換する。
【００５８】 １４μｌのＳＳ ＩＩｗ／Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（反応物中の１００μＭ） ＝９７，３４７光学単位 ＝１３ｎＭ（２ｍｌの容量中） ｐモルの転換：１３ｎＭ×（２／１０００リットル） ＝２６ｐモル（１４μｌ中） ＝１．８６ｐモル／μｌ １．８６／１００＝１．８６％（取り込み） （Ｃ．Ｃｙ３−ｄＵＴＰ／Ｈｅｌａ ｍＲＮＡを用いたＴＳ Ｉのサンプル） 沈殿していない反応サンプルは、２００ｐモル／μｌのＣｙ３−ｄＵＴＰを含
んだ。
【００５９】 沈殿した反応サンプル（２μｌ）を、発光において測定した。
【００６０】 ２μｌのＴＳＩｗ／Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（反応物中の２００μＭ） ＝２８２，７２９光学単位 ＝３４ｎＭ（２ｍｌの容量中） ｐモルの転換：３４ｎＭ×（２／１０００リットル） ＝６８ｐモル（２μｌ中） ＝３４ｐモル／μｌ ３４／２００＝１７％（取り込み） ２．３ＫｂのコントロールＲＮＡおよびＭＡＰ４ ＲＮＡ（５．０Ｋｂ）にお
けるＣｙ３−ｄＵＴＰの取り込みにおける、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTMＩＩ（Ｓ
Ｓ ＩＩ）およびＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTM（ＴＳ Ｉ）の比較
【００６１】
【表２】 注：正常なｄＮＴＰを用いたｃＤＮＡ合成の収率は、ＳＳ ＩＩについては２
８．８％であり、そしてＴＳ Ｉについては３３．３％である。
【００６２】 ＨｅＬａ ｍ−ＲＮＡ中におけるＣｙ３−ｄＵＴＰおよびＲｈ１１０−ｄＵＴ
Ｐの取り込みにおけるＳＳ ＩＩ、ＴＳ Ｉ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩＩ
（ＴＳ ２）およびＡＭＶ ＲＴの比較
【００６３】
【表３】 注：正常なｄＮＴＰを用いたｃＤＮＡ合成の収率は、ＳＳ ＩＩについては３
０．７％であり、ＴＳ Ｉについては２６．１％であり、ＴＳ ＩＩについては
２６．９％であり、そしてＡＭＶ ＲＴについては２２．１％である。
【００６４】 ところで、本発明を、いくらか詳細に理解の明確化の目的のために例示および
実施例によって完全に記載してきたが、これらが、本発明の範囲または本発明の
任意の特定の実施形態に影響を与えることなく、条件、処方、および他のパラメ
ーターの幅および等価な範囲内で本発明を改変または変更することによって実施
され得ること、そして、そのような改変または変更が、添付の特許請求の範囲の
範囲内に含まれることが意図されることは、当業者に明らかである。
【００６５】 本明細書中に記載されている全ての刊行物、特許、および特許出願が、本発明
が属する当業者のレベルを示し、そして各個々の刊行物、特許、または特許出願
が特異的にそして個々に参考として援用されているように、同じ程度で参考とし
て本明細書中で援用されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA09 CA12 HA08 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ52 QR08 QR20 QR36 QR56 QR62 QR66 QS25 QS34 QX02

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １つ以上の核酸分子を標識することにおける使用のための、
    組成物であって、該組成物が、逆転写酵素活性を有している１つ以上の酵素を含
    有しており、ここで、該酵素が多サブユニット酵素である、組成物。
  2. 【請求項２】 前記酵素がヘテロニ量体である、請求項１に記載の組成物。
  3. 【請求項３】 前記酵素が、ＡＳＬＶ逆転写酵素からなる群より選択される
    、請求項１に記載の組成物。
  4. 【請求項４】 前記酵素が、ＲＮａｓｅＨ活性が減少しているか、またはそ
    れが実質的に減少している、請求項１に記載の組成物。
  5. 【請求項５】 前記酵素が、ＲＳＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＡＶ
    逆転写酵素、ＭＡＶ逆転写酵素、およびＨＩＶ逆転写酵素、ならびにそれらの誘
    導体、改変体、フラグメント、または変異体からなる群より選択される、請求項
    １に記載の組成物。
  6. 【請求項６】 前記組成物がさらに、１つ以上の蛍光標識されたヌクレオチ
    ドを含む、請求項１に記載の組成物。
  7. 【請求項７】 前記ヌクレオチドが、ローダミン、フルオレセイン、Ｃｙ３
    、およびＣｙ５からなる群より選択される蛍光分子またはマーカーで標識される
    、請求項６に記載の組成物。
  8. 【請求項８】 前記組成物がさらに、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、なら
    びにその変異体、フラグメント、改変体、および誘導体を含む、請求項１に記載
    の組成物。
  9. 【請求項９】 前記組成物がさらに、逆転写緩衝液および／または核酸鋳型
    を含む、請求項１に記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 １つ以上の核酸分子を逆転写するための方法であって、該
    方法は、以下の工程： （ａ）１つ以上の核酸鋳型を、逆転写酵素活性を有している１つ以上の酵素と
    混合する工程であって、ここで、該酵素が多サブユニット酵素である、工程；お
    よび （ｂ）該混合物を、該１つ以上の鋳型の全てまたは一部に対して相補的である
    １つ以上の第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下でインキュベートする工
    程であって、ここで、該第１の核酸分子の少なくとも１つが、検出可能に標識さ
    れる、工程、 を包含する、方法。
  11. 【請求項１１】 前記核酸鋳型が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子
    またはｍＲＮＡ分子の集団である、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記１つ以上の第１の核酸分子を、該１つ以上の第１の核
    酸分子の全てまたは一部に対して相補的である１つ以上の第２の核酸分子を作製
    するのに十分な条件下で、インキュベートする工程をさらに包含する、請求項１
    ０に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記酵素が、ＡＳＬＶ逆転写酵素からなる群より選択され
    る、請求項１０に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記酵素が、ＲＳＶ、ＲＴ、ＡＭＶ、ＲＴ、Ｔｈｅｒｍｏ
    ＳｃｒｉｐｔTM、およびＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩＩからなる群より選択さ
    れる、請求項１０に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項１０に記載
    の方法。
  16. 【請求項１６】 前記蛍光標識が、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ３、
    およびＣｙ５からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記検出可能に標識された第１の核酸分子が、１つ以上の
    蛍光標識されたヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記検出可能な標識が同じであるかまたは異なる、請求項
    １０に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項１８に記載
    の方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１０に記載の方法に従って調製された、標識された
    核酸分子。
  21. 【請求項２１】 １つ以上の核酸分子を標識することにおける使用のための
    キットであって、該キットが、逆転写酵素活性を有している１つ以上の酵素を含
    有しており、ここで、該酵素が多サブユニット酵素である、キット。
  22. 【請求項２２】 １つ以上のヌクレオチド、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ
    、適切な緩衝液、および１つ以上のプライマーからなる群より選択される１つ以
    上の成分をさらに含有している、請求項２１に記載のキット。
  23. 【請求項２３】 少なくとも１つのヌクレオチドまたは前記ヌクレオチドが
    、蛍光ヌクレオチドである、請求項２２に記載のキット。
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